KR20000011136A - 무성생식 종자의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (i) 세포 또는 막중에 존재시 세포를 배형성이 되도록 하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 식물질을 형질전환시키는 단계, (ii) 상기 형질전환된 물질을 식물 또는 이들의 암술잎-함유 부분으로 재생시키는 단계, 및 (iii) 배낭의 간극중에서 상기 서열을 발현시키는 단계를 포함하는, 무성생식 종자의 생산 방법을 제공한다. 상기 단백질은 류신 반복단위가 풍부한 키나제, 바람직하게는 리간드 결합 도메인이 결실되거나 기능적으로 불활성화될 정도로 변형시킨 것일 수 있다.

Description

무성생식 종자의 생산 방법

본 발명은 유전적으로 형질전환시킨 식물의 생산에 관한 것이다. 상세하게, 본 발명은 무성생식을 유발시키는 방법, 상기 방법으로부터 발생된 무성생식 종자, 및 상기 종자의 발아로부터 발생된 식물 및 이들의 자손에 관한 것이다.

도 1은 표시된 조직으로부터 추출된 RNA에 대해 수행된 RT-PCR 실험 결과를 나타낸다. SERK 발현을 가시화하기 위해서는 발생된 밴드의 서던 블로팅에 따른 40회의 사이클이 필수적이다. 레인은 2,4-D로 3일 미만(레인 1) 또는 이상 (레인 2) 처리한, 7일째의 외식편을 포함한다. 원본에서는 매우 희미한 시그날이 레인 2에서 가시적이나, 레인 1에서는 가시적이지 못하다. 확립된 배형성 배양물(레인 4-6)는 SERK 유전자를 발현시키나 비-배형성 대조군(레인 3)은 발현시키지 않는다. 캐로트 식물에는, 수분후 성장하는 종자(레인 7)를 제외하고는 발현을 검출할 수 없다. 수분후 7일 이내에, 캐로트 접합체는 분할되지 않은 상태로 남아있어, 관찰된 시그날이 접합체로부터만 발생됨을 제시한다. 캐로트 접합체성 배형성에 있어서 10일째에 초기 구상 및 20일째에 핵심 단계에 도달하게 된다.

도 2A는 2,4 D로 3일간 처리한 7일째 외식편에 대한 SERK cDNA와의 홀-마운트 (whole-mount) 동일계 하이브리드화 결과를 나타낸다. 외식편의 표면상의 몇몇 세포만이 SERK 유전자를 발현시키고, 그런 세포들은 배형성이 되는 것들이다.

도 2B는 구상 접합체 배를 함유하는 부분적으로 절제된 종자에 대한 홀 마운트 동일계 하이브리드화를 나타낸다. 하이브리드화는 DIG 염색에 의해 가시화된다.

도 3은 홀 마운트 동일계 하이브리드화에 의해 측정한, 호르몬-유도된 활성화중 배형성 배축 세포중에서의 SERK 발현을 나타낸다. Bari 50 ㎜

(A-E) 활성화된 배축의 기계적 무사분열에 의해 발생된 세포 집단. 확대된 세포로 규정된, 몇몇 특정 타입의 세포만이 SERK 발현 (별표)을 나타낸다. 작은 세포질 세포 (c), 확대된 세포 (eg) 및 거대 세포 (l)는 SERK 발현을 전혀 나타내지 않는다.

(F) 호르몬-유도된 활성화전에 배축 종축 영역. 어떤 타입의 세포에서도 SERK 발현을 검출할 수 없다.

(G-1) 호르몬 처리 개시후 10일째에 내부 배축 조직으로부터 유래한 증식물(종축 영역). G에서 SERK 발현을 나타내는 단독 확대된 세포가 동일한 형태를 나타내는 네가티브 세포의 일렬내에서 검출할 수 있다. H에서는 SERK 발현을 나타내는 단독 확대된 세포를 증식물의 표면으로부터 제거한다. I에서는 SERK 발현을 나타내는 확대된 세포의 클러스터를 증식 조직의 표면에서 검출할 수 있다.

(J) 뿌리 처리 (2,4-D로 24시간 처리한 다음 호르몬을 제거함) 개시후 10일째 배축의 내부 조직으로부터 유래되는 증식물. 표면으로부터 제거된 뿌리 프리모르디아 및 확대된 세포는 둘다 SERK 발현을 나타내지 않는다.

도 4는 파종 수준에서의 2200 bp SERK 루시퍼라제 작제물로 형질전환시킨 아라비도프시스 WS 식물의 표현형을 나타낸다. T2 종자의 발아후 28일째 찍은 사진이다. 식물 II 및 III에서는 파종 단계에서 가시적인 명확한 생장 분열조직이 없다. 이들이 모두 성장한다면, 최초 2개의 잎은 발아후 28일째에 찍은 사진상에 나타난 바와 같이 침상형이다.이때, 명확한 표현형을 나타내지 않는 식물 I에서는 이미 개화되기 시작한다. 제2의 생장 분열조직은 식물 II에서 성장하기 시작하고, 또한 식물 III으로부터 나중에 성장하게 된다. 생장 분열조직, 개화 및 정상적인 꽃이 마침내 모든 식물에서 성장하게 된다.

도 5는 형질전환된 식물의 장각과중 성장하는 배주의 수에 2200 bp SERK 루시퍼라제 작제물이 어떻게 영향을 주는지를 나타낸다.

도 6은 정제된 SERK 융합 단백질의 시험관내 자가포스포릴화를 나타낸다. 레인 1은 정제된 SERK 융합 단백질이고; 레인 2는 세린 포스페이트이며; 레인 3은 트레오닌 포스페이트이고; 레인 4는 티로신 포스페이트이다.

다음 기술내용은 SERK 유전자의 분리 및 클로닝 및 외피의 주심 영역에서 상기 유전자의 이종성 발현에 의해 체세포 배가 형성되어 배낭을 관통하여 종자가 성장함에 따라 종자에 의해 캡슐화됨으로써 무성생식 종자를 생산하는 방법을 설명한다.

Daucus carota로부터 SERK 유전자의 분리 및 클로닝

캐로트의 배형성 세포 배양시 우선적으로 발현되는 cDNA 클론의 분리

배 형성에 있어서 경쟁적인 캐로트 현탁 세포중에서 발현되는 유전자를 수득하는데 있어서의 성공 기회를 증가시키기 위하여, 일련의 확립된 세포 배양물중에 존재하는 수많은 배-형성 세포를 조사한다. 30㎜ 나일론 체를 통과하는 세포의 아집단을 2개월 내지 4년령 범위인 8개의 상이한 배양물로부터 분리한다. 이들 30 ㎜ 아-집단중에서, 단독 세포 및 작은 세포 클러스터로부터 형성된 수많은 배를 측정하여 배형성 개시 단계에 존재하는 세포의 총수의 비율로서 표시한다. 1% 이상의 빈도로 체세포를 형성할 수 있는 체에 통과시킨 <30㎜ 배양물을 경쟁적 세포에 대한 공급원으로 사용하고, 0.01% 미만으로 배를 생산하는 배양물을 비-배형성 대조군으로 사용한다. 주요 클로닝 전략으로서, cDNA 라이브러리의 통상적인 차동 선별외에 콜드 플라크 선별(Hodge et al. 1992) 및 차동 디스플레이 (dd) RT-PCR (Liang and Pardee, 1992)를 사용한다.

차동 선별용으로 표지된 프로브는 배형성 또는 비-배형성 세포 배양물로부터의 세포의 <30㎜ 체에 통과시킨 아-집단의 RNA로부터 수득한다. 대략 2000개의 플라크의 라이브러리 선별에 이들 프로브를 사용하여 프로브에 대한 하이브리드화를 나타내지 못하는 26개의 플라크를 수득한다. 이들 소위 콜드 플라크를 정제하여 추가 분석용으로 사용한다. 하이브리드화되는 플라크의 총수로부터, 약 30개는 배형성 세포로부터의 프로브와만 하이브리드화된다. 앵커 프라이머와 데카머 프라이머의 혼합물을 사용하는 ddRT-PCR 반응을 3개의 배형성, 및 3개의 비-배형성 현탁 배양물로부터 분리된 mRNA에 대해 수행한다. 약 50개의 상이한 ddRT-PCR 단편이 각각의 반응으로부터 수득된다. 3개의 상이한 앵커와 6개의 상이한 데카머 프라이머의 혼합물을 사용하여, 대략 총 1000개의 상이한 cDNA 단편을 가시화시킨다. 이들 PCR 단편중 6개가 배형성 배양물로부터의 세포의 <30 ㎜ 집단으로부터의 mRNA (표 1) 및 앵커 프라이머 (5'-TTTTTTTTTTTGC-3')와 데카머 프라이머 (5'-GGGATCTAAG-3'), (5'-ACACGTGGTC-3'), (5'-TCAGCAGG-3')의 올리고 배합물로 만든 레인에서만 발견된다. 차동 PCR 단편이 통상 수개의 미분해 cDNA 단편으로 이루어지기 때문에 (Li et al. 1994), 수득한 PCR 단편의 추가적인 특성화를 수행하기 전에 클로닝이 필수적인 것으로 입증되었다.

수득한 클론을 모두 2차 스크리닝하는데, 2차 스크리닝은 고도로 엄격한 조건하에서 수행되는 스폿-도트 노던 하이브리드화로 이루어져 있다. 체에 통과시키지 않은 전체 배형성 및 비-배형성 현탁 배양물로부터의 RNA를 사용하는 본 방법은 신속하고 신뢰할만한 추가의 선별 방법인 것으로 입증되었다. 차동 스크리닝후 수득한 30개의 클론중 1개의 클론(22-28)만이 배형성 세포로 제한되는 것으로 입증된 반면, 대다수는 구조적으로 발현된 것이다. 콜드 플라크 스크리닝으로부터 수득한 26개의 클론은 스폿-도트 노던 분석에서 장시간의 노출을 필요로 한다. 이들 클론중 6개는 하이브리드화 시그날을 나타내지 않았으며, 19개는 배형성 및 비-배형성 세포 배양물 모두에서 발현되는 것으로 입증되었다. 1개의 클론(31-50)은 모든 배형성 배양물에서 낮은 발현을 나타냈으며, 1개는 비-배형성 배양물에서 낮은 발현을 나타냈으나, 다른 것들은 나타내지 않았다. ddRT-PCR 디스플레이로 수득한 6개의 클로닝된 단편중에서, 4개는 배형성 배양물중에 존재하는 전사물로 많거나 적게 제한된 하이브리드화를 나타냈다. 2차 스크리닝을 통과한 클론은 모두 서열화시킨다. ddRT-PCR 클론중 2개(6-8 및 7-13)는 배형성 캐로트 세포 배양물에 대한 마커로서 이미 확인된 캐로트 지질 전달 단백질(LTP) 유전자와 동일하였다. LTP 발현은 배형성 세포 클러스터 및 초기 구상 단계 진행으로부터의 체세포 및 접합체 배의 원표피로 제한된다(Sterk et al. 1991). 그러므로, LTP 유전자가 경쟁적 세포에 대한 마커는 아니나, 스크리닝중 이의 출현은 체세포 배형성중 초기에 발현되는 유전자의 클로닝에 있어서 본 발명의 방법의 타당성을 확인시켜 주는 것이다.

cDNA 클론 31-50은 류신-풍부 반복단위 함유 수용체-유사 키나제를 암호화한다.

분리된 클론 31-50에 상응하는 mRNA는 계산된 Mw가 55 kDa인 단백질을 암호화하는 1659개의 뉴클레오티드의 오픈 리딩 프레임을 갖는다. 클론 31-50이 주로 배형성 세포 배양물에서 발현되기 때문에, 이를 체세포 배형성 수용체 키나제 (SERK)로 개명한다. SERK 단백질은 LRR 수용체 키나제에서 단백질-결합 영역으로 작용하는 것으로 제안된 반복된 류신-풍부 모티프가 5배인 N-말단 도메인을 함유한다 (Kobe and Deisenhofer, 1994). SERK의 세포외 LRR 도메인과 막-스패닝 영역 사이에는 SERK 단백질에 대해 독특한, 프롤린 풍부 33개의 아미노산 영역(13)이 있다. 모든 식물 세포벽 단백질 부류로서, 익스텐신에서 관찰되는 서열 SPPPP가 특히 관심의 대상이다(Vamer and Lin, 1989). 상기 단백질의 제안된 세포내 도메인은 단백질 키나제의 촉매적 코어인 11개의 서브도메인 특성을 함유한다. 각각의 키나제 서브도메인 VB 및 VIII중 코어 서열인 HRDVKAAN 및 GTLGYIAPE는 세린/트레오닌 키나제로서의 기능이 있는 것으로 제시되었다(Hanks et al. 1988). SERK 단백질의 세포내 부분의 다른 관심있는 특성은 C-말단 24개 아미노산이 단독 LRR과 유사하다는 것이다. 세포내 LRR 서열내에 존재하는 세린 및 트레오닌 잔기는 산성 잔기로 둘러싸여 있으며 SERK의 자가포스포릴화에 대한 표적일 수 있어, 티로신 수용체 키나제의 EGF족의 SH2 도메인에 대해 기술한 바와 유사한 방식으로 다른 단백질의 상기 수용체-키나제와의 상호반응 능력을 조절할 수 있다.

캐로트 게놈에 대한 SERK cDNA 클론의 하이브리드화로 EcoR1을 사용하여 분해시킨후 단일 주 하이브리드화 밴드만이 존재하는 것으로 밝혀졌는데, 아마도 캐로트 게놈내의 단일 SERK 유전자를 반영하는 것이다. 이는 SERK 유전자내에서 3회 절단하는 효소인 Ddel로 분해시킨후 확인된다. 배형성 세포 배양물로부터의 mRNA의 노던 블로팅 및 표지된 SERK 프로브와의 하이브리드화후에 어떠한 시그날도 관찰되지 않는데, 이는 이들 배양물중에 존재하는 전사물의 수준이 낮음을 반영하는 것이다. 원래의 스포트-도트 노던상에서의 SERK 전사물의 검출은 다른 프로브와 비교하여 장기간 노출시킨후에만 가능하다.

SERK 단백질의 자가포스포릴화 능력은 상기한 자가포스포릴화 검증법 (Mu et al. 1994)을 이용하여 SERK 단백질의 완전 세포내 영역에 함유되어 있는 세균 융합 단백질로 시험관내에서 조사한다. 세균적으로 발현된 SERK 융합 단백질은 자가포스포릴화될 수 있는데, 이는 SERK 단백질이 단백질 키나제로서 생체내에서 역할을 수행할 수 있음을 나타내는 것이다(Heldin. 1995).

SERK 유전자의 발현은 배축 활성화중 경쟁적인 세포의 1차 출현과 상응한다.

캐로트 배축을 2,4-D로 유도시킬 경우, 부맥관 조직의 세포만이 증식한다. 상피와 피질 기원의 세포는 단지 팽창하는데, 이는 부맥관 조직 유래 세포가 새롭게 개시된 현탁 배양물을 형성함을 제시하는 것이다. 2,4-D 제거후, 2 내지 3주 후 체세포 배가 형성된다. 체세포 배는 배형성 세포보다 앞서게 되면, 경쟁적인 세포로부터 성장한다. 경쟁적인 배형성 세포 형성이 2,4-D의 존재하에서 일어나는 반면, 이때 세포가 경쟁성을 획득하게 되는지는 명확하지 않다. 선행 실험 (Toonen et al. 1994)으로 세포 형태가 양호한 기준이 아니라는 것이 밝혀졌기 때문에, 단독 경쟁 세포의 1차 출현은 고정화 세포의 거대 집단상에서 수행되는 반-자동 세포 트래킹에 의해 실험적으로 측정한다. 7일간 2,4-D로 활성화시킨 배축 외식편을 기계적으로 부수어 주로 단독 현탁 세포의 생성된 집단 샘플을 세포 트래킹에 의해 이들의 성장을 기록할 수 있도록 고정화시킨다. 상기 방법으로 수득한 고정화 세포 집단중에는 형태학적으로 구별되는 모든 세포 타입이 존재하는데, 이는 또한 부수지 않은 활성화된 배축에서도 발견된다. 배축 활성화중에 관측된 상이한 세포 형태가 공지되어 있기 때문에(Guzzo et al. 1995), 활성화된 외식편중 각 타입의 세포의 원래 위치를 역추적할 수 있다. 작은 세포질-풍부 세포(16x16㎜)는 맥관 부재를 둘러싸고 있는 증식 세포이다. 맥관화된 세포의 확대(16x40㎜)가 증식 세포 덩어리 표면에서 일어나며, 이들은 완전히 확대(35x90㎜)되었을때 표면으로부터 떼어낼 수 있다. 거대한 맥관화된 세포 (60x140 ㎜ 이상)는 배축 상피 및 피질 연조직의 비-증식 잔존물이다. 확대 및 완전 확대된 세포의 형태는 난형 내지 신장된 형태 또는 삼각형으로 변화될 수 있다. 7일간 활성화된 배축으로부터 방출된 총 24,722개의 세포에 대한 세포 트래킹은 단지 20개의 단독 세포만이 체세포 배를 형성함을 나타낸다. 계속된 2,4-D 처리에 대한 이들의 의존성 때문에, 배-형성 단독 세포는 아직도 경쟁적인 세포 단계에 있다. 배-형성 단독 세포는 모두 3,511개의 확대된 세포 부류에 속하며, 따라서 0.56%의 빈도로 경쟁적인 세포를 함유한다. 단독 세포 트래킹 실험으로, 고도로 세포질이며 신속하게 증식하는 세포 집단으로 만드는, 외식편 세포의 2,4-D의 영향하에서의 세포 분열 재개 능력이 배형성이 되도록 하는 능력과의 인과 관계를 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 새롭게 개시된 배형성 현탁 배양물을 구성하는 매우 제한된 수의 세포만이 실제로 배형성 세포를 형성하는데 있어서 경쟁적임이 자명하다.

세포 트래킹 실험용으로 사용된 것과 유사한 세포 집단상에서의 홀 마운트 동일계 하이브리드화에 의해 측정된 SERK 유전자의 발현은 확대된 세포의 0.44%만으로 제한되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, SERK 유전자의 발현은 경쟁적인 단독 세포의 존재와 정유성 및 정량적으로 모두 밀접한 상관이 있는 것으로 나타났다.

외식편 활성화 과정중 SERK 발현의 주기적 조절을 간파하기 위하여, 상이한 기간 동안 2,4-D로 처리한 전체 천연 또는 수동-분획시킨 외식편에 대해 홀 마운드 동일계 하이브리드화를 수행한다. B5-0으로 되돌리기 전에 무처리된 외식편 및 3일간, 6일간, 7일간 또는 10일간 2,4-D로 처리된 외식편로부터 하루 간격으로 대표적인 샘플을 채취한다. 2,4-D로 3일 미만 동안 처리하에 외식편에서는 SERK-발현 세포가 전혀 관찰되지 않았다. 확대된 세포가 1차 5일간의 배양후 존재하기 시작한 반면, 1차적인 몇몇 SERK-발현 확대된 세포는 2,4-D 처리하에 6-7일간의 배양후 관찰되었다. 이들 몇몇 세포는 부맥관 조직으로부터 기원하는 증식 세포 덩어리의 표면에 존재한다. 2,4-D로 10일간 처리된 배축에서, 다수의 SERK-포지티브 세포가 3.04%로 증가하였고, 이 단계에서 작은 클러스트로 존재하는 세포를 또한 포함하였다. 작은 세포질-풍부 세포 또는 거대한 맥관화 세포에서는 SERK 전사물이 전혀 검출되지 않았다. 배축을 또한 1일간만 2,4-D로 처리하여 호르몬-유리 배지중에서 총 7일 또는 10일간 배양시킨다. 이들 조건하에서 외식편 세포는 증식하여 뿌리와 비-배형성 세포 배양물을 발생시키는데, SERK 발현은 전혀 검출되지 않았다. 상기한 동일계 하이브리드화 결과는 상대적으로 소수의 외식편과 수백개의 세포로부터 수득되어, RT-PCR 및 이어서 서던 하이브리드화를 수행하여 더욱 정량적인 결과를 수득한다. 이들을 도 7에 나타내며, 2,4-D로 3일간 처리된 외식편에서의 경쟁적 세포의 1차 출현과 SERK 유전자의 발현간의 밀접한 주기적 상관 관계가 확인된다. SERK cDNA 프로브로 하이브리드화시킨 후, 심지어는 PhosphorImager에 장기간 노출시킨 후라도, SERK 유전자의 극히 제한된 발현 패턴을 갖는 주에서는 노던 하이브리드화에 의한 시그날이 결코 수득되지 않는다.

SERK 유전자의 발현은 확립된 배형성 세포 배양물중에서의 경쟁 세포의 발생과 상응한다.

지금까지 기술한 결과가 경쟁적이고 배형성 세포 형성이 외식편 활성화중에 특정 부류의 확대된 세포로 제한됨을 나타낸 반면, 확립된 배형성 세포 배양물에서의 상황은 더욱 복합적이다. 상기와 같은 배양물중의 경쟁적 단독 세포는 특히 하나의 세포 타입에 속하는 것으로 나타나진 않았지만, 형태학적으로 상이한 모든 세포 타입으로부터 기원하는 것으로 밝혀졌다. 세포 트래킹 실험에서, 외인성 옥신 처리를 필요로 하지 않는 배형성 세포는 단독이지만 적어도 3 내지 4개의 세포의 클러스트로 이루어진 것으로 관찰되지는 않는다(Toonen et al. 1994). SERK 발현은 세포 타입에 따라 0.1 내지 0.5%의 빈도로 배형성 세포 배양물에 존재하는 형태학적으로 구별되는 단독 세포 타입에서 발견된다. 비-배형성 배양물에서는 SERK 발현 세포가 발견되지 않았다. 활성화된 외식편에서 관찰된 바와 같이, SERK 발현은 단독 세포로 제한되는 것이 아니라, 2 내지 16개의 세포로 이루어진 작은 클러스트에서도 발견되었다. 상기 크기의 클러스트가 배형성 세포로 구성되었다는 것이 공지되었기 때문에, 이들 데이타는 SERK 발현이 경쟁적 단독 세포로 제한되는 것이 아니라, 배형성 세포의 작은 클러스트에도 존재할 수 있음을 나타낸다. 후기 구상, 핵심 및 수뢰-단계의 체세포 배형성시 SERK 발현은 일어나지 않는다.

SERK 유전자는 접합체 배형성에서 일시적으로 발현된다.

캐로트 식물중에서 SERK 유전자의 발현은 RT-PCR로 측정한다. 결과는 SERK mRNA가 성장 식물 기관뿐만 아니라 수분전의 꽃에서도 전혀 축적되지 않았음을 나타낸다. SERK 발현이 검출될 수 있는 1차 기회는 수정이 일어나고 배유 성장이 시작되는 단계인, 수분후(DAP) 3일째의 꽃에서이다. SERK mRAN는 20일 DAP까지 존재하는데, 이는 접합체 배의 초기 구상 단계에 상응한다(Yeung et al. 1996). 부분적으로 절제된 캐로트 종자상에서의 홀 마운트 동일계 하이브리드화로 SERK 유전자가 구상 단계 이내의 초기 배에서만 발현되는 것으로 확인되었다. 발현은 서스펜서를 포함한 전체 배에서 관찰되었다. 파종, 뿌리, 줄기, 잎, 성장하고 성숙한 꽃 기관, 화분 입자 및 수정전 및 후의 주두에서는 발현이 발견되지 않았다. 종자 피복물, 외피, 수정전의 모든 배낭 구성분뿐만 아니라 조사된 모든 성장 단계의 배유와 같은 성장하는 종자중의 조직은 SERK 발현을 전혀 나타내지 않았다. 후기 단계의 캐로트 접합체 배는 또한 SERK mRNA가 완전히 없었다. 접합체 배로 제한되는 상기 패턴의 발현의 경우, 3 및 7 DAP에서 꽃중에서 RT-PCR에 의해 검출되는 바와 같은 시그날은 수분후 1주까지 접합체가 분할되지 않은 상태로 캐로트중에 남아있기 때문에 접합체중에 존재하는 바와 같은 SERK mRAN로부터 유래되어야 한다(Yeung et al. 1996). 체세포의 것과 비교하여 약간 경과된 단계의 접합체 구상 배에서 SERK 발현이 지속되지만, 이들 결과는 체세포 배형성중에 SERK 유전자에 대해 관찰된 바와 같은 일시적인 발현 패턴을 확인하는 것이며, 또한 경쟁 세포의 시험관내 형성과 접합체의 생체내 형성간에 상응점이 있음을 암시하는 것이다.

방법

세포 배양물, 배축 외식편 유도 및 세포 트래킹

세포 배양물은 Daucus carota cv. Flakkese로부터 유도하여 상기한 바와 같이 (De vries et al. 1988a) 유지시킨다. 세포 현탁 배양물은 높은 세포 밀도로 2mM 2,4-D가 보강된 B5 배지(Gamborg et al. 1968) (B5-2 배지)중에 유지시킨다. 구상, 핵심 및 수뢰-단계의 체세포 배와 함께 배 배양물을 2,4-D가 없는 B5 배지 (B5-0)에서 낮은 세포 밀도 (100 000 세포/㎖)로 배양시킨 <30㎜ 체에 통과시킨 세포 배양물로부터 유도시킨다. 배축 이식편 유도 실험의 경우, 상기한 바와 같이 Daucus carota cv. S Valery의 종자로부터 묘목을 수득한다(Guzzo et al. 1994). 1주된 묘목의 배축을 3-5㎜ 절편으로 나누어, 다양한 기간 동안 B5-2 배지중에서 배양시키고 B5-0 배지로 보낸다. 이식 7일후 2,4-D에 노출시킨 배축 절편을 170 ㎜ 체상에서 나누고, 생성된 세포를 수거하여 미세 세포 현탁액을 형성시킨다. B5-0.2 배지중에 이들 세포를 피타겔의 박층으로 고정화시킨다(Toonen et al. 1994). 추가로 1주간 배양시킨후 B5-0 배지로 상기 플레이트를 세척하여 2,4-D를 제거한다. 이로써 배가 구상 단계 이상으로 성장하도록 한다. 고정화된 세포의 성장을 Toonen 등 (1994)에 의해 상기 기술된 방법으로부터 개량된 방법으로 기록한다. 주요 변화는 피타겔중의 모든 세포를 스캔하기 위하여 자동 3축 이동을 위한 신규한 MicroScan 프로그램을 포함시킨 것이다(Toonen et al. 1996).

핵산 분리 및 분석

RNA는 문헌(De Vries et al; 1988b)에 기술된 바와 같이 배양된 세포 및 식물 조직으로부터 분리시킨다. 올리고 (dT) 셀룰로오즈 (Biolabs)에 의해 정제하여 폴리(A)^*-RNA를 수득한다. RNA 겔 블로트 분석을 위하여 전체 RNA 샘플 10㎎을 포름아미드 겔상에서 전기영동시키고, 니트란-플러스 막으로 옮긴다. RNA 스포트-블로트 분석을 위하여 전체 RNA 5㎎을 변성시켜 하이브리도트 매니폴드(BRL)를 사용하여 니트란-플러스 필터상에 스포팅시킨다.

게놈성 DNA를 문헌 (Steark et al. (1991))에 따라서 분리시킨다. 게놈성 DNA 10㎎의 샘플을 상이한 제한 효소로 분해시켜 아가로스 겔상에서 분리시키고, 니트란-플러스 막 (Schleicher & Schuell)으로 옮긴다. RNA 블로트의 하이브리드화는 50% 포름아미드, 6xSSC, 5x덴하르트, 0.5% SDS 및 0.1 ㎎/㎖ 연어 정액 DNA를 함유하는 하이브리드화 완충액중 42 ℃에서 수행한다. DNA 블로트의 하이브리드화는 상기한 바와 같이 수행한다 (Sterk et al. 1991). 하이브리드화시킨 다음, 필터를 엄격한 조건(65℃의 0.1% SSC, 1% SDS 중에서 3×20분)하에 세정한다. 필터를 Kodak X-Omat AR 필름에 노출시킨다. 블로트상에서의 RNA의 집결도 및 양은 18S 리보솜 RNA 프로브와의 하이브리드화에 의해 확인된다. 뉴클레오티드 서열 분석을 ABI 373A 자동화된 DNA 서열화기 (Applied Biosystem)상에서 수행한다.

스크리닝 공정

2개의 독립적인 cDNA 라이브러리를 B5-2 배지중에서 6일간 성장시킨 확립된 세포 배양물, B5-0 배지중에서 6일간 성장시켜 체에 통과시킨 <125㎜ 세포 배양물 및 B5-0 배지중에서 6일간 성장시켜 체에 통과시킨 <30㎜ 세포 배양물로부터의 폴리(A)^*-RNA 등량으로 작제한다. cDNA 합성과 Uni-ZAP: 상표명 XR 벡터중으로의 클로닝은 제조업자의 프로토콜 (Stratagene)에 따라서 수행한다.

cDNA 라이브러리의 차동 스크리닝을 필수적으로 문헌[참조: Scott et al. (1991)]에 기술된 바와 같이 수행한다. 30 ㎜ 메쉬에 통과시킨 후 B5-2중에서 7일간 성장시킨, 3개의 배형성 또는 3개의 비-배형성 세포 배양물로부터 RNA를 분리시킨다. 제1 본쇄 cDNA 합성은 AMV 역전사효소 (Gibco BRL)를 사용하여 전체 RNA 4 ㎎상에서 수행한다. 제1 본쇄 cDNA상에서 랜덤 프라임 표지화 방법을 이용하여 [³²P]dATP 표지된 프로브를 제조한다. 배형성 및 비-배형성 세포 집단으로부터 푸우링한 프로브를 하나의 cDNA 라이브러리로부터 각각 1000개의 플라크를 함유하는, 2쌍의 니트로셀룰로오스 필터에 하이브리드화시킨다. 3x20분간 0.1% SSC, 1% SDS로 65 ℃에서 세척한 후, Kodak X-omatic 필름상에서 2일간 자동방사그래프에 의해 하이브리드화를 가시화한다. 배형성 전사물 프로브를 갖는 시그날을 나타내는 플라크를 2회 추가 스크리닝하여 정제한다.

<30㎜ 체에 통과시킨 세포 집단에서 낮은 수준으로 발현되는 cDNA 클론을 확인하기 위하여, 문헌[참조: Hodge et al. (1992)]에 기술된 바와 같이 콜드 플라크 스크리닝을 수행한다. 7일간의 자동방사그래프 후 시그날을 나타내지 않는 차동 스크리닝으로부터의 플라크를 2회 추가로 스크리닝하여 정제한다. 생성된 클론을 상응하는 유전자의 발현 패턴의 특성화용 프로브로 사용한다.

차동 디스플레이 RT-PCR

mRNA의 차동 디스플레이는 본질적으로 문헌[참조: Liang and Pardee (1992)]에 기술된 바와 같이 수행한다. 200 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 및 1 mM EDTA를 함유하는 완충액 10㎖중에서 전체 RNA 1 ㎎을 다음 앵커 프라이머: (5'-TTTTTTTTTTTGC-3'), (5'-TTTTTTTTTTTCTG-3'), (5'-TTTTTTTTTTTCA-3')로 어닐링시켜 cDNA를 합성한다. 혼합물을 3분간 83 ℃에서 가열한 다음 42 ℃에서 30분간 배양시켜 어닐링시킨다. 어닐링에 이어서 16 mM MgCl₂, 24 mM Tris-HCl (pH 8.3), 8 mM DTT, 400 mM dNTP, 및 AMV 역전사효소 (Gibco BRL) 4 단위를 함유하는 미리-가온시킨 cDNA 완충액 15 ㎖를 가한다. 42 ℃에서 90 분간 cDNA를 합성한다. 제1 스트랜드 cDNA를 페놀/클로로포름 추출하고, 담체로서 글리코겐을 사용하여 에탄올로 침전시킨다. 합성한 cDNA 10%, 앵커 프라이머 100 ng, 하기 10량체 프라이머중 1종 20 ng을 함유하는 20 ㎖의 반응 용적으로PCR 반응을 수행한다: (5'-GGGATCTAAG-3'), (5'-TCAGCACAGG-3'), (5'-GACATCGTCC-3'), (5'-CCCTACTGGT-C'), (5'-ACACGTGGTC-3'), (5'-GGTGACTGTC-3'), 2mMd dNTP, PCR 완충액 (10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 1.5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0.01% 젤라틴 및 0.1% Triton X100)중 Taq 효소 0.5 단위 및 6 nM[a-³²P]dATP (Amersham). PCR 인자는 94 ℃에서 30초, 40 ℃에서 1분, 및 72 ℃에서 30초간 Cetus 9600 (Perkin-Elmer)을 사용하여 40회이다. 증폭시켜 표지시킨 cDNAs를 6% 변성 DNA 서열화 겔상에서 분리한다. 겔을 고정시키지 않고 건조시키고, 밴드를 Kodak X-omatic 필름을 사용하여 16시간의 자동방사그래프로 가시화시킨다. 150 내지 450개의 뉴클레오티드인 차동적으로 발현된 cDNA 단편을 함유하는 밴드를 겔로부터 절단하여 DE-81 페이퍼 (Whatmann)상에서 전기용출시켜 겔 슬라이스로부터 DNA를 추출한다. 저염 완충액 (10 mM TE 완충액중 100 mM LiCl₂)으로 상기 페이퍼를 세척하고, 고염 완충액 (20% 에탄올을 갖는 10 mM TE 완충액중 1 M LiCl₂)중에서 cDNA를 용출시킨후, 담체로서 글리코겐을 사용하여 에탄올중에서 침전시켜 cDNA를 농축시킨다. 상기한 바와 동일한 PCR 사이클 인자를 사용하나 둘다 2.5 mM인 10량체 및 앵커 올리고와 100 mM dNTP를 함유하는 PCR 완충액을 사용하여 cDNA 단편을 재증폭시킨다. DE-81 페이퍼를 사용하여 DNA 단편을 효율적으로 회수하고, 재증폭시켜 40회전후 평균 500 ng의 DNA를 생성시킨다. 증폭시킨 PCR 생성물을 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편 (Pharmacia)을 사용하여 평활-말단화하여, 세파크릴-S200 컬럼 (Pharmacia)상에서 정제하고, Smal 선형화 p블루스크립트 벡터 II SK^-(Stratagene)중으로 결합시켜 전기천공을 사용하여 이. 콜라이중으로 형질전환시킨다.

RT-PCR

Daucus carota로부터의 성숙 식물 조직을 S&G Seeds (Enkhuizen)로부터 수득한다. 손으로 조절된 수분을 수행한다. 각 시점에 대해 3개의 경쟁 산형화서로부터 꽃 조직 RNA를 수득하고, 화분 입자를 포함하여 모든 꽃 기관에 함유되어 있다. 성숙 식물 조직 또는 세포 배양물로부터의 전체 RNA 2 ㎎을 42 ℃에서 50 ng 올리고 (5'-TCTTGGACCAGATAATTC-3')와 어닐링 완충액 (250 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 1 mM EDTA) 10 ㎖중에서 어닐링시킨다. 어닐링 30분 후, AMV-역전사효소 1 단위를 cDNA 완충액 (24 mM Tris-HCl pH 8.3, 16 mM MgCl₂, 8 mM DTT, 0.4 mM dNTP) 15 ㎖의 용적으로 가한다. 역전사 반응은 42 ℃에서 90분간 수행한다. SERK-cDNA의 PCR 증폭은 SERK 키나제 도메인에 대해 특이적인 2개의 올리고, (5'-CTCTGATGACTTTCCAGTC-3') 및 (5'-AATGGCATTTGCATGG-3')로 수행한다. 94 ℃에서 30초의 30회 증폭을 수행하고, 54 ℃에서 30초간 어닐링시켜 72 ℃에서 1분간 연장시킨 다음 72 ℃에서 10분간 최종 연장시킨다.

홀 마운트 동일계 하이브리드화

필수적으로 상기 기술된 바와 같이 (Engler et al. 1994) 홀 마운트 동일계 하이브리드화를 수행한다. 세포 배양물과 체세포 배를 폴리-L-리신 피복된 유리상에 고정화시켜 고정중 조작성을 개선한다. 이식편상에서의 홀 마운트 동일계 하이브리드화는 7일된 묘목으로부터의 배축을 3% Seaplaque 아가로스 (Duchefa)에 박고 이들을 에펜도르프관중에서 가공함으로써 일어난다. 횡방향 뿐만 아니라 종방향으로 비브로톰 (Biorad Microcut)을 사용하여 나눈다. 50-170 ㎜ 두께의 분획물을 B5-2 배지중에서 적어도 3일간 배양시켜 배-형성 세포의 형성을 유도한다. 최적 유도는 두께가 90 ㎜ 이상인 종방향 배축 분획물에 대해 성취된다. 증식하는, 비-배형성 세포 배양물을 수득하기 위하여, 배축 분획물을 2,4-D에 1일간만 노출시키고, 이어서 B5-0 배지 (Guzzo et al. 1994)로 옮긴다. 성장하는 종자상에서의 홀 마운트 동일계 하이브리드화는 프로브 침투가 더욱 용이해지도록 종자의 합점 말단을 제거함으로써 수행된다. 하이브리드화후, 외피와 배유의 둘러싸는 층을 조심스럽게 제거하여 성장하는 배를 노출시킨다. 분획물상에서의 동일계 하이브리드화는 상기한 바와 같이 (Sterk et al. 1991) 수행하지만, 비-방사성 프로브를 사용하는 점이 예외이다.

모든 샘플은 70 mM EGTA, 4% 파라포름알데히드, 0.25% 글루타르알데히드, 0.1% Tween 20, 및 10% DMSO를 함유하는 PBS중에 60분간 고정시킨다. 이어서 샘플을 세척하고, 프로테이나제 K로 10분간 처리하고, 다시 세척하여 2차적으로 고정시킨다. 하이브리드화 용액은 0.1% Tween 20, 330 mM NaCl, 50 ㎎/㎖ 헤파린, 및 50% 탈이온화 포름아미드를 함유하는 PBS로 이루어져 있다. 하이브리드화는 16시간 동안 42 ℃에서 디곡시제닌-표지된 감작 또는 항감작 리보프로브 (Boehringer Mannheim)를 사용하여 수행한다. 세척후 세포를 RNaseA로 처리하여, 식물 단백질 추출물로 미리 흡수시킨 항-디곡시제닌-알칼리성 포스파타제 접합체 (Boehringer MannHeim)와 함께 배양시킨다. 세척하여 과량의 항체를 제거한 다음 염색 완충액 (100 mM Tris-HCl pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM 레바미졸)중에서 세정하고, NBT 및 BCIP를 함유하는 완충액중에서 16시간 동안 염색 반응을 수행한다. Nomarski 광학제품이 장착되어 있는 Nikon Optiphot 현미경을 사용하여 관찰한다.

자가포스포릴화 검정법

N-말단 3개의 LRRs을 제외하고 대부분의 오픈 리딩 프레임을 암호화하는 SERK cDNA의 1.4 kB Sspl cDNA 단편을 pGEX 발현 벡터 (Pharmacia)중으로 클로닝시킨다.

SERK와 글루타티온 S-트랜스퍼라제 유전자 생성물로 이루어진 융합 단백질을 형질전환된 이. 콜라이를 2 mM IPTG로 3시간 유도시켜 합성한다. 융합 단백질을 상기 정의된 바와 같이 (Hom and Walker, 1994) 분리하여 정제한다. 정제된 융합 단백질을 글루타티온 아가로스 비드 (Sigma)에 커플링시키고, 완충액 (50 mM Hepes (pH 7.6), 10 mM MgCl₂, 10mM MnCl₂, 1 mM DTT, 1 mCi [γ-³²P] (3000 Ci/mmol)) 10 ㎖의 용적으로 20 ℃에서 20분간 배양시킨다. 융합 단백질/글루타티온 아가로스 비드를 50 mM Tris-HCl (pH 7.3), 10 mM MgCl₂로 4 ℃에서 5분간 3회 세척하여 과량의 표지물을 제거한다. SDS-PAGE 부하 완충액중에서 조작하여 비드로부터 단백질을 제거한다. SDS-PAGE에 의해 등량의 단백질을 분리시키고, 단백질 자가포스포릴화를 자동방사그래프로 가시화한다.

바스쿨로바이러스 발현 시스템으로 생산한 SERK 융합 단백질

바스쿨로바이러스 벡터 pAcHLT를 사용하여 Daucus carota SERK 단백질의 세포내 부분을 함유하는 추가의 융합 단백질 (캐로트 SERK cDNA 클론 31-50의 1.0 kB HindIII/SspI 단편)을 제조한다.

상기 정제된 단백질을 사용한 시험관내 포스포릴화 연구로 상기 SERK 융합 단백질의 자가포스포릴화중 모두는 아닐지라도 대부분이 트레오닌 잔기에 있다(도 6).

바이러스성 전달 벡터의 작제

pAcHLT-B 및 pAcHLT-C 바쿨로바이러스 전달 벡터를 캐로트 SERK 유전자의 2개의 cDNA 단편의 클로닝을 위하여 사용한다. 캐로트 DcSERK cDNA의 Sspl 1.41 kB 단편을 pAcHLT-B의 Smal 부위 중으로 클로닝시키고, 캐로트 DcSERK cDNA의 SSpl/ Pvull 1.07 kB 단편을 pAcHLT-C의 Smal 부위중으로 클로닝시킨다. 제1 작제물은 DcSERK의 완전한 C-말단 부분과 추정되는 세포외 영역으로부터 화분-풍부 영역 및 3개의 류신-풍부 반복단위를 함유한다. 제2 작제물은 DcSERK 유전자 생성물의 추정적인 세포내 영역만을 함유한다. 뉴클레오티드 서열 분석을 수행하여 벡터내의 DcSERK cDNA의 존재와 방향을 확인한다.

곤충세포의 형질전환

생성된 전달 벡터를 사용하여 선형화된 AcMNPV 바쿨로바이러스 DNA와 함께 Spodoptera frugiperda로부터의 곤충 세포 배양물 Sf21을 형질감염(지질감염)시킨다. SF21 세포의 단층을 힝크스 배지 2 ㎖를 함유하는 35 ㎜ 페트리디쉬중에서 형질감염시킨다. 선형화된 AcMNPV 바쿨로바이러스 DNA (Baculogold, Invitrogen) 1 ㎍을 물 25 ㎕중 pAcHLT/SERK 벡터 작제물 5 ㎍에 가한다. 리포펙틴 (BRL) 15 ㎕를 물 10 ㎕와 혼합하고, 이후 상기 DNA 용액을 가한다. 힝크스 배지 200㎕를 혼합하여 상기 혼합물에 가하고, 용액을 세포 단층으로 옮겨 이로부터 배지를 제거한다. 1시간후, 힝크스 배지 500 ㎕를 가하고 세포를 다시 3시간 동안 배양시킨다. 최종적으로, 소태아 혈청 (FBS) 20%를 갖는 힝크스 배지 1 ㎖를 가하고 세포를 4일간 배양시킨다. 형질감염후, 감소된 세포 성장률, 팽윤된 형태 및 확대된 핵으로 바이러스 감염을 확인한다. 4일후, 감염된 세포를 수거하고, 감염성 발아된 바이러스를 함유하는 배지를 수거하여 플라크 검정용 및 재조합 바이러스 스톡의 증폭용으로 사용한다.

단일 재조합 바이러스의 분리

단일 재조합 바이러스 플라크를 적정 범위의 1차 바이러스 스톡으로 감염된 세포의 단층으로부터 분리시킨다. 35 ㎜ 페트리디쉬중에서 세포의 단층으로 감염을 수행한다. 바이러스 스톡을 그레이스 배지 600 ㎕에 희석시켜 세포 단층에 가한 다음 FBS 20%를 함유하는 그레이스 배지에서 90분간 배양시킨다. 이후, 3% Sea Plaques 아가로스를 오토클레이빙시키고, 20% FBS를 갖는 등량의 2x 그레이스 배지와 혼합하여 생성된 아가로스 중층 용액 2 ㎖로부터 바이러스 종균을 제거한 후 세포 단층상에 도말한다. 배양한지 4일후, 단일 플라크를 가시화시킬 수 있고 추가 분석을 위하여 정제한다.

융합 단백질 제조

정제된 재조합 바이러스의 역가를 측정한후, 75 ㎠ 플라스크중 Sf21 세포의 단층은 감염 다중도 (MOI)가 10인 감염물이다. 바이러스 종균과 세포를 90분간 배양시킨후 10% FBS를 갖는 힝크스 배지 8 ㎖를 가한다. 배양시킨지 3일후, 세포를 수거하여 PBS로 2회 세척한다. 세포를 20배 용적의 1x 곤충 세포 용해 완충액 (10 mM Tris pH 7.5, 130 mM NaCl, 1% Triton, 100 mM NaF, 10 mM NaPi, 10 mM NaPPi, 프로테이나제 억제제: 16 ㎎/ℓ 벤즈아미딘, 10 ㎎/ℓ 페난트롤린, 10 ㎎/ℓ 아프로티닌, 10 ㎎/ℓ 류펩틴, 10 ㎎/ℓ 펩스타틴 A, 1 mM PMSF)중 빙상에서 45분간 용해시킨다.

10,000 g에서 30분간 원심분리시켜 용해물을 청정시키고, 상등액을 TALON 수지 (재조합 융합 단백질의 6xHIS tag에 대한 친화성이 높음)중에서 배치식으로 배양시킨다. 20분간 실온에서 부드럽게 교반시켜 결합을 수행한다. 수지를 용해 완충액으로 3회 세척한 다음, 200 mM 이미다졸을 갖는 용해 완충액으로 용출 단계를 수행한다. 정제된 융합 단백질을 수거하여 순도와 집결도를 SDS-PAGE로 시험한다.

자가포스포릴화 검정

정제된 융합 단백질 1 ㎍을 30분간 실온에서 10 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂, 1 mM DTT 및 10 μM[감마-32]ATP (10⁵pm/pmol ATP)를 함유하는 완충액중에서 배양시켜 단백질 키나제 활성을 측정한다. 50 mM NH₄CO₃, 0.1% SDS, 0.25% 베타-머캅토에탄올을 함유하는 완충액중에서 겔로부터 SDS-PAGE 후 자가포스포릴화된 융합 단백질을 정제한다. 20 ㎍/㎖ BSA 및 20% (w/v) 고체 트리클로로아세트산으로 단백질을 침전시킨다. 침전물을 수거하고 원심분리시킨후, 6N HCl 50 ㎕중에서 1시간 동안 120 ℃에서 가수분해시킨다. 이어서, 동결건조시켜 HCl을 제거하고, 펠릿을 2.2% 포름산과 7.8% 아세트산을 함유하는 완충액중에 재현탁시킨다. 가수분해된 단백질을 대조군 아미노산 샘플 (포스포세린, 포스포트레오닌, 포스포티로신)과 함께 셀룰로오스 박층 크로마토그라피 플레이트상에 부하한다. 프로피온산: 1M 수산화암모늄: 이소프로필 알콜 (90:35:35 v/v/v)을 함유하는 완충액중에서 크로마토그라피를 수행한다. 플레이트를 분리시켜 건조시킨후, 아세톤중 0.25% 닌하이드린으로 분무한 다음 5분간 65 ℃에서 가열시켜 분리된 아미노산을 가시화시킨다. 이후 플레이트를 Phospho Imager 카세트에 노출시켜 포스포-표지된 아미노산을 검출한다.

SERK 항체

정제된 융합 단백질 (10 ㎍)을 완전 프로인드 보조제중에서 혼합하여 BALBc 마우스중으로 복강내 주사한다. 4주후 부스터 항원을 주사한다 (불완전 프로인드 보조제중 정제된 융합 단백질 10 ㎍). 2주후 최종 부스터를 주사한다. 최종 부스터후 1주 경과하여, 이들 마우스로부터 혈청을 수거한다. 생성된 혈청의 특이성과 역가를 SERK 융합 단백질의 존재 또는 부재하에 전체 곤충 세포 추출물을 이용하여 웨스턴 블로트상에서 시험한다.

SERK 유전자의 플란타중으로의 도입 및 무성생식 종자의 생산

SERK 프로모터 단편/루시퍼라제 유전자 융합물을 사용한 캐로트 형질전환

바이너리 벡터 pMT500은 pBIN19 벡터 (Bevan, 1984)를 기본으로 하며 개똥벌레 루시퍼라제 암호화 영역의 단일-방향 결합에 의해 생성된 5개의 독특한 제한 부위를 함유하는 폴리링커의 개똥벌레 루시퍼라제 유전자 다운스트림과 이어서 바이러나 벡터 pMOG800 (네덜란드 왕국 라이덴 소재의 Mogen N.V.에 의해 제공됨)의 HindIII-Xbal 부위중 완두 rbcS::E9 유전자로부터의 폴리아데닐화 서열을 함유한다. 상기 바이너리 벡터 pMOG800은 pBIN19 (Bevan, 1984)을 기본으로 하지만, pBIN19중에서 폴리링커는 좌측 보더와 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (NPT II) 발현 카세트에 의해 플랭킹되어 있으며, pMO800의 폴리링커는 우측 보더와 NTPII 발현 카세트에 의해 플랭킹되어 있다. 게놈성 람다 클론으로부터, HindIII 및 Dral로 분해시켜 캐로트 SERK 유전자로부터의 전사 조절 서열을 분리시키고 (서열 1), p블루스크립트 SK+중으로 클로닝시킨다. 생성된 벡터로부터 SERK 게놈성 DNA를 함유하는 Kpnl/Sstl 단편을 분리시키고, 바이너리 벡터 pMT500의 Kpnl/Sstl 부위중으로 클로닝시킨다. 생성된 DNA 작제물, pMT531는 프로모터 서열로서 2200 bp 게놈성 SERK DNA 단편, 중대한 리포터로서 루시퍼라제 유전자, 및 E9 전자 터미네이터 서열을 함유한다.

전기천공에 의해 바이너리 벡터 pMT531를 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 MOG101 및 MOG301 (캐로트 세포중으로의 형질전환용) 및 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 C58C1 (아라비도프시스 탈리아나 식물중으로의 형질전환용)중으로 형질전환시킨다. 100 ㎎/ℓ 카나마이신을 갖는 LB 플레이트상에서 형질전환된 콜로니를 선택한다.

캐로트 세포의 형질전환

게놈성 캐로트 HindIII/Dral 2200 bp DNA 단편의 조절하에서 개똥벌레 루시퍼라제 암호화 서열을 배축 절편의 아그로박테리움 투메파시엔스 매개된 형질전환에 의해 캐로트 세포중으로 도입시킨다. Daucus carota cv. 'Amsterdamse bak'의 형질전환은 1주간 암실에서 성장시킨 종자를 10 내지 20 ㎜ 절편으로 절단하여 수행한다. 절편을 20분간 새로 제조한 10배 희석된 아그로박테리움의 일야 배양물중에서 배양시킨다. 상기 절편을 건조시키고, 2 μM 2,4-D (P1-2)가 보강되어 아가 (Difco, Detroit, MI, USA)로 고화시킨 변형된 Gamborgs B5 배지 (P1 배지: S&G seeds, Enkhuizen, The Netherlands)로 옮긴다. 암실에서 25 ± 0.5 ℃에서 2일간 배양시킨후, 절편을 카나마이신 (100 ㎎/ℓ), 카르베니실린 (500 ㎎/ℓ; Duchefa) 및 반코마이신 (100 ㎎/ℓ; Duchefa)이 보충된 고화 P1-2 배지로 옮긴다. 3주후, 절편을 신선한 플레이트로 옮기고, 추가로 3주후 형질전환된 세포를 선택한다. 형질전환된 세포를 항체가 있는 P1-2 플레이트상에서 3주간 16 시간 주/8시간 야의 방식으로 성장시킨다. 카나마이신 200 ㎎/ℓ, 카르베니실린 250 ㎎/ℓ 및 반코마이신 50 ㎎/ℓ가 보충된 액체 P1-2 배지 10 ㎖로 유합조직 0.2g을 옮겨 상기한 바와 같이 형질전환된 배형성 현탁 배양을 개시한다. 처음 몇주간은 신선한 배지 1 내지 3 용적을 매주마다 상기 배양물에 가한다. 5 내지 7주후 배양물을 2주마다 배지 50 ㎖당 충전된 세포 용적 2 ㎖로 계대배양시켜 16시간 주/8시간 야의 방식으로 25 ± 0.5 ℃에서 배양시킨다.

카나마이신 선택 배지로 옮긴지 1주후, 루시페린을 배축 절편에 분무하여 루시퍼라제 발현을 형질전환 직후의 형질전환된 유합조직에서 검출할 수 있는지 시험한다. 다수의 배축 절편이 절단 말단에서 루시퍼라제 활성을 나타내지만, 유합조직을 성장시키지 않는다. 대신, 세균 성장이 일어나는데, 이는 루시퍼라제 활성이 세균 기원임을 제시하는 것이다. 형질전환시킨지 6 내지 10주후, 다양한 양에서 루시퍼라제 활성을 나타내지만, 더이상 세균 성장을 관찰할 수 없는 유합조직을 수득한다. 12주후, 직경이 5 내지 10 ㎜로 측정되는 유합조직을 사용하여 현탁 배양을 개시한다. 이때, 세균 오염은 전혀 관찰되지 않는다. CaMV 35S 프로모터의 영향하에서 루시퍼라제를 발현시키는 대조군 형질전환 실험은 단일 세포 및 세포 클러스터가 현탁 배양물중에서 관찰되는데, 이는 루시퍼라제 단백질이 Daucus carota 현탁 배양된 세포중에서 활성임을 입증하는 것이다.

세포 고정화

1주된 고밀도 (10⁶- 10⁷세포/㎖) 현탁 배양물을 연속적으로 300, 125, 50 및 30 ㎛ 기공 크기의 나일론 체 (Monodur-PES; Verseidag Techfab, Walbeck, Germany)에 통과시킨다. 최종 체를 통과하는 단일 세포 및 세포 클러스터를 <30 ㎛ 집단으로 표시한다. 비형질전환 세포에 대한 대조군 실험은 P1-2 배지에서 성장시킨 Daucus carota cv. Trophy (S&G seeds) 현탁 배양물을 사용하여 수행한다. 30㎛ 보다 작은 크기로 분획화된 세포 집단을 페트리펌 디쉬 (Heraeus, Hanau, Germany)중 피타겔 (P8196; Sigma, St. Louis, Mo, USA)에 고정화시킨다. 기저층은 5 mM Ca²⁺및 0.2% 피타겔과 함께 P1-0 배지 1㎖로 이루어져 있다. 0.1% 피타겔이 보충된 Ca²+가 없는 B5-0 배지중 200,000개의 세포 (<30 ㎛ 및 <50 ㎛ 집단)를 기저층 상부에 붓는다. 상기 층의 경우, 실온에서 피타겔이 Ca²⁺이 없는 P1 배지중에서 고화되기 때문에 B5를 적용시킨다. 고화후 2시간이 경과하여, 0.2% 피타겔과 함께 추가의 P1-0 층을 상기 세포층에 부어 B5 층이 이동하는 것을 방지한다. 피타겔 층의 탈수를 방지하고 세포에 루시페린을 공급하기 위하여, 0.05 μM 루시페린 (Promega, Madison, WI, USA)을 함유하는 P1-0 배지 0.5 ㎖를 고화후에 가한다. 배양물중 최종 루시페린 농도는 0.02 μM이다. 단일 세포상에서의 루시페린 검출은 1시간에 5회로 CCD 카메라 (Schmidt et al (1997) Development 124: 2049-2062)로 측정한다. 배양후 7일 경과하여, P1-0 배지로 철저하게 세척하여 배양물로부터 루시페린을 제거한다.

SERK 프로모터 단편/루시퍼라제 유전자 융합물을 사용한 아라비도프시스 형질전환

야생형 WS 식물을 낮이 긴 표준 조건: 16시간 명 및 8시간 암하에서 성장시킨다.

화수를 증가시키기 위하여 1차적으로 출현하는 개화는 제거한다. 5일 경과하여, 진공 침투용으로 준비한다.

형질전환 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 균주 C58C1을 50 ㎎/ℓ 카나마이신, 50 ㎎/ℓ 리팜피신 및 25 ㎎/ℓ 젠타마이신이 보충된 LB 플레이트상에서 성장시킨다. 단일 콜로니를 사용하여 50 ㎎/ℓ 카나마이신, 50 ㎎/ℓ 리팜피신 및 25 ㎎/ℓ 젠타마이신을 함유하는 LB 배지 500 ㎖를 접종시킨다. 상기 배양물을 28 ℃에서 O/N 성장시키고 생성된 로그상 배양물 (OD600 0.8)를 펠릿과 세포로 원심분리시키고 침투 배지 (5% 슈크로오스와 10 ㎕/ℓ 벤질아미노퓨린이 보충된 0.5x MS 배지 (pH 5.7)) 150 ㎖에 재현탁시킨다. 6개의 아라비도프시스 식물의 개화가 침투 현탁액중으로 가라앉으며, 이때 식물의 나머지 부분 (아직 포트에 있음)을 그물망사에 상하로 침투 현탁액과 접촉하는 것을 방지한다.

10분간 50 kPa에서 전체적으로 진공을 건다. 이후 식물을 직접 낮이 긴 표준 조건하에 놓는다. 종자 고정을 완결한후, 종자를 1% 나트륨 하이포클로라이트 침지에 의해 표면 멸균시킨 다음, 멸균수로 철저히 세척하여 0.5xMS 배지 및 80 ㎎/ℓ 카나마이신을 보충시킨 페트리디쉬상에 플레이팅시켜 형질전환된 종자를 선택한다. 낮이 긴 표준 조건 (10,000 룩스)하에서 발아 5일후, 배축의 녹색 (비형질전환 묘종은 황색)으로 형질전환된 종자를 확인하고, 낮이 긴 조건하에 C1 랩 조건하의 토양에서 더 성장시킨다. 상기 진공 침윤법으로 대략 0.1%의 종자가 형질전환된다.

카나마이신 내성을 암호화하는 유전자와 진공 침윤법에 의해 아라비도프시스 탈리아나 (WS) 중으로 개똥벌레 루시퍼라제 유전자에 융합된 2200 bp (HindIII/Dral) SERK 게놈성 DNA를 둘다 함유하는 작제물의 형질전환에의해 6개의 상이한 카나마이신-내성 1차 형질전환체 (I, II, III, IV, V 및 VI)가 생성된다. 식물 IV 및 VI는 카나마이신 내성이지만 이들은 묘종 상태에서 고사시킨다. 4개의 식물 I, II, III 및 V로부터 T2를 발생시킬 수 있다 (도 4). 식물 번호 III 및 V의 T2 발생 장각과내에, 종자의 대략 25 내지 30%에서 성장시 초기 억제가 관찰될 수 있다. 식물 I과 II는 성장하는 종자의 수에 있어서 감소를 나타내지 않는다 (도 5). 종자의 대략 25 내지 50%가 정상적인 종자 성장의 초기 억제를 나타내는, T3 발생에서 유사한 결과가 관찰된다.

AtSERK 유전자를 사용한 아라비도프시스 형질전환

AtSERK 게놈성 및 cDNA 클론의 분리

프로브로서 DcSERK cDNA 서열 (서열 2)를 사용하여, Arabidopsis Landsberg erecta 전체 게놈성 DNA를 형성하는 람다 ZipLox 게놈성 라이브러리를 동족성 서열의 존재에 대해 스크리닝한다. 각각 14, 18 및 20 kb의 삽입물을 갖는 3개의 상이한 람다 클론이 수득된다. 14 kb 클론을 EcoRI로 분해시키고, 생성된 단편을 p블루스크립트 벡터중으로 서브클로닝시킨다. AtSERK 유전자의 전체 암호화 서열을 스패닝시키는 단편을 분리하여, 서열화하고 Daucus 동족체와 비교한다. 생성된 서열을 서열 20으로 나타낸다.

프로브로서 DcSERK cDNA 서열 (서열 2)를 사용하여, 람다 ZAPII cDNA 라이브러리를 동족성 서열의 존재에 대해 선별한다. 4개의 람다 클론을 수득하고, 헬퍼 파아지 분해법을 사용하여 p블루스크립트 벡터중으로 서브클로닝시킨다. AtSERK 유전자의 전체 AtSERK cDNA 암호화 서열을 스패닝시키는 단편을 분리하여, 서열화하고 Daucus 동족체와 비교한다. 생성된 서열을 서열 32로 나타낸다.

프로모터 서열을 함유하는 플라스미드

BamH1 및 HindIII로 분해시켜 p블루스크립트 SK^-(pMT121)중으로 클로닝시킴으로써 바이너리 플라스미드 pUH-1000 (Thoma, S., Hecht, U., Kipper, A., Borella, J., De Vries, S.C., Sommerville, C. (1994) Plant Physiol. 105, 35-45)으로부터 아라비도프시스 탈리아나 LTP1 프로모터 단편을 수득한다.

- -343 내지 -90 영역의 중복에 의해 향상된 CaMV 35S 프로모터 (Kay et al., 1987) Science 236: 1299-1302)를 pMON999 벡터로부터 HindIII 및 Sstl 분해에 의해 분리하여 p블루스크립트 SK^-벡터로 클로닝시킨다 (pMT120).

- 프로모터 AtDMC1 (Klimyuk and Jones (1997) Plant Journal 11: 1-14).

플라스미드 SLJ 9691는 아라비도프시스 탈리아나 DMC1 게놈성 클론 (수탁번호 U76670)이 EcoRV 부위중으로 클로닝되어 있는 p블루스크립트 SK⁺로 이루어져 있는 작제물이다. SLJ 9691는 다음과 같이 변형된 AtDMC1 유전자의 5' 말단의 EcoRV 단편을 포함한다: 제2의 Hpal 부위 대신 BgIII 부위, 제1 엑손중에 2개의 ATG 코돈 및 제2 엑손의 ATG 코돈에 Xhol 부위.

-페튜니아로부터의 FBP7 프로모터 (Angenent et al. (1995) Plant Cell 7: 1569-1582).

FBP7의 0.6 kb HindIII-Xbal 게놈성 DNA 단편을 p블루스크립트 KS^-의 HindIII-Xbal 부위로 서브클로닝에 의해 FBP7 유전자의 프로모터를 클로닝시켜 벡터 FBP201을 생성시킨다.

pAtSERK 바이너리 벡터 작제물.

pBIN 19 벡터를 기본으로 하여, 상이한 프로모터의 조절하에서 아라비도프시스 탈리아나 SERK cDNA의 형질전환용으로 바이너리 벡터 pAtSERK를 작제한다.

p블루스크립트 SK- 플라스미드로부터 SERK의 전장 아라비도프시스 탈리아나 cDNA 클론 (서열 신규)을 수득한다. AtSERK cDNA를 함유하는 Smal-Kpnl 2.1 kb 단편을 pBIN19 Smal-Kpnl중으로 클로닝시킨다. 클레나우-충전된 EcoRI-HindIII E9 DNA 단편을 pBIN19:AtSERK 벡터의 클레나우-충전된 Xmal 부위로 클로닝시켜 바이너리 벡터 pAtSERK를 발생시킴으로써 완두 rbcS::E9 유전자 (Millar et al., 1992)로부터의 폴리아데닐화 서열을 AtSERK cDNA로부터 하부에 놓는다.

식물 발현 벡터의 작제

pAtSERK 바이너리 벡터를 사용하여 다음 프로모터-AtSERK 작제물을 발생시킨다.

- 클레나우-충전된 Kpnl-Sstl DNA 단편으로서 pAtSERK 바이너리 벡터의 Smal 부위중에 AtLTP1 프로모터를 클로닝시켜 pAtLTP1-AtSERK 벡터를 수득한다.

- 클레나우-충전된 Kpnl-Sstl 단편으로서 pAtSERK 바이너리 벡터의 Smal 부위중으로 CaMV 35S 프로모터를 클로닝시켜 p35SAtSERK 벡터를 수득한다.

- 클론 SLJ9691로부터의 BgIII-Xhol 3.3 kB 단편으로 이루어진 AtDMC1 프로모터를 클레나우로 충전시키고, pAtSERK 바이너리 벡터의 Smal 부위중으로 클로닝시켜 pAtDMC1AtSERK 벡터를 수득한다.

- FBP2101의 Sacl-Kpnl 단편을 클레나우로 충전시키고, pAtSERK 바이너리 벡터의 Smal 부위중으로 클로닝시켜 pFBP2101AtSERK 벡터를 수득한다.

아라비도프시스 탈리아나 식물 세포중으로 식물 발현 세포의 도입

상기한 벡터 작제물 (pAtLTP1AtSERK, p35SAtSERK, pAtDMC1AtSERK, pFBP2101AtSERK)을 당해 분야에 공지된 바와 같이 아그로박테리움 투미파시엔스 균주 C58C1중으로 전자형질전환시킨다.

야생형 아라비도프시스 탈리아나 WS 식물을 낮이 긴 표준 조건: 16시간 명, 8시간 암하에서 성장시킨다.

개화수를 증가시키기 위하여 1차로 출현하는 개화는 제거한다. 5일 경과후, 식물을 진공 침투용으로 준비한다. 형질전환 플라스미드 (pAtLTP1AtSERK 벡터 또는 p35SAtSERK 벡터 또는 pAtDMC1AtSERK 벡터 또는 pFBP2101AtSERK 벡터)를 함유하는 아그로박테리움 균주 C58C1을 50 ㎎/ℓ 카나마이신, 50 ㎎/ℓ 리팜피신 및 25 ㎎/ℓ 젠타마이신이 함유되어 있는 LB 플레이트상에서 성장시킨다. 단일 콜로니를 사용하여 50 ㎎/ℓ 카나마이신, 50 ㎎/ℓ 리팜피신 및 25 ㎎/ℓ 젠타마이신을 함유하는 LB 배지 500 ㎖를 접종시킨다. 상기 배양물을 O/N 28 ℃에서 성장시키고, 생성된 로그상 배양물 (OD600 0.8)을 세포가 펠릿화되도록 원심분리시키고, 침투 배지 (5% 슈크로오스와 1 ㎎/ℓ 벤질아미노퓨린이 보충된 0.5x MS 배지 (pH 5.7)) 150 ㎖중에 재현탁시킨다. 6개의 아라비도프시스 식물의 개화가 침투 현탁액중으로 가라앉는데, 이때 식물의 나머지 부분 (이는 아직 포트에 있슴)은 침투 현탁액과의 접촉을 피하기 위하여 그물망사의 상하로 놓는다.

10분간 50 kPa로 고정하여 진공을 전체적으로 적용한다. 이후 식물을 낮이 긴 표준 조건하에서 직접 놓는다. 종자 셋팅 완결후 종자를 1% 나트륨 하이포클로라이트 침지에 의해 표준 멸균시킨 다음, 멸균수로 철저히 세척하고, 0.5xMS 배지와 80 ㎎/ℓ 카나마이신이 있는 페트리디쉬상에 플레이팅하여 형질전환된 종자를 선택한다. 낮이 긴 표준 조건 (10,000 룩스)하에서 발아한지 5일 경과하여, 형질전환된 묘목은 이들의 배축의 녹색으로 확인할 수 있으며 (비형질전환 묘목은 황색임), 낮이 긴 표준 조건하에 토양에서 추가로 성장시킨다. 상기 진공 침투법으로 대략 0.1%의 형질전환된 종자가 생성된다.

아라비도프시스 탈리아나 식물 세포중에서 SERK 서열의 발현

유전자이식 및 비-유전자이식 아라비도프시스 탈리아나 식물로부터의 개화는 프로브로서 AtSERK cDNA로 홀 마운트 동일계 하이브리드화 분석에 의해 분석한다. 상이한 성장 단계에서의 개화를 70 mM EGTA, 4% 파라포름알데히드, 0.25% 글루타르알데히드, 0.1% Tween 20, 및 10% DMSO를 함유하는 PBS중에 60분간 고정시킨다. 이어서 샘플을 세척하고, 프로테이나제 K로 10분간 처리하여 세척하고, 2차로 고정시킨다. 하이브리드화 용액은 0.1% Tween 20, 330 mM NaCl, 50 ㎎/㎖ 헤파린, 및 50% 탈이온화 포름아미드를 함유하는 PBS로 이루어져 있다. 하이브리드화는 디곡시제닌-표지된 감작 또는 항감작 리보프로브 (Boehringer Mannheim)를 사용하여 42 ℃에서 16시간 동안 수행한다. 세척후, 세포를 RNaseA로 처리하고, 식물 단백질 추출물로 미리 흡수시킨 항-디곡시제닌-알칼리성 포스파타제 접합체 (Boehringer Manheim)와 배양시킨다. 세척하여 과량의 항체를 제거한 다음 염색 완충액 (100 mM Tris-HCl pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM 레바미졸)중에서 세정하고, 염색 반응을 NBT 및 BCIP를 함유하는 완충액중에서 16시간 동안 수행한다. Nomarski 광학기가 장착되어 있는 Nikon Optiphot 현미경으로 관찰한다.

형질전환된 식물은 배낭의 간극에서 SERK의 장소외 발현을 나타낸다.

(1) 일반 정보

(i) 출원인 :

(A) 성명 : 노바티스 아게

(B) 거리 : 슈바르츠발트알레 215

(C) 도시 : 바젤

(E) 국가 : 스위스

(F) 우편 번호 : 4058

(G) 전화 번호 : +41 61 69 11 11

(H) 텔리 팩스 : +41 61 696 79 76

(I) 텔렉스 : 962 991

(ii) 발명의 명칭 : 유기 화합물에서의 개선 또는 이에 관한 개선

(iii) 서열 수 : 33

(iv) 컴퓨터 판독 형태 :

(A) 매체 형태 : 플로피 디스크

(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환

(C) 운영 체계 : PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.25(EPO)

(2) 서열 1에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 6695개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 이본쇄

(D) 위상 : 비공지

(ii) 분자 유형 : DNA(게놈성)

(iii) 가설 : 없음

(iii) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 다우쿠스 카로타(Daucus carota)

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : CDS

(B) 위치 : 3696..6617

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : 인트론

(B) 위치 : 3731..3802

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : 인트론

(B) 위치 : 3851..3979

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : 인트론

(B) 위치 : 4124..4211

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : 인트론

(B) 위치 : 4284..4357

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : 인트론

(B) 위치 : 4430..4528

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : 인트론

(B) 위치 : 4642..4757

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : 인트론

(B) 위치 : 4890..4967

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : 인트론

(B) 위치 : 5295..5803

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : 인트론

(B) 위치 : 6197..6339

(xi) 서열 1에 대한 기술:

(2) 서열 2에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 1815개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 비공지

(ii) 분자 유형 : cDNA

(iii) 가설 : 없음

(iii) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 다우쿠스 카로타(Daucus carota)

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : CDS

(B) 위치 : 94..1752

(xi) 서열 2에 대한 기술:

(2) 서열 3에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 553개 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 유형 : 단백질

(xi) 서열 3에 대한 기술:

(2) 서열 4에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 13개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 비공지

(iii) 가설 : 없음

(iii) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 프라이머

(xi) 서열 4에 대한 기술:

(2) 서열 5에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 10개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 비공지

(iii) 가설 : 없음

(iii) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 프라이머

(xi) 서열 5에 대한 기술:

(2) 서열 6에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 10개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 비공지

(iii) 가설 : 없음

(iii) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 프라이머

(xi) 서열 6에 대한 기술:

(2) 서열 7에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 10개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 비공지

(iii) 가설 : 없음

(iii) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 프라이머

(xi) 서열 7에 대한 기술:

(2) 서열 8에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 14개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 비공지

(iii) 가설 : 없음

(iii) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 프라이머

(xi) 서열 8에 대한 기술:

(2) 서열 9에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 13개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 비공지

(iii) 가설 : 없음

(iii) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 프라이머

(xi) 서열 9에 대한 기술:

(2) 서열 10에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 10개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 비공지

(iii) 가설 : 없음

(iii) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 프라이머

(xi) 서열 10에 대한 기술:

(2) 서열 11에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 10개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 비공지

(iii) 가설 : 없음

(iii) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 프라이머

(xi) 서열 11에 대한 기술:

(2) 서열 12에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 10개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 비공지

(iii) 가설 : 없음

(iii) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 프라이머

(xi) 서열 12에 대한 기술:

(2) 서열 13에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 10개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 비공지

(iii) 가설 : 없음

(iii) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 프라이머

(xi) 서열 13에 대한 기술:

(2) 서열 14에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 18개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 비공지

(iii) 가설 : 없음

(iii) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 프라이머

(xi) 서열 14에 대한 기술:

(2) 서열 15에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 19개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 비공지

(iii) 가설 : 없음

(iii) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 프라이머

(xi) 서열 15에 대한 기술:

(2) 서열 16에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 16개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 비공지

(iii) 가설 : 없음

(iii) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 프라이머

(xi) 서열 16에 대한 기술:

(2) 서열 17에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 5개 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 비공지

(ii) 분자 유형 : 펩타이드

(iii) 가설 : 없음

(iii) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 다우쿠스 카로타(Daucus carota)

(xi) 서열 17에 대한 기술:

(2) 서열 18에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 8개 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 비공지

(ii) 분자 유형 : 펩타이드

(iii) 가설 : 없음

(iii) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 다우쿠스 카로타(Daucus carota)

(xi) 서열 18에 대한 기술:

(2) 서열 19에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 9개 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 비공지

(ii) 분자 유형 : 펩타이드

(iii) 가설 : 없음

(iii) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 다우쿠스 카로타(Daucus carota)

(xi) 서열 19에 대한 기술:

(2) 서열 20에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 4081개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 이본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 유형 : DNA(게놈성)

(iii) 가설 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)

(vii) 중간체 공급원 :

(B) 클론 : 아라비도프시스 SERK 유전자

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : 엑손

(B) 위치 : 1280..1367

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : 엑손

(B) 위치 : 1796..1928

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : 엑손

(B) 위치 : 2014..2085

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : 엑손

(B) 위치 : 2203..2346

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : 엑손

(B) 위치 : 2450..2521

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : 엑손

(B) 위치 : 2617..2688

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : 엑손

(B) 위치 : 2772..2884

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : 엑손

(B) 위치 : 3015..3146

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : 엑손

(B) 위치 : 3305..3646

(ix) 특성 :

(A) 명칭/키 : 엑손

(B) 위치 : 3760..4081

(xi) 서열 20에 대한 기술:

(2) 서열 21에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 494개 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 쇄의 수 : 비공지

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 유형 : 단백질

(iii) 가설 : 없음

(v) 단편 유형 : N-말단

(xi) 서열 21에 대한 기술:

(2) 서열 22에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 1106개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 유형 : cDNA 또는 mRNA

(iii) 가설 : 없음

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : CDS

(B) 위치 : 142..795

(xi) 서열 22에 대한 기술:

(2) 서열 23에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 218개 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 유형 : 단백질

(xi) 서열 23에 대한 기술:

(2) 서열 24에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 981개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 유형 : cDNA 또는 mRNA

(iii) 가설 : 없음

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : CDS

(B) 위치 : 104..757

(xi) 서열 24에 대한 기술:

(2) 서열 25에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 218개 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 유형 : 단백질

(xi) 서열 25에 대한 기술:

(2) 서열 26에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 789개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 유형 : cDNA 또는 mRNA

(iii) 가설 : 없음

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : CDS

(B) 위치 : 2..661

(xi) 서열 26에 대한 기술:

(2) 서열 27에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 220개 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 쇄의 수 : 선형

(ii) 분자 유형 : 단백질

(xi) 서열 27에 대한 기술:

(2) 서열 28에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 894개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 유형 : cDNA 또는 mRNA

(iii) 가설 : 없음

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : CDS

(B) 위치 : 1..675

(xi) 서열 28에 대한 기술:

(2) 서열 29에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 225개 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 유형 : 단백질

(xi) 서열 29에 대한 기술:

(2) 서열 30에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 1063개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 일본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 유형 : cDNA 또는 mRNA

(iii) 가설 : 없음

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : CDS

(B) 위치 : 106..759

(xi) 서열 30에 대한 기술:

(2) 서열 31에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 218개 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 유형 : 단백질

(xi) 서열 31에 대한 기술:

(2) 서열 32에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 2089개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 이본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 유형 : cDNA 또는 mRNA

(iii) 가설 : 없음

(iii) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초 공급원 :

(A) 생물 : 아라비도프시스 탈리아나

(vii) 중간체 공급원 :

(B) 클론 : SERK 유전자 cDNA

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : CDS

(B) 위치 : 195..2069

(xi) 서열 32에 대한 기술:

(2) 서열 33에 대한 정보

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 625개 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 유형 : 단백질

(xi) 서열 33에 대한 기술:

<참고문헌>

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종자를 통한 식물 (비-유성) 번식방법인 무성생식은 일부 배수체 비-재배종에서 발견되는 유전적으로 조절된 번식 메카니즘이다. 상기 공정은 배우체성 또는 비-배우체성으로 분류된다. 배우체성 무성 번식에는 2가지 타입 (무포자 생식 및 2배체 포자형성)이 있는데, 전형적으로 반족세포 핵이 결여되어 있는 다중 배낭이 형성되거나, 배낭에서 대포자형성이 일어난다. 부정배 형성 (비-배우체성 무성생식)에 있어서, 배낭, 자방벽 또는 외피의 세포로부터 직접 체세포 배가 성장한다. 부정배 형성에서, 둘러싸는 세포로부터의 체세포 배는 유성 난소를 침범하고, 체세포 배중 하나는 다른 체세포 배와 유성 배를 경쟁하여 생산된 배유를 이용한다.

무성생식이 조절가능하고 재현가능한 현상이라면 식물 개량과 재배종 개발에 있어서 수많은 잇점이 제공되며 이 경우 유성 식물을 무성생식 식물과의 교배체로서 입수할 수 있다.

예를들면, 무성생식은 종자 보급 하이브리드에 순수한-육종을 제공한다. 또한, 무성생식은 육종 과정을 단축시키고 단순화시켜 목적하는 유전자 조합을 생산하고(하거나) 안정화시키는지에 대한 자가 및 자손 시험을 생략할 수 있도록 한다. 무성생식은 무성생식 유전자형이 이형접합성과는 상관없이 진짜로 육종되기 때문에 독특한 유전자 조합을 갖는 유전자형의 재배종으로서의 용도를 제공한다. 따라서, 유전자 또는 유전자군이 슈퍼 유전자형으로 "피라미드화"되어 "고정"될 수 있다. 유성-무성생식 교배로부터의 우수한 무성생식 유전자형은 모두 재배종으로서의 잠재성을 갖는다. 무성생식은 식물 육종업자들이 높이, 종자 및 사료 품질 및 성숙도와 같은 특성에 대해 특히 안정한 성질을 갖는 재배종을 개발할 수 있도록한다. 육종업자들은 (i) 웅성 불임된 자성 모체를 생산하기 위한 세포질-핵 상호반응 또는 (ii) 수분체의 생식능 보존능력에 의한 하이브리드의 상업적 생산으로 제한되지는 않는다. 거의 모든 교배-적합성 생식질은 무성생식 하이브리드를 생산하기 위한 잠재적 모체일 수 있다.

최종적으로, 무성생식은 상업적인 하이브리드 종자 생산을 단순화시킨다. 특히, (i) 상업적인 하이브리드 생산 포장을 물리적으로 격리시킬 필요가 없으며; (ii) 모든 이용가능한 경작지를 이용하여 수분체와 웅성 불임주간의 공간을 분리하는 대신 하이브리드 종자를 증가시킬 수 있고; (iii) 모주 종자 스톡을 유지할 필요가 없도록 한다.

무성생식을 통한 종자의 생산으로부터 발생될 수 있는 잇점은 대상이 되는 식물중으로 무성생식능을 조작시키는 문제때문에 현재 큰 정도로 현실화되어 있지 않다. 본 발명은 부정배 형성 타입의 무성생식을 나타내는 식물을 수득하기 위한 방법을 제공하여 상기 문제점에 대한 해결책을 제공한다.

본 발명에 따라서

(i) 활성형으로 세포, 또는 이들의 막중에 존재시 세포를 배형성이 되도록 하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 식물질을 형질전환시키는 단계;

(ii) 상기 형질전환된 물질을 식물, 또는 이들의 암술잎-함유 부분으로 재생시키는 단계; 및

(iii) 배낭의 간극에서 상기 서열을 발현시키는 단계를 포함하는 무성생식 종자의 생산 방법이 제공된다.

"배낭의 간극"이란 다음중 하나 이상을 의미한다: 심피, 외피, 배주, 배주 프리모르듐, 자방벽, 합점, 핵, 배주병 및 태좌. 숙련가들은 용어 "외피"가 또한 이로부터 유래된 내피와 같은 조직을 포함함을 인지할 것이다. "배형성"이란 투과성 조건하에서 배로 성장할 수 있는 세포의 능력을 의미한다. 용어 "활성형으로"란 절단되거나 달리 이들이 정상적으로 존재하는 조직중에서 이들이 달리 작용하도록 하는 시그날 형질도입 성분과 상호반응하든지 아니든지 간에 이들이 배형성을 개시하거나 증폭시키는 단백질인 한 이들을 포함하는 것으로 이해된다.

용어 "식물질 (plant material)"은 원형질체, 세포벽을 갖는 분리된 식물 세포 (기공 가드 세포와 같은), 화분, 생겨난 작은 뿌리, 줄기, 잎, 화판, 어린 줄기부, 정상의 분열조직, 씨방, 접합체형 배 자체, 뿌리, 맥관 다발, 내초, 약초, 체세포 배 등과 같은 전체 조직을 포함한다.

본 발명의 다른 양태는 세포, 또는 이들의 막중에 활성형으로 존재시 상기 세포를 배형성이 되도록 하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자에 관한 것이다.

상기 뉴클레오티드 서열은 식물질중으로, 특히 세균성 또는 바이러스성 벡터를 통하여, 미세-주입법, 고분자량 글리콜의 존재하에서 식물질과 서열의 동시-배양 또는 식물질중으로 도입될 생물학적으로 불활성인 입자의 표면상에 상기 서열을 피복시켜 도입시킬 수 있다.

서열의 발현으로 식물 세포막을 스패닝시킬 수 있는 단백질 키나제를 생산할 수 있다. 전형적으로, 키나제는 자가-포스포릴화시킬 수 있는 능력을 갖는 류신 풍부 반복단위 수용체 유사 키나제일 수 있다. 숙련가들은 용어 "류신 풍부 반복단위 수용체 유사 키나제"가 무엇을 의미하는지 알 것이다. 상기와 같은 단백질의 예로는 아라비도프시스 RLK5 (Walker, 1993), 아라비도프시스 RPS2 (Bent et al. 1994), 토마토 CF-9 유전자 생성물 (Jones et al. 1994), 토마토 N (Whitham et al. 1994), 페튜니아 PRK1 (Mu et al. 1994), 드로소필라 톨 유전자의 생성물 (Hashimoto et al. 1988), 벼 OsPK10 유전자에 의해 암호화된 단백질 키나제 (Zhao et al. 1994), 벼 EST 클론 ric2976의 해독 생성물 및 드로소필라 펠레 유전자의 생성물 (Shelton and Wasserman, 1993)이 있다. 상기와 같은 단백질의 다른 예로는 TMK1, 클라바탈 (Clavatal), 에렉타 (Erecta), 및 아라비도프시스로부터의 TMKL1 유전자 생성물, 드로소필라로부터의 플라이트레스-1 유전자 생성물, 돼지로부터의 TrkC 유전자 생성물, 래트 LhCG 수용체 및 FSH 수용체, 개의 TSH 수용체, 및 사람의 Trk 수용체 키나제가 있다. 상기 단백질은 리간드 결합 도메인, 프롤린 박스, 트랜스막 도메인, 키나제 도메인 및 단백질 결합 도메인을 포함할 수 있다. 수많은 수용체 키나제에서 세포외 (리간드 결합) 도메인은 리간드-유리 상태에서 키나제 도메인의 억제제로서 작용한다. 이런 억제는 리간드의 결합후 제거된다. 따라서, 본 발명의 하나의 양태로 상기 단백질은 리간드 결합 도메인이 결여되거나 기능적으로 불활성화되어 키나제 도메인이 활성화 시그날 (리간드)의 부재시 구조적으로 활성적일 수 있도록 한다. 단백질이 리간드 결합 도메인-또는 달리 기능을 갖든지 간에, 일단 발현되어 식물 세포막중으로 혼입되면 상기 단백질 결합 도메인이 세포내에 위치하는 것이 바람직하다.

본 방법의 바람직한 양태로, 상기 서열은 또한 세포막 표적화 서열을 암호화한다. 상기 서열은 서열 1, 2, 20 또는 32에 나타낸 것일 수 있거나, 엄격한 조건하에서 상기 서열과 하이브리드화되며 키나제 활성을 갖는 막 결합 단백질을 암호화하는 서열에 대해 상보적인 것과 유사할 수 있다. "유사한"이란 본 발명의 서열에 하이브리드화될 수 있는 시험 서열에 대해 상보적인 서열을 의미한다. 시험 서열과 본 발명의 서열이 이본쇄인 경우, 시험 서열을 구성하는 핵산의 TM은 본 발명의 서열의 TM의 20 ℃ 내인 것이 바람직하다. 시험 서열과 본 발명의 서열을 함께 혼합하여 동시에 변성시킬 경우, 서열의 TM 수치가 서로 10 ℃ 이내인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 하이브리드화를 엄격한 조건하에서 시험 또는 본 발명의 DNA (바람직하게는 지지된 것)로 수행한다. 따라서, 변성된 시험 또는 본 발명의 서열은 먼저 지지체에 결합시키고, 특정한 기간 동안 50 내지 70 ℃의 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 2배 농도의 시트레이트 완충 염수 (SSC)중에서 하이브리드화를 수행한 다음 동일한 온도에서 SSC 농도를 감소시킨 완충액으로 지지체를 세정하는 것이 바람직하다. 요구되는 엄격성의 정도에 따라 및 서열의 유사성 정도에 따라서, 특정 온도, 예를들면 60 ℃에서, 예를들어 감소된 농도의 완충액은 전형적으로 0.1% SDS를 함유하는 단일 농도 SSC, 0.1% SDS를 함유하는 절반 농도 SSC 및 0.1% SDS를 함유하는 1/10 농도이다. 유사성 정도가 가장 큰 서열은 감소된 농도의 완충액중에서 세척에 의해 하이브리드화가 영향을 받지 않는 것이다. 시험 서열과 본 발명의 서열은 이들간의 하이브리드화가 0.1% SDS를 함유하는 1/10 농도의 나트륨 시트레이트 완충액중에서의 세척 또는 배양에 의해 거의 영향을 받지않을 정도로 유사한 것이 가장 바람직하다.

따라서, 본 발명은 또한 서열 22, 24, 26, 28 및 30에 나타낸 바와 같은 DNA 서열 또는 상기 서열과 엄격한 조건하에서 하이브리드화되고 키나제 활성을 갖는 막 결합 단백질을 암호화하는 것에 대해 상보적인 서열을 포함한다.

상기 서열은 공지된 mRNA 불안정성 모티프 또는 폴리아데닐화 시그날을 제거할 수 있고(있거나) 서열이 삽입될 식물에 의해 우선되는 코돈을 상기 변형된 서열의 상기 식물중에서의 발현으로 단백질이 내인성인 유기체중에서 비변형된 서열의 발현에 의해 수득되는 것과 실질적으로 유사한 단백질을 수득할 수 있도록 사용할 수 있게 변형시킬 수 있다.

조직 특이적 방법으로 재생된 식물 (및 특히 이들의 심피)에서 상기 서열을 발현시키기 위해서는 상기 서열이 전형적으로 다음중 하나일 수 있는, 유도성 또는 성장적으로 조절되는 프로모터의 발현 조절하에 있는 것이 바람직하다: 플란타 중의 SERK 유전자의 발현을 조절하는 프로모터, 아라비도프시스 ANT 유전자 프로모터, 팔래노프시스로부터의 O126 유전자의 프로모터, 캐로트 키티나제 DcEP3-1 유전자 프로모터, 아라비도프시스 AtChitlV 유전자 프로모터, 아라비도프시스 LTP-1 유전자 프로모터, 아라비도프시스 bel-1 유전자 프로모터, 페튜니아 fbp-7 유전자 프로모터, 아라비도프시스 AtDMC1 프로모터, pTA7001 유도성 프로모터. DcEP3-1 유전자는 일시적으로 내부 외피 분해중에 발현되고 이후 성장하는 배유의 내부 일부 라인인 세포중에서 발현된다. AtChilV 유전자는 일시적으로 주공 배유중에서 셀룰라화까지 발현된다. LTP-1 프로모터는 성장하는 핵의 표피, 외피, 종피 피막 및 초기 배에서 활성이다. bel-1 유전자는 성장하는 내부 외피에서 발현되고, fbp-7 프로모터는 배낭 성장중에 활성적이다. 아라비도프시스 ANT 유전자는 외피 성장중에 발현되고, 팔래노프시스로부터의 O126 유전자는 성숙 배주에서 발현된다.

상기 서열이 배낭, 자방벽, 핵 또는 외피의 체세포에서 발현되는 것이 가장 바람직하다.

무성생식 종자내의 배유는 배낭내의 극성 핵과 화분-유래 웅성 배우체 핵과의 융합으로부터 발생한다. 상기 단백질을 암호화하는 서열이 극성 핵과 웅성 배우체 핵과의 융합전에 발현되는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 세포 또는 이들의 막중에 활성형으로 존재시 상기 세포를 배형성이 되도록 하는 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 DNA, 바람직하게는 재조합 DNA를 포함한다. 류신 풍부 반복단위 수용체 유사 키나제이고 리간드 결합 도메인, 프롤린 박스, 트랜스막 도메인, 키나제 도메인 및 단백질 결합 도메인을 포함하며 리간드 결합 도메인이 임의로 부재하거나 기능적으로 불활성인 단백질을 암호화하는 DNA가 바람직하다.

특히, 본 발명은 다음 아미노산 서열을 갖는 N-말단 단백질 단편을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA에 관한 것이다: Gln Ser Trp Asp Pro Thr Leu Val Asn Pro Cys Thr Trp Phe His Val Thr Cys Asn.

본 발명의 특정 양태는 서열 3 또는 21에 나타낸 서열을 갖는 단백질, 또는 막 결합될 수 있으며 키나제 활성을 갖는 것과 실질적으로 유사한 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA에 관한 것이다. "실질적으로 유사한"이란 하기 서열 3에 나타낸 단백질의 서열과 90% 이상이 유사한 아미노산 서열을 갖는 순수한 단백질을 의미한다. 본 발명의 명세서에서, 서로 90% 이상 유사한 2개의 아미노산은 90% 이상 동일하거나 8개 이하의 갭에 대해서 최적으로 허용되도록 배열시 유사한 위치에서 보존적으로 대체된 아미노산 잔기를 갖는데, 단 각각의 갭에 대해서 영향을 받는 아미노산 잔기는 총 4개 미만이어야 한다. 본 발명의 상기 목적의 경우, 다음 그룹내에서의 아미노산간에 보존적으로 대체될 수 있다:

(i) 세린과 트레오닌;

(ii) 글루탐산과 아스파르트산;

(iii) 아르기닌과 리신;

(iv) 아스파라긴과 글루타민;

(v) 이소류신, 류신, 발린과 메티오닌;

(vi) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판;

(vii) 알라닌과 글리신.

또한, 비-보존적 치환은 낮은 빈도로 일어날 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 다음 아미노산 서열을 갖는 N-말단 단백질 단편을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA에 관한 것이다: Val Xaa Gln Ser Trp Asp Pro Thr Leu Val Asn Pro Cys Thr Trp Phe His Val Thr Cys Asn (여기서 Xaa는 가변성 아미노산이나 바람직하게는 Leu 또는 Val임).

본 발명의 범주내에서 특히 바람직한 것은 다음 아미노산 서열을 갖는 N-말단 단백질 단편을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA이다:

Val Xaa Gln Ser Trp Asp Pro Thr Leu Val Asn Pro Cys Thr Trp Phe His Val Thr Cys Asn Xab Xac Xad Xae Val Xaf Arg Val Asp Leu Gly Asn Xag Xah Leu Ser Gly His Leu Xai Pro Glu Leu Gly Xaj Leu Xak Xal Leu Gln.

상기 아미노산 서열중 Xaa 내지 Xak는 가변성 아미노산이나, 바람직하게는 다음과 같다:

Xaa = Leu 또는 Val

Xab = Asn 또는 Gln

Xac = Glu 또는 Asp 또는 His

Xad = Asn 또는 His

Xae = Ser 또는 Arg 또는 Gln

Xaf = Ile 또는 Thr

Xag = Ala 또는 Ser

Xah = Glu 또는 Asn

Xai = Val 또는 Ala

Xaj = Val 또는 Lys

Xak = Lys 또는 Glu

Xal = Asn 또는 His.

상기 DNA는 또한 세포막 표적화 서열을 암호화하고, 단백질 암호화 영역은 예를들어 플란타중에서 SERK 유전자의 발현을 조절하는 프로모터, 캐로트 키티나제 DcEP3-1 유전자 프로모터, 아라비도프시스 AtChitlV 유전자 프로모터, 아라비도프시스 LTP-1 유전자 프로모터, 아라비도프시스 bel-1 유전자 프로모터, 페튜니아 fbp-7 유전자 프로모터, 아라비도프시스 ANT 유전자 프로모터, 또는 팔래노프시스로부터의 O126 유전자 프로모터; 아라비도프시스 AtDMC1 프로모터, 또는 pTA7001 유도성 프로모터와 같은, 성장적으로 조절되거나 유도성인 프로모터의 발현 조절하에 있는 것이 바람직하다.

상기 DNA의 특히 바람직한 양태는 서열 1, 2, 20 또는 32에 나타낸 것 또는 상기 서열과 엄격한 조건하에서 하이브리드화되는 것에 대해 상보적이며 키티나제 활성을 갖는 막 결합된 단백질을 암호화하는 것이다. 상기 나타낸 바와 같이, 상기 DNA는 공지된 mRNA 불안정성 모티프 또는 폴리아데닐화 시그날을 제거할 수 있고(있거나) DNA가 삽입될 식물에 의해 우선되는 코돈을 상기 변형된 DNA의 상기 식물중에서의 발현으로 단백질이 내인성인 유기체중에서 비변형된 DNA의 발현에 의해 수득되는 것과 실질적으로 유사한 단백질을 수득할 수 있도록 사용할 수 있게 변형시킬 수 있다.

본 발명은 또한 상기 3개의 선행 문구에 나타낸 바와 같은 DNA를 함유하는 벡터, 재조합 DNA 또는 벡터로 형질전환시킨 식물, 및 안정하게 혼입된 상기 DNA를 함유하는 상기 식물의 자손 및(또는) 상기 식물 또는 자손의 무성생식 종자를 포함한다.

본 발명의 재조합 DNA 분자는 수많은 인지된 기술적 방법으로 식물 세포중으로 도입시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 방법의 선택이 식물의 종류, 즉, 형질전환용으로 표적화된 단자엽 또는 쌍자엽 식물에 따라 이루어질 수 있슴을 알 것이다. 식물 세포의 적합한 형질전환 방법으로는 미세주사법 (Crossway et al., BioTechniques 4:320-334 (1986)), 전기천공 (electroporation: Riggs et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606 (1986)), 아그로박테리움 매개된 형질전환법 (Hinchee et al., Biotechnology 6:915-921 (1988)), 직접적인 유전자 전달법 (Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717-2722 (1984)), 위스콘신주 매디슨 소재의 Agracetus, Inc. 및 델라웨어주 윌밍톤 소재의 Dupont, Inc.로부터 입수가능한 장치를 사용한 탄소 입자 가속법 (참조: Stanford et al. 미국특허 제4,945,050호; 및 McCabe et al., Biotechnology 6:923-926 (1988)), 및 원형질체 형질전환/재생법 (참조: 1994년 9월 27일자로 Ciba-Geigy Corp.에게 허여된 미국 특허 제5,350,689호. 또한, 다음 문헌을 참고한다: Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22:421-477 (1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5:27-37 (1987) (양파); Christou et al., Plant Physiol. 87:671-674 (1988) (대두); McCabe et al., Bio/Technology 6:923-926 (1988) (대두); Datta et al., Bio/Technology 8:736-740 (1990) (벼); Klein et al., Proc. Natl. Sci. USA, 85:4305-4309 (1988) (옥수수); Klein et al., Bio/Technology 6:559-563 (1988) (옥수수); Klein et al., Plant Physiol. 91:440-444 (1988) (옥수수); Fromm et al., Bio/Technology 8:833-839 (1990); 및 Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-619 (1990) (옥수수).

본 발명의 범주내에는 유전자이식 식물, 특히 상기한 방법으로 형질전환시킨 유전자이식 생식성 식물 및 안정하게 혼입된 DNA를 함유하는, 이들의 무유성 및(또는) 유성적 자손 및(또는) 상기와 같은 식물 또는 자손의 무성생식 종자가 포함된다.

본 발명에 따르는 유전자이식 식물은 쌍떡잎 또는 외떡잎 식물일 수 있다. 상기와 같은 식물로는 포장 작물, 야채류 및 과일류로서 토마토, 후추, 멜론, 레튜스, 콜리플라워, 브로콜리, 양배추, 브뤼셀 스프라우트, 사탕무, 옥수수, 스위트콘, 양파, 당근, 리크, 오이, 담배, 알파파, 가지, 무우, 잠두, 셀러리, 치커리, 동부, 꽃상추, 호리병박, 땅콩, 파파야, 완두, 피너트, 파인애플, 감자, 잇꽃, 강낭콩, 대두, 시금치, 호박, 해바라기, 사탕수수, 수박 등; 및 관상 작물로서 봉선화, 베고니아, 페튜니아, 펠라르고늄, 비올라, 시클라멘, 베르베나, 빙카, 타게트, 프리뮬라, 세인트 폴리아, 아거라튬, 아마란투스, 안티륨, 아퀼레지아, 크리스안테뮴, 시네라리아, 클로버, 코스모스, 카우피, 달리아, 다투라, 델피늄, 게베라, 글라디올러스, 글로시니아, 히피스트럼, 메셈브리안테뮴, 살피클로시스, 지니아 등이 있다. 바람직한 양태로, 본 발명의 DNA는 옥수수, 스위트 콘 및 완두 등과 같은 "종자 작물"에서 발현에 의해 발생된 무성생식 종자가 물리적으로 돌연변이되지 않거나 달리 작물과 같은 비형질전환된 작물의 종자와 비교하여 손상되지 않는 방법으로 발현되는 것이다. Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale 및 Setaria 식물을 포함한 Graminaceae 족의 외떡잎 식물이 바람직하다.

유전자이식 옥수수, 밀, 보리, 사탕수수, 라이, 오트, 잔디 및 사료 작물, 기장 및 벼가 더욱 바람직하다. 옥수수, 밀, 사탕수수, 라이, 오트, 잔디 및 벼가 특히 바람직하다.

쌍떡잎 식물중에서 아라비도프시스, 대두, 면화, 사탕무, 당밀, 유종자 평지, 담배 및 해바라기가 더욱 바람직하다. 대두, 면화, 담배, 사탕무 및 유종자 평지가 특히 바람직하다.

표현 "자손"은 유전자이식 식물의 "무성적" 및 "유성적" 발생된 자손을 둘다 포함하는 것으로 이해된다. 상기 정의는 또한 예를들어, 세포 융합 또는 돌연변이체 선별과 같은 공지된 방법으로 수득할 수 있으며, 초기 형질전환된 식물의 특징적인 특성을 나타내는 모든 돌연변이체 및 변이체와 함께, 형질전환된 식물질의 모든 교배 및 융합 생성물을 포함함을 의미한다. 이는 또한 상기 자손 식물이 본 발명에 따르는 DNA를 함유하는 한, 역교배로부터 생성된 자손 식물을 포함한다.

본 발명의 다른 목적은 유전자이식 식물의 증식물에 관한 것이다.

유전자이식 식물의 증식물은 생체내 또는 시험관내에서 유성적으로 또는 무성적으로 보급될 수 있는 식물질로서 본 발명에 대해 정의된다. 본 발명의 범주내에서 특히 바람직한 것은 유전자이식 식물로부터 수득한 다른 보급물과 함께, 원형질체, 세포, 칼리, 조직, 기관, 종자, 배, 화분, 난세포, 접합체이다.

본 발명의 방법으로 미리 형질전환시켜 유전자이식 세포의 적어도 일부분으로 이루어진 유전자이식 식물 또는 이들의 자손에서 기원하는 꽃, 줄기, 과실, 잎, 뿌리와 같은 식물의 일부가 또한 본 발명의 목적이다. 무성생식 종자가 특히 바람직하다.

본 발명의 다른 목적은

(i) 활성형으로 세포, 또는 이들의 막중에 존재시 세포를 배형성이 되도록하며, 바람직하게는 식물 세포막을 스패닝시킬 수 있으며 자가포스포릴화될 수 있는 단백질 키나제인, 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 식물질을 형질전환시키는 단계;

(ii) 상기 형질전환된 물질을 식물, 또는 이들의 암술잎-함유 부분으로 재생시키는 단계; 및

(iii) 배낭의 간극에서 상기 서열을 발현시키는 단계를 포함하는 무성생식 종자, 바람직하게는 부정배 형성 타입인 종자의 생산 방법이다.

본 발명에 따르는 DNA에 의해 발현되는 키나제 단백질은 바람직하게는 류신 풍부 반복단위 수용체 유사 키나제이며, 리간드 결합 도메인, 프롤린 박스, 트랜스막 도메인, 키나제 도메인 및 단백질 결합 도메인을 포함한다. 본 발명의 특정 양태로, 상기 키나제 단백질은 기능성 리간드 결합 도메인이 결여될 수 있지만 프롤린 박스, 트랜스막 도메인, 키나제 도메인 및 단백질 결합 도메인을 포함한다.

상기한 유전자이식 종자 및 식물로 조작되는 유전자 특성은 유성 생식 또는 영양 성장에 의해 통과되어 자손 식물에서 유지되어 보급될 수 있다. 일반적으로, 상기 유지 및 보급은 경운, 파종 또는 경작과 같은 특정 목적에 맞게 개발된 공지된 농업 방법을 사용토록 한다. 수경재배 또는 온실 기술과 같은 특화된 방법을 또한 적용할 수 있다. 성장하는 작물이 곤충 또는 감염으로부터 발생되는 공격 및 손상을 받기 쉬울 뿐만아니라 잡초와의 경쟁 때문에, 잡초, 식물 질병, 곤충, 기생충 및 기타 수율을 향상시키는데 부정적인 조건을 구제하기위한 수단을 이용한다. 이들로는 토양의 경지 또는 잡초 및 감염된 식물의 제거와 같은 기계적 방법 뿐만 아니라 제초제, 살진균제, 배우자제거제, 살선충제, 성장조절제, 성충제 및 숙성제와 같은 농업 화학제의 사용이 있다.

본 발명에 따르는 유전자이식 식물 및 종자의 유리한 유전자 특성을 또한 기생충, 제초제 또는 스트레스 내성과 같은 개선된 특성, 개선된 영양가, 증가된 수율, 또는 도복 또는 분산으로부터 발생되는 소실량이 적도록한 개선된 구조를 갖는 식물을 개발할 목적의 식물 육종에 이용할 수 있다. 여러가지 육종 단계는 교배시킬 주의 선별, 모주의 직접적인 수분, 또는 적합한 자손 식물의 선별과 같은 정의가 잘 되어있는 사람의 간섭으로 특징된다. 목적하는 특성에 따라서 상이한 육종 방법을 취한다. 관련 기술은 당해 분야에 숙지되어 있으며, 비제한적으로 하이브리드화, 동계교배, 역교배 육종, 다중 육종, 다양한 배합, 종간 하이브리드화, 이수성 (異數性) 기술 등이 있다. 하이브리드화 기술로는 또한 기계적, 화학적 또는 생화학적 수단에 의한 웅성 또는 자성 불임 식물을 얻기 위한 식물의 불임화가 있다. 웅성 불임 식물과 상이한 주의 화분과의 교배 화분으로 웅성은 불임되었지만 자성 생식성 식물의 게놈은 모주 둘다의 특성을 균일하게 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르는 유전자이식 종자 및 식물은 예를들어 제초제 또는 살충제 처리와 같은 통상의 방법의 효과를 증가시키거나 이들의 변형된 유전자 특성으로 인하여 상기 방법을 생략할 수 있도록 하는 개량된 식물중의 육종을 위하여 사용될 수 있다. 달리 최적화된 유전적 "장치"로 인하여 필적하는 부정적인 성장 환경을 견딜수 없는 생성물보다 더 우수한 품질의 경작물을 산출하는, 스트레스 내성이 개선된 신규 작물을 수득할 수 있다.

종자 생산에 있어서는 발아 품질과 종자의 균일성이 필수적인 생성물 특징인 반면, 발아 품질 및 농부에게 수확되어 판매되는 종자의 균일성은 중요하지 않다. 다른 작물 및 잡초 종자가 없도록 작물을 보호하기 어렵기 때문에, 종자유래 질병을 구제하고 양호한 발아성을 갖는 종자를 생산하기 위하여, 매우 강력하고 잘-정의된 종자 생산법이 순수한 종자의 성장, 조절 및 시판 분야에서의 숙련가인 종자 생산업자에 의해 개발되어 있다. 따라서, 농부 자신의 경작물로부터 수확한 종자를 사용하는 대신 특정 품질 기준을 만족시키는 검증된 종사를 구입하는 것이 농부에게 있어서는 통상적인 관행이다. 종자로서 사용될 보급물은 통상적으로 제초제, 살충제, 살진균제, 살균제, 살선충제, 연체동물 제거제 또는 이들의 혼합물을 포함하는 보호성 피복물로 처리한다. 통상적으로 사용되는 보호성 피복물은 캅탄, 카복신, 티람 (TMTD: 등록상표), 메탈락실 (Apron: 등록상표), 및 피리미포스-메틸 (Actellic: 등록상표)과 같은 화합물을 포함한다. 경우에 따라, 이들 화합물은 추가의 담체, 세균, 진균 또는 동물 기생물에 의해 유발되는 손상에 대한 보호를 제공하기 위하여 제형 분야에서 통상적으로 사용되는 계면활성제 또는 용도-증진 보조제와 함께 제형화시킨다. 액체 제형으로 보급물을 함침시키거나 혼합된 습식 또는 건식 제형으로 피복시켜 보호성 피복물을 적용할 수 있다. 눈 또는 과실에 직접 처리하는 것과 같은 다른 적용 방법이 또한 가능하다.

본 발명의 다른 목적은 재배된 식물, 특히 종자 처리에 통상적으로 사용되는 종자 보호성 피복물로 처리된 식물 종자용의 식물 보급물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따르는 유전자이식 식물, 유전자이식 물질, 또는 유전자이식 종자를 사용하는 것으로 특징되는 상기 예시된 방법과 같은 신규한 농업 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 방법에 따라서 형질전환시킨 식물로부터의 자손을 육종시키기 위하여, 다음과 같은 방법을 사용할 수 있다: 하기 나타낸 실시예에 기술된 바와 같이 생산된 식물을 온실 또는 토양중의 포트에서 당해 분야에 공지된 바와 성장시켜 개화시킨다. 화분을 성숙한 수술로부터 수득하여 이를 사용하여 동일한 식물, 동족 식물, 또는 다른 바람직한 식물의 암술을 수분시킨다. 유사하게, 형질전환된 식물상에서 성장한 암술은 동일한 식물, 동족 식물, 또는 다른 바람직한 식물로부터 수득한 화분으로 수분시킬 수 있다. 상기 방법으로 수득한 형질전환된 자손은 도입된 유전자(들) 및(또는) 수반되는 DNA (유전자형), 또는 부여된 표현형의 존재에 의해 비-형질전환된 자손과 구별할 수 있다. 상기 형질전환된 자손은 바람직한 특성을 포함하는 식물에 대해 통상적으로 수행하는 것과 유사하게 자가적으로 또는 다른 식물과 교배시킬 수 있다. 유사하게, 상기 방법으로 생산한 담배 또는 기타 형질전환된 식물은 당해 분야에 공지된 바와 같이 자가 또는 교배시켜 목적하는 특성을 갖는 자손을 생산할 수 있다. 유사하게, 당해 분야 및 본 발명에서 공지된 방법을 병용하여 생산된 다른 유전자이식 유기체를 당해 분야에 공지된 바와 같이 육종하여 목적하는 특성을 갖는 자손을 생산할 수 있다.

본 발명에 따르는 재조합 DNA 서열 또는 벡터를 사용하여 식물질을 형질전환시키고, 상기 식물질 또는 이들의 유도체중에서 상기 서열을 발현시켜 상기 물질 또는 유도체를 상기 서열의 유전자 생성물에 대한 리간드로서 작용하는 화합물로 처리함을 특징으로하여, 식물질중에서 배형성 세포를 수득하는 방법이 또한 본 발명에 포함된다.

본 발명은 또한 SERK 단백질이 장소외에서 과발현되는 시험관내 조건하에서 체세포 배를 발생시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 DNA 서열을 사용하여 배낭의 간극에서 발현시키는, 무성생식 종자의 생산에 있어서 상기 DNA의 용도를 포함한다.

본 발명의 특정 양태로 SERK 유전자를 예를들면, 아라비도프시스 식물과 같은 유전자이식 식물중에서, 식물 발현 시그날, 특히 플란타중에서의 SERK 유전자의 발현을 조절하는 프로모터, 바람직하게는 성장적으로 조절되거나 유도성인 프로모터로, 예를 들면, 캐로트 키티나제 DcEP3-1 유전자 프로모터, 아라비도프시스 AtChitIV 유전자 프로모터, 아라비도프시스 LTP-1 유전자 프로모터, 아라비도프시스 bel-1 유전자 프로모터, 페튜니아 fbp-7 유전자 프로모터, 아라비도프시스 ANT 유전자 프로모터, 또는 팔래노프시스로부터의 O126 유전자의 프로모터, 아라비도프시스 AtDMC1 프로모터, 또는 pTA7001 유도성 프로모터의 조절하에서 발현시킬 수 있다.

DcEP3-1 및 AtChitIV 유전자의 프로모터를 표준 방법으로 클로닝하여 특성화시킬 수 있다. DcSERK 암호화 서열 (서열 2)를 DcEP3-1, AtChitIV 또는 AtLTP-1 프로모터 뒤에서 클로닝시켜 아라비도프시스중으로 형질전환시킨다. 프로모터가 전사시킬 서열에 기능적으로 결합되도록 하는 방법으로 결합을 수행한다. 형질전환된 물질의 선별을 제공하는 공지된 마커 유전자를 또한 함유하는 상기 작제물을 pBIN19와 같은 바이너리 벡터의 T-DNA 영역중에 삽입시켜 아라비도프시스중으로 형질전환시킨다. 아라비도프시스중으로의 아그로박테리움-매개된 형질전환은 숙련가에게 공지된 진공 유입법 또는 근 형질전환 공정으로 수행한다. 형질전환된 종자를 선택하여 경작하고, (경우에 따라) 형질전환주를 통상적인 자가수분에 의해 확립시킨다. 35S 프로모터-SERK 작제물과 전체 SERK 유전자 자체를 갖는 평행 형질전환체를 대조군으로 사용하여 수많은 세포 또는 단지 SERK 유전자를 천연적으로 발현시키는 몇몇 세포중에서의 과-발현을 평가한다. 35S 프로모터-SERK 작제물은 SERK-매개된 형질도입쇄를 활성화시키는 시그날이 식물중에 존재하는 곳이라면 어느곳에서나 배 형성을 부여할 수 있다. 제웅 (emasculation)과 LTP-1 프로모터-GUS 및 SERK 프로모터-바마제를 포함하는 화분에 대한 공여체 식물주의 발생을 기본으로 하는 시험 시스템이 확립되어 있다.

수개의 아라비도프시스 배경주중으로의 형질전환용으로 동일한 작제물 (SERK 암호화 서열에 융합된 35S, EP3-1, AtChitlV, AtLTP-1 및 SERK 프로모터)을 사용한다. 이들 배경주는 야생형의 웅성 불임, fis (emb 173에 대한 대립형) 및 프리모르디아 타이밍 (pt)-1 주, 또는 2종 또는 수종의 이들 배경주의 혼합형이다. wt 주를 대조군으로 사용하여 정상적인 접합체 배형성에 대한 가능한 효과를 평가하고, 제웅후 수정시키지 않고서 종자 세트에 대해 점수를 매긴다. ms 주를 사용하여 수정시키지 않고서 종자 세트에 대해 직접 점수를 매겨, SERK 작제물의 존재에 의해 향상될 수 있는, 무성생식 배형성에 대한 자연적 경향을 가지는지에 대해 예측할 수 있다. pt-1 주는 탁월한 재생능력을 가지며, 1차적인 안정한 배형성 아라비도프시스 세포 현탁 배양을 개시하는데 사용되고 있다. 상기 배경주 수개의 혼합형은 서로 교배시키고 장소외 SERK 발현 작제물을 함유하는 주와 교배시켜 수득한다. ms 주를 제외하고, 정상적인 자가수분에 의해 보급할 수 있으며, 제웅후 무성생식 특성을 분석한다. AtChiIV, AtLTP-1 및 SERK 프로모터를 bel-1 및 fbp-7 프로모터 뿐만 아니라 자성 배우체의 성분에 특이적인 다른 프로모터로 대체시킨 유사한 방법을 사용한다.

구성 수용체 키나제 활성을 갖는 다른 작제물을 발생시킨다. SERK 타입의 대부분의 수용체 키나제는 하부 시그날 형질도입 캐스케이드를 활성화시킬 수 있기 전에 자가포스포릴화를 필요로 하는, 동종이량체성 (homodimeric) 수용체로서 작용한다. 수많은 수용체 키나제에서 세포외 도메인은 리간드-유리 단계에서 키나제 도메인의 억제제로서 작용한다. 상기 억제는 리간드 결합후 제거한다 (Cadena and Gill, 1992). 세포외 리간드-결합 도메인이 제거된 SERK 작제물을 도입시킴으로써, 구조적으로 활성화된 키나제 도메인을 갖는 돌연변이 동종이량체성 (SERK 단백질의 천연 집단을 갖지 않는 세포) 또는 이종이량체성 (비변형형을 또한 발현시키는 세포) 단백질을 발생시킬 수 있다. 상기 방법은, 핵 영역에서 활성인 프로모터중 하나에 커플링될 때, 활성화 시그날 부재하에서 배형성 경로를 활성화시킨다. 이는 특정 프로모터 활성에 대해서만 의존적이고 활성화 시그날의 일시적 조절과는 독립적인 SERK 경로의 활성화를 갖는 것이 필수적이거나 바람직한 경우에 중요한 대안일 수 있다. 수정-독립적-배형성 (fie)이 되도록 하는 SERK 작제물의 도입은 이들의 효과에 대해 다른 종에서 시험한다. fie 표현형을 인식하기 위하여, 숙련가들은 적합한 웅성 불임 배경주를 사용한다. 그러나, 배유의 생산을 확실히하기 위해서는 수분이 통상 부정배형성 배 타입의 무성생식에 필수적이다.

본 발명이 심피의 핵 영역에서 SERK 유전자의 이종성 발현에 의한 무성생식 종자의 생산 방법으로 상세하게 기술되었으나, 숙련가들은 다른 유전자, 즉 SERK 유전자 생성물과 유사한 구조/기능을 갖는 생성물이 유사한 결과로 발현될 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 실시예가 아라비도프시스에서의 무성생식 종자 생산을 설명하고 있으나, 물론 본 발명이 상기 식물에서의 무성생식 종자-유도 유전자의 발현만으로 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 명세서는 구성-조직 비-특이적 방법으로 (예를들면 CaMV35S 또는 NOS 프로모터의 전사 조절하에서) 형질전환된 식물질중에서 SERK (또는 관련) 유전자 서열의 발현 가능성을 포함한다. 이 경우, 상기 유전자 생성물의 리간드의 배낭의 간극내에 편재된 존재로 조직 특이성이 확실하게 된다. 또한, SERK (또는 관련) 유전자 생성물은 배형성을 조절하는데 관련되는 전사 인자와 같은 단백질과 상호반응할 수 있다. 본 발명의 기술내용에 따라서 형질전환된 조직내에서의 상기 상호반응은 또한 본 발명의 일부이다.

본 발명의 기술내용의 유익함을 갖는 숙련가들은 또한 SERK 유전자 (및 상기 선행 문장에 나타낸 바와 같은 기타 유전자들)를 보급 및/또는 분화시킬 수 있는 식물질중으로 형질전환시켜 체세포 배를 수득할 수 있는 외식편으로서 사용할 수 있다. 형질전환된 조직 (키나제 유전자 생성물의 리간드에 처리함)중에서 상기와 같은 서열의 발현은 비-형질전환된 유사 조직중에 존재하는 구성원과 비교하여, 체세포 배를 형성시키는데 있어서 경쟁적인 조직중 세포의 비율을 실질적으로 증가시킨다.

본 발명은 다음 기술내용과 관련된 도면 및 서열로부터 더욱 자명하게 될 것이다.

서열 1은 배형성 세포에 대해 경쟁적인 전위와 관련된 추정적인 수용체 키나제 (SERK)의 Daucus carota 클론을 나타낸 것이다.

서열 2는 상기 추정적인 키나제의 cDNA를 나타낸 것이다.

서열 3은 서열 1의 DNA에 의해 암호화되는 SERK 단백질의 예측되는 단백질 서열을 나타낸 것이다.

서열 4-16은 여러가지 PCR 프라이머의 서열을 나타낸 것이다.

서열 17-19는 서열 2의 유전자 생성물내에 함유되어 있는 특정 펩티드를 나타낸 것이다.

서열 20은 배형성 세포에 대해 경쟁적인 전위와 관련된 추정적인 수용체 키나제 (SERK)의 아라비도프시스 탈리아나 부분적인 게놈성 클론을 나타낸 것이다.

서열 21은 서열 20의 DNA에 의해 암호화된 SERK 단백질의 예측되는 단백질 서열을 나타낸 것이다.

서열 22, 24, 26, 28 및 30은 SERK LRR 서열과의 상동성이 높은 5개의 EST 클론의 부분적인 DNA 서열을 나타낸 것이다.

서열 23, 25, 27, 29 및 31은 서열 22, 24, 26, 28 및 30의 5개의 EST 클론의 부분적인 DNA 서열의 예측되는 단백질 서열을 나타낸 것이다.

서열 32는 아라비도프시스 탈리아나로부터의 SERK cDNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.

서열 33은 서열 32의 DNA에 의해 암호화된 아라비도프시스 탈리아나로부터의 SERK 단백질의 예측되는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

Claims (46)

1. (i) 활성형으로 세포, 또는 이들의 막중에 존재시 세포를 배형성이 되도록 하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 식물질을 형질전환시키는 단계;

   (ii) 상기 형질전환된 물질을 식물, 또는 이들의 암술잎-함유 부분으로 재생시키는 단계; 및

   (iii) 배낭의 간극에서 상기 서열을 발현시키는 단계를 포함하는 무성생식 종자의 생산 방법.
2. 제1항에 있어서, 무성생식 종자가 부정배 형성 타입인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열의 발현으로 식물 세포막을 스패닝시킬 수 있는 단백질 키나제가 생성되는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 키나제가 자가포스포릴화할 수 있는 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 류신 풍부 반복단위 수용체 유사 키나제이고 리간드 결합 도메인, 프롤린 박스, 트랜스막 도메인, 키나제 도메인 및 단백질 결합 도메인을 포함하는 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 기능성 리간드 결합 도메인이 결여되어 있지만 프롤린 박스, 트랜스막 도메인, 키나제 도메인 및 단백질 결합 도메인을 포함하는 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포막중으로 일단 혼입되면, 단백질 결합 도메인이 세포-내부에 위치하게 되는 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 추가로 세포막 표적화 서열을 암호화하는 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 서열 1 또는 2에 나타낸 것이거나, 엄격한 조건하에서 상기 서열과 하이브리드화하고 키나제 활성을 갖는 막 결합된 단백질을 암호화하는 것에 대해 상보적인 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 서열을 공지된 mRNA 불안정성 모티프 또는 폴리아데닐화 시그날이 제거되고/되거나 서열이 삽입될 식물에 의해 우선되는 코돈이 사용되도록 변형시켜 상기 변형된 서열의 상기 식물중에서의 발현으로 상기 단백질이 내인성인 유기체중에서 비변형된 서열의 발현에 의해 수득된 것과 실질적으로 유사한 단백질을 수득하는 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열의 발현이 유도성 또는 성장 조절된 프로모터의 조절하에 있는 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 서열의 발현이 플란타중 SERK 유전자의 발현을 조절하는 프로모터, 캐로트 키티나제 DcEP3-1 유전자 프로모터, 아라비도프시스 AtChitlV 유전자 프로모터, 아라비도프시스 LTP-1 유전자 프로모터, 아라비도프시스 bel-1 유전자 프로모터, 페튜니아 fbp-7 유전자 프로모터, 아라비도프시스 ANT 유전자 프로모터, 팔래노프시스로부터의 O126 유전자의 프로모터 중 하나의 조절하에 있는 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 배낭, 자방, 핵, 또는 외피의 체세포중에서 발현되는 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 무성생식 종자내의 배유가 배낭내의 극성 핵과 화분-유래 웅성 배우자 핵과의 융합으로부터 발생되는 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질을 암호화하는 서열을 극성 핵과 웅성 배우자 핵과의 융합전에 발현시키는 방법.
16. 세포, 또는 이들의 막중에 활성형으로 존재시 세포를 배형성이 되도록 하는 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 DNA.
17. 제16항에 있어서, 상기 단백질이 류신 풍부 반복단위 유사 키나제이고 리간드 결합 도메인, 프롤린 박스, 트랜스막 도메인, 키나제 도메인 및 단백질 결합 도메인을 포함하며, 리간드 결합 도메인이 임의로 부재하거나 기능적으로 불활성인 DNA.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 다음 아미노산 서열을 갖는 N-말단 단백질 단편을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA:

    Gln Ser Trp Asp Pro Thr Leu Val Asn Pro Cys Thr Trp Phe His Val Thr Cys Asn.
19. 제18항에 있어서, 다음 아미노산 서열을 갖는 N-말단 단백질 단편을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA:

    Val Xaa Gln Ser Trp Asp Pro Thr Leu Val Asn Pro Cys Thr Trp Phe His Val Thr Cys Asn.

    상기 아미노산 서열중 Xaa는 가변성 아미노산이나, 바람직하게는 Leu 또는 Val이다.
20. 제19항에 있어서, 다음 아미노산 서열을 갖는 N-말단 단백질 단편을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA:

    Val Xaa Gln Ser Trp Asp Pro Thr Leu Val Asn Pro Cys Thr Trp Phe His Val Thr Cys Asn Xab Xac Xad Xae Val Xaf Arg Val Asp Leu Gly Asn Xag Xah Leu Ser Gly His Leu Xai Pro Glu Leu Gly Xaj Leu Xak Xal Leu Gln.

    상기 아미노산 서열중 Xaa 내지 Xak는 가변성 아미노산이나, 바람직하게는 다음과 같다:

    Xaa = Leu 또는 Val

    Xab = Asn 또는 Gln

    Xac = Glu 또는 Asp 또는 His

    Xad = Asn 또는 His

    Xae = Ser 또는 Arg 또는 Gln

    Xaf = Ile 또는 Thr

    Xag = Ala 또는 Ser

    Xah = Glu 또는 Asn

    Xai = Val 또는 Ala

    Xaj = Val 또는 Lys

    Xak = Lys 또는 Glu

    Xal = Asn 또는 His.
21. 서열 3에 나타낸 서열을 갖는 단백질, 또는 막결합될 수 있으며 키나제 활성을 갖는 것과 실질적으로 유사한 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 DNA.
22. 서열 21에 나타낸 서열을 갖는 단백질, 또는 막결합될 수 있으며 키나제 활성을 갖는 것과 실질적으로 유사한 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 DNA.
23. 서열 33에 나타낸 서열을 갖는 단백질, 또는 막결합될 수 있으며 키나제 활성을 갖는 것과 실질적으로 유사한 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 DNA.
24. 서열 23, 25, 27, 29 및 31에 나타낸 서열을 갖는 단백질, 또는 막결합될 수 있으며 키나제 활성을 갖는 것과 실질적으로 유사한 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 DNA.
25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 1 또는 2에 나타낸 서열 또는 엄격한 조건하에서 상기 서열과 하이브리드화하는 것에 대해 상보적이며 키나제 활성을 갖는 막 결합된 단백질을 암호화하는 서열을 갖는 DNA를 포함하는 DNA.
26. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 20에 나타낸 서열 또는 엄격한 조건하에서 상기 서열과 하이브리드화하는 것에 대해 상보적이며 키나제 활성을 갖는 막 결합된 단백질을 암호화하는 서열을 갖는 DNA를 포함하는 DNA.
27. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 32에 나타낸 서열 또는 엄격한 조건하에서 상기 서열과 하이브리드화하는 것에 대해 상보적이며 키나제 활성을 갖는 막 결합된 단백질을 암호화하는 서열을 갖는 DNA를 포함하는 DNA.
28. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 22, 24, 26, 28 및 30에 나타낸 서열 또는 엄격한 조건하에서 상기 서열과 하이브리드화하는 것에 대해 상보적이며 키나제 활성을 갖는 막 결합된 단백질을 암호화하는 서열을 갖는 DNA를 포함하는 DNA.
29. 제16항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 세포막 표적화 서열을 추가로 암호화하는 DNA.
30. 제16항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 암호화 영역이 성장 조절되거나 또는 유도성 프로모터의 발현 조절하에 있는 DNA.
31. 제30항에 있어서, 프로모터가 플란타중 SERK 유전자의 발현을 조절하는 프로모터, 캐로트 키티나제 DcEP3-1 유전자 프로모터, 아라비도프시스 AtChitlV 유전자 프로모터, 아라비도프시스 LTP-1 유전자 프로모터, 아라비도프시스 bel-1 유전자 프로모터, 페튜니아 fbp-7 유전자 프로모터, 아라비도프시스 ANT 유전자 프로모터, 팔래노프시스로부터의 O126 유전자의 프로모터; 아라비도프시스 DMC1 프로모터, pTA7001 유도성 프로모터 중의 하나인 DNA.
32. 제16항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA가 재조합 DNA인 DNA.
33. 제16항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 서열을 공지된 mRNA 불안정성 모티프 또는 폴리아데닐화 시그날이 제거되고/되거나 상기 DNA가 삽입될 식물에 의해 우선되는 코돈이 사용되도록 변형시켜 상기 변형된 DNA가 상기 식물중에서의 발현으로 상기 단백질이 내인성인 유기체중에서 비변형된 DNA의 발현에 의해 수득된 것과 실질적으로 유사한 단백질을 수득하는 DNA.
34. 제16항 내지 제29항 중 어느 한 항의 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 것에 대해 상보적인 DNA.
35. 제16항 내지 제34항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 DNA 서열을 함유하는 벡터.
36. 제16항 내지 제34항 중 어느 한 항의 DNA 또는 제35항의 벡터로 형질전환시킨, 게놈중으로 안정하게 혼입시킨 DNA를 함유하는 식물 세포.
37. 제36항에 있어서, 전체 식물의 일부인 식물 세포.
38. 제16항 내지 제34항 중 어느 한 항의 DNA 또는 제35항의 벡터로 형질전환시킨 식물, 상기 안정하게 혼입된 DNA를 함유하는 식물의 자손 및/또는 상기와 같은 식물 또는 자손의 무성생식 종자.
39. 제16항 내지 제34항 중 어느 한 항의 재조합 DNA를 포함하는 DNA로 형질전환시킨 식물.
40. 무성생식 종자를 제조하는데 있어서 제16항 내지 제34항 중 어느 한 항의 DNA의 용도.
41. 제1항 내지 제15항 또는 제40항 중 어느 한 항에 따르는 방법으로 수득할 수 있는 무성생식 종자로부터 유래된 식물.
42. 제38항, 제39항 또는 제40항 중 어느 한 항의 식물 및 상기 방법으로부터 생성된 재배종의 화분으로 식물을 수정시키는 단계를 포함하는 재배종 수득 방법.
43. 제16항 내지 제34항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 재조합 DNA 서열, 제16항 내지 제34항 중 어느 한 항의 재조합 DNA를 포함하는 DNA, 또는 제35항의 벡터로 식물질을 형질전환시키고, 식물질 또는 이들의 유도체에서 서열을 발현시켜 상기 식물질 또는 유도체를 상기 서열의 유전자 생성물에 대한 리간드로서 작용하는 화합물로 처리함을 특징으로하여, 식물질중 배형성 세포를 수득하는 방법.
44. 제43항에 있어서, 상기 서열이 류신 풍부 반복단위 수용체 유사 키나제를 암호화하고, 상기 화합물이 식물-호르몬인 방법.
45. SERK 단백질이 정규장소외로 과발현되는 시험관내 시험 조건하에서 체세포 배를 발생시키는 방법.
46. 제1항 내지 제15항 또는 제40항 중 어느 한 항의 방법으로 수득할 수 있는 무성생식 종자를 함유하는 백.