MXPA01009311A

MXPA01009311A - Plantas modificadas geneticamente que tienen senalizacion modulada de brasinoesteroides..

Info

Publication number: MXPA01009311A
Application number: MXPA01009311A
Authority: MX
Inventors: Joanne Chory
Original assignee: Salk Inst For Biological Studi
Priority date: 1999-03-16
Filing date: 2000-03-16
Publication date: 2002-08-12
Also published as: WO2000055302A2; EP1163324A4; AU3889000A; CA2365555C; US6534313B1; EP1163324A2; US7034205B2; JP2002538817A; US20020073446A1; WO2000055302A3; CA2365555A1; KR20020028866A

Abstract

La presente invencion provee el citocromo P450s, util para producir plantas modificadas geneticamente, caracterizadas por tener el rasgo fenotipico de sintesis modulada de senalizacion de brasinolidas, por ejemplo, dando como resultado resistencia a insectos, enanismo y follaje verde mas oscuro en comparacion con plantas tipo silvestre. Tales plantas pueden ser modificadas, por ejemplo, usando "basl", u homologos funcionales del mismo, un polipeptido codificado por bas1 que modula la sintesis y/o senalizacion de brasinolidas en plantas. La invencion tambien provee metodos para modular la actividad de ecdiesteroides en una planta y para ensayar la funcion de brasinoesteroides en una planta. Este ultimo metodo puede ser usado para crear una serie alelica de ganancia de funcion de plantas caracterizadas por niveles incrementados de sobre-expresion de un citocromo P450 para examinar la actividad de brasinolidas en especies de plantas.

Description

PLANTAS MODIFICADAS GENÉTICAMENTE OUE TIENEN SEÑALIZACIÓN MODULADA DE BRASINOESTEROIDES Campo de la Invención La presente invención se relaciona con el crecimiento y desarrollo de plantas, y más específicamente con métodos para modificar la actividad de las brasinólidas en plantas, mediante la modulación de la actividad del citocromo P450. Antecedentes de la Invención Una planta se considera saludable cuando ésta puede realizar sus funciones fisiológicas, tales como división celular, diferenciación, desarrollo, fotosíntesis, absorción y trans-locación de agua en nutrientes a partir de la tierra, metabolismo, reproducción, y almacenamiento de suministros de alimento, sin interrupción. Cuando patógenos o insectos perturban las funciones de la planta, las plantas se enferman o destruyen. La enfermedad se puede definir como el mal funcionamiento de las células y tejidos de la planta anfitriona, provocado por la irritación continua por parte de un agente patogénico o insecto. Una enfermedad envuelve cambios anormales en la forma, fisiología, o comportamiento de la planta. Los insectos o plagas representativos que atacan a las plantas incluyen coleópteros y lepidópteros tales como el gusano de raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera virgifera) , ¿J? gusano de raíz del maíz norteño (Diabrotica longicornis barberi) , gusano de raíz del maíz sureño (Diabrotica undecimpunctata howardi) , gusano del algodón, barrenillo del maíz europeo, gusano de membrana de la raíz del maíz, gusano de maíz y algodón rosa, y gusano de yema del tabaco. Las plantas transgénicas son de preferencia plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas. Las bacterias patógenas de plantas también provocan una diversidad de síntomas de enfermedad de plantas. Aproximadamente 80 especies de bacterias (por ejemplo, Pseudowonas viridi flava, Xanthomonas campestri s pv, asclepiadas, Xyella fastidiosa, Acidovorax albilineans, y Acidovorax avenae sspl ci trulli ) provocan enfermedades en las plantas, incluyendo la pudrición de la fruta, excoriaciones, marchitamientos, plaga, y manchas en las hojas. Dado que las bacterias se multiplican rápidamente, es crítico controlarlas temprano en el proceso de enfermedad. Los compuestos de cobre y estreptomicina son los únicos compuestos químicos actualmente disponibles para el control de enfermedades bacterianas . La ingeniería genética de plantas, que vincula el aislamiento y la manipulación de material genético, por ejemplo, ADN o ARN, y la introducción subsecuente de ese material dentro de una planta o células de la planta, ha cambiado considerablemente la reproducción de plantas y la agricultura durante los años recientes. Los valores nutritivos incrementados de la-cosecha, producciones más altas, valor alimenticio, costos de producción reducidos, resistencia a las plagas, tolerancia a la tensión, resistencia a las sequías, la producción de productos farmacéuticos, productos químicos y moléculas biológicas, así como otras cualidades características benéficas potencialmente se pueden conseguir todas mediante de técnicas de ingeniería genética. Las técnicas de ingeniería genética que suministran los genes implicados en la resistencia a patógenos tienen el potencial para afectar sustancialmente la producción de la cosecha . Tradicionalmente, el control de la estatura de las plantas ha sido a través del proceso de reproducción selectiva. Frecuentemente se eligen plantas enanas por su valor ornamental o su habilidad mejorada para sobrevivir bajo tensión mecánica, tal como viento violento. Sin embargo, este proceso de reproduc-ción puede tomar muchos años. Una manera alternativa para crear rápidamente plantas enanas es por medio de la aplicación exógena de ciertos compuestos orgánicos, tales como el inhibidor de biosíntesis de giberelina, uniconazol . Sin embargo, estos compuestos son costosos y se deben aplicar a todo lo largo del ciclo de vida de la planta. La luz también tiene un papel importante en el desarrollo de la planta, tanto por la fotosíntesis como porque es como una indicación del desarrollo. Una diversidad de foto-receptores responden a la calidad, cantidad, dirección y duración del medio ambiente de luz. En Arabidopsis hay cinco fitocromos que absorben rojo/muy rojo (phyA-phyE) , dos criptocromos que absorben azul/UVA (cryl y 2) y los menos entendidos foto-receptores UVB. Todos afectan cambios morfológicos grandes en el desarrollo de la plántula a medida que se desemblanquecen, haciendo la transición de crecimiento en la oscuridad a crecimiento en la luz (C. Fankhauser y J. Chory, Annu Rev Cell Dev Biol 13_:203-29, 1997). El análisis genético demuestra una red compleja de interacciones entre estas trayectorias de señalización de foto-receptores (Casal y Mazzella, Plant Physiol 118:19-25, 1998; M.M. Neff y J. Chory, Plant Physiol 118:27-35, 1998; L. Henning y colaboradores, Planta 2_C_8: 257-263 , 1999; G. Lasceve y colaboradores, Plant Physiol 120 : 605-614 , 1999) . También existen distintas clases de foto-receptores, las fototropinas (por ejemplo, NPH1) , que efectúan el crecimiento direccional de las plántulas (E. Liscum y W.R. Briggs, Plant Cell 7:473-485, 1995; E. Huala y colaboradores, Science 278. : 2120-2123 , 1997; J.M. Christie y colaboradores, Science 282:1698-701, 1998), un proceso que se puede modificar mediante la actividad de los fitocromos (B.M. Parks y colaboradores, Plant Physiol 110 : 155-162 , 1996). Las hormonas de las plantas también pueden contribuir a las respuestas fotomorfogénicas . Algunos mutantes fotomorfogé-nicos se asemejan a los mutantes implicados en la biosíntesis o detección de la fitohormona. Por ejemplo, el mutante de señalización GA spindly se asemeja a plantas con mutaciones en phyB, las cuales tienen tallos largos, hojas descoloridas, y florecimiento temprano. Este fenotipo también se puede imitar en plantas de tipo silvestre, por medio de la aplicación de GA3 (S.E. Jacobsen y N.E. Olszewski, Plant Cell 5:887-896, 1993) . El análisis genético de GA y los mutantes de fitocromos apunta a las interacciones entre estos dos sistemas de transducción de señal para ciertas respuestas (J. Chory, Plant Cell .9:1225-34, 1997) . Sin embargo, es probable que otras respuestas, tales como florecimiento, se controlen independientemente por medio de ambos sistemas (M.A. Blázquez y D. Weigel, Plant Phys 120 : 1025-32 , 1999) . Las giberelinas no son las únicas hormonas que están implicadas en la señalización de luz. Las auxinas claramente tienen algún papel en la fotomorfogénesis . Por ejemplo, el transporte de la auxina se afecta de una manera dependiente de la luz (P.J. Jensen y colaboradores, Plant Physiol 116 : 455-462 , 1998) . El análisis genético también apunta hacia un papel para la auxina en la transducción de señal de luz. La mutación shy2 , identificada en un examen supresor para los mutantes con niveles reducidos de todos los fitocromos (Kim y colaboradores [Cita En Proceso] . Plant J 15:61-68) , o en un mutante nulo de phyB (J.W. Reed y colaboradores, Genetics 148:1295-1310, 1998), reside en el gen inducido por auxina IAA3 (Q. Tian y J.W. Reed, Development 126 : 711-21 , 1999) . Un tercer ejemplo del interjuego entre la fotomorfogénesis y las fitohormonas es que se han identificado muchos mutantes de brasinoesteroides en exámenes genéticos de plantas que pueden soportar el desemblanquecimiento en la ausencia de una indicación de luz (para revisión ver (S. Li y J. Chory, Exp Bot .50:275-282, 1999)). Cuando estos mutantes se cultivan en la oscuridad, sus plántulas tienen hipocotíleos cortos con cotiledones que empiezan a desarrollarse como si estuvieran creciendo en la luz. Como adultos, estos mutantes son enanos con hojas epinásticas verde oscuro, y tallos y pecíolos cortos. Estos son de crecimiento lento con senectud retardada. Cada uno de estos fenotipos adultos es esencialmente el opuesto de los mutantes que carecen del fitocromo B (para revisión ver (Chory, 1997, supra) . Los exámenes genéticos de mutaciones de pérdida de funciones han llevado a la identificación de muchos lugares que se cree que están implicados en la fotomorfogénesis (Fankhauser y Chory, supra) . Sin embargo, estos exámenes pueden omitir componentes importantes de la transducción de señal de luz que son ya sea miembros redundantes de una familia de genes, o son esenciales para la supervivencia. El papel de esos genes pudiera identificarse únicamente en los exámenes de mutantes de ganancia de funciones. Un método para dirigir las mutaciones de ganancia de funciones es a través del análisis supresor extragénico (G. Prelich, Trends Genet 15:261-6, 1999) . Este planteamiento se ha usado exitosamente en Arabidopsi s para identificar los mutantes dominantes o semi-dominantes implicados en la transducción de señal de luz (A.

. Já.4- ->-«3-tti-i? *. , A . á ? Í M Pepper y J. Chory, Genetics 145 : 1125-37, 1997; Kim y colaboradores, supra ; Reed y colaboradores, 1998, supra) . Sin embargo, la clonación posicional de los supresores extragénicos dominantes o semi-dominantes puede ser difícil y consumidora de tiempo, si éstos no tienen un fenotipo en un antecedente de tipo silvestre. La shy2 es la única mutación supresora extragénica dominante, clonada mediante métodos basados en mapas en Arabidopsi s, y tiene un fenotipo impresionante en un antecedente de tipo silvestre (Tian y Reed, supra) . Se ha usado un planteamiento de etiquetación del gen para circunvenir las dificultades de la clonación basada en mapas de las mutaciones en Arabidopsis . En este planteamiento, los mutantes se generan mediante la transformación con ADN de transferencia (ADN-T) mediado por Agrobacterium . Puesto que se conoce la secuencia del ADN-T, se pueden identificar y clonar fácilmente las mutaciones que se etiqueten mediante el transgen (F.J. Behringer y J.I. Medford, Plant Molecular Biology Repórter 10:190-198, 1992; Y.-G. Liu y colaboradores, Plant J. 8:457-463, 1995) . Sin embargo, estas mutaciones se provocan principalmente por la pérdida de la función genética. De esta manera, la cantidad de información que se puede entresacar a partir de su identificación es limitada. Se ha desarrollado una modificación de etiquetación de ADN-T que se dirige específicamente a las mutaciones de ganancia de funciones. En este planteamiento, se incorporan copias multimerizadas de elementos mejoradores del promotor 35S del virus de mosaico de coliflor (CaMV) , cerca del límite derecho de un ADN-T. Cuando se insertan estos mejoradores cerca de un gen, se puede mejorar su transcripción; dando como resultado una mutación etiquetada dominante (R. Walden y colaboradores, Plant Mol Biol 26:1521-8, 1994). Compendio de la Invención La presente invención se basa en el descubrimiento de que el gen basl en Arabidopsis thalia codifica un citocromo P450 (CYP72B1) , el cual tiene un papel en la señalización o síntesis de brasinoesteroides. La sobre-expresión del gen basl en las plantas provoca un fenotipo enano verde oscuro, que imita a plantas que tienen niveles bajos de la hormona de la planta, brasinólida. La sobre-expresión del gen basl también incrementa la resistencia a los insectos en las plantas. El análisis bioquímico muestra que el CYP72B1 es una hidroxilasa C-26 de la brasinólida, que la tiene como objetivo para inactivación. Las plantas transgénicas diseñadas para sobreexpresar el gen basl tienen niveles severamente reducidos de brasinólida y algunos precursores de brasinoesteroides. La sobreexpresión del gen basl en el tabaco (Nicotiana tabacum) confiere un fenotipo similar, indicando que este gen es funcionalmente activo en una familia de plantas divergente. En base a estas observaciones, la presente invención proporciona plantas genéticamente modificadas con el gen basl, u homólogos funcionales, o fragmentos funcionales del mismo, en donde esas plantas exhiben señalización o síntesis de brasinoesteroides modulada, en comparación con las plantas de tipo silvestre. De conformidad con lo anterior, en una primera modalidad, la invención proporciona un polipéptido BAS1 que modula la actividad de la brasinólida en las plantas. También están incluidos los polinucleótidos que codifican a BAS1 y los anti-cuerpos que se fijan a BAS1. En otra modalidad, la invención proporciona una planta genéticamente modificada que comprende cuando menos una secuencia de ácidos nucleicos exógena que codifica un citocromo P450, por ejemplo, el polipéptido BAS1 o un equivalente funcional, en su genoma, o cuando menos una secuencia reguladora que modifica la expresión del citocromo endógeno P450, por ejemplo, el gen basl , y que se caracteriza porque tiene actividad de brasinólida modulada, en comparación con una planta tipo silvestre. Esas plantas genéticamente modificadas pueden exhibir enanismo con hojas verde oscuro en plantas adultas. En otra modalidad, la invención proporciona un método para modificar genéticamente una célula de planta, de tal manera que una planta, producida a partir de la célula, se caracterice como teniendo actividad de brasinólida modulada en comparación con una planta tipo silvestre. El método de la invención para modificar una célula de planta comprende introducir cuando menos un citocromo exógeno P450, por ejemplo, el polinucleótido basl , & ? ,i J, ?.á.Ay A,Á. t. M, Á^. dentro de una célula de planta, para obtener una célula de planta transformada, y criar la célula de planta transformada bajo condiciones que permitan la expresión del citocromo P450, por ejemplo, el producto del gen basl , produciendo mediante lo mismo una planta que tenga actividad de brasinólida modulada. En otra modalidad, la invención proporciona un método para producir una planta genéticamente modificada caracterizada porque tiene estatura de adulto enano con follaje verde oscuro, por medio de poner en contacto una célula de planta con un vector que contenga una secuencia de ácidos nucleicos exógena que comprenda cuando menos un gen estructural que codifique un citocromo P450, por ejemplo, el polipéptido BAS1, el gen estando operablemente asociado con una secuencia reguladora que provoca la sobreexpresión del gen, para obtener una célula de planta transformada, produciendo una planta a partir de la célula de planta transformada; y seleccionar una planta que exhiba estatura de adulto enano con follaje verde oscuro. 4 En otra modalidad, la invención proporciona una planta genéticamente modificada que tiene una expresión incrementada de transgen del gen basl , cromosomalmente integrado dentro del genoma de la planta. En otra modalidad, la invención proporciona un método para producir una planta genéticamente modificada caracterizada como siendo hipersensible a la brasinólida, por medio de poner en contacto una célula de planta con un vector que contenga una i », secuencia de ácidos nucleicos exógena que codifique un producto que interrumpa o interfiera con la expresión del citocromo P450, por ejemplo, el polipéptido BAS1, ácido nucleico que está operablemente asociado con un promotor, para obtener una célula de planta transformada, produciendo una planta a partir de la célula de planta transformada; y seleccionar una planta que exhiba hiperresponsividad a la brasinólida de una manera dependiente de la luz . En otra modalidad, la invención proporciona un método para modificar genéticamente una célula de planta, de tal manera que una planta, producida a partir de la célula, se caracterice por tener actividad de ecdiesteroide modulada, en comparación con una planta tipo silvestre. En esta modalidad, el método de la invención comprende introducir cuando menos un citocromo exógeno P450, por ejemplo, el polinucleótido basl , dentro de una célula de planta, para obtener una célula de planta transformada; y criar la célula de planta transformada bajo condiciones que permitan la expresión del citocromo P450, por ejemplo, el producto del gen basl , produciendo mediante lo mismo una planta que tenga actividad de ecdiesteroide modulada. En otra modalidad, la invención proporciona un método para producir una planta genéticamente modificada, caracterizada porque tiene resistencia incrementada a enfermedades o insectos, en comparación con una planta correspondiente de tipo silvestre. El método incluye poner en contacto las células de la planta con i. c m ácido nucleico que codifique un polipéptido BAS1 o un fragmento funcional del mismo, asociado operativamente con una secuencia de control de expresión, para obtener células de planta transformadas; producir plantas a partir de las células de planta transfor- 5 madas; y seleccionar una planta que exhiba resistencia incrementada a enfermedades o insectos. También se proporciona un método para modificar genéticamente una célula de planta, de tal manera que una planta producida a partir de la célula se caracterice como teniendo resistencia incrementada a enfermedades o insectos, 10 en comparación con una planta tipo silvestre. El método incluye introducir un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido BAS1 dentro de una célula de planta, para obtener una célula de planta transformada, y criando la célula de planta transformada bajo condiciones que permitan la expresión del polinucleótido 15 BAS1, produciendo mediante lo mismo una planta que tenga resistencia incrementada a enfermedades o insectos En una modalidad adicional, se proporciona un método para producir una planta genéticamente modificada caracterizada porque tiene resistencia incrementada a enfermedades o insectos, 20 en comparación con la planta correspondiente de tipo silvestre, por medio de poner en contacto una planta susceptible con una cantidad inductora de promotor BAS1 de un agente necesario para elevar la expresión del gen BAS1, sobre la expresión de BAS1 en una planta que no se puso en contacto con el agente. Por ejemplo, 25 el agente puede ser un factor de transcripción o un agente químico, tal como dexametasona (DEX) . También se proporciona un método para producir plantas genéticamente transformadas, resistentes a enfermedades o insectos, mediante la introducción dentro del genoma de una célula de planta, para obtener una célula de planta transformada, de una secuencia de ácidos nucleicos que tenga una secuencia de control de expresión, enlazada operablemente a un polinucleótido que codifique un polipéptido BAS1. La invención también proporciona plantas, tejido de planta, y semillas producidos mediante plantas producidas por medio de los métodos de la invención. En todavía otra modalidad, se proporciona un método para identificar genes novedosos resistentes a enfermedades o insectos, o genes capaces de inducir estatura reducida en plantas, por medio de sondear una genoteca de ácidos nucleicos con cuando menos un fragmento de un polinucleótido que codifique BAS1, y seleccionar aquellos clones que hibriden con el fragmento . En otra modalidad, la invención proporciona una secuencia de ácidos nucleicos aislada, que comprende una secuencia reguladora no codificadora aislada corriente arriba de un gen basl, en donde la secuencia de ácidos nucleicos contiene cuando menos un sitio de restricción para clonar una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga de interés. En la Figura 1C (SEQ ID NO: 16) se muestra una secuencia reguladora de basl ejemplar. La invención también proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende, leyendo de la dirección 5' a 3', una secuencia no codificadora 5' aislada a partir del gen basl, y una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un gen estructural, en donde esa secuencia de ácidos nucleicos es heteróloga a la secuencia no codificadora 5'. La construcción es útil para la producción de plantas transgénicas que expresen un gen de interés de una manera específica al tejido, por e emplo. Breve Descripción de los Dibujos Las Figuras ÍA y IB muestran las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducidas de BAS1 (SEQ ID NO : 1 y 2, respectivamente) . (Ver también el número de acceso de GenEMBL AC003105 que codifica el ADNc EST T04442 de longitud completa, que se incorpora en la presente por referencia) . La Figura 1C muestra la secuencia promotora para basl (SEQ ID NO: 16) . La Figura 2 es un diagrama esquemático que muestra la inserción de elementos mejoradores 35S de CaMV dentro de ADN genómico en el plásmido pBlueScript® que se usa para rescate de plásmidos. El blanco representa parte del ADN-T; los óvalos representan los elementos mejoradores, los sombreados representan el ADN genómico de la planta. Las Figuras 3A-C son gráficas que muestran la respuesta a la dosis de los hipocotíleos de las plántulas al brasinoeste-roide, según se midió después de 6 días en niveles variables de brasinólida. La Figura 3A muestra la respuesta a la dosis en los hipocotíleos de plántulas criadas en luz, y la Figura 3B muestra la respuesta a la dosis en los hipocotíleos de plántulas criadas en la sombra. La Figura 3C muestra la respuesta a la dosis de pecíolos cotiledones después de 12 días de crecimiento en luz blanca. Col-0 = círculos cerrados; phyB-4 = diamantes abiertos; basl -DphyB-4 = círculos abiertos; línea anti - sentido de BAS1 -diamantes cerrados; y det2 -l = triángulos abiertos. Las barras de error representan un error estándar del promedio. Cuando no es visible ninguna barra de error, éstas son más pequeñas que los símbolos . Las Figuras 4A-D son gráficas que muestran la respuesta de fluencia de luz de los hipocotíleos de plántulas de seis días de edad, medida después del crecimiento en la luz o en intensidades variables de luz. La Figura 4A muestra la respuesta a la luz blanca; la Figura 4B muestra la respuesta a la luz muy roja; la Figura 4C muestra la respuesta a la luz azul; y la Figura 4D muestra la respuesta a la luz roja. Las líneas probadas con Col-0 (círculos cerrados), phyB-4 (diamantes abiertos), basl -DphyB-4 (círculos abiertos) , línea anti-sentido de BAS1 (diamantes cerrados) , y det2 -l (triángulos abiertos) . Las barras de error representan un error estándar del promedio. Cuando no es visible ninguna barra de error, éstas son más pequeñas que los símbolos. Las Figuras 5A y 5B son gráficas que muestran los resultados del análisis de segregación de mutantes dobles. La Figura 5A compara los mutantes phyB- 4phyA-201 que segregan la mutación basl -D (barras sombreadas) con las líneas de control »a- . I ¡ (barras abiertas) en 15 µEm 2s x de luz muy roja continua durante seis días. La Figura 5B compara los mutantes phyB-4cryl que segregan la mutación basl -D (barras sombreadas) con las líneas de control (barras abiertas) en 20 µEm"2s_1 de luz azul continua durante seis días. Las barras de error representan un error estándar del promedio. Descripción Detallada La presente invención se basa en el descubrimiento germinativo de que un citocromo P450, cuando se expresa a niveles incrementados en una planta, en comparación con una planta de tipo silvestre, es efectivo para proporcionar estatura reducida y/o resistencia a los insectos a la planta. Aunque no se desea limitarse por una teoría particular, se cree que el P450, por ejemplo, CYP72B1 cataliza la hidroxilación en C26 de los brasinoesteroides, y por lo tanto puede catalizar igualmente la hidroxilación en C26 de la ecdisona, evitando de esta manera que los predadores experimenten la muda después de alimentarse de plantas que expresen niveles elevados del citocromo P450. En la presente se proporciona un citocromo P450 ilustrativo, no obstante, se entiende que la invención incluye cualquier P450 que tenga la actividad que se describe para esta especie ilustrativa. El citocromo ejemplar descrito en la presente es un citocromo P450 sustancialmente puro (CYP72B1), BAS1, el producto de expresión del gen basl en Arabidopsi s thalia . Se debe entender que el BAS1 se proporciona con propósitos ejemplares, y que la invención no se debe considerar como limitada únicamente a este citocromo P450. La sobre-expresión de basl en las plantas transgénicas provoca que esas plantas exhiban una estatura disminuida, acompañada por follaje verde más oscuro en compara-ción con sus contrapartes de tipo silvestre. Las proteínas que codifican las moléculas de ácido nucleico, de conformidad con la invención, comprenden de preferencia dominios característicos para las proteínas del citocromo P450 (ver, por ejemplo, Nebert y González, Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) , 945-993) . Además, se prefiere que las proteínas que codifican las moléculas de ácido nucleico de conformidad con la invención, contengan dominios característicos para las hidroxilasas de esteroides, a saber, dominios de fijación de esteroides. De preferencia las proteínas tienen la actividad enzimática de una hidroxilasa de esteroide. En una primera modalidad, la presente invención proporciona un citocromo P450 ejemplar, útil en los métodos de la invención. Se ejemplifica un polipéptido BAS1 sustancialmente puro por medio de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) . El polipéptido BAS1 se caracteriza porque tiene un peso molecular predicho de aproximadamente 56 kD, según se determina mediante SDS-PAGE, porque es un citocromo P450 (CYP72B1) , porque es un supresor dominante de phyB-4, y porque modula la actividad de la brasinólida en las plantas. También se incluyen los fragmentos u homólogos biológicamente activos del polipéptido BASl. Esos fragmentos se pueden identificar, por t íi ej emplo, mediante los métodos que se proporcionan en los Ejemplos en las presentes. El término "polipéptido BAS1" , como se usa en la presente, significa el polipéptido BAS1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 2 , así como los fragmentos funcionales del mismo, junto con otros citocromos P450 de planta homólogos, tales como CYP72A de Catharanthus roseus (vincapervinca de Madagascar) que tiene aproximadamente el 42 por ciento de identidad de secuencia con BAS1 al nivel aminoácido, y el CYP72 chibi2 de Arabidopsis . El término "sustancialmente puro" , como se usa en la presente, se refiere al polipéptido BAS1 que está sustancialmente libre de otras proteínas, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los cuales éste está naturalmente asociado. Un técnico en la materia puede purificar el BAS1 usando técnicas estándares para la purificación de proteínas. El polipéptido sustancialmente puro producirá una sola banda principal de aproximadamente 56 kD en un gel de poliacrilamida de desnaturalización, tal como SDS-PAGE. La pureza del polipéptido BAS1 también se puede determinar mediante análisis de secuencia de aminoácidos con terminal amino. La invención incluye el polipéptido BAS1 funcional, y los fragmentos funcionales del mismo. Como se usa en la presente, el término "polipéptido funcional" se refiere a un polipéptido que posee función o actividad biológica, que se identifica a través de un ensayo funcional (por ejemplo, actividad de brasinólida) , y que está asociada con una alteración biológica, morfológica, o fenotípica particular en la célula. Por ejemplo, la sobre-expresión del polipéptido BAS1 da como resultado la modulación de la actividad de la brasinólida, caracterizada por uno o más de los siguientes: hipersensibilidad a la luz muy roja en un fondo PHYA, y la carencia de responsividad en un fondo nulo phyA, la etiolación con los hipocotíleos de longitud casi de tipo silvestre en plántulas que crecieron a la sombra, y enanismo con hojas verde oscuro en plantas adultas. El término "fragmentos funcionales del polipéptido BAS1" se refiere a todos los fragmentos de BAS1 que retienen la actividad de BAS1, por ejemplo, ser supresores dominantes de phyB-4, ser un citocromo P450, modular la actividad de la brasinólida en las plantas. Los fragmentos biológicamente funcionales, por ejemplo, pueden variar en tamaño desde un fragmento de polipéptido tan pequeño como un epítopo capaz de fijar una molécula de anti-cuerpo, hasta un polipéptido grande capaz de participar en la inducción o programación característica de cambios fenotípicos adentro de una célula. Los fragmentos funcionales de BAS1 incluyen fragmentos antigénicos. La actividad moduladora de la brasinólida de BAS1 se puede utilizar en bioensayos, para identificar fragmentos biológicamente activos del polipéptido BAS1 o polipéptidos relacionados. Por ejemplo, el BAS1 puede modular la actividad de fo¡ la brasinólida en diferentes tejidos, o de una manera específica al tejido; por lo tanto, se puede realizar un ensayo para detectar la actividad de brasinólida de BASl. Se pueden usar inhibidores de BAS1, tales como los ácidos nucleicos anti -sentido de BAS1, para provocar la pérdida de la función de BAS1, dando como resultado, por ejemplo, hipocotíleos que sean ligeramente más largos que el tipo silvestre en crecimiento a la sombra, y que tengan una responsividad reducida a la luz blanca, muy roja y azul, en comparación con las plantas tipo silvestre. Los polipéptidos de la invención también incluyen formas negativas dominantes del polipéptido BAS1 que no tienen la actividad biológica de BASl. Una "forma negativa dominante" de BAS1 es un polipéptido que es estructuralmente similar a BAS1, pero no tiene la función de BAS1 de tipo silvestre. Por ejemplo, un polipéptido BAS1 negativo dominante puede interferir con la función del BAS1 de tipo silvestre, por medio de fijarse a, o secuestrar de otra manera, agentes reguladores, tales como componentes corriente arriba o corriente abajo, que normalmente interactúan funcionalmente con el polipéptido BASl. Las modificaciones menores de la secuencia de aminoácidos principal de BAS1 pueden dar como resultado proteínas que tengan actividad sustancialmente equivalente al polipéptido BAS1 descrito en la presente en la SEQ ID NO : 2 (Figura 1) . Esas modificaciones pueden ser deliberadas, tal como mediante mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser espontáneas. En la -,.,-. - .. Jf t > i . presente están incluidos todos los polipéptidos producidos mediante estas modificaciones, siempre y cuando esté presente la actividad biológica del BAS1, por ejemplo, que esté presente la modificación de la síntesis y/o señalización de brasinólida o ecdiesteroide. Además, la supresión de uno o más aminoácidos también puede dar como resultado una modificación de la estructura de la molécula resultante, sin alterar significativamente su actividad. Esto puede llevar al desarrollo de una molécula activa más pequeña que pueda tener actividad más amplia. Por ejemplo, pudiera ser posible remover los aminoácidos con terminal amino o carboxi que no se requieran para la actividad de BASl. El polipéptido BAS1 incluye secuencias de aminoácidos sustancialmente iguales a la secuencia establecida en la SEQ ID NO : 2. La invención incluye polipéptidos que tengan sustancialmen-te la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO : 2 , fragmentos funcionales de la misma, y secuencias de aminoácidos que sean sustancialmente idénticas a la SEQ ID NO : 2. Con "sustancialmente la misma" o "sustancialmente idéntica" se quiere decir un polipéptido o ácido nucleico que exhiba cuando menos el 80 por ciento, de preferencia el 85 por ciento, de más preferencia el 90 por ciento, y de mayor preferencia el 95 por ciento de homología con una secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de referencia. Para los polipépti-dos, la longitud de las secuencias de comparación generalmente será de cuando menos 16 aminoácidos, de preferencia cuando menos 20 aminoácidos, de más preferencia cuando menos 25 aminoácidos, y de mayor preferencia cuando menos 35 aminoácidos. Para los ácidos nucleicos, la longitud de las secuencias de comparación generalmente será de cuando menos 50 nucleótidos, de preferencia cuando menos 60 nucleótidos, de más preferencia cuando menos 75 nucleótidos, y de mayor preferencia cuando menos 110 nucleótidos. Los homólogos de BAS1 se pueden identificar como teniendo un porcentaje de homología con BAS1 dentro de estos rangos. Los fragmentos funcionales incluyen aquellos fragmentos de BAS1 que retienen la función o actividad de BAS1, tal como la habilidad para modular la síntesis o señalización de la brasinólida. Un técnico en la materia puede clasificar la funcionalidad de un fragmento mediante el uso de los ejemplos que se proporcionan en la presente, en donde se describe el BAS1 de longitud completa. También se prevé que los fragmentos de BAS1 que inhiban o promuevan la síntesis o señalización de la brasinólida se puedan identificar de una manera similar. Con "sustancialmente idéntica" se quiere decir una secuencia de aminoácidos que difiere únicamente en sustituciones de aminoácidos conservadoras, por ejemplo, la sustitución de un aminoácido por otro de la misma clase (por ejemplo, valina por glicina, arginina por lisina, etcétera) , o por una o más sustituciones no conservadoras, supresiones, o inserciones localizadas en posiciones de la secuencia de aminoácidos que no destruyen la función de la proteína ensayada (por ejemplo, como se describe en la presente) . De preferencia, esa secuencia es cuando menos el 85 por ciento, de más preferencia el 100 por ciento idéntica al nivel de aminoácidos a la SEQ ID NO : 2. La homología frecuentemente se mide usando software de análisis de secuencias (por ejemplo, el Paquete Sequence Analysis Software del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, Estados Unidos) . Ese software compara secuencias similares mediante la asignación de grados de homología a diferentes sustituciones, supresiones, sustituciones, y otras modificaciones . Con un "polipéptido sustancialmente puro" se quiere decir un polipéptido BAS1 que se ha separado de los componentes que lo acompañan naturalmente. Típicamente, el polipéptido es sustancialmente puro cuando éste está cuando menos el 60 por ciento en peso libre de proteínas y moléculas orgánicas naturalmente ocurrentes con las cuales éste está naturalmente asociado. De preferencia, la preparación es cuando menos el 75 por ciento, de preferencia cuando menos el 90 por ciento, y de mayor preferencia cuando menos el 99 por ciento en peso, el polipéptido BASl. Un polipéptido BAS1 sustancialmente puro se puede obtener, por ejemplo, mediante la extracción de una fuente natural (por ejemplo, una célula de planta) ; mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante que codifique un polipéptido BAS1; o mediante la sintetización química de la proteína. La pureza se puede medir mediante cualquier método apropiado, por ejemplo, aquellos que se describen en cromatografía de columna, electroforesis de gel de poliacrilamida, o análisis HPLC. Una proteína está sustancialmente libre de componentes naturalmente asociados cuando ésta se separa de aquellos contaminantes que la acompañan en su estado natural . De esta manera, una proteína que se sintetice químicamente o se produzca en un sistema celular diferente de la célula a partir de la cual ésta se origina naturalmente, estará sustancialmente libre de sus componentes naturalmente asociados. De conformidad con lo anterior, los polipéptidos sustancialmente puros incluyen aquellos que se derivan de organismos eucarióticos, pero se sintetizan en E. coli u otros procariotes. La invención proporciona polinucleótidos que codifican la proteína BASl. Estos polinucleótidos incluyen secuencias de ADN, ADNc, y ARN que codifican a BASl. Se entiende que en la presente también están incluidos todos los polinucleótidos que codifican a BAS1, siempre y cuando éstos codifiquen un polipéptido con actividad BASl. Esos polinucleótidos incluyen polinucleó-tidos naturalmente ocurrentes, sintéticos, e intencionalmente manipulados. Por ejemplo, el polinucleótido basl se puede someter a mutagénesis dirigida al sitio. La secuencia de polinucleótidos que codifica a BAS1 también incluye secuencias anti - sentido, secuencias que codifican formas negativas dominantes de BAS1, y secuencias que codifican fragmentos de BAS1 o péptidos. Los polinucleótidos de la invención incluyen secuencias que son degeneradas como un resultado del código genético. Existen 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales se especifican por más de un codón. Por lo tanto, en la invención están incluidas todas las secuencias de nucleótidos degeneradas, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos del polipéptido BAS1 codificado por la secuencia de nucleótidos esté funcionalmente sin cambios. Específicamente descrita en la presente está una secuencia de polinucleótidos que contiene el gen basl . De preferencia, la secuencia de nucleótidos de basl es la SEQ ID NO : 1. El término "polinucleótido" o "secuencia de ácidos nucleicos" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cuando menos 10 bases de longitud. Con "polinucleótido aislado" o "polinucleótido purificado" se quiere decir un polinucleótido que no es inmediatamente contiguo con ambas secuencias codificadoras con las cuales éste es inmediatamente contiguo (una en el extremo 5', y una en el extremo 3') en el genoma naturalmente ocurrente del organismo a partir del cual se deriva éste. El término, por lo tanto, incluye por ejemplo, un ADN recombinante que está incorporado dentro de un vector; dentro de un plásmido autónomamente duplicador o virus; o dentro del ADN genómico de un procariote o eucariote; o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc) independiente de otras secuencias. Los nucleótidos de la invención pueden ser ribonucleótidos, desoxi-rribonucleótidos, o formas modificadas de cualquier nucleótido. El término incluye formas individuales o dobles de ADN. Este también incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica la secuencia de polipéptidos adicional. La invención también proporciona una secuencia de polinucleótidos aislada que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 2. El transcrito basl contiene un solo marco de lectura abierto largo, que codifica una proteína de aproximadamente 510 aminoácidos. El polinucleótido que codifica a BAS1 incluye la secuencia de nucleótidos en la Figura 1 (SEQ ID N0:1), así como las secuencias de ácidos nucleicos complementarias a esa secuencia. Una secuencia complementaria puede incluir un nucleótido anti - sentido. Cuando la secuencia es ARN se reemplazan los desoxirribonucleótidos A, G, C, y T de la Figura 1, por los ribonucleótidos A, G, C, y U, respectivamente. En la invención también están incluidos fragmentos ("sondas") de las secuencias de ácidos nucleicos descritas anteriormente, que son de cuando menos 15 bases de longitud, la cual es una longitud suficiente para permitir que la sonda se hibride selectivamente al ADN que codifica la proteína de la Figura 1 (SEQ ID NO : 2 ) . "Hibridación selectiva", como se usa en la presente, se refiere a la hibridación bajo condiciones fisiológicas moderadamente estringentes o altamente estringentes (Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis y colaboradores, Molecular Cloning * .i .i ?. -k*ÍíStíÍ Címí..-..Mrn. M .

A Labora tory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989, incorporado en la presente por referencia) , que distingue las secuencias de nucleótidos basl relacionadas de las no relacionadas . Específicamente descrita en la presente está una secuencia de ADNc para el gen basl . La Figura 1 muestra las secuencias de ADNc completa y de proteínas deducida (SEQ ID NO : 1 y 2, respectivamente). Una secuencia de ácidos nucleicos "sustancialmente idéntica" codifica por una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica como se definió anteriormente. En las reacciones de hibridación de ácido nucleico, las condiciones que se usan para conseguir un nivel particular de estringencia variarán, dependiendo de la naturaleza de los ácidos nucleicos que se estén hibridando. Por ejemplo, se pueden considerar la longitud, el grado de complementariedad, la composición de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, contenido de GC contra AT) , y el tipo de ácido nucleico (por ejemplo, ARN contra ADN) de las regiones de hibridación de los ácidos nucleicos, para seleccionar las condiciones de hibridación. Una consideración adicional es si uno de los ácidos nucleicos está inmovilizado, por ejemplo, en un filtro. Un ejemplo de condiciones de estringencia progresivamente más altas es como sigue: 2 x SSC/SDS al 0.1 por ciento casi a la temperatura ambiente (condiciones de hibridación) ; 0.2 x ,|, j .

SSC/SDS al 0.1 por ciento casi a la temperatura ambiente (condiciones de estringencia baja); 0.2 x SSC/SDS al 0.1 por ciento a aproximadamente 42 °C (condiciones de estringencia moderada); y 0.1 x SSC a aproximadamente 68°C (condiciones de estringencia alta) . El lavado se puede realizar usando únicamente una de estas condiciones, por ejemplo, condiciones de estringencia alta, o se puede usar cada una de las condiciones, por ejemplo, durante 10-15 minutos cada una, en el orden enlistado anteriormente, repitiendo cualquiera o todos los pasos enlístados. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, las condiciones óptimas variarán, dependiendo de la reacción de hibridación particular implicada, y se pueden determinar empíricamente. Una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido BAS1 de la invención incluye secuencias de nucleóti-dos que codifican la secuencia descrita (por ejemplo, la SEQ ID NO : 2 ) , y variaciones conservadoras de la misma. El término "variación conservadora", como se usa en la presente, denota el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro residuo, biológicamente similar. Los ejemplos de variaciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina, o metionina, por otro, o la sustitución de un residuo polar por otro, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por aspártico, o glutamina por asparagina, y similares. El término "variación conservadora" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido madre no sustituido, con la condición de que los anti-cuerpos que surgen al polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido no sustituido. Las secuencias de ADN que codifican a BAS1 se pueden expresar in vi tro mediante transferencia de ADN dentro de una célula hospedera adecuada. Las "células hospederas" son células en las cuales se puede propagar un vector y expresar su ADN. La célula puede ser procariótica o eucariótica. El término también incluye cualquier progenie de la célula hospedera sujeto. Se entiende que toda la progenie pudiera no ser idéntica a la célula madre, puesto que puede haber mutaciones que ocurran durante la réplica. Sin embargo, esa progenie está incluida cuando se usa el término "célula hospedera" . En la materia se conocen los métodos de transferencia estable, queriendo decir que el ADN extranjero se mantiene continuamente en el anfitrión. En la presente invención, las secuencias de polinucleótidos basl se pueden insertar dentro de un vector de expresión. El término "vector de expresión" se refiere a un plásmido, virus u otro vehículo conocido en la materia, que se haya manipulado mediante la inserción o incorporación de las secuencias genéticas que codifican a BASl. Una secuencia de polinucleótidos que codifica a BAS1 se puede enlazar operablemente a las secuencias de control de expresión, "enlazado operablemente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar de su manera pretendida. ÍM,í ta«*-i--*Jfa>tJ"fc- iuij Una secuencias de control de expresión enlazada operativamente a una secuencia codificadora se liga de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se consigue bajo condiciones compatibles con las secuencias de control de expresión. Como se usa en la presente, el término "secuencia de control de expresión" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que regula la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos a la cuál ésta está operativamente enlazada. Las secuencias de control de expresión están operativamente enlazadas a una secuencia de ácidos nucleicos cuando las secuencias de control de expresión controlan y regulan la transcripción y, según sea apropiado, la traslación de la secuencia de ácidos nucleicos. De esta manera, las secuencias de control de expresión pueden incluir promotores apropiados, mejoradores, terminadores de transcripción, un codón de inicio (es decir, ATG) enfrente de un gen que codifica la proteína, una señal de empalme para intrones, o el mantenimiento del marco de lectura correcto de ese gen, para permitir la traslación apropiada del ARNm, y los codones de detención. El término "secuencias de control" se pretende que incluya, como mínimo, los componentes cuya presencia sea conveniente, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañero de fusión. Las secuencias de control de expresión pueden incluir un promotor. Con "promotor" se quiere decir la secuencia mínima suficiente para dirigir la transcripción. En la invención también _. z están incluidos aquellos elementos promotores que son suficientes para producir la expresión de gen dependiente del promotor, que se puede controlar por específica al tipo de célula, específica al tejido, o la expresión que se puede inducir mediante señales o agentes externos. Esos elementos pueden estar localizados en las regiones 5' o 3' del gen. En la invención están incluidos los promotores tanto constitutivos como inducibles (ver, por ejemplo, Bitter y colaboradores, 1987, Methods in Enzymology 153:516-544) . La expresión de los genes estructurales que se emplean en la presente invención se puede activar por medio de muchos promotores. Aunque se puede utilizar el promotor endógeno de un gen estructural de interés para la regulación transcripcional del gen, de preferencia, el promotor es una secuencia reguladora extranjera. Para los vectores de expresión de plantas, los promotores virales adecuados incluyen los promotores ARN 35S y ARN 19S del CaMV (Brisson y colaboradores, Nature, 310:511, 1984; Odell y colaboradores, Nature, 313 : 810 , 1985); el promotor de transcrito de longitud completa del Virus de Mosaico de Escrofu- laria (FMV) (Gowda, y colaboradores, J. Cell Biochem . , 13D:301, 1989) y el promotor de proteína de cobertura de TMV (Takamatsu, y colaboradores, EMBO J. 6:307, 1987). Alternativamente, se pueden usar promotores de planta tales como el promotor inducible por luz de la subunidad pequeña de carboxilasa de bisfosfato de ribulosa (ssRUBISCO) (Corussi, y colaboradores, EMBO J. , 3 : 1611 , 1984; Broglie, y colaboradores, Science, 224 : 838 , 1984); el djg^^ j^ promotor de sintasa de manopina (Velten, y colaboradores, EMBO J. , 2:2723, 1984), los promotores de smtasa de nopalina (NOS) y sintasa de octopina (OCS) (llevados en plásmidos inductores de tumores de Agrobacterium tumefaciens y tienen actividad de planta) ; el promotor inducible por etileno cuyo nivel de actividad se incrementa en respuesta al tratamiento con etileno, o un compuesto equivalente tal como propileno; los promotores de golpe de calor, por ejemplo, hspl7.5-E o hspl7.3-B de frijol de soya (Gurley, y colaboradores, Mol . Cell . Biol . , 6.:1986; Severin, y colaboradores, Plant Mol . Biol . , 1?>:827, 1990); o los promotores inducibles por etanol (Caddick y colaboradores, Nature Biotech . , 16:177, 1998). Los promotores útiles en la invención incluyen promotores naturales tanto constitutivos como inducibles, así como promotores diseñados. Los promotores de CaMV son ejemplos de promotores constitutivos. Para ser más útil, un promotor mducible debe 1) proporcionar baja expresión en la ausencia del inductor; 2) proporcionar alta expresión en la presencia del inductor; 3) usar un esquema de inducción que no interfiera con la fisiología normal de la planta; y 4) no tener ningún efecto sobre la expresión de otros genes. Los ejemplos de promotores inducibles útiles en plantas incluyen aquellos inducidos por medios químicos, tal como el promotor de metalotioneína de levadura, el cual se activa mediante iones de cobre (Mett, y colaboradores, Proc . Na ti . Acad . Sci . , U. S . A . , 9_0:4567, 1993); ?-- c?~¿ Jy.iJ.j.1 « ,» las secuencias reguladoras In2-1 e In2-2, las cuales se activan por medio de bencensulfonamidas sustituidas, por ejemplo, aseguradores herbicidas (Hershey, y colaboradores, Plant Mol . Biol . , 17:679, 1991); las secuencias reguladoras GRE, que se inducen por medio de glucocorticoides (Schena, y colaboradores, Proc . Na ti . Acad . Sci . , U. S . A . , 88:10421, 1991); y promotores inducibles por etanol (Caddick y colaboradores, supra) . Los técnicos en la materia conocerán otros promotores (tanto constitutivos como inducibles) y mejoradores. El promotor particular seleccionado debe ser capaz de provocar suficiente expresión, para dar como resultado la sobre-expresión del producto de gen estructural, por ejemplo, BAS1, para disminuir la síntesis o señalización de la brasinólida. La síntesis o señalización disminuida de la brasinólida se caracte-riza por la hiperresponsividad a la brasinólida de una manera dependiente de la luz, la presencia de los hipocotíleos que son más largos que los de tipo silvestre, y la sensibilidad reducida a una diversidad de condiciones de luz, en comparación con las plantas de tipo silvestre. Los promotores que se usan en las construcciones de vector de la presente invención se pueden modificar, si se desea, para afectar sus características de control. En un planteamiento preferido, se incorporan las copias multimerizadas de elementos mejoradores del promotor 35S del virus de mosaico de coliflor (CaMV), cerca (por ejemplo, dentro de 381 nucleótidos) de 5 ' al inicio del gen basl . Cuando estos mej oradores se insertan cerca de un gen, se puede mejorar su transcripción. En la presente invención también se pueden utilizar promotores específicos al tejido. Como se usa en la presente, el término "promotor específico al tejido" significa una secuencia de ADN que sirve como un promotor, es decir, regula la expresión de una secuencia de ADN seleccionada, enlazada operablemente al promotor. Un promotor específico al tejido efectúa la expresión de la secuencia de ADN seleccionada en células específicas, por ejemplo, en la raíz o en el retoño de una planta. El término también cubre los promotores llamados "agrietados", los cuales regulan la expresión de un ADN seleccionado principalmente en un tejido, pero también provocan la expresión en otros tejidos. Esos promotores también pueden incluir secuencias de ADN adicionales que sean necesarias para la expresión, tales como intrones y secuencias mejoradoras. Un ejemplo de un promotor específico al tejido es el promotor HHA expresado en meristemas del retoño (Atanassova, y colaboradores, Plant J. , 2 = 291, 1992). Los técnicos en la materia conocerán otros promotores específicos al tejido, útiles en plantas transgénicas, incluyendo el promotor cdc2a y el promotor cycOl . (Ver por ejemplo, Ito y colaboradores, Plant Mol . Biol . , 2^:863, 1994; Martínez, y colaboradores, Proc . Na ti . Acad . Sci . USA, 29=7360, 1992; Medford, y colaboradores, Plant Cell , 3:359, 1991; Terada, y colaboradores, Plant Journal , 2=241, 1993; Wissenbach, y colaboradores, Plant Journal , 4:411, 1993) . Los ejemplos de promotores específicos al tejido, activos en los meristemas florales, son los promotores de los genes apétala 3 y apétala 1 , que se describen en Jack y colaboradores, Cell , 76.: 703, 1994; y Hempel y colaboradores, Development, 121:3845, 1997. En adición, en la práctica de la invención puede ser útil el promotor específico al meristema del gen UFO (patente de los Estados Unidos No. 5,880,330). En otra modalidad, la invención proporciona una secuencia de ácidos nucleicos aislada, que comprende una secuencia reguladora no codificadora, aislada corriente arriba de un gen basl, en donde esa secuencia de ácidos nucleicos contiene cuando menos un sitio de restricción para clonar una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga de interés. En la Figura 1C (SEQ ID NO: 16) se muestra una secuencia reguladora de basl ejemplar. La invención también proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende, leyendo de la dirección 5' a 3', una secuencia no codificadora 5' aislada del gen basl, y una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un gen estructural, en donde esa secuencia de ácidos nucleicos es heteróloga a esa secuencia no codificadora 5 ' . La construcción es útil para la producción de plantas transgénicas que expresen un gen de interés de una manera específica al tejido, por ejemplo. Opcionalmente, un marcador seleccionable puede estar asociado con la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga, es decir, el gen estructural operablemente enlazado a un promotor.

Como se usa en la presente, el término "marcador" se refiere a un gen que codifica una cualidad característica o un fenotipo, que permite la selección de, o la clasificación por, una planta o célula de planta que contenga el marcador. El gen marcador puede ser un gen de resistencia a antibióticos que permita que se use el antibiótico apropiado para seleccionar células transformadas de entre células que no estén transformadas, o el gen marcador puede ser un gen de resistencia a herbicidas. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados incluyen resistencia a deaminasa de adenosina, reductasa de dihidrofolato, higromicin-B-fosfotransferasa, cinasa de timidina, fosfo-ribosiltransferasa de xantina - guanina, glucofosfato y glufosinato, y 3 ' -0-fosfotrans-ferasa II de amino-glucósido (resistencia a canamicina, neomicina y G418) . Los técnicos en la materia conocerán otros marcadores adecuados. El (los) vector (es) que se emplea (n) en la presente invención para la transformación de una célula de planta, para modular la síntesis o señalización de la brasinólida, comprende (n) una secuencia de ácidos nucleicos que comprende cuando menos un gen estructural que codifica una proteína (por ejemplo, BAS1) , que modula la síntesis o señalización de la brasinólida, asociado operablemente con un promotor. Para comenzar un proceso de transformación de conformidad con la presente invención, primeramente es necesario construir un vector adecuado, e introducirlo apropiadamente dentro de la célula de planta. Los técnicos en el campo de la ingeniería genética de plantas conocen los detalles de la construcción de vectores adecuados para usarse en la presente. En la presente invención, de preferencia el gen que codifica una proteína que modula la síntesis o señalización de la brasinólida, es el gen basl . El gen basl se puede utilizar solo o en combinación con otro gen estructural, tal como otro gen que codifique una proteína importante en la síntesis y/o señalización de la brasinólida. Los ejemplos de esos genes incluyen binl y otros ejemplos de CYP72 en Arabidopsi s , tal como chibi2 , y similares, y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos heterólogas que se utilizaron en la presente invención se pueden introducir dentro de las células de planta usando los plásmidos Ti, plásmidos inductores de raíz (Ri) , y vectores de virus de planta. (Para revisiones de esas técnicas, ver por ejemplo, Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York, Sección VIII, páginas 421-463, 1998; Grierson y Corey, Plant Molecular Biology, 2a. edición, Blackie, Londres, Capítulos 7-9, 1998; y Horsch, y colaboradores, Sci ence, 227 : 1229 , 1985, todos los cuales son incorporados en la presente por referencia) . Un técnico en la materia será capaz de seleccionar un vector apropiado para introducir la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga en un estado relativamente intacto. De esta manera, debe ser suficiente cualquier vector que produzca una planta que -M..?. i A JL i lleve la secuencia de ADN introducida. Se esperaría que hasta una pieza simple de ADN fuera capaz de conferir las propiedades de esta invención, aunque a baja eficiencia. La selección del vector, o si usar un vector, típicamente se guía mediante el método de transformación seleccionado. La transformación de plantas de conformidad con la invención se puede realizar en esencialmente cualquiera de las diferentes maneras que conocen los técnicos en el campo de la biología molecular de plantas. (Ver, por ejemplo, Methods of Enzymoloqy, Volumen 153, 1987, Wu y Grossman, Eds., Academic Press, incorporado en la presente por referencia) , y como se describe en los Ejemplos en la presente, que ilustran la invención. Como se usa en la presente, el término "transformación" significa la alteración del genotipo de una planta hospedera, mediante la introducción de una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga. "Transformación" se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno dentro de una célula hospedera, sin importar el método que se use para la inserción, por ejemplo, captación directa, transducción, bombardeo, o electroporación. El polinucleótido exógeno se puede mantener como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido, o alternativamente, se puede integrar dentro del genoma anfitrión. Un planteamiento, conocido como transformación directa, induce la captación e integración del plásmido o ADN linearizado en el genoma de los protoplastos de la planta, es decir, células . ,-*, . ,*' s . individuales descortezadas del material de la pared celular (Lorz y colaboradores, Mol . Genet . , 199:178-182, 1985). Otro planteamiento envuelve la transferencia de bacteriófago exógeno o ADN de plásmido dentro de granos de polen en germinación, para modificar las propiedades de la planta. Puesto que el cañón de polen brota a partir del grano de polen maduro, el material de la pared celular se deposita detrás de la punta en crecimiento. Un tercer planteamiento depende de la infección por la bacteria Agrobacterium, que inserta las secuencias de un plásmido, conocido como el plásmido Ti, dentro del genoma de las células de planta (Chilton y colaboradores, Cell 11:263:271, 1977) . Se puede introducir una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga dentro de una célula de planta, utilizando Acr/rro-acte-ri um tumefaciens que contiene el plásmido Ti. Al usar un cultivo de A. tumefaciens como un vehículo de transformación, es más conveniente usar una cepa no oncogénica de la Agrobacterium como el portador de vector, de tal manera que sea posible la diferenciación no oncogénica normal de los tejidos transformados. También se prefiere que la Agrobacterium albergue un sistema de plásmido Ti binario. Ese sistema binario comprende 1) un primer plásmido Ti que tiene una región de virulencia esencial para la introducción de ADN de transferencia (ADN-T) dentro de las plantas, y 2) un plásmido quimérico. El último contiene cuando menos una región limítrofe de la región de ADN-T de un plásmido Ti tipo silvestre, que flanquea el ácido nucleico que se va a -.'«a* t»? i í k transferir. Los sistemas de plásmido Ti binarios se han mostrado efectivos para transformar células de planta (De Framond, Biotechnology, 1 : 262 , 1983; Hoekema, y colaboradores, Nature, 303 : 179 , 1983). Se prefiere ese sistema binario porque éste no requiere la integración dentro del plásmido Ti en Agrobacterium . Los métodos que envuelven el uso de Agrobacterium incluyen, pero no están limitados a: 1) el cocultivo de Agrobacterium con protoplastos aislados cultivados; 2) la transformación de células o te idos de planta con Agrobacterium; o 3) la transformación de semillas, ápices o meristemas con Agrobacte-rium . En adición, la transferencia de genes se puede realizar mediante la transformación in si tu por Agrobacterium, como la describe Bechtold, y colaboradores ( C. R . Acad . Sci . Paris, 316 : 1194 , 1993) . Este planteamiento se basa en la infiltración al vacío de una suspensión de células de Agrobacteri um . El método preferido para introducir el ácido nucleico heterólogo dentro de las células de planta es infectar esas células de planta, una explantación, un meristema o una semilla, con Agrobacterium tumefaciens como se describió anteriormente. Bajo las condiciones apropiadas, conocidas para los técnicos en la materia, las células de planta transformadas se crían para formar retoños, raíces, y desarrollarse adicionalmente en plantas . Un vector (es) preferido (s) de la invención comprende un sistema binario de plásmido Ti, en donde la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga codifica la proteína BASl. Ese vector puede contener opcionalmente cuando menos otra secuencia de ácidos nucleicos que codifique un segundo vector o proteína activo en la síntesis o señalización de la brasinólida, tal como BIN1 o CHIBI2 y combinaciones de los mismos. Alternativamente, se pueden utilizar dos vectores, en donde cada vector contiene cuando menos una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga. Se puede utilizar otra actividad de brasinólida o ecdiesteroide que modifique los genes, para la construcción de uno o más vectores, de una manera similar. Alternativamente, el ácido nucleico heterólogo se puede introducir dentro de una célula de planta por medio de contactar la célula de la planta, usando medios mecánicos o químicos. Por ejemplo, el ácido nucleico se puede transferir mecánicamente mediante microinyección, directamente dentro de las células de planta, mediante el uso de micropipetas . Alternativamente, el ácido nucleico se puede transferir dentro de la célula de planta mediante el uso de polietilenglicol, el cual forma un complejo de precipitación con material genético que capta la célula. El ácido nucleico heterólogo también se puede introducir dentro de las células de planta mediante electroporación (Fromm, y colaboradores, Proc . Na ti . Acad . Sci . , U. S . A . , 82 : 5824 , 1985, que se incorpora en la presente por referencia) . En esta técnica, se electroporan los protoplastos de la planta en la l .í..,i *i A 4* j i-.it.J-i., presencia de vectores o ácidos nucleicos que contengan las secuencias de ácidos nucleicos relevantes. Los impulsos eléctricos de resistencia de campo alta permeabilizan inversamente las membranas, permitiendo la introducción de los ácidos nucleicos. Los protoplastos de la planta electroporados reforman la pared celular, se dividen y forman un callo de planta. La selección de las células de planta transformadas con el gen transformado se puede realizar usando marcadores fenotípicos como se describió en la presente. Otro método para introducir el ácido nucleico dentro de una célula de planta es una penetración balística a alta velocidad, mediante partículas pequeñas con el ácido nucleico que se introducirá contenido ya sea adentro de la matriz de pequeños glóbulos o partículas, o sobre la superficie de los mismos (Klein, y colaboradores, Nature, 327:70, 1987) . Aunque típicamente sólo se requiere una sola introducción de una secuencia de ácidos nucleicos nueva, este método permite particularmente múltiples introducciones. También se puede usar el virus de mosaico de coliflor (CaMV) como un vector para introducir ácido nucleico heterólogo dentro de las células de planta (patente de los Estados Unidos No. 4,407,956) . El genoma de ADN viral de CaMV se inserta dentro de un plásmido bacteriano madre, creando una molécula de ADN recombmante que se puede propagar en la bacteria. Después de la clonación, el plásmido recombinante se puede clonar nuevamente, Í ^st-i¡i¿IBA»-B ía¿b-a--^'te*'"''^----A--y modificar adicionalmente mediante la introducción de la secuencia de ácidos nucleicos deseada. La porción viral modificada del plásmido recombinante se escinde del plásmido bacteriano madre, y se usa para inocular las células de planta o las plantas. También se conocen métodos para usar el virus de mosaico del tabaco como un vector, para obtener la expresión de ADN recombinante (patente de los Estados Unidos No. 5,955,647) . En otra modalidad, la invención proporciona un método para modificar genéticamente una célula de planta, de tal manera que una planta producida a partir de la célula, esté caracterizada por tener síntesis o señalización modulada de la brasinólida. La actividad de brasinólida modulada incluye un cambio en la estatura de planta, el color de las hojas, y la sensibilidad a la luz, en comparación con una planta tipo silvestre. El método incluye introducir cuando menos un polinucleótido que codifique a BAS1 de la invención, dentro de una célula de planta, para obtener una célula de planta transformada, y criar la célula de planta transformada bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido BAS1, produciendo mediante lo mismo una planta que tenga síntesis o señalización de brasinólida modulada. El término "modulada" se refiere a la síntesis o señalización incrementada o disminuida de brasinólida o ecdiesteroide, en comparación con una planta de tipo silvestre. Por ejemplo, una planta que tenga actividad disminuida de brasinólida, provocada por la sobre-expresión de BAS1, se caracteriza por uno o más de i. .i. los siguientes: hipersensibilidad a luz muy roja en un fonda PHYA, y carencia de responsividad en un fondo nulo phyA, etiolación con hipocotíleos de longitud casi de tipo silvestre en plántulas criadas a la sombra, y enanismo con hojas verde oscuro en plantas adultas. La actividad disminuida de brasinólida o ecdiesteroide se puede conseguir mediante la inducción o aumento de la expresión del gen basl , o la actividad del polipéptido BASl. En la presente se describen los vectores que codifican el polipépti-do BAS1, que son útiles en el método de la invención. Por ejemplo, se puede usar la expresión del gen basl bajo el control de un promotor inducible o un promotor constitutivo, para incrementar la producción de BAS1 sobre los niveles que se encuentran en las plantas de tipo silvestre. De manera similar, la actividad incrementada de brasinólida o ecdiesteroide se puede conseguir mediante la inhibición de la expresión del gen basl endógeno, o la actividad del polipéptido BAS1 en la planta. Se pueden usar las secuencias de ácidos nucleicos negativas dominantes BAS1 anti - sentido o BAS1, para inhibir la expresión del gen basl , o disminuir la actividad de la proteína BAS1 de tipo silvestre, respectivamente, por ejemplo. Por ejemplo, las versiones negativas dominantes de BAS1 y/u otros genes reguladores de la síntesis o señalización de brasinólida, se pueden expresar constitutivamente. Los mutantes negativos dominantes son proteínas que interfieren activamente con la función de una proteína endógena normal. De esta manera, se puede bloquear la acción de un gen sin inactivar el gen estructural mismo o si ARN. Esta estrategia ha sido exitosa tanto para las moléculas de transducción de señal, como para los factores de transcripción (por ejemplo, Attardi, y colaboradores, Proc . Nati . Acad . Sci . USA, 90.: 10563, 1993; Lloyd, y colaboradores, Nature, 352 :635, 1991; Logeat , y colaboradores, EMBO J. , 10:1827, 1991; Mantovani , y colaboradores J". Biol . Chem . , 269=20340, 1994; Ransone, y colaboradores, Proc . Na ti . Acad . Sci . USA, 87:3806, 1990; Richardson, y colaboradores, Mech . Dev. , 5:173, 1994; Tsai , y colaboradores, Genes Dev. , 6:2258, 1992; Thomas y colaboradores, Nature Geneti cs, 37:58, 1997; Wittbrodt, J. Y Rosa, F., Genes and Development , 2=1448, 1994; Kashles y colaboradores, Mol . Cell . Biol . , 11:1454, 1991; Pierce y Kimelman, Development , 121 : 755 , 1995). En otra modalidad, la invención incluye un método para producir una planta genéticamente modificada, caracterizada porque tienen estatura de adulto enano con follaje verde oscuro, incluyendo poner en contacto una célula de planta con un vector que contenga una secuencia de ácidos nucleicos exógena, que comprenda cuando menos un gen estructural que codifique un polipéptido BAS1, operablemente asociado con la secuencia reguladora que provoca la sobre-expresión el gen, para obtener una célula de planta transformada; producir una planta a partir Ü ... t -1 á t.-.i. y ¿Íii¿i,.Aj j ima..^,.. .. -. de la célula de planta transformada; y seleccionar una planta que exhiba estatura de adulto enano con follaje verde oscuro, en comparación con las plantas de tipo silvestre. Como se usa en la presente, el término "poner en contacto" se refiere a cualquier medio para introducir el (os) vector (es) dentro de la célula de planta, incluyendo medios químicos y físicos, como se describió anteriormente. De preferencia, poner en contacto se refiere a introducir el ácido nucleico o vector dentro de las células de planta (incluyendo una explantación, un meristema, o una semilla) , por medio de Agrobacterium tumefaci ens transformada con el ácido nucleico heterólogo como se describió anteriormente . Normalmente, se regenera una célula de planta para obtener una planta completa del proceso de transformación. Se hace referencia al producto inmediato de la transformación como "transgenote" . El término "criar" o "regeneración" como se usa en la presente, significa criar una planta completa a partir de una célula de planta, un grupo de células de planta, una parte de la planta (incluyendo las semillas) , o una pieza de planta (por ejemplo, a partir de un protoplasto, callo, o parte de tejido) . La célula de planta, como se usa en la presente, incluye, sin limitación, algas, cianobacterias, semillas, cultivos de suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, raíces, retoños, gametofitos, esporófitos, polen, y micro-esporas . 1-1.. .Í.?.Á..?..

La regeneración a partir de los protoplastos varía de especie a especie de plantas, pero generalmente primero se hace una suspensión de protoplastos. En ciertas especies, se puede inducir entonces la formación de embriones a partir de la suspensión de protoplastos, a la etapa de maduración y germinación como embriones naturales. El medio de cultivo generalmente contendrá diferentes aminoácidos y hormonas, necesarios para crecimiento y regeneración. Los ejemplos de las hormonas que se utilizan incluyen auxina y citoquininas . Algunas veces es conveniente añadir ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para especies tales como maíz y alfalfa. La regeneración eficiente dependerá del medio, del genotipo, y de la historia del cultivo. Si se controlan estas variables, la regeneración se puede reproducir. La regeneración también ocurre a partir del callo, explantaciones, órganos o partes de la planta. La transformación se puede realizar en el contexto de regeneración de órgano o parte de planta. (Ver Methods in Enzymology, Volumen 118, y Klee, y colaboradores, Annual Review of Plant Physiology, 22=467, 1987) . Utilizando el método de transformación regeneración de disco de hoja de Horsch y colaboradores, Science, 227 : 1229 , 1985, se cultivan los discos en medio selectivo, seguido por la formación de retoños en aproximadamente 2-4 semanas. Los retoños que se desarrollan se escinden de los callos, y se trasplantan a la tierra tan pronto como es posible después de que aparecen las a-i -A ¿¿Lmbto??Í?.1 raíces. Las plántulas se pueden volver a plantar en macetas hasta que alcancen la madurez. En cosechas que se propagan de manera vegetativa, las plantas transgénicas maduras se propagan mediante la toma de cortes o mediante técnicas de cultivo de tejido, para producir múltiples plantas idénticas. Se hace la selección de transgenotes deseables, y se obtienen nuevas variedades y se propagan de manera vegetativa para uso comercial. En cosechas propagadas de semillas, las plantas transgénicas maduras se pueden auto-cruzar para producir una planta endogámica homocigótica . La planta endogámica produce semillas que contienen el (os) gen (es) extranjero (s) recién introducido (s) . Estas semillas se pueden criar para producir plantas que producirían el fenotipo seleccionado, por ejemplo, enanismo con follaje verde más oscuro que las plantas de tipo silvestre . En la invención están incluidas partes obtenidas de la planta regenerada, tales como flores, semillas, hojas, ramas, fruta, y similares, con la condición de que estas partes comprendan células que se hayan transformado como se describió. También están incluidos dentro del alcance de la invención la progenie y variantes, y mutantes de las plantas regeneradas, con la condición de que estas partes comprendan las secuencias de ácidos nucleicos introducidas. Se pueden seleccionar las plantas que exhiben la síntesis o señalización modulada de brasinólida mediante observación visual, y por medio de los métodos descritos en 1OE Ejemplos en la presente. La invención incluye una planta producida mediante el método de la invención, incluyendo tejido de planta, semillas, y otras células de planta derivadas a partirtj-de la planta genéticamente modificada. En todavía otra modalidad, la invención proporciona una planta genéticamente modificada que comprende cuando menos una secuencia de ácidos nucleicos exógena, que codifica un citocromo P450, por ejemplo, el polipéptido BAS1, en su genoma, o cuando menos una secuencia reguladora que modifique la expresión delj. citocromo endógeno P450, por ejemplo, el gen basl , y que sé caracteriza porque tiene actividad modulada de brasinólida, por¡+ I ejemplo, síntesis o señalización disminuida de brasinólida en la planta. La secuencia promotora está operablemente enlazada con e] gen estructural . El promotor es un promotor inducible cuando se desea la inducción de la actividad de brasinólida. Por ejemplo,, una célula de planta y planta se produce como se describe en la presente, y la actividad o señalización de brasinólida modulada se induce en la planta por medio de poner en contacto e]¡. promotor, enlazado con una secuencia de ácidos nucleicos qu^ codifica a BAS1, con un inductor apropiado. Esos promotores inducibles se describieron anteriormente, e incluyen aquellos promotores inducibles de preferencia mediante medios químicos. Con "transformación" se quiere decir un cambio genérico inducido en una célula después de la incorporación de ADN nuevo (es decir, ADN exógeno a la célula) . En donde la célula es una célula de mamífero, el cambio genético generalmente se consigue mediante la introducción del ADN dentro del genoma de la célula (es decir, estable) . Con "célula transformada" se quiere decir una célula adentro de la cual (o adentro de un ancestro de cual ) se ha introducido, por medio de técnicas de ADN recombinant e , una molécula de ADN que codifica el citocromo P450, por ej remplo , BAS1. La transformación de una célula hospedera con ADN re r ombi -nante se puede realizar por medio de técnicas convencí o na les , como es bien sabido para los técnicos en la materia. En otra modalidad, la invención proporciona un riétodo para producir una planta genéticamente modificada caracte ri zada porque tiene resistencia incrementada a enfermedades o ins ctos , en comparación con una planta que no se ha modificado ge nre tica-mente (por ejemplo, una planta de tipo silvestre) . El t srmino resistencia a "enfermedades o insectos" o "patógenos" o " insec -tos" se refiere a la habilidad para mantener un fenotipo de eable después de la exposición a infección, con relación a una ;?lanta no transgénica. El nivel de resistencia se puede déte rminar mediante la comparación de las características físicas de la planta de la invención a plantas no transgénicas que, o se han expuesto o no se han expuesto a infección o infestad ón de insectos. Las características físicas ejemplares a ob Servar incluyen un incremento en la población de plantas que ti e: en la £. ..- .- _. yj J-..JJÍ .fa.J-jlJ.j i jy -Sy-tejyii.-.,, habilidad para sobrevivir a agresión de patógenos, desarrollo retardado de lesiones, tamaño reducida de la lesión, y simi lares . El término "enfermedad" se refiere a una agresión de pat 5genos provocada por cualquier agente del que se sabe que provoca síntomas de infección en plantas, incluyendo, pero sin limitarse a bacterias, nemátodos, virus, micoplasmas, y hongos En una modalidad preferida, el patógeno es un patógeno bacte nano, incluyendo, pero sin limitarse a Pseudomonas. Los orga nismos ejemplares incluyen Pseudomonas synringe pv. tomate (I st) y Pseudomonas synringe pv. maculicola (Psm) . El término "res isten-cia incrementada a patógenos" o "resistencia increment ada a enfermedades" se refiere a un nivel de resistencia que tiene una planta transgénica de la invención a los patógenos de p lanta, sobre un nivel de referencia definido, tal como el n ive 1 de resistencia que despliegan las plantas no transgénicas de las mismas especies. De esta manera, la resistencia increment ada se mide con relación a plantas previamente existentes de la misma especie. En alguna modalidad, la resistencia se incrrementa sustancialmente sobre el nivel de referencia definido, mayor que o igual a un 20 por ciento de incremento, de preferencia mayor que o igual a un 50 por ciento de incremento, de más prefe trencia mayor que o igual a un incremento del 75 por ciento, con reí más preferido siendo un incremento del 95 por ciento y más. La frase "planta no transgénica de las mismas especies" signifi a una planta de la misma especie que no contiene ningún t r ansg ee n i lU ¡.i ¿. i . íí?±í ilzl-- ... tok . «-«-heterólogo, o no contiene ningún transgen que contenga una secuencia derivada de BASl. El término "secuencia de ácidos nucleicos heteróloga", como se usa en la presente, se refiere a un ácido nucleico extranjero a la planta hospedera receptora o, nativo al anfitrión si el ácido nucleico nativo está sustancialmente modificado de su forma original. Los niveles de la resistencia a patógenas se pueden determinar usando métodos bien conocidos para un técnico en la materia. Estos métodos incluyen ensayos de resistencia bacteriana, y ensayos de infección fungal, descritos en la patente de los Estados Unidos No. 5,530,187, incorporada en la presente por referencia. De preferencia, las plantas transgénicas son resistentes a Coleópteros y Lepidópteros tales como el gusano de raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera virgifera) , gusano de raíz del maíz norteño (Diabrotica longicornis barberi) , gusano de raíz del maíz sureño (Diabrotica undecimpunctata howardi) , gusano del algodón, barrenillo del maíz europeo, gusano de membrana de la raíz del maíz, gusano de maíz y algodón rosa, y gusano de yema del tabaco. Las plantas transgénicas son de preferencia plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas. Las plagas de plantas representativas (por ejemplo, insectos) incluyen, pero no están limitadas a Coleópteros: Diabrotica, Melanotus, Agriotes, Limonius, Dalopius, Eleodes, Chaetocnema, Macrodactylus, Sphenophorus , Sitophilus, L sorhoptrus , Oulema, Rhyzopertha, Prostephanus , Phyllophage, Cyclocephala, Popillia, Anthonomus, Zabrotes, Leptinotarsa; Lepidópteros: Heliothis, Ostrinia, Diatraea, Elasmopalpus, Papaipema, Agrotis, Loxagrotis, Euxoa, Peridroma saucia, Chorizagrotis, Spodoptera, Pseudaletia, Chilo, Busseola, Sesamia, Eldana, Maliarpha, Scirpophaga, Duataea, Rupela, Sitotroga cerealella, Sitroga, Plodia interpunctella, Crambus, Mythimna, Ñola, Pectinophora, Acontia, Trichoplusia, Anticarsia, Pseudoplusia, Manduca, Leptinotarsa, Lema Thysanopte-ra; Frankliniella, Anaphothrips, Hercothrips, Stenothrips Homoptera: Dalbulus, Cicadulina, Rhopalosiphum, Melanaphis, Anuraphis, Prosapia, Nilaparvata, Sogatella, Laodelphax, Sogatodes, Nephotettix, Reciian, Cofana, Empoasca, Poophilus, Schizaphis, Sipha, Paratrioza, Empoasca, Ophilia. Scleroracus, Macrosteles, Circulifer, Aceratagallia, Agallia, Myzus, Macrosip-hum, Aphis Díptera: Delia platura, Euxesta, Diopsis, Atherigona, Hydrellia, Orseolia, Chironomus, Contarinia Orthoptera: Melano-plus, Schistocerca, Sphenarium, Aneolamia Isoptera: Microtermes, Macrotermes, Allodontermes, Odontotermes Heteroptera: Nezara, Acrosternum, Euschistus, Blissus Acariña: Tetranychus, Parate-tranychus, Oligonychus. Los patógenos de planta o insectos, provocan enfermedad por medio del debilitamiento de la planta, por medio de absorber el alimento de las células de la planta, secretar toxinas, enzimas, o sustancias reguladoras de crecimiento que perturban o matan las células de planta, o bloquean el transporte de los nutrientes de alimentos o el agua en la planta. Se pueden t a A¿ JL l íi ázmlta. &? . »,-infectar las raíces, los tallos, las hojas, las flores, o las frutas. Las células y tejidos afectados se debilitan o destruyen, y no pueden realizar las funciones fisiológicas normales, dando como resultado la reducción del crecimiento de la planta o la muerte, y reducir la calidad o la producción de la cosecha. Las principales causas de las enfermedades de las plantas son las bacterias, micoplasmas, virus, nematodos, y hongos. Las especies fúngales de una diversidad de géneros afectan las plantas, incluyendo Fusarium, Pythiu , Phytophthora, Verticillium, Rhizoctonia, Macrophonmina, Thielaviopsis , Sclerotinia, y muchos otros. La enfermedad de planta provocada por hongos incluye pudrición por el pie de la plántula previo y posterior al brote, descomposiciones de hipocotíleos, descomposiciones de la raíz, descomposiciones de la corona, marchitamiento vascular, y otros síntomas. Los nematodos dañinos a las plantas incluyen especies de nematodo de los géneros Meloidogyne, Heterodera, Ditylenchus, y Pratylencus . Las enfermedades de plantas provocadas por nematodos incluyen excoriaciones de la raíz, descomposición de la raíz, lesiones, raíz "gruesa y roma", impedimento del crecimien-to, y otras descomposiciones y marchitamiento. Algunos nematodos (por ejemplo, Trichodorus, Lonoidorus, Xipenema) pueden servir como vectores para enfermedades de virus en muchas plantas, incluyendo Prunus, uva, tabaco, y tomate. El método de la invención comprende los pasos de introducir cuando menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifique a BAS1 dentro de una célula de planta, para obtener una célula de planta transformada, en donde la secuencia de ácidos nucleicos está operablemente asociada con un promotor; producir una planta a partir de la célula de planta transformada, bajo condiciones que permitan la expresión del polinucleótido BAS1, para producir el polipéptido BAS1; y después de lo mismo seleccionar una planta que exhiba resistencia incrementada a los patógenos. La planta puede ser ya sea una magnitud o un dicotiledón. Los ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen, pero no están limitados a, espárrago, maíz de forraje y dulce, cebada, trigo, arroz (por ejemplo, Japóni ca o Indica) , sorgo, cebolla, mijo de perla, centeno y avena. Los ejemplos de plantas dicotiledóneas incluyen, pero no están limitados a tomate, tabaco, algodón, raptor, habas de forraje, frijoles de soya, papas, uvas, fresas, pimientas, lechuga, alverjas, alfalfa, trébol, cosechas de col o Brassi ca olerácea (por ejemplo, repollo, brócoli, coliflor, coles de bruselas) , rábano, zanahoria, remolacha, berenjena, espinaca, pepino, calabaza, melones, cantaloupe, girasoles, y diferentes plantas ornamentales. Las especies leñosas incluyen álamo, pino, secoya, cedro, roble, y similares. El término "modificación genética" , como se usa en la presente, se refiere a la introducción de una o más secuencias de ácidos nucleicos heterólogas, dentro de una o más células de planta, para proporcionar plantas viables, sexualmente competen-tes. El término "genéticamente modificada", como se usa en la ? t^ presente, se refiere a una planta que se ha generado a través del proceso mencionado anteriormente. Las plantas genéticamente modificadas de la invención son capaces de autopolinización o polinización cruzada con otras plantas de la misma especie, de tal manera que el gen extranjero, que se encuentra en la línea germinal, se pueda insertar dentro de, o criarse dentro de variedades de planta agriculturalmente útiles. El término "célula de planta", como se usa en la presente, se refiere a protoplastos, células productoras de gametos, y células que se regeneran dentro de la planta completa. De conformidad con lo anterior, en la definición de "célula de planta" está incluida una semilla que comprenda múltiples células de planta capaces de regeneración dentro de una planta completa. Como se usa en la presente, el término "planta" se refiere a ya sea la planta completa, una parte de la planta, una célula de planta, o un grupo de células de planta, tal como tejido de planta, por ejemplo. Las plántulas también están incluidas dentro del significado de "planta" . Las plantas incluidas en la invención son cualesquier plantas receptivas a técnicas de transformación, incluyendo angiospermas , gimnospermas, monocotiledóneas y dicotiledóneas. El término "secuencia de ácidos nucleicos heteróloga" se ha definido anteriormente. Se puede usar cualquier secuencia de ácidos nucleicos de interés con la presente invención. Por ejemplo, el término incluye un ácido nucleico que se origina en .&, * A. L M la especie del anfitrión, en donde esa secuencia está operablemente enlazada a un promotor que difiere del promotor natural o de tipo silvestre. En el amplio método de la invención, cuando menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica al polipép-tido BAS1 está asociada con un promotor adecuado. Pudiera ser deseable introducir más de una copia del polinucleótido BAS1 dentro de una planta, para expresión mejorada de BASl. Por ejemplo, múltiples copias del gen tendrían el efecto de incrementar la producción del polipéptido BAS1 en la planta, permitiendo mayor resistencia a enfermedades o insectos. Las plantas genéticamente modificadas de la presente invención se producen mediante la introducción, dentro de una célula de planta, de un vector que incluye cuando menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica a BASl. Para ser efectiva una vez introducida dentro de las células de planta, la secuencia de ácidos nucleicos BAS1 debe estar operablemente asociada con un promotor que sea efectivo en las células de planta para provocar la transcripción de BASl. Adicionalmente, también se puede emplear una secuencia de poliadenilación o secuencia de control de transcripción, también reconocida en las células de planta. Se prefiere que el vector que alberga la secuencia de ácidos nucleicos que se vaya a insertar también contenga uno o más genes marcadores seleccionables, de tal manera que se puedan seleccionar las células transformadas a partir de células no transformadas en el cultivo, como se describe en la i-J-é 3,1. ?t k.????tMü ¿?í??cc. i t i l presente . La expresión de los polinucleótidos BAS1 en la presente invención se puede activar por medio de muchos promotores. Se puede utilizar el promotor endógeno, o nativo de un BAS1 para la regulación transcripcional del gen, o se puede utilizar un promotor heterólogo que es una secuencia reguladora extranjera. Para los vectores de expresión de planta, los promotores virales adecuados incluyen los promotores ARN 35S y ARN 19S de CaMV (Brisson y colaboradores, Nature 310 : 511 , 1984; Odell y colabora-dores, Na ture 313 : 810 , 1985); el promotor de transcrito de longitud completa del Virus de Mosaico de Escrofularia (FMV) (Gowda, y colaboradores, J. Cell Biochem . , 13D : 301 , 1989) y el promotor de proteína de cobertura de TMV (Takamatsu, y colaboradores, EMBO J. 6:307, 1987). Alternativamente, se pueden usar promotores de planta tales como el promotor inducible por luz de la subunidad pequeña de carboxilasa de bisfosfato de ribulosa (ssRUBISCO) (Corussi, y colaboradores, EMBO J. , 3:1671, 1984; Broglie, y colaboradores, Science, 224 : 838 , 1984) ; el promotor de sintasa de manopina (Velten, y colaboradores, EMBO J. , 2=2723, 1984), los promotores de sintasa de nopalina (NOS) y sintasa de octopina (OCS) (llevados en plásmidos inductores de tumores de Agrobacterium tumefaciens) ; o promotores de golpe de calor, por ejemplo, hspl7.5-E o hspl7.3-B de frijol de soya (Gurley, y colaboradores, Mol . Cell . Biol . , 6:559, 1986; Severin, y colaboradores, Plant Mol . Biol . , 12=827, 1990).

Los promotores útiles en la invención incluyen promotores naturales tanto constitutivos como inducibles, así como promotores diseñados. Los promotores de CaMV son ejemplos de promotores constitutivos. Para ser más útil, un promotor inducible debe 1) proporcionar baja expresión en la ausencia del inductor; 2) proporcionar alta expresión en la presencia del inductor; 3) usar un esquema de inducción que no interfiera con la fisiología normal de la planta; y 4) no tener ningún efecto sobre la expresión de otros genes. Los ejemplos de promotores inducibles útiles en plantas incluyen aquellos inducidos por medios químicos, tal como el promotor de metalotioneína de levadura, el cual se activa mediante iones de cobre (Mett, y colaboradores, Proc . Na ti . Acad . Sci . , U. S . A . , 90:4567, 1993); las secuencias reguladoras In2-1 e In2-2, las cuales se activan por medio de bencensulfonamidas sustituidas, por ejemplo, aseguradores herbicidas (Hershey, y colaboradores, Plant Mol . Biol . , 1_7:679, 1991); y las secuencias reguladoras GRE, que se inducen por medio de glucocorticoides (Schena, y colaboradores, Proc . Nati . Acad . Sci . , USA . , 22=10421, 1991) (Ver Ejemplo 10). Los técnicos en la materia conocerán otros promotores, tanto constitutivos como inducibles. El promotor particular seleccionado debe ser capaz de provocar suficiente expresión, para dar como resultado la producción de una cantidad efectiva de producto de gen estructu-ral, por ejemplo, el polipéptido BAS1, para provocar resistencia incrementada a enfermedades o insectos, finalmente dando como resultado una producción incrementada de la planta. Los promotores que se usan en las construcciones de vector de la presente invención se pueden modificar, si se desea, para afectar sus características de control . En la presente invención también se pueden utilizar promotores específicos al tejido. Un ejemplo de un promotor específico al tejido es el promotor activo en los meristemas de retoños (Atanassova, y colaboradores, Plant J. , 2=291, 1992) . Los técnicos en la materia conocerán otros promotores específicos al tejido, útiles en plantas transgénicas, tales como el promotor cdc2a y el promotor cycOl 2 (Ver por ejemplo, Ito y colaboradores, Plant Mol . Biol . , 2i:863, 1994; Martínez, y colaboradores, Proc . Nati . Acad . Sci . USA, 22=7360, 1992; Medford, y colaboradores, Plant Cell , 2=359, 1991; Terada, y colaboradores, Plant Journal , 2 = 241, 1993; Wissenbach, y colaboradores, Plant Journal , 4_:411, 1993) . Hay promotores de los que se sabe que limitan la expresión a partes particulares de la planta, o en respuesta a estímulos particulares (por ejemplo, los promotores de patatina o los promotores para las subunidades grandes o pequeñas de pirofosfo-rilasa de glucosa ADP) . Estos promotores que limitan la expresión, tales como aquellos que dirigen la expresión a las raíces, pueden estar operablemente asociados con BAS1 para dirigir la expresión principalmente en el tubérculo. Un técnico en la materia sabrá de muchos de esos promotores específicos a parte de la planta, que serían útiles en la presente invención. Si se desea, se pueden modificar los promotores que se usan en las construcciones de ácido nucleico de la presente invención, para afectar sus características de control. Por ejemplo, el promotor 35S de CaMV se puede ligar a la porción del gen ssRUBISCO que reprime la expresión de ssRUBISCO en la ausencia de luz, para crear un promotor que sea activo en las hojas, pero no en las raíces. El promotor quimérico resultante se puede usar como se describe en la presente. Para los propósitos de esta descripción, la frase promotor "35S de CaMV" incluye así variaciones del promotor 35S de CaMV, por ejemplo, los promotores que se derivan por medio de ligación con regiones operadoras, mutagénesis aleatoria o controlada, etcétera. Además, se pueden alterar los promotores para que contengan múltiples "secuencias mejoradoras" para ayudar a elevar la expresión del gen. Alternativamente, los promotores que se utilizan se pueden seleccionar para que confieran la expresión especifica de BAS1 en respuesta a enfermedades, tales como infección fungal. La infección de las plantas por patógenos fúngales activa genes relacionados con la defensa o relacionados con la patogénesis (PR) , que codifican (1) enzimas implicadas en el metabolismo fenilpropanoide, tales como liasa de amoniaco de fenilalanina, sintasa de calcona, ligasa de coA de 4-cumarato y 4-hidroxilasa de ácido cumárico, (2) proteínas que modifican las paredes de las células de la planta, tales como glucoproteínas ricas en hidroxiprolina, proteínas ricas en glicina, y peroxidasas, (3) enzimas tales como quitmasas y glucanasas, que degraden la pared celular fungal, (4) proteínas parecidas a taumatina, o (5) proteínas de función hasta ahora desconocida. Se han aislado y caracterizado los genes relacionados con defensa y PR, de muchas especies de plantas. Se pueden usar los promotores de estos genes para obtener la expresión de BAS1 en plantas transgénicas, cuando se agrede a esas plantas con un patógeno, particularmente un patógeno fungal tal como Pi . El promotor particular seleccionado debe ser capaz de provocar suficiente expresión de BAS1, para dar como resultado la producción de una cantidad efectiva de polipéptido . Opcionalmente, un marcador seleccionable puede estar asociado con la secuencia de ácidos nucleicos que se va a insertar. Anteriormente se ha definido el término "marcador". De preferencia, el gen marcador es un gen de resistencia a antibióticos, por medio del cual se puede usar el antibiótico apropiado para seleccionar células de planta transformadas de entre las células de planta que no están transformadas. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados se describieron anteriormente. De preferencia, el gen marcador es un gen de resistencia a antibióticos, por medio del cual se puede usar el antibiótico apropiado para seleccionar células transformadas de entre las células de planta que no están transformadas. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para usarse en plantas incluyen deaminasa de adenosina, reductasa de dihidrofolato, higromicin-B-fosfotransferasa, cinasa de timidina, fosfo- ribosiltransferasa de xantina - guanina, y 3 ' -0-fosfotransferasa II de amino-glucósido (resistencia a canamicina, neomicina y G418) . Los técnicos en la materia conocerán otros marcadores adecuados . El (los) vector (es) que se emplea (n) en la presente invención para la transformación de las células de planta, comprende (n) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica al péptido BAS1, asociado operablemente con un promotor. Para efectuar un proceso de transformación de conformidad con la presente invención, primeramente es necesario construir un vector adecuado, e introducirlo apropiadamente dentro de la célula de planta. Los técnicos en el campo de la ingeniería genética de plantas conocen los detalles de la construcción de los vectores que se utilizan en la presente. Las secuencias de ácidos nucleicos BAS1 que se utilizan en la presente invención se pueden introducir dentro de las células de planta usando los plásmidos Ti de Agrobacterium tumefaciens, plásmidos inductores de raíz (Ri), y vectores de virus de planta. (Para revisiones de esas técnicas, ver por ejemplo, Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Bioloqy, Sección VIII, páginas 421-463, Academic Press, New York, 1998; Grierson y Corey, Plant Molecular Bioloqy, 2a. edición, Capítulos 7-9, Blackie, Londres, 1998; y Horsch, y colaboradores, Science, 227 : 1229, 1985, cada uno incorporado en la presente por referencia) . En adición a los vectores de transformación de planta que se derivan de los plásmidos Ti o inductores de raíz (Ri) de Agrobacterium, se pueden utilizar métodos alternativos de 5 transformación, incluyendo el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que incrementen la captación de ácidos nucleicos libres, transformación usando virus o polen, y el uso de transformación biolística. Un técnico en la materia será capaz de seleccionar un 10 vector apropiado para introducir la secuencia de polinucleótidos BAS1 en un estado relativamente intacto. De esta manera, debería ser suficiente cualquier vector que produzca una planta que contenga la secuencia de ácidos nucleicos introducida. Se esperaría que hasta el uso de una pieza simple de ácido nucleico 15 confiriera las propiedades de esta invención, aunque a baja eficiencia. La selección del vector, o si usar un vector, frecuentemente se guía mediante el método de transformación seleccionado . La transformación de plantas de conformidad con la 20 invención, se puede realizar en esencialmente cualquiera de las diferentes maneras conocidas para los técnicos en el campo de la biología molecular de plantas. (Ver, por ejemplo, Methods of Enzymology, volumen 153, Wu y Grossman, editores, Academic Press, 1987, incorporado en la presente por referencia) . Como se usa en 25 la presente, el término "transformación" significa la alteración fJ ^^^t-?taH?u&^Aí? ii. j,,,^, j^j , del genotipo de una planta anfitriona, mediante la introducción de la secuencia de ácidos nucleicos BAS1. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos BAS1 se puede introducir dentro de una célula de planta utilizando Agrobacterium tumefaciens que contenga el plásmido Ti, como se mencionó brevemente anteriormente. Al usar un cultivo de A . tumefaciens como un vehículo de transformación, es conveniente usar una cepa no oncogénica de Agrobacterium como el portador del vector, de tal manera que sea posible la diferenciación no oncogénica normal de los tejidos transformados. También se prefiere que la Agrobacterium albergue un sistema de plásmido Ti binario. Ese sistema binario comprende 1) un primer plásmido Ti que tiene una región de virulencia esencial para la introducción de ácido nucleico de transferencia (ADN-T) dentro de las plantas, y 2) un plásmido quimérico. El último contiene cuando menos una región limítrofe de la región de ADN-T de un plásmido Ti tipo silvestre, que flanquea el ácido nucleico que se va a transferir. Los sistemas de plásmido Ti binarios se han mostrado efectivos para transformar células de planta (De Framond, Biotechnology, 1:262, 1983; Hoekema, y colaboradores, Nature, 303 : 179, 1983). Se prefiere ese sistema binario porque éste no requiere la integración dentro del plásmido Ti de Agrobacterium, que es una metodología más antigua. Los métodos que envuelven el uso de Agrobacterium en la transformación, de conformidad con la presente invención, incluyen, pero no están limitados a: 1) el cocultivo de Agrobacterium con protoplastos aislados cultivados; 2) la transformación de células o tejidos de planta con Agrobacterium; o 3) la transformación de semillas, ápices o meristemas con Agrobacte-rium. En adición, la transferencia de genes se puede realizar mediante la transformación in planta por Agrobacterium, como la describe Bechtold, y colaboradores ( C. R . Acad . Sci . Paris, 316 : 1194 , 1993) , y se ejemplifica en los Ejemplos en la presente. Este planteamiento se basa en la infiltración al vacío de una suspensión de células de Agrobac eríum. El método preferido para introducir el polinucleótido BAS1 dentro de las células de planta es infectar esas células de planta, una explantación, un meristema o una semilla, con Agrobacteri um tumefaciens transformado, como se describió anteriormente y como se describe en los Ejemplos. Bajo las condiciones apropiadas, conocidas en la materia, las células de planta transformadas se crían para formar retoños, raíces, y desarrollarse adicionalmente en plantas. Alternativamente, el polinucleótido BAS1 se puede introducir dentro de una célula de planta usando medios mecánicos o químicos. Por ejemplo, el ácido nucleico se puede transferir mecánicamente dentro de la célula de planta mediante microinyección, usando una micropipeta. Alternativamente, el ácido nucleico se puede transferir dentro de la célula de planta mediante el uso de polietilenglicol, el cual forma un complejo de precipitación con material genético que capta la célula. El polinucleótido BAS1 también se puede introducir dentro de las células de planta mediante electroporación (Fromm, y colaboradores, Proc . Nati . Acad . Sci . , U. S . A . , 22:5824, 1985, que se incorpora en la presente por referencia) . En esta técnica, se electroporan los protoplastos de la planta en la presencia de vectores o ácidos nucleicos que contengan las secuencias de ácidos nucleicos relevantes. Los impulsos eléctricos de resisten-cia de campo alta permeabilizan inversamente las membranas, permitiendo la introducción de los ácidos nucleicos. Los protoplastos de la planta electroporados reforman la pared celular, se dividen y forman un callo de planta. La selección de las células de planta transformadas con el gen transformado se puede realizar usando marcadores fenotípicos como se describió en la presente. Otro método para introducir el polmucleótido BAS1 dentro de una célula de planta es una penetración balística a alta velocidad, mediante partículas pequeñas con el ácido nucleico que se introducirá contenido ya sea adentro de la matriz de esas partículas, o sobre la superficie de las mismos (Klein, y colaboradores, Na ture, 327:70, 1987) . Los métodos de transformación por bombardeo también se describen en Sanford y colaboradores ( Techniques 2:3-16, 1991) y Klein y colaboradores (Bio/ Techniques 20:286, 1992) . Aunque típicamente sólo se requiere una ..*?>S. sola introducción de una secuencia de ácidos nucleicos nueva, este método permite particularmente múltiples introducciones. También se puede usar el virus de mosaico de coliflor (CaMV) como un vector para introducir ácido nucleico dentro de las células de planta (patente de los Estados Unidos No. 4,407,956) . El genoma de ácido nucleico viral de CaMV se inserta dentro de un plásmido bacteriano madre, creando una molécula de ácido nucleico recombinante que se puede propagar en la bacteria. Después de la clonación, el plásmido recombinante se puede clonar nuevamente, y modificarse adicionalmente mediante la introducción de la secuencia de ácidos nucleicos deseada (por ejemplo, la secuencia BAS1) . La porción viral modificada del plásmido recombinante se escinde del plásmido bacteriano madre, y se usa para inocular las células de planta o las plantas. Como se usa en la presente, el término "poner en contacto" se refiere a cualquier medio para introducir a BAS1 dentro de la célula de la planta, incluyendo medios mecánicos y físicos como se describió anteriormente. De preferencia, poner en contacto se refiere a introducir el ácido nucleico o vector dentro de células de planta (incluyendo una explantación, un meristema o una semilla) , por medio de Agrobacteri um tumefaciens transformada con el ácido nucleico que codifica a BAS1, como se describió anteriormente. Normalmente, una célula de planta transformada se regenera para obtener una planta completa a partir del proceso de . 1 transformación. Se hace referencia al producto inmediato de la transformación como un "transgenote" . El término "criar" o "regeneración", como se usa en la presente, significa criar una planta completa a partir de una célula de planta, un grupo de células de planta, una parte de planta (incluyendo semillas) , o una pieza de planta (por ejemplo, a partir de un protoplasto, callo, o parte de tejido) . La regeneración a partir de protoplastos varía de especie a especie, pero generalmente el proceso se inicia por medio de primeramente proporcionar una suspensión de protoplastos. En ciertas especies, la formación de la planta se puede inducir a partir de la suspensión de protoplastos, seguida por la maduración y germinación como planta natural. El medio de cultivo generalmente contendrá diferentes aminoácidos y hormonas, necesarios para el crecimiento y la regeneración. Los ejemplos de hormonas que se utilizan incluyen auxinas y citoquininas . Algunas veces es conveniente añadir ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para especies de plantas tales como maíz y alfalfa. La regeneración eficiente dependerá del medio, el genotipo, y la historia del cultivo. Si se controlan estas variables, se puede reproducir la regeneración. La regeneración también ocurre a partir de callos, explantaciones, órganos o partes de la planta. La transformación se puede realizar en el contexto de la regeneración de órgano o parte de la planta. (Ver Methods in Enzymology , Volumen 118, 1987, y Klee y colaboradores, Annual Revi ew of Plant Physiology, 22:467, 1987). Utilizando el método de transformación regeneración de disco de hoja de Horsch y colaboradores, Science, 227 : 1229, 1985, se cultivan los discos en medio selectivo, seguido por la formación de retoños en aproximadamente 2-4 semanas. Los retoños que se desarrollan se escinden de los callos, y se trasplantan a medio selectivo inductor de raíz apropiado. Las plántulas se trasplantan a tierra tan pronto como es posible después de que aparecen las raíces. Las plántulas se pueden volver a plantar en macetas, según se requiera, hasta que alcancen la madurez. En cosechas que se propagan de manera vegetativa, las plantas transgénicas maduras se propagan por medio de utilizar cortes o técnicas de cultivo de tejido, para producir múltiples plantas idénticas. Se hace la selección de transgenotes deseables, y se obtienen nuevas variedades y se propagan de manera vegetativa para uso comercial. En cosechas propagadas de semillas, las plantas transgénicas maduras se autocruzan para producir una planta endogámica homocigótica . La planta endogámica resultante produce semillas que contienen el (los) gen (es) extranjero (s) recién introducido (s) . Estas semillas se pueden criar para producir plantas que producirían el fenotipo seleccionado, por ejemplo, producción incrementada. En la invención están incluidas las partes obtenidas de la planta regenerada, tales como flores, semillas, hojas, ramas, fruta, y similares, con la condición de que estas partes comprendan células que se hayan transformado como se describió. También están incluidos dentro del alcance de la invención la progenie y variantes, y mutantes de las plantas regeneradas, con la condición de que estas partes comprendan las secuencias de ácidos nucleicos introducidas. Después de seleccionar las células transformadas, uno puede confirmar la expresión del gen heterólogo deseado. Se puede conseguir la detección simple del ARNm codificado por el ADN insertado mediante métodos bien conocidos en la materia, tales como la hibridación de mancha Northern. La secuencia insertada también se puede identificar mediante hibridación de mancha Southern. Las plantas que exhiben resistencia incrementada a enfermedades o insectos en comparación con las plantas de tipo silvestre se pueden seleccionar mediante observación visual . (Ver también la patente de los Estados Unidos No. 5,530,187, incorporada en la presente por referencia) . La invención incluye plantas producidas mediante el método de la invención, así como tejido y semillas de planta. En todavía otra modalidad, la invención proporciona un método para modificar genéticamente una célula de planta, tal como una planta, producida a partir de la célula, caracterizada porque tiene resistencia incrementada a enfermedades o insectos, en comparación con una planta tipo silvestre. El método incluye introducir cuando menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifique al polipéptido BAS1 dentro de una célula de planta, una célula de planta transformada; criar la célula de planta transformada bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido BAS1, produciendo mediante lo mismo una planta que tenga resistencia incrementada a enfermedades. Las condiciones tales como el medio ambiente y las condiciones de inducción del promotor varían de especie a especie, pero deben ser las mismas dentro de una especie. En otra modalidad, la invención proporciona un método para producir una planta, caracterizada porque tiene resistencia incrementada a enfermedades o insectos, mediante la introducción del polinucleótido BAS1 dentro de una célula de planta, para obtener una célula transformada, y después criar la célula de planta transformada bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido BAS1, para producir una planta con resistencia incrementada a enfermedades o insectos. El término "expresión" se refiere a un incremento en la transcripción del ADN de BAS1 o la traslación del ARNm de BAS1 o la actividad del polipéptido BASl. En todavía otra modalidad, la invención proporciona un método para producir una planta caracterizada porque tiene resistencia incrementada a enfermedades o insectos, en comparación con una planta tipo silvestre, por medio de poner en contacto una planta susceptible con una cantidad inductora del promotor BAS1, de un agente que induzca la expresión del gen BAS1, en donde la inducción de la expresión del gen BAS1 da como resultado la producción de una planta que tiene resistencia incrementada a enfermedades o insectos, en comparación con una planta que no se puso en contacto con el agente. El agente puede inducir la expresión endógena del gen BAS1, por ejemplo, en una modalidad preferida, la planta es una planta transgénica que contiene un ácido nucleico que codifica un promotor inducible enlazado operablemente al ácido nucleico que codifica a BASl. Los ejemplos de promotores inducibles útiles en las plantas incluyen aquellos inducidos por medios químicos, tales como el promotor de metalotioneína de levadura, el cual se activa mediante iones de cobre (Mett, y colaboradores, Proc. Nati . Acad . Sci . , U. S . A . , £0:4567, 1993); las secuencias reguladoras In2-1 e In2-2, las cuales se activan por medio de bencensulfonamidas sustituidas, por ejemplo, aseguradores herbicidas (Hershey, y colaboradores, Plant Mol . Biol . , 1_7:679, 1991); y las secuencias reguladoras GRE, que se inducen por medio de glucocorticoides (Schena, y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . , U. S . A . , 88:10421, 1991). El término cantidad inductora de promotor se refiere a aquella cantidad del agente, necesaria para elevar la expresión del gen BAS1 por arriba de la expresión de BAS1 en una célula de planta que no se puso en contacto con el agente. Por ejemplo, se puede usar un factor de transcripción o un agente químico para elevar la expresión del gen del promotor nativo BASl. El método de la ,.í ..i ? ? ¿. j . Ja-A-i - AAZAmAb*. , - .14 . invención prevé poner en contacto células que contengan el promotor endógeno BAS1 o el promotor BAS1 recombinantemente producido. Selección para Identificar Genes Novedosos de Resistencia a Enfermedades o Insectos La invención proporciona un método para identificar genes novedosos de resistencia a enfermedades o insectos, relacionados con BAS1, por medio de sondear una genoteca de ácidos nucleicos con cuando menos un fragmento de un polinucleó-tido aislado que codifique a BAS1, y seleccionar aquellos clones que se hibriden con el fragmento. Los genes novedosos resistentes a enfermedades o insectos, tales como los homólogos de BAS1, se identifican por medio de cualquiera de muchos métodos. La secuencia de nucleótidos que codifica un gen novedoso de resistencia a enfermedades o insectos se puede aislar de conformidad con cualquiera de una diversidad de métodos bien conocidos para los técnicos en la materia. Por ejemplo, se puede aislar el ADN que codifica a un homólogo de BAS1, ya sea a partir de una genoteca de ADNc, o a partir de una genoteca de ADN genómico (ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) . En una modalidad, se puede usar un fragmento de un polinucleótido que codifica a BAS1 como una sonda de hibridación con una genoteca de ADNc del organismo objetivo de interés, en donde se usan l-jj-tl ¡L Á - c¿.¡*.ÍjáJt ÁMÍtj M.. jJ-MaJ-fea ...4, 1 i* i , condiciones de baja estringencia. La sonda puede ser un fragmento grande, o uno o más cebadores degenerados cortos. En una modalidad preferida, la sonda es de cuando menos ocho nucleótidos de longitud. 5 Los ácidos nucleicos que tienen similitud de secuencia se detectan mediante hibridación bajo condiciones de estringencia baja, por ejemplo, a 50/C y lOxSSC (0.9M solución salina/O.09M citrato de sodio) y permanecen fijos cuando se someten a lavado a 55/C en lxSSC. La identidad de la secuencia se puede determinar 10 mediante hibridación bajo condiciones más severas, por ejemplo, a 50/C o más y 0. lxSSC (9 mM solución salina/0.9 mM citrato de sodio) . Mediante el uso de sondas, particularmente sondas etiquetadas de secuencias de ADN, uno puede aislar genes homólogos o relacionados. La fuente de los genes homólogos puede 15 ser cualesquier especie, por ejemplo, especies de plantas, especies de primates, particularmente seres humanos; roedores tales como ratas y ratones, caninos, felinos, bovinos, ovinos, equinos, levadura, y nemátodos. De manera alternativa, el ADN que codifica un gen de 20 enfermedad o de insecto novedoso, se puede aislar usando la amplificación por reacción de cadena de polimerasa (PCR) estándar de cebadores de oligonucleótidos sintéticos, por ejemplo, como se describe en Mullís y colaboradores, patente de los Estados Unidos No. 4,800,159, o los métodos de clonación de expresión bien 25 conocidos en la materia (vea, por ejemplo, Sambrook y colaborado- —--•-^^iÉftHllilliiMiíit. ^,^.AAJJP*.-*"*"**"*-****-'- -^ » .!»>- , . . .a. . **... , y,A . „ .«, .»-. «i>.tt.i res, 1989, Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) . Un técnico en la materia puede diseñar fácilmente los cebadores para la amplificación por reacción de cadena de polimerasa que se basa en la secuencia de un polinucleótido que codifica el polipéptido BASl. Entre las especies de plantas, por ejemplo, monocotiledóneas, dicotiledóneas, y especies leñosas, los homólogos típicamente tienen similitud de secuencia sustancial, es decir, cuando menos el 75 por ciento de identidad de secuencia entre las secuencias de nucleótidos. La similitud de la secuencia se calcula en base a una secuencia de referencia, la cual puede ser un subconjunto de una secuencia más larga, tal como un motivo conservado, región de codificación, o región de flanqueo, por ejemplo. Una secuencia de referencia será usualmente de cuando menos 18 nucleótidos (nt) de largo, más usualmente de cuando menos 30 nt de largo, y se puede extender hasta el largo de la secuencia completa que se está comparando. Los algoritmos para el análisis de la secuencia son conocidos en la materia, tal como BLAST, que describen Altschul y colaboradores (1990) J. Mol . Biol . 215:403-10. Las secuencias que se proporcionan en la presente, son esenciales para reconocer las proteínas relacionadas y homologas de BAS2 en las búsquedas en la base de datos. Anti-cuerpos Se pueden usar los polipéptidos BAS1 de la invención . l . ..t ?a i.yM-A- ?t..i,jtatu-fa_ para producir anti-cuerpos los cuales son inmunorreactivos o se fijan a epítopos de los polipéptidos BASl. Se proporcionan anticuerpos que consisten esencialmente de anti-cuerpos monoclonales agrupados con especificidades epitópicas diferentes, así como con preparaciones de anti-cuerpos monoclonales distintas. La preparación de anti-cuerpos policlonales es bien conocida para los técnicos en la materia. Vea, por ejemplo, Green y colaboradores, Production of Polyclonal Antisera, en: Immuno-chemical Protocols (Manson, editor) , páginas 1-5 (Human Press 1992) ; Coligan y colaboradores, Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters, en: Current Protocols in Immunology, sección 2.4.1 (1992), los cuales se incorporan en la presente por referencia. La preparación de anti-cuerpos monoclonales es igualmente convencional. Vea, por ejemplo, Kohier y Milstein, 1975, nature 256:495; Coligan y colaboradores, secciones 2.5.1-2.6.7; y Harlow y colaboradores, en: Antibodies: a Laboratory Manual , página 726 (Cold Spring Harbor Pub. 1988) , las cuales se incorporan en la presente por referencia. Brevemente, los anti-cuerpos monoclonales se pueden obtener por medio de inyectar ratones con una composición que comprenda un antígeno, que verifica la presencia de la producción de anti-cuerpos por medio de remover una muestra de suero, remover el bazo para obtener linfocitos B, fusionar los linfocitos B con las células del mieloma para producir hibridomas, clonar los hibridomas, seleccionar los clones positivos que producen los anti-cuerpos para el antígeno, y aislar los anti-cuerpos a partir de los cultivos de hibridomas. Los anti-cuerpos monoclonales se pueden aislar y purificar a partir de os cultivos de hibridomas mediante una variedad de técnicas bien establecidas. Estas técnicas de aislamiento incluyen la cromatografía de afinidad con la Sefarosa de Proteína A, cromatografía de exclusión por tamaño, y cromatografía por intercambio de iones. Vea, por ejemplo, Coligan y colaboradores, secciones 2.7.1-2.7.12 y secciones 2.9.1-2.9.3; Barnes y colaboradores, Purification of Immunoglobulin G (IgG) , en: Methods in Molecular Bioloqy, volumen 10, páginas 79-104 (Human Press, 1992) . Los métodos de la multiplicación in vi tro e in vivo de los anti-cuerpos monoclonales, son bien conocidos para los técnicos en la materia. La multiplicación in vi tro se puede realizar en el medio de cultivo adecuado, tal como el Medio Eagle Modificado de Dulbecco o el medio RPMl 1640, que se complementa de manera opcional mediante un suero de mamífero tal como el suero de becerro fetal o elementos de rastro y complementos sustentadores de crecimiento, tales como células de exudado peritoneal de ratón normal, células de bazo, timocitos, o macrofagos de médula ósea. La producción in vi tro proporciona preparaciones de anti-cuerpos relativamente puras y permite el aumento progresivo para producir grandes cantidades de los anti- cuerpos deseados. El cultivo de hibridomas a gran escala se puede realizar mediante el cultivo de suspensión homogénea en un reactor de transporte por aire, en un reactor agitador continuo, o en cultivo de células inmovilizadas o entrampadas. La multiplicación in vivo se puede realizar por medio de inyectar clones de células dentro de mamíferos histocompatibles con las células madre, por ejemplo, ratones singenéicos, para provocar el crecimiento de tumores que producen anti-cuerpos. De manera opcional, se ceban los animales con un hidrocarburo, especialmente aceites tal como pristane (tetrametilpentadecano) , antes de la inyección. Después de una a tres semanas, se recupera el anticuerpo monoclonal deseado a partir del fluido corporal del animal . El término "anti-cuerpo" como se usa en esta invención, incluye moléculas intactas, así como fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')2, y Fv, las cuales pueden fijar el determinante epitópico. Estos fragmentos de anti-cuerpo retienen alguna capacidad para fijarse de manera selectiva con su antígeno o receptor y se definen como sigue: (1) Fab, el fragmento que contiene un fragmento de fijación de antígeno monovalente de una molécula de anti-cuerpo, se puede producir mediante la digestión del anti-cuerpo completo con la enzima papaína para producir una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada; (2) Fab', el fragmento de una molécula de anti-cuerpo de puede obtener por medio de tratar el anti-cuerpo completo con B Mt-l-li&.Ji.yji.a a .ji-..iy.iyá>---t.yj&j|«^.a.^-.¿.... ... , . ...j*. . . *, *; , .t,; i? -I pepsina, seguido por reducción, para producir una cadena ligera intacta y una porción de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anti-cuerpo; (3) (Fab') 2, el fragmento del anti-cuerpo que se puede obtener por medio de tratar el anti-cuerpo completo con la enzima pepsina, sin reducción subsecuente; F(ab')2 es un dímero de dos fragmentos Fab' que se mantienen juntos mediante dos enlaces bisulfuro; (4) Fv, que se define como un fragmento genéticamente diseñado que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada que se expresa como dos cadenas; y (5) Anti-cuerpo de una sola cadena ("SCA"), que se define como una molécula genéticamente diseñada que contiene la región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena pesada, que se enlaza mediante un enlazador polipéptido adecuado como una molécula de una sola cadena genéticamente fusionada . Los métodos para fabricar estos fragmentos, son conocidos en la materia. (Vea, por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988) , que se incorpora en la presente por referencia) . Como se usa en esta invención, el término "epítopo" quiere decir cualquier determinante antigénico o un antígeno al cual se fija el parátopo de un anti-cuerpo. Los determinantes epitópicos usualmente consisten de agrupamientos de moléculas superficiales químicamente activos tales como los aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y usualmente tienen características estructurales de tres dimensiones, así como características de carga específicas. Los fragmentos de anti-cuerpos de la presente invención se pueden preparar mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo o mediante la expresión en E. coli del ADN que codifica el fragmento. Los fragmentos de anti-cuerpos se pueden obtener mediante la digestión de pepsina o papaína de anti-cuerpos completos mediante los métodos convencionales. Por ejemplo, se pueden producir fragmentos de anti-cuerpos mediante la disociación enzimática de anti-cuerpos con pepsina, para proporcionar un fragmento 5S que se denota F(ab')2. Este fragmento se puede disociar adicionalmente usando un agente reductor de tiol, y opcionalmente un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo que resultan de la disociación de los enlaces de disulfuro, para producir fragmentos monovalentes de 3.5S Fab'. De manera alternativa, una disociación enzimática que usa pepsina produce dos fragmentos Fab' monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos métodos los describe, por ejemplo, Goldenberg, patentes de los Estados Unidos Nos. 4,036,945 y 4,331,647, y las referencias contenidas en las mismas. Estas patentes se incorporan en la presente por referencia en su totalidad. Vea también Nisonhoff y colaboradores, 1960, Arch . Biochem . Biophys . 8_9:230, Porter, 1959, Biochem . J. 72:119; Edelman y colaboradores, 1967, Methods in Enzymology, volumen 1, página 422 (Academic Press) ; y Coligan y colaboradores, en las secciones 2.8.1-2.8.10 y 2.10.1-2.10.4. También se pueden usar otros métodos para disociar anti-cuerpos, tales como la separación de cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada monovalentes, la disociación adicional de fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas, o genéticas , siempre que los fragmentos se fijen al antígeno que se reconoció mediante el anti-cuerpo intacto. Por ejemplo, los fragmentos Fv comprenden una asociación de las cadenas VH y VL. Esta asociación puede ser no covalente, como lo describen Inbar y colaboradores, 1972, Proc . Nati . Acad . Sci . USA 69:2659. De manera alternativa, las cadenas variables se pueden enlazar mediante un enlace de disulfuro intermolecular o se pueden reticular mediante productos químicos tal como el glutaraldehído. Vea, por ejemplo, Sandhu, supra . De preferencia, los fragmentos Fv comprenden las cadenas VH y VL conectadas mediante un enlazador de péptido. Estas proteínas de fijación de antígeno de una sola cadena (sFv) se prepararan por medio de construir un gen estructural que comprenda secuencias de ADN que codifiquen los dominios de VH y VL que se conectan mediante un oligonucleótido. El gen estructural se inserta dentro de un vector de expresión, el cual se introduce subsecuentemente dentro de una célula hospedera, tal como la E . coli . Las células hospederas recombinantes sintetizan una sola cadena de péptido con un péptido enlazador que hace un puente entre los dominios de V. Los métodos para producir sFvs los describen, por ejemplo, Whitlow y colaboradores, 1991, Methods : a Companion to Methods in Enzymology, volumen 2, página 97; Bird y colaboradores, 1988, Science, 242 : 426 ; Ladner y colaboradores, patente de los Estados Unidos No. 4,946,778; Pack y colaboradores, 1993, Bio/Technology 11 : 1211 - 11 ; y Sandhu, supra . Otra forma de una fragmento de anti-cuerpo, es un péptido que codifica para una región de determinación de complementariedad individual (CDR) . Los péptidos de CDR ("unidades de reconocimiento mínimo"), se pueden obtener por medio de construir genes que codifiquen la CDR de un anti-cuerpo de interés. Estos genes se preparan, por ejemplo, mediante el uso de la reacción de cadena de polimerasa para sintetizar la región variable a partir del ARN de las células productoras de anticuerpos. Vea, por ejemplo, Larrick y colaboradores, Methods : a Companion to Methods in Enzymology, volumen 2, página 106 (1991) . Los anti-cuerpos que se fijan a un polipéptido BAS1 de la invención, se pueden preparar usando un polipéptido intacto o fragmentos que contengan péptidos pequeños de interés como el antígeno de inmunización. El polipéptido o un péptido que se use para inmunizar un animal, se puede derivar del ADNc trasladado o síntesis química, la cual se puede conjugar con una proteína portadora, si se desea. Estos portadores que se usan comúnmente que se acoplan de manera química al péptido, incluyen hemocianina Í-ij¿a» ÍjÍ¿¿-*''**t»---- >MS''t»---*-- . CM.m y»-.!. . • - - - - .«1 M.?.mAjlk? *MM mjl*^*. M.M... , .- . .... ...-„, .„.—..J .. -I , de limpete de orificio (KLH) , tiroglobulina, albúmina de suero de bovino (BSA), y el toxoide del tétanos. Después, se usa el péptido acoplado para inmunizar al animal (por ejemplo, un ratón, una rata, o un conejo) . Si se desea, se pueden purificar adicionalmente los anti-cuerpos policlonales o monoclonales, por ejemplo, por medio de fijarlos a, y levigarlos a partir de una matriz a la cual se fija el polipéptido o un péptido para el cual se cultivó el anticuerpo. Los técnicos en la materia conocerán diferentes técnicas comunes en las técnicas de inmunología para la purificación y/o concentración de los anti-cuerpos policlonales, así como de los anti-cuerpos monoclonales (Vea, por ejemplo, Coligan y colaboradores, Unidad 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Inters-cience, 1991, que se incorpora por referencia) . También es posible usar la tecnología antiidiotipo para producir anti-cuerpos monoclonales, los cuales imitan un epítopo. Por ejemplo, un anti-cuerpo monoclonal anti-idiotípico que se fabricó para un primer anti-cuerpo monoclonal tendrá un dominio de fijación en la región hipervariable, la cual es la "imagen" del epítopo que se fijó mediante el primer anti-cuerpo monoclonal . Plantas Genéticamente Modificadas En una modalidad, la invención proporciona una planta genéticamente modificada que comprende cuando menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica al BAS1 en su genoma, '-AyS? en donde la secuencia que modifica a BAS1 modula la síntesis de la brasinólida o la señalización en la planta. La planta también se puede caracterizar porque tiene actividad de fitoecdisteroide modulada. La planta se caracteriza por lo tanto porque tiene actividad de brasinólida o de fitoecdisteroide modulada. También se incluyen en la presente las células y te idos de plantas, todos derivados a partir de la planta genéticamente modificada de la invención. Además, se proporcionan las semillas que pueden germinar dentro de una planta genéticamente modificada, como se describe en la presente. El término "modificación genética" , como se usa en la presente, se refiere a la introducción de una o más secuencias de ácido nucleico heterólogo dentro de una o más células de plantas, las cuales pueden generar plantas completas, sexualmente competentes, viables. El término "genéticamente modificadas", como se usa en la presente, se refiere a una planta que se ha generado a través de uno de os procesos que se mencionaron anteriormente. Las plantas genéticamente modificadas de la invención pueden autopolinizarse o polinizarse por cruzamiento con otras plantas de la misma especie, de manera que un gen extraño, que se lleva en la línea germinal, se pueda insertar dentro, o cultivarse dentro de variedades de plantas agricultu-ralmente útiles. El término "célula de planta", como se usa en la presente, se refiere a los protoplastos, células productoras de gametos, y células que se regeneran en plantas completas. De i i fe. conformidad con lo anterior, en la definición de "célula de planta" se incluye una semilla que comprende múltiples células de planta que se pueden regenerar en una planta completa. Como se usa en la presente, el término "planta" se refiere ya sea a una planta completa, la parte de una planta, una célula de planta, o un grupo de células de plantas, tales como tejido de plantas, por ejemplo. Las plántulas que se incluyen en la invención son cualesquier plantas receptivas a las técnicas de transformación, que incluyen plantas monocotiledóneas y dicotile- doñeas, así como coniferas y similares. Los ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen, pero no se limitan a, espárrago, maíz de forraje y dulce, cebada, trigo, arroz, sorgo, cebolla, mijo perla, centeno y avena. Los ejemplos de plantas dicotiledóneas incluyen, pero no se limitan a, jitomate, tabaco, algodón, semilla de naba, frijoles de campo cultivado, frijol de soya, pimientos lechuga, chícharos, alfalfa, trébol, cultivos de col o Brassica olerácea (por ejemplo, repollo, brócoli, coliflor, coles de Bruselas), rábano, zanahorias, remolacha, berenjena, espinaca, pepino, calabaza, melones, cantaloupe, girasoles y diferentes plantas de ornamento. Las especies leñosas incluyen álamo, álamo temblón, pino, secoya, cedro, chopo, acacia, roble y similares. Los mutantes de ganancia de función de BAS1 de estas especies leñosas producen árboles que son más compactos y de verde más oscuro que las plantas que no expresan en demasía el gen basl . Además, se observa un rango de fenotipos en estas plantas transgénicas (por ejemplo, dependiendo del grado de sobre-expresión) desde enanos extremos hasta aquellos que son ligeramente más compactos y verde oscuro, lo que permite la selección de enanos "ideales" que se pueden producir indefinidamente. Además de árboles y otras plantas de ornamento, se puede producir césped de mutante basl para obtener prados más compactos, de colore verde oscuro (por ejemplo, que necesitan que se le siegue poco) . Las plantas enanas de la invención, a diferencia de las plantas enanas convencionales, se producen sin la aplicación de compuestos orgánicos exógenos costosos a través de toda la vida de la planta, productos químicos que pudieras ser ilegales para su aplicación bajo ciertas condiciones. El término "secuencia de ácido nucleico heterólogo" , como se usa en la presente, se refiere a cuando menos un gen estructural que se asocia de manera operable con una secuencia reguladora tal como un promotor. La secuencia de ácido nucleico se origina en una especie extraña, o en la misma especie, si se modifica sustancialmente a partir de su forma original. Por ejemplo, el término "secuencia de ácido nucleico heterólogo" incluye un ácido nucleico que se origina en la misma especie, en donde esta secuencia se enlaza de manera operable a un promotor que difiere del promotor de tipo silvestre o natural. Como se usa en la presente, el término "secuencia d ácido nucleico" se refiere a un polímero de deoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, en la forma de un fragmento separado o como un •*»* j * * componente de una construcción más grande. El ADN que codifica las proteínas que se utilizan en el método de la invención, se puede ensamblar a partir de fragmentos de ADNc o a partir de oligonucleótidos que proporcionan un gen sintético que se puede expresar en una unidad de transcripción recombinante. Las secuencias de polinucleótidos o de ácido nucleico de la invención incluyen secuencias de ADN, ARN y ADNc (ver la descripción previa) . Polinucleótidos Anti-sentido Las plantas que tienen niveles y/o actividad incrementados del ecdisteroide o la brasinólida, se pueden conseguir mediante la introducción de moléculas anti-sentido dentro de la célula de una planta, a partir de la cual se produce una planta transformada o genéticamente modificada. Este planteamiento también incluye, por ejemplo, ácido nucleico anti-sentido, riboenzimas, o agentes triples para bloquear la transcripción o traducción del ARNm de BAS1, ya sea por medio de disfrazar ese ARNm con un ácido nucleico anti-sentido o agente triple, o por medio de disociarlo con una riboenzima. En una modalidad, la invención incluye una planta genéticamente modificada que tiene un transgen que rompe o interfiere con la expresión del gen basl , que se integra de manera cromosomática dentro del genoma de la planta. Un "transgen" es cualquier pieza de ADN que se inserta por artificio dentro de una célula, y llega a ser parte del genoma del organismo o la planta que se desarrolla a partir de esa célula. Este transgen puede incluir un gen el cual es parcial o completamente heterólogo (es decir, extraño) para el organismo transgénico, o puede representar un gen homólogo a un gen endógeno del organismo. Como se usa en la presente, el término "transgen" significa una secuencia de ADN que incluye uno o más ADNs seleccionados que se van a expresar en una planta genéticamente modificada o transgénica que es parcial o enteramente heteróloga, es decir, extraña, para la planta transgénica, o heteróloga para un gen endógeno de la planta transgénica, pero se diseña para insertarse dentro del genoma de la planta en un lugar que difiere de aquel del gen original . Un transgen incluye uno o más promotores y cualquier otro ADN, tal como los intrones, necesarios para la expresión del ADN seleccionado, todos enlazados de manera operable al ADN seleccionado, y puede incluir una secuencia mejoradora. La invención incluye un método para producir una planta genéticamente modificada que se caracteriza por ser hipersensible a la brasinólida por medio de poner en contacto una célula de planta con un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que incluye cuando menos un gen estructural que romper o interfiere con la expresión del polipéptido BAS1, en donde el gen se asocia de manera operable con un promotor, para obtener una célula de planta transformada; producir una planta a partir de células de plantas transformadas; y seleccionar una planta que aá .i-.m- . ,iz -.íí.4.íí. exhiba hipersensibilidad a la brasinólida de una manera dependiente de la luz. La hipersensibilidad a la brasinólida se puede identificar como se demuestra en los Ejemplos en la presente, por ejemplo, la observación visual del desarrollo del hipocotíleo de la planta transgénica en comparación con el desarrollo del hipocotíleo de la planta de tipo silvestre en las plántulas. El método para producir una planta genéticamente modificada que se caracteriza porque tiene hipersensibilidad para la brasinólida, incluye poner en contacto una célula de planta con un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico anti-sentido de BAS1 o una secuencia de ácido nucleico que codifica una forma negativa del BAS1, que se asocia de manera operable con un promotor, y cultivar plantas que se obtienen a partir de estas células de plantas en luz. Los ácidos nucleicos anti-sentido son moléculas de ADN o ARN que son complementarias para cuando menos una porción de una molécula de ARNm específica (Weintraub, 1990, Scientifi c American 262 : 40) . En la célula, los ácidos nucleicos anti-sentido se hibridan con el ARNm correspondiente, formando una molécula de cadena doble. Los ácidos nucleicos anti-sentido interfieren con la traducción del ARNm, debido a que la célula no traducirá un ARNm que sea de cadena doble. Se prefieren los oligómeros anti-sentido de aproximadamente 15 nucleótidos, debido a que éstos se sintetizan de manera sencilla y es menos probable que provoquen problemas, en comparación con las moléculas más grandes, cuando g-Mfe a . se introducen dentro de la célula productora de BAS1 objetivo. El uso de los métodos de anti-sentido para inhibir la traducción in vivo de genes, es bien conocido en la materia (Marcus-Sakura, 1988, Anal . Biochem . 172:289) . También se pueden usar virus para la supresión anti-sentido (Angelí y Balcombe, Embo J. , 16 : 3675 , 1997) . El uso de un oligonucleótido para obstruir la transcripción, se conoce como la estrategia triple debido a que el oligómero se enrolla alrededor del ADN de doble hélice, formando una hélice de tres cadenas. Por lo tanto, estos compuestos triples se pueden diseñar para reconocer un sitio único en gen escogido (Maher y colaboradores, 1991, Antisense Res . and Dev. 1(3) : 227 ; Helene, C, 1991, Anticancer DruQ Desiqn 6(6) :569) . Las riboenzimas son moléculas de ARN que poseen la capacidad para disociar de manera específica a otro ARN de una sola cadena, de una manera análoga a las endonucleasas de restricción del ADN. A través de la modificación de las secuencias de nucleótidos que codifican estos ARNs, es posible diseñar moléculas que reconozcan las secuencias de nucleótidos específi-cas en una molécula de ARN y disociarla (Cech, 1988, J. Amer. Med . Assn . 260:3030) . Una ventaja principal de este planteamiento es que, debido a que son específicos para la secuencia, solamente se desactivan los ARNs con secuencias particulares. Existen dos tipos básicos de riboenzimas, a saber, el tipo tetrahimena (Hasselhoff, 1988, Nature 334 : 585) y el tipo "cabeza de martillo" . Las riboenzimas del tipo tetrahimena reconocen secuencias que tienen cuatro bases de longitud, mientras que las riboenzimas del tipo de "cabeza de martillo" reconocen secuencias base de 11-18 bases de longitud. Entre más 5 larga sea la secuencia de reconocimiento, más grande será la probabilidad de que la secuencia ocurra exclusivamente en las especies de ARNm objetivo. En consecuencia, las riboenzimas de tipo de cabeza de martillo son preferibles a las riboenzimas de tipo tetrahimena para desactivar una especie de ARNm específica 10 y las secuencias de reconocimiento de 18 bases son preferibles a las secuencias de reconocimiento más cortas. Mutaciones Negativas Dominantes En otra modalidad de la presente invención se proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína 15 negativa dominante de BASl. Por ejemplo, se puede enlazar de manera operable una construcción genética que contenga este gen de codificación negativo dominante, a un promotor tal como un promotor específico de tejido. Los ejemplos de estos promotores y métodos se uso, se describieron anteriormente. 20 Estas construcciones son útiles en los métodos para modular la actividad de la brasinólida o para controlar la estatura en una planta. Por ejemplo, un método de la invención incluye la transformación de una célula o tejido de planta con una construcción genética que codifica una proteína de BAS1 25 negativa dominante y el promotor adecuado en enlace operable y expresar el gen basl de codificación negativa dominante, modulando mediante lo mismo la actividad de la brasinólida en la planta, por medio de interferir con la actividad del BAS1 de tipo silvestre . Selección para agonistas o antagonistas de BAS1 En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar un compuesto que module la actividad de la proteína o la expresión del gen de BASl. El método incluye incubar los componentes que comprenden el compuesto, el polipép-tido BAS1 o una célula recombinante que exprese el polipéptido BAS1, bajo condiciones suficientes para permitir que los componentes interactúen y determinar el efecto del compuesto sobre la actividad o la expresión del BASl. Se puede medir el efecto del compuesto sobre la actividad de BAS1 mediante un número de ensayos, y puede incluir mediciones antes y después de la incubación en la presencia del compuesto. Los compuestos que afectan la actividad de BAS1 o la expresión del gen incluyen péptidos, peptidomiméticos, polipéptidos, compuestos químicos y agentes biológicos. Los ensayos incluyen el análisis de manchado Northern del ARNm de BSA1 (por ejemplo, para la expresión del gen) y el análisis de manchado Western (por ejemplo, para la actividad de la proteína) . La incubación incluye condiciones que permiten el contacto entre el compuesto de prueba y el polipéptido BAS1 o con una célula recombinante que exprese el polipéptido BASl. El contacto incluye la fase en solución y en sólido, o en una célula. El compuesto de prueba puede ser opcionalmente una genoteca de combinación para clasificar una pluralidad de compuestos. Los compuestos que se identifican en el método de la 5 invención se pueden evaluar, detectar, clonar, secuenciar, o algo similar de manera adicional, ya sea en solución o después de fijarlos a un soporte sólido, mediante cualquier método que se aplique usualmente a la detección de una secuencia de ADN específica tal como PCR, restricción del oligómero (Saiki y 10 colaboradores, Bio/Technology, 2:1008-1012, 1985), análisis de sonda de oligonucleótido específico del alelo (ASO) (Conner y colaboradores, Proc . Nati . Acas . Sci . , 22=278, 1983), ensayos de ligación de oligonucleótidos (OLAs) (Landegren y colaboradores, Sci ence, 241:1077, 1988), y similares. Se han repasado las 15 técnicas moleculares para el análisis de ADN (Landegren y colaboradores, Science, 242:229-237, 1988) . La invención proporciona un método para identificar un compuesto el cual puede modular la actividad de un BASl. El método incluye incubar el polipéptido BAS1 o una célula recombi- 20 nante que exprese un polipéptido BAS1 o variante del mismo, y un compuesto de prueba, bajo condiciones suficientes para permitir que los componentes interactúen, y medir el efecto del compuesto sobre la actividad o expresión del BASl. Los compuestos que afectan la actividad de BAS1 o la expresión del gen incluyen 25 péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, compuestos químicos y agentes biológicos. "Incubar" incluye condiciones que permitan el contacto entre el compuesto de prueba y el polipéptido BASl. "Poner en contacto" incluye la fase en solución y en sólido. El compuesto 5 de prueba puede ser también una genoteca de combinación para clasificar una pluralidad de compuestos. Se puede incluir una variedad de otros agentes en los ensayos de selección. Estos incluyen agentes como sales, proteínas neutrales, por ejemplo albúmina, detergentes, etcétera, que se usan para facilitar la 10 fijación proteína-proteína óptima y/o reducir las interacciones no específicas o de antecedente. Se pueden usar reactivos que mejoran la eficiencia del ensayo, tal como los inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos, etcétera. Se agrega la mezcla de componentes en cualquier orden 15 que proporcione la fijación de requisito. Las incubaciones se realizan a cualquier temperatura adecuada, típicamente entre 4°C y 40°C. Los períodos de incubación se seleccionan para la actividad óptima, pero también se pueden optimizar para facilitar la selección de rendimiento elevado rápida. Típicamente, serán 20 suficientes entre 0.1 y 10 horas. Los compuestos que son ácidos nucleicos por naturaleza que se identifican en el método de la invención, se pueden evaluar, detectar, clonar, secuenciar y más, de manera adicional, ya sea en solución o después de fijarlos a un soporte sólido, 25 mediante cualquier método que se aplique usualmente para la detección de un ADN específico, tal como la PCR, restricción del oligómero (Saiki y colaboradores, Bio/Technology, 2=1008-1012, 1985) , análisis de sonda de oligonucleótido específico del alelo (ASO) (Conner y colaboradores, Proc . Na ti . Acas . Sci . , 22=278, 1983), ensayos de ligación de oligonucleótidos (OLAs) (Landegren y colaboradores, Science, 241 : 1077 , 1988), y similares. Se han repasado las técnicas moleculares para el análisis de ADN (Landegren y colaboradores, Sci ence, 242:229-237, 1988) . Los compuestos candidatos que afectan la actividad de BAS1 incluyen compuestos químicos. Una clase son las moléculas orgánicas, de preferencia compuestos orgánicos pequeños que tengan un peso molecular de más de 50 y de menos de aproximadamente 2,500 daltones. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con las proteínas, particularmente la fijación del hidrógeno, y típicamente incluyen cuando menos una amina, un grupo carbonilo, hidroxilo o carboxilo, de preferencia cuando menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos frecuentemente comprenden carbono cíclico o estructuras heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los compuestos candidatos se obtienen a partir de una variedad amplia de fuentes que incluyen genotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, hay disponibles numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, que incluyen la expresión de oligonucleótidos y oligopéptidos aleatorizados. De manera alternativa, las genotecas producidas de manera natural o sintética están disponibles o se producen fácilmente. Adicional-mente, las genotecas y productos que se producen de manera natural o sintética se modifican fácilmente a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales, y se pueden usar para producir genotecas de combinación. Los agentes farmacéuticos conocidos se pueden someter a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, etcétera, para producir análogos estructurales. Los agentes candidatos también se encuentran entre las biomoléculas que incluyen, pero no se limitan a: péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Un compuestos puede afectar la expresión del gen reportero ya sea por medio de estimular o inhibir la expresión del gen reportero. Un compuesto "inhibe" la expresión del gen reportero si el nivel de transcritos o producto de proteína que se produjo a partir del gen reportero, disminuye en comparación con el nivel en la ausencia del compuesto de prueba. Un compuestos "estimula" la expresión del gen reportero si se incrementa el nivel de transcritos o producto de proteína que se produjo a partir del gen reportero. Un técnico en la materia puede identificar un número de í?í±Si-ikmi. i *M,m? . -?.A l.i.,i.,j genes reporteros para el uso en el método de clasificación de la invención. Los ejemplos de genes reporteros de uso con la invención, son lacZ, luciferasa, acetiltransferasa de cloranfenicol, beta-glucuronidasa y proteína fluorescente verde. 5 El efecto del compuesto sobre la transcripción del gen reportero se puede medir por medio de evaluar la expresión del reportero mediante métodos bien conocidos en la materia (por ejemplo, manchas Northern; EMSA) . De manera alternativa, se puede medir la producción del producto de proteína a partir del gen reportero mediante métodos bien conocidos en la materia (por ejemplo, ensayo inmunosorbente enlazado con enzima [ELISA] o RÍA; manchas Western; SDS-electroforesis de gel de poliacrilamida [SDS-PAGE] ) . La invención proporciona además un método para identificar una proteína celular que se fija al polipéptido BAS1 o una variante del mismo, por medio de incubar cuando menos una proteína celular y el polipéptido BAS1 de la invención o una variante del mismo, bajo condiciones suficientes para que los componentes interactúen, separando un complejo del polipéptido BAS1 y una proteína de fijación putativa a partir del BAS1 sin fijar, y aislando la proteína (por ejemplo, un sistema de 2 híbridos) . En una modalidad preferida, se utiliza una proteína celular aislada. Sin embargo, se pueden utilizar proteínas parcialmente purificadas, fracciones de extractos de células, extractos de células completas, o células intactas con el método de la invención. "Incubar" incluye condiciones que permitan el contacto entre el componente celular y el polipéptido BASl. El término "interactuar" incluye la fase en solución y sólida, e incluye la formación o fijación de cualquier complejo del componente celular al polipéptido BASl. Interactuar también incluye cualquier interacción enzimática en donde el componente celular realice una modificación bioquímica del polipéptido BASl. El complejo del componente celular con un polipéptido BAS1 se puede separar a partir del polipéptido BAS1 no acomplejado, mediante cualquier medio convencional, bien conocidos para un técnico en la materia. La presencia del componente celular que se fijó al BAS1 se puede conseguir mediante separación por tamaño, separación física, u otros métodos estándares. Por ejemplo, se puede usar la electroforesis de gel no desnaturalizante para separar el BAS1 acomplejado con un componente celular a partir del BAS1 no acomplejado. Una vez que se ha aislado el complejo, se puede aislar y caracterizar el componente celular mediante elementos bien conocidos en la materia. Por ejemplo, si el componente celular es una proteína, se puede secuenciar la proteína usando la metodología bien conocida en la materia. El polinucleótido que codifica la proteína se puede producir usando la tecnología de síntesis de ADN. Después, se puede insertar el polmucleótido dentro de un vector usando técnicas moleculares bien conocidas en la materia, 'itíJ..Aá.A.íkt>¿-t**.>-l-y transformarlo dentro de células anfitriones, usando las técnicas que se describieron anteriormente. Después de la transformación, se pueden aislar grandes cantidades de la proteína y purificarlas de conformidad con las maneras convencio-nales. Por ejemplo, el lisato se puede preparar del anfitrión de expresión y el lisato purificado, usando cromatografía de líquido de alto rendimiento (HPLC) , cromatografía de exclusión, electroforesis de gel, cromatografía de afinidad, u otra técnica de purificación. La proteína purificada generalmente será cuando menos aproximadamente 80 por ciento pura, de preferencia cuando menos aproximadamente 90 por ciento pura, y puede ser hasta e incluir, 100 por ciento pura. Por puro se quiere decir libre de otras proteínas, así como de desechos celulares. Las plantas genéticamente modificadas de la invención, pueden autopolinizarse o polinizarse por cruzamiento con otras plantas de la misma especie, de manera que el gen extraño, que se lleva en la línea germinal se pueda insertar dentro, o cultivarse dentro de variedades de plantas agriculturalmente útiles. El término "célula de planta", como se usa en la presente, se refiere a los protoplastos, células productoras de gametos, y células que se regeneran en plantas completas. De conformidad con lo anterior, una semilla que comprenda múltiples células de planta que puedan regenerarse dentro de una planta completa, se incluye en la definición de "células de planta" . De manera alternativa, se pueden introducir las -I» .- ««»— «I > ?.A. * j. t secuencias de ácido nucleico que codifican a BAS1 dentro de una célula de planta, usando medios mecánicos o químicos. Por ejemplo, el ácido nucleico se puede transferir de manera mecánica dentro de la célula de planta mediante microinyección, usando una micropipeta. De manera alternativa, se puede transferir el ácido nucleico dentro de la célula de planta mediante el uso de polietilenglicol, el cual forma un complejo de precipitación con el material genético que capta la célula. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el BAS1 también se pueden introducir dentro de células de plantas mediante electroforesis (Fromm y colaboradores, Proc . Na ti . Acad . Sci . USAK, 22=5824, 1985, la cual se incorpora en la presente por referencia) . En esta técnica, se someten a electroforesis los protoplastos de la planta en la presencia de vectores o ácidos nucleicos que contengan las secuencias de ácido nucleico de relevancia. Los impulsos eléctricos de alta resistencia de campo permeabilizan de manera reversible las membranas, permitiendo la introducción de los ácidos nucleicos. Los protoplastos de las células que se sometieron a electroforesis reforman la pared celular, dividen y forman un callo en la planta. La selección de las células de planta que se transformaron con el gen transformado, se puede conseguir usando los marcadores fenotípicos como se describe en la presente. Otro método para introducir el ácido nucleico que codifica el BAS1 dentro de la célula de una planta, es la -a*"* penetración balística de alta velocidad mediante partículas pequeñas, estando contenido el ácido nucleico que se va a introducir ya sea dentro de la matriz de esas partículas, o sobre la superficie de la misma (Klein y colaboradores, Nature, 327:70, 1987) . En Sanford y colaboradores ( Techniques , 2=3-16, 1991) y Klein y colaboradores (Bio/ Techniques, 20:286, 1992) también se describen los métodos de transformación por bombardeo. Aunque típicamente se requiere solamente una sola introducción de una secuencia de ácido nucleico, este método proporciona particular-mente para múltiples introducciones. Como se usa en la presente, el término "poner en contacto" se refiere a cualquier medio para introducir el basl dentro de la célula de la planta, incluyendo un medio químico o físico como se describió anteriormente. De preferencia, poner en contacto se refiere a introducir el ácido nucleico o el vector, dentro de células de plantas (incluyendo una explantación de tejido, una meristema o una semilla) , por medio de la Agrobacterium tumefaciens transformada con el ácido nucleico que codifica el BAS1, como se describió anteriormente. Selección para identificar genes de señalización de brasinólida y/o de respuesta novedosos La invención proporciona un método para identificar genes de señalización de brasinólida y/o de respuesta que se relacionan con el BAS1, por medio de sondear una genoteca de ácidos nucleicos con cuando menos un fragmento de un polinucleó- |fffrft ^*-*?*fr**At,'j'*uifa --*•*** a-tido aislado que codifica BAS1, y seleccionar esos clones que se hibridan con el fragmento. Los genes inhibidores de brasinólida novedosos, tales como los homólogos de basl , se identifican mediante cualquier número de métodos. Se puede aislar la secuencia de nucleótidos que codifica un gen de respuesta de brasinólida novedoso, de conformidad con cualesquiera de una variedad de métodos bien conocidos para los técnicos en la materia. Por ejemplo, el ADN que codifica el homólogo de BAS1 se puede aislar a partir ya sea de una genoteca de ADNc o a partir de una genoteca de ADN genómico (vea, por ejemplo Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) . En una modalidad, se puede usar un fragmento de un polinucleótido que codifique el BAS1 como una sonda de hibrida-ción con una genoteca de ADNc a partir del organismo objetivo de interés, o uno o más cebadores degradados cortos. En una modalidad preferida, la sonda es de cuando menos ocho nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos que tienen similitud de secuencia se detectan mediante hibridación bajo condiciones de estringencia baja, por ejemplo, a 50°C y lOxSSC (0.9 M solución salina/0.09 M citrato de sodio) y permanecen fijos cuando se someten a lavado a 55°C en lxSSC. La identidad de la secuencia se puede determinar mediante hibridación bajo condiciones más severas, por ejemplo, a 50°C o más y 0. lxSSC (9 mM solución salina/0.9 M citrato de sodio) . Mediante el uso de sondas, particularmente sondas etiquetadas de secuencias de ADN, uno puede aislar los homólogos o los genes relacionados. La fuente de los genes homólogos puede ser cualquier especie, por ejemplo, especies de plantas, especies de primates, particularmente seres humanos; roedores, tales como ratas y ratones, caninos, felinos, bovinos, ovinos, equinos, levadura, y nemátodos. De manera alternativa, el ADN que codifica una síntesis de brasinólida novedosa o el gen de señalización se puede aislar usando la amplificación por reacción de cadena de polimerasa (PCR) estándar de los cebadores de oligonucleótidos sintéticos, por ejemplo, como se describe en Mullís y colaboradores, patente de los Estados Unidos No. 4,800,159, o los métodos de clonación de expresión bien conocidos en la materia (vea, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloninq: A Laboratory Manual , 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) . Un técnico en la materia puede diseñar fácilmente los cebadores para la amplificación por reacción de cadena de polimerasa que se basa en la secuencia de un polinu-cleótido que codifica el polipéptido BASl. Todavía otro método alternativo para identificar genes homólogos o relacionado, utiliza el llamado sistema de "dos híbridos" de Fields & Song que se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,283,173. El sistema de dos híbridos incluye el uso de dos genes quiméricos que codifican proteínas híbridas para probar si hay interacción entre una proteína conocida y la proteína de interés. El primer gen quimérico codifica para un polipéptido BAS1, o fragmento funcional del mismo, que se fusiona al dominio de fijación de ADN de un activador transcripcional. El 5 segundo gen quimérico codifica para una proteína de interés que se fusiona al dominio de activación transcripcional del activador transcripcional. De manera alternativa, la proteína de interés pudiera ser desconocida y se podría derivar a partir de, por ejemplo, una genoteca de ADNc. En una célula hospedera adecuada 10 tal como la levadura, si la proteína de interés y la proteína de cebo sí interactúan, se llevan a la proximidad de los dominios de fijación del ADN y de activación transcripcional. Esta proximidad es suficiente para provocar la transcripción de un gen marcador que se coloca bajo el control de un promotor que contiene un 15 sitio de fijación para el dominio de fijación del ADN. De este modo, el sistema de dos híbridos generalmente permite la detección de una interacción entre dos proteínas por medio de la señal positiva de expresión de un gen reportero. Entre las especies de plantas, por ejemplo, monocotile- 20 doñeas, dicotiledóneas, y especies leñosas, los homólogos típicamente tienen similitud de secuencia sustancial, es decir, cuando menos 75 por ciento de identidad de secuencia entre las secuencias de nucleótidos. La similitud de la secuencia se calcula basándose en una secuencia de referencia, la cual puede 25 ser un subconjunto de una secuencia más larga, tal como un motivo conservado, región de codificación, o región de flanqueo, por ejemplo. Una secuencia de referencia será usualmente de cuando menos aproximadamente 18 nucleótidos (nt) de longitud, más usualmente cuando menos 30 nt de longitud, y se puede extender hasta la secuencia completa que se está comparando. Los algoritmos para el análisis de la secuencia son conocidos en la materia, tal como BLAST, que se describe en Altschul y colaboradores, J. Mol . Biol . 215:403-410, 1990. La secuencias que se proporcionan en la presente son esenciales para reconocer el BAS1 relacionado y las proteínas homologas en las búsquedas de la base de datos. Una "planta susceptible" se refiere a una planta a la que se puede inducir para que utilice su gen basl endógeno, para conseguir la sobre-expresión de BASl. El término "cantidad inductora del promotor" se refiere a esa cantidad de un agente necesaria para elevar la expresión del gen basl por arriba de la expresión del gen basl en una célula de planta que no se puso en contacto con el agente. Por ejemplo, se puede usar un factor de transcripción o un agente químico para elevar la expresión del gen desde un promotor nativo de basl , induciendo o incrementando así el promotor y la expresión del gen basl . Se ha adoptado el planteamiento de etiquetado del gen en los estudios que se presentan en la presente, para aislar los supresores de rotulación de activación (ATS) del phyB-4 de mutación de missense. La mutación phyB-4 cambia e aminoácido 283 de histidina a tirosina. Los estudios del tipo silvestre y la m Áiá . I. proteína phyB mutante que se expresa en la levadura, muestran que la mutación phyB-4 codifica un pigmento capaz de una fototrans-formación casi normal (T.D. Elich y J. Chory, Plant Cell , 2=2271-2280, 1997) . El mutante phyB-4 tiene un hipocotíleo largo en la luz blanca que es intermediaria entre el tipo silvestre y un alelo nulo (M. Koornneef y colaboradores, Heynh Z Pflanzenphysiol , 100S : 147-160 , 1980; J.W. Reed y colaboradores, Plant Cell , 5:147-157, 1993) . Esta transducción de señal mediada por phyB débil "actual" en el mutante phyB- 4 la hace un objetivo ideal para el análisis de ATS, permitiendo una búsqueda de genes basada amplia que se incluye en las respuestas experimentales a la luz. Esta técnica ha dado como resultado una identificación mutante de la basl -D (supresor 1 -dominante rotulado de activación del fitocromo B) , provocado por la expresión amplificada del citocromo P450: CYP72B1. La enzima basl -D cataliza la hidroxilación C26 de la brasinólida, apuntándole para la desactivación. Las líneas transgénicas con expresión reducida de basl -D tienen hipocotíleos con respuestas mejoradas a la brasinólida y respuestas reducidas a la luz. Los cruzamientos con mutaciones nulas del foto-receptor colocan la basl -D corriente abajo de phyA y cryl, lo que genera un supresor de desviación de alelos phyB . Nosotros proponemos que el gen basl -D actúa como un punto de control entre múltiples trayectorias de transducción de señal del foto-receptor y la señalización del brasinoesteroide . Una Arabidopsis mutante de basl-D es un supresor rotulado de i,l ?i a .1 *.i.i?iAi*i . i l ?-JSaia „^- J '. ,. Ir activación, dominante, de la mutación phyB-4 Se seleccionaron aproximadamente 3000 plántulas transgénicas phyB-4 (transformante primario) que contenían ADN-T con elementos mejoradores a partir del promotor CaMV 35S por hipocotíleos más cortos en luz blanca. A partir de esta selección, se aislaron tres mutantes bas -D dominantes que fueron causados por los genes endógenos amplificados o de sobre-expresión, debido a la inserción próxima de los elementos mejoradores del promotor CaMV 35S. El mutante doble basl -DphyB-4 exhibió un fenotipo que se caracteriza por un hipocotíleo significativamente más corto que phyB-4 (Figuras 2A-C) . Las semillas T3 a partir de los heterocigotos en la generación T2 , segregaron 470 plantas suprimidas, resistentes a la canamicina y 147 plantas no suprimidas, sensibles, lo que indicó que este transgen se localizaba en un solo lugar. El análisis Southern confirmó esta conclusión. Todas las plantas resistentes a la canamicina confirieron el fenotipo basl -DphyB-4 de hipocotíleos cortos. Además, todos los separadores altos fueron sensibles a la canamicina, lo que indica que el fenotipo de altura estuvo enlazado con el transgen basl -DphyB-4 . Los homocigotos de basl -D fueron indistinguibles de los heterocigotos en la etapa de plántula, sin embargo, las líneas heterócigas, adultas, dieron conjuntos de semillas ligeramente mejores. Se clonó el ADN genómico adyacente a la orilla derecha del ADN-T mediante el rescate de plásmidos (Figura 2) . Las búsquedas de BLAST (Altschul y colaboradores, supra) de ADN genómico de flanqueo mostró que el sitio de la inserción del ADN- T estuvo en el Cromosoma II sur del marcador ER a aproximadamente 50 centimorganos en el mapa físico (Vea el cromosoma artificial bacteriano secuenciado y anotado F18A8 (número de acceso del GenBank: AC003105) ) . Se insertaron los cuatro elementos mejorado- res, 381 nucleótidos 5' al inicio del gen basl . El análisis Northern del ARN total mostró que este marco de lectura abierta estaba sobre-expresado en esos mutantes basl -DphyB-4 . Otros dos transcritos predichos cerca del sitio de la inserción del ADN-T no mostraron una acumulación alterada en el mutante basl -DphyB-4 . El transcrito sobre-expresado codifica al BAS1, un citocroraa putativo P450 (CYP72B1) . El BAS1 es similar al clon T04442 en la base de datos EST de la Arabidopsis (número de acceso del GenBank: T04442) (T. Newman y colaboradores, Plant Physiol . , 106 : 1241-1255 , 1994). Sin embargo, después del secuenciamiento del gen basl , se descubrió un error en el secuenciamiento del clon T04442. Se verificó que el basl codifica un ADNc completo para CYP72B1, las plántulas mutantes phyB-4 que se transformaron ya sea con el gen mutante en contexto con los elementos mejoradores CaMV o con el ADNc bajo el control del promotor CaMV 35S, recapitularon el fenotipo basl -DphyB- 4 original como plántulas y adultos café claro, demostrando mediante lo mismo que la sobre- expresión del gen basl es responsable por el fenotipo mutante basl -DphyB-4 . El mutante doble basl -DphyB-4 se asemeja a los mutantes del brasinoesteroide como plántulas y adultos café claro, lo que muestra que la supresión del fenotipo de hipocotíleo largo phyB-4 es provocada por la alteración de la síntesis o la señalización del brasinoesteroide. A diferencia de las plantas que carecen de, o que son insensibles a los brasinoesteroides, las plántulas basl -DphyB-4 no tuvieron hipocotíleos cortos en la oscuridad. Cuando se cultivaron las líneas de recapitulación en la oscuri-dad, cuatro de cinco transformadores independientes con el ADNc bajo el control del promotor CaMV 35S tuvieron hipocotíleos cortos. Solamente una línea de recapitulación de los siete transformadores independientes con el clon mutante basl -D, tuvo hipocotíleos que fueron más cortos que el mutante basl -DphyB-4 original . Este resultado indica la regulación transcripcional de este gen mutante. El análisis Northern del transcrito basl -D en el mutante basl -DphyB-4 , no mostró ninguna diferencia en la acumulación del transcrito entre las plántulas que se cultivaron en la luz y en la oscuridad, lo que sugiere que la luz no regula la acumulación total del ARNm del basl -D. El análisis RT-PCR demostró una diferencia en la acumulación de transcritos entre los rosetones y los hipocotíleos de los mutantes phyB-4 y basl -DphyB-4 , lo que indica la regulación transcripcional específica del tejido para los genes tanto de tipo silvestre, como mutante. Como se muestra mediante la cuantificación de los productos de RT-PCR, hubo una acumulación tres veces mayor de transcrito en el rosetón que en el hipocotíleo, tanto en phyB-4 , como en basl -DphyB-4 . Además, los niveles y patrones de expresión en el tipo silvestre eran casi idénticos 5 a aquellos en phyB-4 . La cuantificación también mostró que la acumulación total del transcrito basl en los mutantes basl -DphyB- 4 fueron aproximadamente 50 veces más elevados que en el mutante phyB-4 o en la planta de tipo silvestre. Este análisis de la acumulación del transcrito basl que se toma junto con los 10 hipocotíleos cortos que se encontraron en las líneas de recapitulación café oscuro, demuestra que el basl -D reprime el phyB- 4 a través de la amplificación del patrón de expresión de basl endógeno y no mediante la expresión ectópica de este gen Se observa la expresión tres veces más grande en los 15 rosetones que en el hipocotíleo tanto en el tipo silvestre, phyB- 4 , como en el mutante basl -DphyB-4 . Sin embargo, aún en la oscuridad, aunque el basl -D tuvo aproximadamente una expresión 50 veces mayor que el tipo silvestre, solamente se creó un hipocotíleo ligeramente más corto, lo que indica que algún mecanismo 20 dependiente de la luz provoca que los hipocotíleos de los mutantes basl -D se hicieran hipersensibles a la luz. Todavía falta ver si este control es transcripcional, postranscripcional o de traslación. La sobre-expresión y sub-expresión del CYP72B1 confieren 25 respuestas alteradas a la brasinólida Para probar el papel del gen basl en las plantas de tipo silvestre, se generaron pérdidas parciales de las líneas transgénicas de función por medio de las construcciones anti-sentido (D.C. Baulcombe, Plant Mol Biol , 22:79-88, 1996) . El análisis RT-PCR mostró que dos de estas líneas exhibieron aproximadamente el 50 por ciento de la acumulación del transcrito basl de tipo silvestre. Estas líneas fueron epistáticas para el mutante basl -DphyB-4 , lo que demuestra adicionalmente que estos son mutantes anti-sentido bona fide . Los experimentos de respuesta a la dosis mostraron una hipersensibilidad a la brasinólida para los hipocotíleos de las líneas anti-sentido cuando se cultivaron en la luz (Figura 3A) , aunque no cuando se cultivaron en la oscuridad (Figura 3B) . En contraste, un mutante det2 -l de la biosíntesis del brasinoeste-roide produjo peciolos que fueron más cortos que el tipo silvestre en la luz, mientras que los peciolos de los mutantes phyB-4 fueron más largos que el tipo silvestre en la luz. En ambos casos, estos fenotipos se rescataron mediante la exposición a cantidades en aumento de brasinoesteroides. En contraste, los peciolos del mutante basl -DphyB-4 siempre fueron más cortos que el tipo silvestre en todos los niveles de brasinoesteroide que se probaron, lo que indica que, a diferencia de det2 -l , los fenotipos del rosetón de basl -DphyB- 4 . Es insensible a los brasinoesteroides (Figura 3C) . Análisis Cuantitativo de brasinoesteroides en basl -DphyB-4 y phyB - 4 La sobre-expresión de basl confiere un fenotipo enano dominante con los rosetones que son insensibles a la brasinólida (BR) . Para probar si el gen basl -DphyB-4 desactiva o degrada los brasinoesteroides, se determinaron los niveles endógenos de BRs a partir de las plantas basl -DphyB-4 y phyB-4 mediante el uso del análisis de ion seleccionado por cromatografía de gas con estándares internos. Los resultados de estos estudios (Tabla I) mostraron que se detectaron castasterona y 6-deoxocastasterona en basl -DphyB-4 , pero a niveles grandemente reducidos en comparación con aquellos en phyB-4 . Además, no se detectó brasinólida en basl -DphyB-4 . De este modo, los niveles endógenos de BRs en basl -DphyB-4 fueron grandemente disminuidos, o que indicó que esta mutación afecta los niveles de BR y se puede relacionar con la hidroxilación de la brasinólida. De hecho, se encontró una acumulación incrementada de 6-deoxoteasterona en el mutante basl -DphyB-4 . Aunque la invención no pretende obligarse por el mecanismo, se cree que este resultado podría ser provocado por la regulación superior de las enzimas biosintéticas que se inhiben por retroalimentación mediante una brasinólida de producto final que no fue detectable en el mutante basl -DphyB-4 . Para probar la hipótesis de que la sobre-expresión del producto del gen basl da como resultado la hidroxilación de la brasinólida, se examinó el metabolismo de la brasinólida rotulada con deuterio y no rotulada, usando plántulas que se cultivaron de manera aséptica. Como posibles metabolitos hidroxilados de la brasinólida, se sintetizaron químicamente la 14-hidroxibrasinóli-da, 20-hidroxibrasinólida, 25-hidro-xibrasinólida, 26-hidroxibra-sinólida, y 28-hidroxibrasinólida . Las posibles fracciones de brasinólida hidroxilada a partir de los experimentos de alimentación, se analizaron mediante cromatografía de gas - espectrometría de masa (GC-MS) , después de la conversión a derivados de metanoboronato-trimetilsililo . En experimentos preliminares, se alimentó a las plántulas de basl -DphyB-4 y phyB-4 con brasinólida rotulada con 2H6 (d6-BL) y se incubó durante un día. Se encontró un pico prominente en GC-MS en el basl -DphyB-4 (el nivel fue seis veces más elevado que en el phyB-4 solo) . Basados en la comparación con cromatografía de gas - espectrofotometría de masa (GC-MS) directa con las muestras auténticas, se sugiere que el metabolito podría ser la d6-BL hidroxilada en el carbono 26 (d6-26-OHBL) . Para confirmar la identificación del 26-OHBL, se realizaron los experimentos con la d6 -brasinólida (d6-BL) y la BL no rotulada (BL) . Cuando se alimentó con BL a las plántulas, se detectó 26-OHBL como un metabolito de BL . El espectro de masa y el tiempo de retención en GC fueron idénticos a aquellos de la 26-OHBL auténtica. Cuando se alimentó con d6-BL a las plántulas, se detectaron iones del fragmento tales como m/z 625, 583 y 570. Estos i9ones de fragmento corresponden con m/z 619, 577 y 564 del derivado de metanoboronato-trimetilsililo de la 26-OHBL.

Adicionalmente, el tiempo de retención del metabolito (es decir, el derivado de 26-OHBL) en GC, fue de un segundo más pronto que aquel del derivado de 26-OHBL no rotulada. Esto se debe a un efecto del isótopo. De esta manera, se confirmó que la d6-26-OHBL era un metabolito de d6-BL. El nivel de este metabolito fue cinco veces más elevado en basl -DphyB- 4 que en los mutantes phyB-4 , lo que demuestra que la brasinólida se convierte en 26-hidroxibrasi-nólida en las plántulas de Arabidopsi s, y que la conversión es mayor en el mutante basl -DphyB-4 . Transcripción de otro citocromo biosintético 450s de BL en el mutante Jbasl -D No se detectó brasinólida en el mutante basl -D (Tabla I) . A través de la regulación por retroalimentación, esto podría provocar que ciertas enzimas biosintéticas del brasinoesteroide tengan expresión alterada en el antecedente del mutante basl -D. El transcrito CYP90A1 (que codificó el gen cpd) (M. Szekeres y colaboradores, Cell , 22=171-182, 1996) se acumula menos en la plantas que se alimentó con brasinólida (J. Mathur y colaboradores, Plant J, 24:593-602, 1998) . La acumulación del trasncrito del CYP90A1 y su miembro de familia, CYP90B1 (que codifica el gen dwf4 ) (S. Choe y colaboradores, Plant Cell , 10:231-43, 1998) se examinó en las plantas mutantes basl -DphyB-4 , en plantas de tipo silvestre, y en las dos líneas anti-sentido de basl . Tanto el transcrito cpd como el dwf4 , acumularon cinco veces mas en el mutante basl -DphyB-4 que en la planta de tipo silvestre. A S í i .L Í -lió-diferencia del cpd, el transcrito dwf4 acumuló 50 por ciento menos en la línea anti-sentido de basl que en las plantas de tipo silvestre . Análisis de respuesta de fluencia Para probar el papel del gen basl en la transducción de señal en luz, se analizó la respuesta tanto de los sobre-expresores como de los sub-expresores de basl , en calidades y cantidades variables de luz. Aunque el mutante basl -DphyB-4 fue ligeramente más corto que el tipo silvestre en la oscuridad, fue hipersensible a la luz blanca, roja, muy roja y azul continua. En contraste, las líneas anti-sentido de basl tuvieron hipocotíleos que fueron ligeramente más largos que el tipo silvestre en la oscuridad, mostraron una sensibilidad reducida a la luz blanca, muy roja y azul (Figuras 4A-C) , y exhibieron una respuesta de tipo silvestre a la luz roja (Figura 4D) . Como se esperaba, los mutantes phyB-4 tuvieron una respuesta reducida a la luz blanca y la luz roja, en comparación con el tipo silvestre. Es probable que haya una actividad mínima de basl corriente debajo de la luz; roja debido a que el mutante basl -DphyB-4 fue menos sensible a la luz roja que a otras condiciones de luz, mientras que las líneas anti-sentido de basl respondieron de manera normal a la luz roja. Para probar cuál de los foto-receptores controla la actividad de basl , se hicieron mutantes dobles con basl -D y los alelos nulos de phyA, phyB, y cryl (Figuras 5A-B) . En la luz muy roja continua, el basl -D no suprimió una mutación nula phyA (Figura 5A) . En la luz azul continua, el basl -D suprimió parcialmente una mutación nula cryl (Figura 5B) . En contraste, el basl -D suprimió por completo una mutación nula phyB . Tomados juntos con el análisis de respuesta de afluencia (Figuras 4A-D) , estos datos indican que en os mutantes basl -D (los cuales sobre-expresan el gen basl ) , los alelos phyB se suprimen a través de la actividad de cuando menos phyA y cryl y se pueden colocar normalmente como un supresor de desviación de phyB. Expresión heteróloga Para probar si el gen Arabidopsi s thalia basl es activo en un sistema heterólogo, se transformaron plantas de tabaco ya sea con el gen mutante basl -D o el ADNc de basl que está siendo impulsado por el promotor CaMV 35S (Vea el Ejemplo 11 en la presente) . En los dos casos, fue posible crear plantas de tabaco enanas que tenían un fenotipo evocativo de aquel que se creó en el mutante basl -DphyB-4 original en la Arabidopsi s . Las plantas de tabaco que expresaron el gen mutante basl -D tuvieron hojas verde oscuro, epinásticas, con tallos y peciolos cortos, en comparación con el tipo silvestre. Las plántulas que se cultiva-ron en la oscuridad a partir de estas plantas, tuvieron hipocotíleos que fueron similares al tipo silvestre en la oscuridad, teniendo la más severa de los dos hipocotíleos ligeramente más cortos evocativos de los mutantes basl -DphyB-4 que se cultivaron en la oscuridad. Las plantas de tabaco transgénicas que expresaron el ADNc de basl bajo el control del promotor CaMV 35S, también demostraron los atributos de las enanas que se cultivaron en la oscuridad. Cuando estas plántulas se cultivaron en la oscuridad, tuvieron hipocotíleos significativamente más cortos que el tipo silvestre, teniendo el más débil de los dos expresores del ADNc hipocotíleos dramáticamente más cortos que la más fuerte de las dos líneas que expresaron el gen mutante basl -D. Estos resultados indican que los brasinoesteroides pueden ser desactivados por CYP72B1, el producto del gen basl , en el tabaco y que existe un control transcripcional similar de la expresión del gen basl en estos sistemas de plantas heterólogas. El basl -D suprime la mutación phyB -4 a través de la desactivación de los brasinoesteroides La identificación del basl -D da un discernimiento significativo acerca de dos procesos de señalización complejos y cómo estos procesos interactúan para regular el desarrollo de la planta. Se ha estudiado la acción recíproca entre la luz y la señalización de la hormona durante años, aunque los mecanismos entre estas trayectorias se entienden muy poco. La expresión mejorada (es decir, la sobre-expresión de CYP72B1) suprime el fenotipo de hipocotíleo largo del mutante foto-receptor débil phyB-4 . Estos resultados de los estudios que se describieron anteriormente indican que esta enzima cataliza la desactivación del brasinoesteroide por medio de la hidroxilación, siempre que: el mutante basl -DphyB-4 se parezca a los mutantes del brasinoes- jj» a» ji-yW. %. a;»-»&..-. » — . teroide; no haya brasinólida detectable en el mutante basl -DphyB-4 ; y que el mutante basl -DphyB-4 convierta la brasinólida en una forma C26 hidroxilada en una proporción más grande que el tipo silvestre. Los experimentos de alimentación y de respuesta a la dosis alegan que uno de los sustratos para CYP72B1 es la brasinólida de producto final de la biosíntesis. Sin embargo, las mediciones de los precursores de la biosíntesis de la brasinólida mostraron niveles reducidos tanto de la castasterona como de la 6-deoxo-castasterona en el mutante doble basl -DphyB-4 , en comparación con el phyB-4 solo, lo que sugiere que el CYP72B1 también puede actuar sobre los precursores del brasinoesteroide. La acumulación de la 6-deoxoteasterona en el basl - DphyB-4 es provocada probablemente por la actividad incrementada de las hidroxilasas del esteroide CYP90A1 que cataliza la hidroxilación C23 de la (6-deoxo) catasterona a (6-deoxo) teasterona, que se identificaron originalmente como los alelos de pérdida de función cpd, dwf3 , y cbb3 (M. Szekeres y colaboradores, supra ; A. Kauschmann y colaboradores, Plant J, 2 = 701-713, 1996) . El gen cpd se expresa en los cotiledones y hojas jóvenes de las plántulas en desarrollo y se regula hacia abajo por la brasinólida (Mathur y colaboradores, supra) . Debido a que la brasinólida no es detectable en los rosetones del basl -DphyB- 4 , uno podría esperar la expresión más elevada que se observó del cpd en los rosetones. El CYP90B1, un miembro de la familia con CYP90A1 y que se identificó originalmente como el .á ~¿ .i & alelo dwf4 (Choe y colaboradores, supra) , cataliza el paso de hidroxilación C-22 antes de la actividad de cpd. El CYP90B1 también tiene acumulación de transcrito incrementada en el mutante basl -DphyB-4 . Los transcritos DWF4 acumular apenas el 50 por ciento en las líneas anti-sentido de BAS1 cuando se comparan con el tipo silvestre, correlacionándose muy bien con la acumulación del transcrito BAS1 en estas líneas y alegando que la transcripción de DWF4 está regulada apretadamente por la trayectoria de la biosíntesis de la brasinólida. La acumulación 10 de la 6-deoxoteasterona en los mutantes basl -DphyB-4 da suficiente evidencia bioquímica para decir que el BAS1 no hidroxila de manera eficiente la 6-deoxoteasterona, que actúa corriente debajo de este intermediario en la biosíntesis de la brasinólida (más probablemente en múltiples intermediarios además de la brasinóli¬ 15 da) . Esta conclusión coloca genéticamente al BAS1 corriente abajo tanto del CPD como del DWF4 . El que haya una acumulación en la 6- deoxoteasterona en el mutante basl -DphyB- 4 también argumenta que la actividad del BAS1 es probablemente uno de los pasos limitantes de velocidad en la síntesis del brasinoesteroide en las 20 hojas . Se ha clonado un receptor de brasinoesteroide putativo, el BR11 , y se mostró que tenía homología con las cinasas del receptor de repetición ricas en leucina (Li y Chory, supra) . A diferencia de los mutantes de la biosíntesis del brasinoesteroi¬ 25 de, los alelos bril de pérdida de función son insensibles a las tSM émaÉi méi ^-A-?.ñ,^ M,.L.. ^¿,.... aplicaciones de brasinólida, lo que los identifica como mutantes de señalización. La naturaleza del producto del gen sugiere que el bri l codifica el receptor de brasinólida; sin embargo, no se ha mostrado la fijación del brasinoesteroide por parte de BRI1. Uno de los aspectos que causa perplejidad que tienen que ver con la inclusión del BRI1 en la percepción de la brasinólida, es que parece ser que el gen se expresa de manera ubicua y constitutiva a través de todo el cultivo de la Arabidopsis y no está regulado por la luz, un patrón que es similar a la expresión del gen biosintético DET2 del brasinoesteroide (Li y Chory, supra) . Estos hallazgos hace surgir la cuestión en cuanto a cómo los brasinoesteroides actúan como hormonas si se metabolizan y se perciben en la misma célula. Una manera para regular las respuestas específicas del tejido a la brasinólida, es mediante la desactivación del esteroide a través de la hidroxilación mediada por BASl . El hecho de que el BAS1 tenga regulación transcripcional específica para el tejido soporta este modelo. Las dos mutaciones basl de ganancia de función y de pérdida de función confieren respuestas al brasinoesteroide alteradas en los hipocotíleos que se cultivaron en la luz, argumentando que en este tejido la actividad de CYP72B1 determina el grado de respuesta a los brasinoesteroides. Aunque las plántulas basl -DphyB-4 que se cultivaron en la oscuridad están descoloridas, tienen hipocotíleos que son ligeramente más cortos que el tipo silvestre. Además, las líneas anti-sentido de basl que se cultivaron en la oscuridad tienen hipocotíleos ligeramente más largos que el tipo silvestre. Estos resultados alegan que es la actividad del CYP72B1 la que finalmente controla la respuesta del hipocotíleo a los brasinoesteroides. La desactivación de la hormona mediante la hidroxilación, es un mecanismo que comparten los sistemas de plantas y e insectos. Como es el caso con BAS1, una hidroxilación C26 mediada por (CYP450) del citocromo P450 desactiva las hormonas de insectos, ecdiesteroides (H.H. Rees, Eur. J. Entomol . , 92 : 9-39 , 1995; H. Kayser y colaboradores , Eur J Biochem, 242:707-16, 1997; D.R. Williams y colaboradores, J Biol Chem, 222=8427-32, 1997). Aunque los ecdiesteroides se desactivan de una manera similar a los brasinoesteroides, estas hormonas de insectos no inducen las respuestas al brasinoesteroide en las plantas (S.D. Clouse y colaboradores, Plant Physiol , 100 : 1377-1383 , 1992). Otras hormonas de insecto juveniles se pueden hidroxilar y aparentemente catabolizar en una manera similar a la ecdisona (T.D. Sutherland y colaboradores, Proc Na ti Acad Sci USA, 95 : 12884-9, 1988). La hidroxilación C24 dependiente de CYP450 de la lcr.,25-dihidroxivitamina D-3 desactiva esta forma de vitamina D tanto en ratas (C. Hahn y colaboradores, Nucleic Acids Res, 22:2410-6, 1994; R. Kumar y colaboradores, J Biol Chem, 222=3804-9, 1978), como en seres humanos (K.S. Chen y colaboradores, Biochim Biophys Acta , 1262 = 1-9, 1995). En las plantas, la hidroxilación 2ß desactiva las giberel as, apuntándoles para su destrucción. ^ ' , ' -' •azámA.h??* ' '* •> •'•^— -* »..,., «. .^ttisi.

Existen cuando menos dos CYP450s que catalizan esta reacción en chícharos (Lester y colaboradores, Plant J. , 29=65-73, 1999) y cuando menos tres en la Arabidopsi s (Thomas y colaboradores, supra) . En ambos casos, parece que hay alguna redundancia genética con traslapo, así como patrones transcripcionales diferentes en diferentes tejidos. Dada la redundancia genética de las hidroxilasas 2ß de la giberelina en chícharos y Arabidopsis , una redundancia genética similar pudiera estar presente para la desactivación mediada por hidroxilación de los brasinoesteroides. La desactivación de la hormona mediante hidroxilación, no es un mecanismo poco común. Como es el caso con el BAS1 , la hidroxilación C26 mediada por CYP450 desactiva los ecdiesteroides de las hormonas de insecto (Rees, supra ; Kayser y colaboradores, supra ; Williams y colaboradores, supra) . Aunque los ecdiesteroi-des se desactivan de una manera similar a los brasinoesteroides, estas hormonas de insectos no inducen las respuestas al brasinoesteroide en las plantas (Clouse y colaboradores, supra) . Otras hormonas juveniles de insecto se pueden hidroxilar y aparentemente catabolizar de una manera similar a la ecdisona (Sutherland y colaboradores, supra) . La hidroxilación C24 dependiente de CYP450 de la la, 25-dihi-droxivitamina D-3 desactiva esta forma de vitamina D tanto en ratas (Hahn y colaboradores, supra ; Kumar y colaboradores, supra) , como en seres humanos (Chen y DeLucca, suprra) . En las plantas, la hidroxilación 2ß desactiva las giberelinas, apuntándoles para su destrucción. Existen cuando i AJk&?. ?*.? **?*MÁ ..M, sx?í.iy.zí.. menos dos CYP450s que catalizan esta reacción en chícharos (Lester y colaboradores, supra) y cuando menos tres en la Arabidopsi s (Thomas y colaboradores, suprra) . En los dos casos, parece que hay alguna redundancia genética con traslapo, así como patrones de transcripción distintos en diferente tejidos. Dada la redundancia genética de las hidroxilasas 2ß de la giberelina en los chícharos y la Arabidopsis, pudiera haber una redundancia genética similar para la desactivación mediada por hidroxilación de los brasinoesteroides. Existe cuando menos otro CYP72 en la Arabidopsis ( chibi2) que, cuando se sobre-expresa, confiere un fenotipo menos brasinoesteroide similar a los mutantes basl -D . Dada la redundancia genética en este proceso catabólico de la brasinólida, no es sorprendente que tanto basl -D como chibi2 se aislaron en las selecciones de mutantes de ganancia de función. Probablemente la hidroxilación C26 no sea la única trayectoria para desactivar los brasinoesteroides. Se han aislado las sulfotransferasas del esteroide a partir de la Brassica napus y la Arabidopsis y han mostrado que desactivan las brasinólidas a través de la sulfona- ción O (M. Rouleau y colaboradores, J Biol Chem, 274 :20925-30, 1999) . Aunque todavía no se ha determinado un papel in vivo para estas sulfotransferasas, es claro que existen múltiples mecanismos para el control de los brasinoesteroides a través de su catabolismo . Debido a que la mutación basl -D es provocada por una mutación de ganancia de función de gen, la mutación basl -D se puede transferir dentro de sistemas de plantas heterólogas. Se ha mostrado que el uso del basl -D o el ADN de basl fusionado con el promotor CaMV 35S, crea el brasinoesteroide menos mutantes en el tabaco, en donde no existen estos mutantes. Hasta la fecha, la única manera para estudiar las plantas de tabaco que carecen de brasinólida, es cultivarlas sobre el inhibidor de la biosíntesis del brasinoesteroide, brasinazol (T. Asami y s. Yoshida, S., Trends Plant Sci , 4:348-353, 1999) . Las plantas de tabaco que se cultivaron sobre niveles elevados de brasinazol, se ven similares a las líneas transgénicas débiles con expresión mejorada de basl . Existen múltiples ventajas para usar las plantas que sobre-expresan el basl para reemplazar el cultivo de plantas sobre brasinazol, para estudiar la función del brasinoesteroide en una variedad de tipos de plantas. Dependiendo del transgen que se use, el fenotipo que se cultiva en oscuridad de las líneas transgénicas se pueden controlar en las plantas que sobre-expresan basl . Las plantas transgénicas confieren una serie alélica de ganancia de función, similar a, y aún más severa que las plantas que se cultivaron sobre niveles aumentantes de brasinazol. Por medio de usar estas series alélicas en experimentos futuros, se puede evitar la necesidad de hacer una respuesta a la dosis de brasinazol bajo diferentes condiciones ambientales. Por ejemplo, estas series alélicas se pueden usar para dirigir la conveniencia de los individuos con diferentes niveles de estado ,, *.„A ..* Í? til A estable de las brasinólidas activas bajo selección natural, lo que permite que el papel de los brasinoesteroides se dirija en plantas menos receptivas al análisis genético que la Arabidopsi s . Además, las líneas de tabaco transgénicas que sobre-expresan basl pueden facilitar el análisis bioquímico adicional debido a que es más fácil obtener grandes cantidades de tejido de tabaco que los que es la Arabidopsis . Los estudios que se muestran en los Ejemplos en la presente, representan el primer ejemplo de análisis de supresión de la rotulación de activación en la Arabidopsis . Mediante la búsqueda de los alelos ATS que ponen como blanco a phyB-4 , se ha identificado un punto de control entre las múltiples trayectorias de señalización por luz y la biosíntesis/detección del brasinoesteroide. Además, se ha identificado un citocromo P450 (CYP450) que cataliza muy probablemente la hidroxilación C26 y la desactivación subsecuente de la brasinólida. El análisis genético coloca esta actividad corriente debajo de los múltiples foto- receptores. Por lo tanto, se cree que este CYP72B1 actúa como un punto de control principal en el catabolismo de los brasinoeste- roides, regulando las respuestas pata estas hormonas en diferentes tejidos de la plántula en desarrollo. También hemos expresado el gen CYP72B1 en tabaco, creando el primer ejemplo de mutantes de brasinoesteroide en esta especie. Dadas las resistencias genéticas de la Arabidopsi s como un sistema modelo, el análisis ATS deberá llegar a ser un planteamiento genético principal para entender adicionalmente los procesos de desarrollo en las plantas . La descripción anterior describe generalmente la presente invención. Se puede obtener un entendimiento mas completo por la referencia a los siguientes ejemplos específicos, los cuales se proporcionan en la presente para propósitos de ilustración solamente y no se pretende que limiten el alcance de la invención. EJEMPLO 1 Selección del mutante Se identificó el mutante basl -DphyB-4 como teniendo un hipocotíleo más corto que el phyB-4 en la siguiente selección. La mutación phyB-4 se aisló originalmente en el antecedente genético de La-er (M. Koornneef y colaboradores, supra ; J.W. Reed y colaboradores, 1993, supra) . Para mejorar la eficacia de la transformación, se introdujo esta mutación dentro del antecedente genético de Col-0 seis veces. Se usaron marcadores polimórficos entre La-er y Col -O para identificar las líneas que se introdujeron dentro del antecedente de Col -O (C. Konieczny y F.M. Ausubel, Plant J. , 4:403-410, 1993) . Los mutantes phyB-4 se transformaron con la construcción de rotulación de activación pSK1074 que contiene cuatro copias de elementos mejoradores a partir del promotor CaMV 35S. Esta construcción se modificó a partir del plásmido pPCVICEn4HPT en donde el gen de resistencia a la higromicina se intercambió con el gen de fosfotransferasa de ... -,-. ?.A, t ? X neomicina, el cual confiere resistencia a la canamicina antibiótica (Igor Kardailsky, Detlef Weigel per. comm.) Se prefiere la resistencia a la canamicina como un marcador genético para el transgen debido a que el fenotipo del hipocotíleo de phyB-4 se registró fácilmente en este medio de selección. Las plantas se transformaron con la técnica de inmersión floral (S.J. Clough y A.F. Bent, Sci ence, 282 : 1698-701, 1998) . La cepa de Agrobacterium que se usó, fue la GV3101. Se esterilizaron las semillas por medio de agitar primero en EtOH al 70 por ciento (v/v) con Tritón X-100 al 0.05 por ciento (v/v) durante 15 minutos, después en EtOH al 95 por ciento (v/v) durante 15 minutos. Las semillas esterilizadas se colocaron en papel filtro de Whatman estéril en un capuchón de flujo de aire laminar y se permitió que se secara antes de que se le rociara sobre medio de cultivo estándar (D. Valvekens y colaboradores, Proc Na t . Acad . Sci . USA, 85:5536-5540, 1988; Neff y Chory, supra) con 30 µg/litro de canamicina a una densidad de aproximadamente 2000 semillas por 150 milímetros X 20 cajas de petri. En todos los experimentos, las placas con canamicina (30 µg/litro) o gentamicina (60 µg/litro), usaron fitagar al 0.8 por ciento (GibcoBRL Life Technologies, Grand Island, New York, Estados Unidos) como un agente gelante y aquellos sin selección usaron fitagel al 1.0 por ciento (Sigma Chemical Co . , St . Louis, Missouri, Estados Unidos) . Después de un tratamiento de cuatro días en la oscuridad a 4°C, se cultivaron las plántulas por seis t¿-j '.-jii ' ? ** £fc?„ días a 20°C en 150 µEm 2S1 de luz blanca continua que se suministró mediante seis tubos fluorescentes HO-CW (GE Lighting, Cleveland, Ohio, Estados Unidos) y dos bulbos incandescentes de 25-W en una cámara de cultivo de plantas (modelo E30B Percival Scientific, Boone, Iowa, Estados Unidos) . Se analizaron los supresores putativos que tuvieron hipocotíleos más cortos que phyB-4 por la mutación phyB- 4 mediante amplificación por reacción de cadena de polimerasa, con los siguientes cebadores específicos para el gen: 5' - CTGTCGTGGAAAGTGTGAGG - 3' (SEQ ID NO: 4) y 5' - GAACCTTGACGCTTGAGG - 3' (SEQ ID NO: 5) Se resolvieron los productos de la reacción de cadena de polimerasa sobre un gel de agarosa MetaPhor al 2.5 por ciento (FMC BioProducts, Rockland, Maryland, Estados Unidos) después de la digestión con la endonucleasa de restricción Nía III. En (Neff y colaboradores, Plant J. , 14:387-392, 1998) se describen las minipreparaciones del ADN genómico de la planta y las condiciones de la reacción de cadena de polimerasa. EJEMPLO 2 Clonación y análisis molecular Debido a que la selección de bas se realizó sobre transformadores primarios (Tl), se usó un examen que selecciona específicamente los mutantes dominantes o semi-dominantes. Se permitió que el mutante basl -DphyB- 4 original se autopolinizara, y se volvieron a seleccionar semillas T2 sobre placas con y sin selección de canamicina. Esto mostró que el fenotipo de supresión procreó en verdad y que el mutante original fue en realidad un alelo dominante provocado por la inserción del transgen en un solo lugar. También se germinaron las semillas T2 en la oscuridad y tuvieron un fenotipo de desemblanquecimiento similar al del tipo silvestre, lo que indica que esta supresión no fue provocada por un defecto de alargamiento celular general. Se cultivaron 35 plantas T2 y se volvieron a seleccionar sobre placas con y sin canamicina. Todas las plantas que se registraron como no supresoras en la generación previa, procrearon plántulas largas y sensibles a la canamicina en la generación T2. Todas las líneas supresoras homocigotas fueron 100 por ciento resistentes a la canamicina. Las líneas homocigotas se segregaron nuevamente como alelos dominantes, siendo las plantas sensibles a la canamicina largas y no supresoras. Como un resultado, establecimos el enlace del transgen en menos de 3 centimorganos de la mutación de supresión. EJEMPLO 3 Análisis Southern, rescate de plásmidos, y secuenciamiento de ADNc Se preparó el ADN de la planta a partir de 1-2 gramos (peso fresco) de las líneas de basl -DphyB-4 homocigotas, usando el equipo de extracción de ADN de planta PhytoPure (Nucleón Biosciences, Remo Unido) . Se digirió el ADN de la planta con las endonucleasas de restricción EcoR I, Xho I, Hind III, Kpn I, Not I, y BamH 1. Se sometió el Adn a electroforesis sobre un gel de agarosa al 0.7 por ciento en IX TAE, se transfirió a Hybond N+ usando el método de transferencia alcalina recomendado (Amersham, LifeScience, Reino Unido), se híbrido con pBlueScript radio- etiquetado con 32P (Stratagene, La Jolla, California, Estados Unidos) , se lavó y se expuso durante un día sobre película de rayos X (Eastman Kodak Co . , Rochester, New York) . A partir de esto, se determinó que el mutante basl -DphyB-4 tuvo una inserción de ADN-T única, simple, la cual se pudo usar para el rescate de , plásmidos desde la orilla derecha. Después de varias extracciones con fenol, se ligaron 2 µg del ADN de basl -DphyB-4 total digerido con Hind III o Kpn I durante toda la noche en un volumen total de 250 µL. La solución de ligasa se precipitó con EtOH, se volvió a suspender en 12 µL de dH20 y se usaron 3 µL para la electropora- ción en células supercompetentes Epicurean Coliß SURE® 2 (Stratagene, La Jolla, California, Estados Unidos) . Se usaron estas células debido a su baja frecuencia de recombinación con ADN inestable tal como las cuatro, en tándem, copias de elementos mejoradores. Se secuenció el plásmido rescatado de 7.3 kb Hind III (PBAS1H) con un cebador 3' del sitio de Hind III en el ADN-T (5'- GCTCTCTCGAGGTCGACGG-3' ) (SEQ ID NO: 6). Una búsqueda BLAST (Altschul y colaboradores, supra) dio como resultado un golpe exacto sobre la secuencia genómica que codifica al CYP72B1 y el EST T04442. Se usaron el cebador de la reacción de cadena de polimerasa (5' GCTTGCTGGACTATTTGAGC 3') (SEQ ID NO : 7 ) y la -¿¿-,.,.4..,-..,*, secuencia del cebador T7 para amplificar la unión de inserción en el mutante basl -DphyB- 4 y los dos plásmidos rescatados, mostrando así que los tres compartían la misma arquitectura de inserción y que las cuatro copias de los elementos mejoradores estaban intactas. El plásmido rescatado Kpn I (pBASlK) fue de 13,67 kb y contuvo el CYP72B1 de codificación de gen completo más 6.33 kb de la secuencia genómica 3' del marco de lectura abierto de CYP72B1. Se secuenció el EST T04442 y se mostró que era un ADNc completo que codificaba el gen CYP72B1. Se encontró un error en la introducción en la base de datos para la secuencia a partir de BAC F18A8 en donde el nucleótido 784 de esta secuencia de ADNc fue una C en lugar de la T reportada. De esta manera, se anotó el aminoácido 262 como un triptofano en lugar de la arginina correcta. La secuencia de ADN corregida codificó el sitio de reconocimiento para la endonucleasa de restricción BsmA I. Confirmamos la presencia de este sitio de restricción mediante la amplificación, digestión y resolución por reacción de cadena de polimerasa, usando el ADNc, el BAC F18A8, o el ADN genómico a partir de Col -O, phyB-4 y basl -DphyB-4 como plántulas (no se muestran los datos) . EJEMPLO 4 Análisis Northern Se cultivaron rápidamente plántulas de 8 días de edad a partir de las placas que se prepararon como se describe en el Ejemplo 2 y se congelaron en nitrógeno líquido, después se l.y..-,-,:.! aÍ..¿¿-Í-i-l.^iy,.J,.-y.-fcyy. almacenaron a -80 °C hasta que se usaron. Se sembraron 200 miligramos de plántulas congeladas en nitrógeno líquido, junto con 0.5 mililitros de regulador del pH de extracción del ARN (100 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.5 , 1 mM EDTA, SDS al 1 por ciento), y 150 µL fenol. Se extrajo la mezcla en polvo con 300 µL cloroformo y se precipitó durante toda la noche con un volumen igual de 4M LiCl. Se volvió a suspender la pelotilla en 300 µL de agua tratada con fosforocianidato de dietilo (DEPC) . Después de la adición de 33 µL de 3M NaOAc (pH 5.2) y 830 µL de EtOH, se usó un tratamiento de 1 hora a -20°C y centrifugación para hacer pelotilla el ARN total. Para el análisis Northern, se cargaron 10 µL de ARN sobre gel de agarosa que contenía formaldehído al 1.3 por ciento y se pasó por electroforesis en IX ácido 3-(N-morfolineo) -propansulfónico (MOPS) regulador del pH (20 mM MOPS, 5 mM NaOAc, 1 mM ácido etilendiamintetraacético (EDTA) ) , seguido por la transferencia a una membrana de nailon Hybond-NX durante 18 horas, como se recomendó (Amersham, Reino Unido) . Después de la transferencia, se fijó el ARN a la membrana mediante horneado a 80 °C durante 1 hora. Se usó un producto de la reacción de cadena de polimerasa del CYP72B1 como una sonda, y se trató igual que en el análisis Southern. EJEMPLO 5 Análisis RT-PCR Se cultivó tejido a partir de las líneas de tipo silvestre y anti-sentido durante nueve días en 150 µE 'V de luz WiirtirfTffttf-^--*-• blanca continua, antes de cosecharse en N2 líquido y se almacenó a -80°C. Para el análisis de RT-PCR del hipocotíleo vs . Rosetón, se cultivaron las plántulas durante 5 días en la oscuridad (para inducir el crecimiento del hipocotíleo) , después 9 días más en 150 de luz blanca continua. Se recolectó el tejido de los hipocotíleos y los rosetones y se congelaron de inmediato en N2 líquido antes de almacenarlo a 80°C. Se aisló el ARN total usando el Reactivo TRIzol® como lo recomienda el fabricante (GibcoBRL Life Technologies, Grand Island, New York) . Se sintetizaron los ADNc's a partir de 1 µg de ARN total usando 500 ng de un oligo-dt de 27-mer y la transcriptasa de reversa SuperScript (GibcoBRL Life Technologies, Grand Island, New York, Estados Unidos) . Se usó un décimo de la reacción del ADNc para cada reacción de cadena de polimerasa (vea (Neff y colaboradores, supra , la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad) para las condiciones) . Se usaron los cebadores que abarcaban el tercer intrón de BAS1 para detectar este transcrito (5'-GGTTCAGGACATTGTGGAGG-3' (SEQ ID NO : 8 ) y el transcrito 5'-GGATACAACCTTAAAGACTCG-3' (SEQ ID NO: 9). Se usaron los cebadores que abarcaban el último intrón de CPD para detectar el transcrito (5 ' -GCAACTCGGTAACGACAGGC-3 ' (SEQ ID NO: 10) y 5'-TCAAGTAGCAAAATCACGGCG-3' (SEQ ID NO.ll)). Los cebadores que abarcaban el último intrón de DWF4 para detectar el transcrito (5' -CTCTTTAATCCTTGGAGATGGC-3' (SEQ ID NO: 12) y el transcrito 5'-GGTTGATCATCTTCTGCTAATTCCC-3' (SEQ ID NO:13). Se usaron los cebadores que amplificaban el gen UBQ10 como un control para la concentración de la plántula total ( 5 ' -GATCTTTGCCGGAAAA CAATTGGAGGATGGT-3' (SEQ ID NO: 14) y 5 ' -CGACTTGTCATTAGAAAGAAA GAGATAACAGG-3' 8SEQ ID N0:15)). Los productos a partir de la reacción de cadena de polimerasa que se ejecutan con diferentes números de ciclos, se sometieron a electroforesis y se sondearon seguidos por la cuantificación usando un formador de imágenes de fósforo (Molecular Dynamics) . El análisis del formador de imágenes de fósforo sobre números variables de ciclos de reacción de cadena de polimerasa, mostró que los resultados del RT-PCR que se presentaron estaban dentro del rango lineal de exactitud. Como se muestra mediante la cuantificación de los productos del RT-PCR, hubo una acumulación tres veces más elevada del transcrito en el rosetón que en el hipocotíleo tanto en phyB- 4 como en basl -Dphyb-4 . Además, los niveles y patrones de expresión en el tipo silvestre fueron casi idénticos a aquellos en phyB-4 . La cuantificación también mostró que la acumulación total del transcrito basl en los mutantes basl -DphyB-4 fue aproximadamente 50 veces más elevada que el mutante phyB-4 o en la planta de tipo silvestre. Este análisis es de la acumulación del transcrito basl . EJEMPLO 6 Construcciones de recapitulación y anti-sentido Se usaron dos tipos de construcciones para la recapitu- lación del fenotipo mutante basl -D. La primera contenía el clon genómico BASl -D del gen mutante basl -D a partir del plásmido rescatado pBASlK. Después de la restricción de pBASlK con las endonucleasas Bam? I y Sac I, se clonó un fragmento de 5.7 kb que contenía el marco de lectura abierto de CYP72B1 completo en el contexto de los cuatro elementos mejoradores, dentro del vector binario pPZP212 (Hajdukiewikz y colaboradores, Plant Cell , 9:1951-1962, 1997 1994). La segunda, que contenía el ADNc bajo la expresión del promotor CaMV 35S, se hizo mediante la clonación ya sea del fragmento BamH l /Sal I o un fragmento Ba.mH I /Kpn I a partir del clon de ADNc T04442 dentro del vector binario pCHF3 , el cual contiene el promotor completo CaMV 35S, el terminador RBCS de chícharo, y confiere resistencia a la canamicina para la selección en las plantas. Se fabricó una construcción que expresa de manera constitutiva el ARN de anti-sentido del BAS1 , por medio de clonar un fragmento Bam? l /Sac I dentro del vector binario pCHFl, el cual contiene el promotor completo CaMV 35S, el terminado RBCS de chícharo, y confiere resistencia a la gentamicina para la selección en las plantas. El tratamiento de respuesta a la dosis mostró una hipersensibilidad a la brasinólida para los hipocotíleos de líneas anti-sentido cuando se cultivaron en la luz, aunque no cuando se cultivaron en la oscuridad. En contraste, un mutante de la biosíntesis del brasinoesteroide det2 -l produjo peciolos que fueron más cortos que el tipo silvestre en la luz, mientras que los peciolos de los mutantes phyB-4 fueron más largos que el tipo silvestre en la luz. En ambos casos, estos fenotipos se rescataron mediante la exposición a cantidades aumentantes de brasinoesteroides. En contraste, los peciolos del mutante basl -DphyB-4 fueron siempre más cortos que el tipo silvestre en todos los niveles de brasinoesteroides que se probaron, lo que indica que, a diferencia del det2 -l , el fenotipo del rosetón del basl -DphyB-4 es insensible a los brasinoesteroides. EJEMPLO 7 Plántulas de recapitulación cultivadas en la oscuridad Para examinar el fenotipo que se cultivó en la oscuridad de las líneas de recapitulación de basl -D, se cultivaron las plántulas T2 durante 6 días en la oscuridad sobre medio de cultivo estándar sin selección antibiótica. Estas plántulas se transfirieron bajo condiciones estériles al medio de cultivo con selección de canamicina, se tendieron sobre el agar y se pasaron por imagen con un escáner de lecho plano (Veff y Chory, supra) . Después del escaneo, se cultivaron las plántulas durante una semana en luz blanca continua par registrar la resistencia a la canamicina. La longitud del hipocotíleo que se cultivó en la oscuridad se determinó a partir de la imagen digital de las plántulas de las que se determinó que eran resistentes a la canamicina. En cada caso, las plántulas de las que se determinó que albergaban el transgen, desarrollaron un genotipo del rosetón similar al de basl -DphyB-4 . Las plántulas de tabaco se trataron de una manera similar. - -i kaSai -* <í Á.?.Á*J M tsá?Ím..jyj-MMttfc»..

Estos estudios mostraron que las plántulas de basl -DphyB-4 que se cultivaron en la oscuridad están descoloridas pero tienen hipocotíleos que son ligeramente más cortos que el tipo silvestre. Además, las líneas anti-sentido de basl que se cultivaron en la oscuridad tienen hipocotíleos ligeramente más largos que el tipo silvestre. Estos resultados argumentan que es la actividad del CYP72B1 la que finalmente controla la respuesta del hipocotíleo a los brasinoesteroides. EJEMPLO 8 Análisis genético con mutantes nulos del foto-receptor Para el análisis de las interacciones entre el basl -D y los diferentes foto-receptores, se cruzaron plantas basl -DphyB-4 con los mutantes del foto-receptor, phyB-5, phya -201 e hy4 -2. 23N (cryl ) . Las semillas F2 se cultivaron sobre medio de cultivo estándar con 30 µg/Litro de canamicina. Para el mutante basl -DphyB-4phyA-201 , las plantas F2 que tuvieron hipocotíleos largos después de seis días en luz muy roja y que confirieron resistencia a la canamicina después del cultivo subsecuente en luz blanca, se genotiparon para las mutaciones phyB-4 y phya -201 (Neff y colaboradores, supra) . Para el mutante basl -DphyB-4cryl , las plantas F2 que tuvieron hipocotíleos más largos después de seis días en luz azul y que confirieron resistencia a la canamicina después del cultivo subsecuente en luz blanca, se genotiparon para la mutaciones phyB-4 y cryl (Neff y Chory, supra) . Debido a que el basl -DphyB-4 se aisló en un antecedente de ecotipo Col-0 y los mutantes phyA y cryl se aislaron en el ecotipo La-er, se examinaron las poblaciones de F3 que fueron homocigotas para phyB-4 y phyA o el cryl todavía segregó la mutación basl -D. Esto permitió probar el efecto que estos foto- receptores tuvieron en la presencia o ausencia de la mutación basl -D, mientras que controlaban las variaciones que provocaron los diferentes ecotipos. Para probar el efecto de la mutación basl -D en un antecedente mutante nulo de phyB, se cultivaron semillas F3 a partir de una línea que era heterocigota para basl- D y segregó phyB- 5 /phyB- 4 . Se examinaron más de 200 plántulas F3 , pero no se encontró que ninguna de las plantas tuviera tanto hipocotíleos largos como resistencia a la canamicina conferida en luz blanca, lo que muestra que el basl -D sí suprimió una mutación nula phyB . EJEMPLO 9 Respuesta a la dosis de brasinólida y condiciones de luz (CIDtech Research Inc., Mississauga, Ontario, Canadá) Se hizo un abasto de 2 mM de brasinólida por medio de disolver en EtOH al 95 por ciento (v/v) y se almacenó a -20°C. El 1 mM de solución se fabricó mediante una disolución de 1:2000 veces del abasto de 2 mM en medio de cultivo estándar. Todas las otras concentraciones que incluían el control negativo, contenían la misma cantidad de EtOH. Las condiciones de luz para las respuestas de fluencia en luz roja y azul y las mediciones de las plántulas se realizaron como se describe en Neff y Chory, supra .

Una cámara de cultivo E30LED (Percival Scientific, Boone, IA) suministró la luz muy roja. Se midieron las fluencias muy rojas con un espectrorradiómetro portátil (modelo LI-1800, Li-Cor, Inc., Lincoln, NE) . EJEMPLO 10 Análisis Bioquímico Para las mediciones del brasinoesteroide, se cultivaron las plantas en tierra (Neff y Chory, supra) en condiciones de días cortos (8 horas de luz, 18 horas de oscuridad) durante cinco semanas antes de que los rosetones se cosecharan en nitrógeno liquido. No se observaron golpes florales visibles en este momento. El tejido se almacenó a 80°C antes de la liofilización. Se recolectaron 200 gramos peso fresco de phyB-4 y 100 gramos peso fresco de basl -DphyB-4 . Se analizaron los brasinoesteroides de conformidad con los métodos que describen (S. Fujioka y colaboradores, Plant Cell , 9:1951-1962, 1997). Antes de los experimentos de alimentación, se transfirieron las plántulas de siete días de edad a un matraz de 20 mililitros que contenía 30 mililitros de medio de cultivo sin agar y complementado con sacarosa al 1 por ciento (phyB-4 , 50 plántulas; basl -DphyB-4 , 100 plántulas) . Cinco días después de la transferencia, se agregó una solución de EtOH (50 mililitros) de brasinólida rotulada con 2H6 (50 miligramos) o brasinólida no rotulada (50 miligramos) , a un matraz de 200 mililitros que contenía plántulas de Arabidopsis . Se incubaron las plántulas durante un día a 22 °C en la luz sobre t-jt-A-t-A Jtjtrf rf — • *--*-•- --* un agitador (125 rpm) . Después de la incubación, se extrajeron las plántulas con MeOH. Se purificó el extracto de MeOH con un cartucho de gel de sílice (Sep-Pak Vac 2 gramos; Waters, Milford, MA) , el cual se levigó con 20 mililitros de cloroformo, MeOH al 3 por ciento, y MeOH al 20 por ciento en cloroformo. La última fracción se purificó con HPLC sobre una columna de 150- x 4.6 milímetros Senshu Pak 0DS-1151-D (Senshu Scientific Co . , Ltd. , Tokio, Japón) , mediante el uso de acetonitrilo al 45 por ciento a una velocidad de flujo de 1.0 mililitro/minuto. Se recolectaron las fracciones cada minuto (tiempo de retención de 1 a 10 minutos) . Cada fracción se sometió al análisis GC-MS después de la derivación. Se detectó 26-0HBL a partir de tiempo de retención de 2-3 minutos. Los análogos de brasinólida hidroxilada auténtica que se usaron en este estudio se sintetizaron químicamente, de conformidad con el método de Hideharu Seto y colaboradores. El análisis GC-MS se realizó sobre un espectrómetro de masa JMS-AM 150 que se conectó a una cromatógrafo de gas Hewlett-Packard 5890a -II. El análisis se condujo bajo las siguientes condiciones: columna GC, DB-5 (0.25 milímetros x 15 metros, espesor de la película de 0.25 milímetros, J&W) ; temperatura de inyección, 280°C; gas portador, helio a una velocidad de flujo de 1 mililitro/ minuto; ionización, El (70 eV) ; temperatura de la columna, 80°C durante 1 minuto, elevada a 320°C a 30°C/minuto, después mantenida en 320°C. Se trató la fracción de brasinólida hidroxilada con piridina que contenía ácido metanoborónico (20 miligramos por 10 mililitros) a 80°C durante 30 minutos y después con 10 mililitros de N-metil-N-trimetilsililtri-fluoroacetamida (MSTFA) a 80 °C durante 30 minutos. En la Tabla 1 más adelante se muestran los resultados de estos estudios : Tabla 1 Niveles de Brasinoesteroide basl-D (ng/g peso fresco) PhyB -4 phyB - 4 6-desoxoTe 0.19 0.26 6-desoxoCS 0.79 0.04 CS 0.13 0.02 BL 0.32 ND ii . iii. TE = teasterona; CS = castasterona; BL = brasinólida; ND = no detectada Como se muestra por los datos en la Tabla 1, la castasterona y la 6-deoxocastasterona se detectaron en el basl-DphyB-4, pero en niveles grandemente reducidos en comparación con aquellos en phyB-4. Además, no e detectó brasinólida en basl-DphyB-4. De este modo, los niveles endógenos de BRs en basl-DphyB-4 se diminuyeron grandemente, lo que indica que esta mutación afecta los niveles de BR y pudiera estar relacionada con la hidroxilación de la brasinólida. De hecho, se encontró una acumulación incrementada de la 6-deoxoteasterona en el mutante basl-DphyB-4. EJEMPLO 11 Í ?cí? Ml*.ká&Ím*l.J_ÁCiAÍ*M*¡M.:t,. m ií , Transformación del tabaco Se usó la Ni cotiana tabaccum cv. Xhanti para la transformación. Se cultivaron las mismas cepas de Agrobacterium que se usaron para la transformación de la Arabidopsis durante toda la noche, hasta que habían alcanzado un crecimiento de tronco medio. Se diluyeron los cultivos 1:10 en agua estéril y se cultivaron juntas durante 20 minutos con discos de hojas a partir de plantas de tabaco jóvenes cultivadas estériles. Estos discos se incubaron en 2X medio de cultivo, bactoagar al 0.8 por ciento (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, Estados Unidos) en uz blanca continua. Después de 48 horas, se colocaron los discos de hoja al revés sobre placas frescas del mismo medio de cultivo complementado con 0.4 miligramos/litro de ácido indoleacético (IAA) , 2 miligramos/litro de bencil -aminopurina (hOBAP) , 200 miligramos/litro de canamicina y 500 miligramos/litro de carbenicilina. Este medio se reemplazó cada 2 semanas. Cuando se formaron los vastagos, se removieron del disco de hoja y se colocaron en medio fresco complementado con solamente 200 miligramos/litro de canamicina. Una vez que se formaron las raíces, las plantas se transplantaron en condiciones de invernadero estándares y se cultivaron hasta que florecieron. Se esterilizaron las semillas T2 durante 30 minutos en blanqueador al 10 por ciento (v/v) con Tritón X-100 al 0.05 por ciento, después se lavaron 3 veces con agua estéril y se platearon en 2X medio de cultivo, bactoagar al 0.8 por ciento, con o sin 200 i?' ?? ?díAm Aíá A? i .l t i miligramos/litro de canamicina. Aunque la invención se ha descrito en detalle con referencia a ciertas modalidades preferidas de la misma, se entenderá que las modificaciones y variaciones están dentro del espíritu y alcance de aquello que se describe y reivindica. -160- LISTA DE SECUENCIAS <110> The Salk Institute for Biological Studies <120> PLANTAS MODIFICADAS GENÉTICAMENTE QUE TIENEN SEÑALIZACIÓN MODULADA DE BRASINOESTEROIDES <130> SALKINS.024VPC <140> PCT/US0006915 <141> 2000-03-16 <150> US 60/124,570 <151> 1999-03-16 <150> US 60/170,931 <151> 1999-12-14 <150> US 60/172,832 <151> 1999-12-20 <160> 16 <170> SEQ rápida para Windows Versión 4.0 <210> 1 <211> 1563 <212> DNA <213> Arabidopsis thalia ^'?ff-f- f-H"'--1 *"» J-- - -ASHm.l~m- .AL. tt sm Jiih ái -161- <220> <221> CDS <222> (1) 1563! <400> 1 atg gag gaa gaa agt age age tgg ttc att cea aag gtt ctt gtt ctg 48 Met Glu Glu Glu Ser Ser Ser Trp Phe lie Pro Lys Val Leu Val Leu 1 5 10 15 tet gta ate tta agt ctt gta ata gtg aag ggt atg tet ctg tta tgg 96 Ser Val lie Leu Ser Leu Val lie Val Lys Gly Met Ser Leu Leu Trp 20 25 30 tgg aga cea aga aag att gaa gaa cat ttc tet aaa caa gga att cga 144 Trp Arg Pro Arg Lys lie Glu Glu His Phe Ser Lys Gln Gly lie Arg 35 40 45 ggt cct cct tat cat ttc ttc ate gga aat gtt aaa gaa ctt gtt gga 192 Gly Pro Pro Tyr His Phe Phe lie Gly Asn Val Lys Glu Leu Val Gly 50 55 60 atg atg ctt aaa gct tet tet cat cct atg cct ttc tet cae aat att 240 Met Met Leu Lys Ala Ser Ser His Pro Met Pro Phe Ser His Asn lie 65 70 75 80 ctt cct aga gtt ctc tet ttt tac cat cae tgg aga aaa ate tac ggt 288 Leu Pro Arg Val Leu Ser Phe Tyr His His Trp Arg Lys lie Tyr Gly 85 90 95 tÉiÉÜIÉJÉii 1 iliaüim n ÜHÍH I I ni) lll mil ?? nl? IIHIIÉÉIIIÉI -162-gct aca ttt ctg gtt tgg ttc ggt cea act ttc cgg tta acg gta gcc 336 Ala Thr Phe Leu Val Trp Phe Gly Pro Thr Phe Arg Leu Thr Val Ala 100 105 110 gat cct gat ttg ate aga gag ate ttc tet aag tet gag ttc tac gag 384 Asp Pro Asp Leu lie Arg Glu lie Phe Ser Lys Ser Glu Phe Tyr Glu 115 120 125 aag aat gaa gct cae cct ttg gtt aaa caa ctt gaa ggc gat gga cta 432 Lys Asn Glu Ala His Pro Leu Val Lys Gln Leu Glu Gly Asp Gly Leu 130 135 140 ctt agt ctc aaa ggt gaa aaa tgg gct cat cat cga aaa ate att age 480 Leu Ser Leu Lys Gly Glu Lys Trp Ala His His Arg Lys lie lie Ser 145 150 155 160 cct act ttt cat atg gag aat ctt aag ttg ctt gta cea gtt gtg ttg 528 Pro Thr Phe His Met Glu Asn Leu Lys Leu Leu Val Pro Val Val Leu 165 170 175 aag agt gtg act gat atg gtg gat aaa tgg tec gat aag tta tca gaa 576 Lys Ser Val Thr Asp Met Val Asp Lys Trp Ser Asp Lys Leu Ser Glu 180 185 190 aac ggt gaa gtt gag gta gat gtc tat gag tgg ttt cag att ttg act 624 Asn Gly Glu Val Glu Val Asp Val Tyr Glu Trp Phe Gln lie Leu Thr 195 200 205 gaa gat gtt att agt aga aca gct ttt gga agt age tat gaa gat ggt 672 -163- Glu Asp Val lie Ser Arg Thr Ala Phe Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Gly 210 215 220 cga gca gtt ttt cga ctt caa gct caa caa atg ctt ctt tgt gct gaa 720 Arg Ala Val Phe Arg Leu Gln Ala Gln Gln Met Leu Leu Cys Ala Glu 225 230 235 240 gct ttt caa aaa gtc ttc att cct ggc tat aga ttt ttt ccg aca aga 768 Ala Phe Gln Lys Val Phe lie Pro Gly Tyr Arg Phe Phe Pro Thr Arg 245 250 255 ggg aat ttg aag tet cgg aag tta gac aag gag ata agg aag tcg ttg ¡16 Gly Asn Leu Lys Ser Arg Lys Leu Asp Lys Glu lie Arg Lys Ser Leu 260 265 270 ttg aag ctg ata gag cgg cgg aga caa aac gct ata gat gga gaa ggg :64 Leu Lys Leu lie Glu Arg Arg Arg Gln Asn Ala lie Asp Gly Glu Gly 275 280 285 gaa gaa tgt aag gag ccg gcg gcg aag gat ttg ttg gga tta atg att 912 Glu Glu Cys Lys Glu Pro Ala Ala Lys Asp Leu Leu Gly Leu Met lie 290 295 300 cag gca aag aat gtg acg gtt cag gac att gtg gag gag tgt aaa age 960 Gln Ala Lys Asn Val Thr Val Gln Asp lie Val Glu Glu Cys Lys Ser 305 310 315 320 ttt ttc ttc gcc ggg aaa cag aca act tet aat ctg ctg acg tgg acg 100? Phe Phe Phe Ala Gly Lys Gln Thr Thr Ser Asn Leu Leu Thr Trp Thr «?Üt r ? MM mZ? & líiMn . m uim,, , FÍ . , M , ,r. li*,'r , -lifli-.-,.» i. i.-r nl^-r-WT^ f¿a-8-Í, -164- 325 330 335 acc ate ttg cta tec atg cae ccg gag tgg cag gcc aaa gca cgt gat 1056 Thr lie Leu Leu Ser Met His Pro Glu Trp Gln Ala Lys Ala Arg Asp 340 345 350 gag gtc ctc agg gtc tgc ggc tca cgt gat gtc cct acc aag gac cat 1104 Glu Val Leu Arg Val Cys Gly Ser Arg Asp Val Pro Thr Lys Asp His 355 360 365 gtc gtt aag ctt aaa acg ttg agt atg ate ttg aac gag tet tta agg 1152 Val Val Lys Leu Lys Thr Leu Ser Met lie Leu Asn Glu Ser Leu Arg 370 375 380 ttg tat cea cea ata gta gct acg att cga cgc gct aaa tcg gat gtg 1200 Leu Tyr Pro Pro lie Val Ala Thr lie Arg Arg Ala Lys Ser Asp Val 385 390 395 400 aag cta gga ggg tac aaa ate cea tgt ggc acg gag ctt cta ate cea 1248 Lys Leu Gly Gly Tyr Lys lie Pro Cys Gly Thr Glu Leu Leu lie Pro 405 410 415 ate ata gcg gtc cat cat gac caa gcc att tgg ggt aat gac gtg aac 1296 lie lie Ala Val His His Asp Gln Ala lie Trp Gly Asn Asp Val Asn 420 425 430 gaa ttc aat cea gct cgg ttt gcg gat gga gtg ccg cgt gct gcc aaa 1344 Glu Phe Asn Pro Ala Arg Phe Ala Asp Gly Val Pro Arg Ala Ala Lys 435 440 445 y^ÜÉ IÉi -165- cac ccc gtt ggc ttc ata ccg ttt ggc ctc gga gtt cgt aca tgc att 1392 His Pro Val Gly Phe lie Pro Phe Gly Leu Gly Val Arg Thr Cys lie 450 455 460 ggt cag aat ctt gct ata ctt cag gcc aaa ttg aca ctc gct gta atg 1440 Gly Gln Asn Leu Ala lie Leu Gln Ala Lys Leu Thr Leu Ala Val Met 465 470 475 480 ate caa cgc ttc acc ttt cae ttg gct cct act tat cag cat gca cct 1488 lie Gln Arg Phe Thr Phe His Leu Ala Pro Thr Tyr Gln His Ala Pro 485 490 495 acc gtc ctt atg ttg ctt tat cct caa cat ggt gca cea ate acc ttc 1536 Thr Val Leu Met Leu Leu Tyr Pro Gln His Gly Ala Pro lie Thr Phe 500 505 510 cgg aga ttg acc aat cat gag gat tga 1563 Arg Arg Leu Thr Asn His Glu Asp * 515 520 <210> 2 <211> 519 <212> PRT <213> Arabidopsis thalia <400> 2 Glu Glu Glu Ser Ser Ser Trp Phe lie Pro Lys Val Leu Val Leu Ser ?* A-t .-t^.a-«->. **~*?.? -166- 1 5 10 15 Val lie Leu Ser Leu Val lie Val Lys Gly Met Ser Leu Leu Trp Trp 20 25 30 Arg Pro Arg Lys lie Glu Glu His Phe Ser Lys Gln Gly lie Arg Gly 35 40 45 Pro Pro Tyr His Phe Phe lie Gly Asn Val Lys Glu Leu Val Gly Met 50 55 60 Met Leu Lys Ala Ser Ser His Pro Met Pro Phe Ser His Asn lie Leu 65 70 75 80 Pro Arg Val Leu Ser Phe Tyr His His Trp Arg Lys lie Tyr Gly Ala 85 90 95 Thr Phe Leu Val Trp Phe Gly Pro Thr Phe Arg Leu Thr Val Ala Asp 100 105 110 Pro Asp Leu lie Arg Glu lie Phe Ser Lys Ser Glu Phe Tyr Glu Lys 115 120 125 Asn Glu Ala His Pro Leu Val Lys Gln Leu Glu Gly Asp Gly Leu Leu 130 135 140 Ser Leu Lys Gly Glu Lys Trp Ala His His Arg Lys lie lie Ser Pro 145 150 155 160 Thr Phe His Met Glu Asn Leu Lys Leu Leu Val Pro Val Val Leu Lys 165 170 175 Ser Val Thr Asp Met Val Asp Lys Trp Ser Asp Lys Leu Ser Glu Asn 180 185 190 Gly Glu Val Glu Val Asp Val Tyr Glu Trp Phe Gln lie Leu Thr Glu 195 200 205 Asp Val lie Ser Arg Thr Ala Phe Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Gly Arg 210 215 220 Ala Val Phe Arg Leu Gln Ala Gln Gln Met Leu Leu Cys Ala Glu Ala 225 230 235 240 Í?Jlc kJi?A? i-Ét MAill*í)i, *-^1^B^^-i'ftAÍ¡SMli^i.? -167- Phe Gln Lys Val Phe lie Pro Gly Tyr Arg Phe Phe Pro Thr Arg Gly 245 250 255 Asn Leu Lys Ser Arg Lys Leu Asp Lys Glu lie Arg Lys Ser Leu Leu 260 265 270 Lys Leu lie Glu Arg Arg Arg Gln Asn Ala lie Asp Gly Glu Gly Glu 275 280 285 Glu Cys Lys Glu Pro Ala Ala Lys Asp Leu Leu Gly Leu Met lie Gln 290 295 300 Ala Lys Asn Val Thr Val Gln Asp He Val Glu Glu Cys Lys Ser Phe 305 310 315 320 Phe Phe Ala Gly Lys Gln Thr Thr Ser Asn Leu Leu Thr Trp Thr Thr 325 330 335 He Leu Leu Ser Met His Pro Glu Trp Gln Ala Lys Ala Arg Asp Glu 340 345 350 Val Leu Arg Val Cys Gly Ser Arg Asp Val Pro Thr Lys Asp His Val 355 360 365 Val Lys Leu Lys Thr Leu Ser Met He Leu Asn Glu Ser Leu Arg Leu 370 375 380 Tyr Pro Pro He Val Ala Thr He Arg Arg Ala Lys Ser Asp Val Lys 385 390 395 400 Leu Gly Gly Tyr Lys He Pro Cys Gly Thr Glu Leu Leu He Pro He 405 410 415 He Ala Val His His Asp Gln Ala He Trp Gly Asn Asp Val Asn Glu 420 425 430 Phe Asn Pro Ala Arg Phe Ala Asp Gly Val Pro Arg Ala Ala Lys His 435 440 445 Pro Val Gly Phe He Pro Phe Gly Leu Gly Val Arg Thr Cys He Gly 450 455 460 Gln Asn Leu Ala He Leu Gln Ala Lys Leu Thr Leu Ala Val Met He »»^t..JJ^» i. MM ^J ,t^Hy-J. -168- 465 470 475 480 Gln Arg Phe Thr Phe His Leu Ala Pro Thr Tyr Gln His Ala Pro Thr 485 490 495 Val Leu Met Leu Leu Tyr Pro Gln His Gly Ala Pro He Thr Phe Arg 500 505 510 Arg Leu Thr Asn His Glu Asp 515 <210> 3 <220> <223> Primer <400> 3 000 <210> 4 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Primer <400> 4 ctgtcgtgga aagtgtgagg 20 <210> 5 -169- <211> 18 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 5 gaaccttgac gcttgagg <210> 6 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 6 gctctctcga ggtcgacgg 19 <210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer l»^^.-^»! *^. ?. m?*. j^^J^ -170- <400> 7 gcttgctgga ctatttgagc 20 <210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 8 ggttcaggac attgtggagg 20 <210> 9 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 9 ggatacaacc ttaaagactc g 21 <210> 10 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial -171- <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 10 gcaactcggt aacgacaggc 20 <210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 11 tcaagtagca aaatcacggc g 21 <210> 12 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 12 ctctttaatc cttggagatg ge 22 <210> 13 iir fruir"- na, AcánAa ,*»?8ii-,l,to?éi>.laftÍJj«<j'<BMiMi.<^^ -172- <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 13 ggttgatcat cttctgctaa ttccc 25 <210> 14 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 14 gatctttgcc ggaaaacaat tggaggatgg t 31 <210> 15 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer liiiil 1 1 i lé \ ) riiifii? IÍÍ IIIW— Mni rirttir"— M,*-^**aj -173- <400> 15 cgacttgtca ttagaaagaa agagataaca gg 32 <210> 16 <211> 588 <212> ADN <213> Arabidopsis thalia <220> <221> misc_feature <222> (1) ... (588) <223> n = A,T,C or G <400> 16 ttagatcccc aacatggtgg ntaatcctac atecacataa tgtaacatgg ttgatntggc 60 cgttgtgata tacatggcgg cccctacgcc gttggccttc ctctctctct ctttctctat 120 atctctttct tgatctctct ctataaaagc tcaaatagcc cagcaagcaa aataatecaa 180 aaagaaacca agataagaag aaacaaactc gcaaagaaac aaaaaggaaa aaaaaaaaaa 240 aaaegaatta aaaaaagaag aaataaatcc tcctttttaa cacctcattc cctctttctc 300 cggcactcaa aagagaccaa agaagaaaac tttagetetc ctttttgtgt tttctctctt 360 ttctttgttg gtgttccgac aatggaggaa gaaagtagca gctggttcat tccaaaggtt 420 cttgttctgt ctgtaatctt aagtccttgt aatagtgaag ggtatgtctc tgttatggtg 480 gagaccaaga aagattgaag aacatttctc taaacaagga attcgaggtc ctccttatca 540 tttetteate ggaaatgtta aagaacttgt tgaatgatgc ttaaagct 588 -y-., . ..„« ~'- .—^-t-^- J.^-A--*,..

Claims

-145- REIVINDICACIONES 1. Un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido BAS1 o fragmento funcional del mismo.
2. Una célula hospedera que contiene el vector de la reivindicación 1.
3. Un anti-cuerpo que se liga a un polipéptido BAS1, o se liga a fragmentos antigénicos de dicho polipéptido.
4. Una planta modificada genéticamente, que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica un polipéptido BAS1, un homólogo o un fragmento funcional del mismo, en su genoma, o al menos una secuencia reguladora que modifica la expresión del gen endógeno basl , un homólogo o un fragmento funcional del mismo, y que está caracterizada por tener actividad o síntesis modulada de brasinólida.
5. La planta de la reivindicación 4, donde la planta contiene múltiples secuencias de ácido nucleico exógenas que codifican un polipéptido BASl.
6. La planta de la reivindicación 4, donde la modulación es hipersensibilidad a una luz roja lejana en un fondo PHYA y falta de respuesta en un fondo phyA nulo.
7. La planta de la reivindicación 4, donde la modulación es enanismo con hojas color verde oscuro en plantas adultas .
8. La planta de la reivindicación 4, donde la &*«* -146- odulación es etiolación con hipocotíleos de longitud casi tipo silvestre en semillas cultivadas en la oscuridad.
9. La planta de la reivindicación 4, donde la secuencia de ácido nucleico de basl está asociada operativamente con una secuencia de ácido nucleico regulatoria.
10. La planta de la reivindicación 9, donde la secuencia de ácido nucleico regulatoria comprende un promotor.
11. La planta de la reivindicación 10, donde el promotor es un promotor constitutivo.
12. La planta de la reivindicación 10, donde el promotor es un promotor inducible.
13. La planta de la reivindicación 4, donde el ácido nucleico comprende además un marcador seleccionable.
14. La planta de la reivindicación 4, donde la secuencia regulatoria que modifica la expresión del gen basl endógeno, un homólogo o fragmento funcional del mismo, comprende un ADN de transferencia que contiene cuatro o mas copias de regiones mejoradoras del promotor CAMV 35S.
15. La planta de la reivindicación 4, donde la planta es una planta dicotiledónea.
16. La planta de la reivindicación 4, donde la planta es una planta monocotiledónea.
17. Te ido de planta derivado de la planta de la reivindicación 4.
18. Una semilla que germina en una planta, que -147-comprende al menos una secuencia de ácido nucleico basl exógena, un homólogo o fragmento funcional de la misma, en su genoma, y está caracterizada por tener una actividad de brasinólida modulada .
19. Una semilla que germina en una planta que sobre-expresa un gen basl endógeno, un homólogo o fragmento funcional del mismo.
20. Un vector que contiene al menos una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica un polipéptido BAS1, un homólogo o fragmento funcional del mismo, asociada operativamente con un promotor.
21. El vector de la reivindicación 21, comprendiendo además un promotor.
22. El vector de la reivindicación 21, donde el promotor es un promotor constitutivo.
23. El vector de la reivindicación 21, donde el promotor es un promotor inducible.
24. El vector de la reivindicación 21, donde el promotor es inducido por medios químicos.
25. El vector de la reivindicación 20, comprendiendo además ADN de transferencia que contiene cuatro o mas copias de regiones mejoradoras del promotor CaMV 35S adyacentes a dicha secuencia de ácido nucleico exógena.
26. Un método para modificar genéticamente una célula de planta, tal que una planta, producida a partir de dicha i???É?^ *jbá+ *M.. Mj? ~Mc.... "*-*"- • i~< " ? 'Í ?» -148- célula, esté caracterizada por tener actividad de brasinólida modulada en comparación con una planta tipo silvestre, dicho método comprendiendo: introducir al menos un polinucleótido basl exógeno, un homólogo o fragmento funcional del mismo, en una célula de planta para obtener una célula de planta transformada; y cultivar la célula de planta transformada bajo condiciones que permitan la expresión del producto de gen basl , un homólogo o fragmento funcional del mismo, con ello produciendo una planta que tiene una actividad de brasinólida modulada.
27. El método de la reivindicación 26, donde dicha modulación es hipersensibilidad a luz roja extrema en un fondo PHYA y falta de respuesta en un fondo nulo phyA .
28. El método de la reivindicación 26, donde la expresión es sobre-expresión y la modulación es enanismo acompañado por follaje verde oscuro en plantas adultas.
29. El método de la reivindicación 26, donde la expresión es sobre-expresión y la modulación es etiolación con hipocotíleos de longitud casi tipo silvestre en semillas cultivadas en la oscuridad.
30. El método de la reivindicación 26, donde dicha modulación es actividad de brasinólida suprimida.
31. El método de la reivindicación 24, donde dicha supresión de actividad de brasinólida es lograda por sobre- expresión de jasl en la planta. ¿r^^J í^-y^- íi**^. -149-
32. El método de la reivindicación 24, comprendiendo además introducir al menos un polinucleótido exógeno que comprende un gen chibi2 estructural en la célula de planta para obtener la célula de planta transformada y cultivar la célula de planta transformada bajo condiciones que permitan la expresión del producto de gen chibi2.
33. Un método de producir una planta modificada genéticamente, caracterizada por tener una estatura adulta enana con follaje verde oscuro, dicho método comprendiendo: poner en contacto una célula de planta con un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico exógena que comprende al menos un gen estructural que codifica un polipéptido BAS1, un homólogo o fragmento funcional del mismo, dicho gen estando asociado operativamente con una secuencia regulatoria que ocasiona sobre-expresión del gen, para obtener una célula de planta transformada; producir una planta a partir de dicha célula de planta transformada; y seleccionar una planta que exhibe dicha estatura adulta enana con follaje verde oscuro.
34. El método de la reivindicación 33, donde el contacto es por medios físicos.
35. El método de la reivindicación 33, donde el contacto es por medios químicos.
36. El método de la reivindicación 33, donde la célula -150- de planta es seleccionada del grupo que consiste en protoplastos, células productoras de gametos, y células que se regeneran en una planta completa.
37. El método de la reivindicación 33, donde la 5 secuencia regulatoria comprende un promotor constitutivo.
38. El método de la reivindicación 33, donde la secuencia regulatoria comprende un promotor inducible.
39. Una planta producida por el método de la reivindicación 33. 10
40. Tejido de planta derivado de una planta producida por el método de la reivindicación 33.
41. Un método para modular la actividad de brasinólida en una planta, que comprende: poner en contacto una célula de planta con el vector de 15 la reivindicación 20 para obtener una célula de planta transformada ; cultivar la célula de planta transformada bajo condiciones de formación de planta para producir una planta a partir de dicha célula de planta transformada; y 20 seleccionar una planta que exhibe dicha actividad de brasinólida modulada.
42. Una planta modificada genéticamente que tiene un transgen que incrementa la expresión del gen jbasl, un homólogo o fragmento funcional del mismo, integrado cromosomalmente en el 25 genoma de la planta. -151-
43. Un método de producir una planta modificada genéticamente, caracterizada por ser hiper-responsiva a brasinólida, dicho método comprendiendo: poner en contacto una célula de planta con un vector 5 que contiene una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica un producto que perturba o interfiere con la expresión del polipéptido BAS1, un homólogo o fragmento funcional del mismo, dicho ácido nucleico estando asociado operativamente con un promotor, para obtener una célula de planta transformada; 10 producir una planta a partir de dicha célula de planta transformada; y seleccionar una planta que exhibe una hiper-capacidad de respuesta a brasinólida en una manera dependiente de la luz.
44. Un método para ensayar la función de brasinoeste- 15 roides en una planta, dicho método comprendiendo: poner en contacto al menos una planta transgénica obtenida de acuerdo con el método de la reivindicación 43 con una cantidad efectiva de brasinólida, y determinar la hiper-capacidad de respuesta de la planta 20 a brasinólida.
45. El método de acuerdo con la reivindicación 44, donde la secuencia de ácido nucleico de basl está asociada operativamente con uno o mas promotores CaMV 35S para crear un mutante sin brasinoesteroides. 25
46. El método de acuerdo con la reivindicación 44, || lll?? ????UÉMlÍl?? n i rtll i i 1 II i i l? *í.. . -152-donde una pluralidad de las plantas transgénicas forman una serie alélica de ganancia de función caracterizada por niveles que se incrementan de sobre-expresión de basl .
47. El método de acuerdo con la reivindicación 44, donde la determinación es en una manera dependiente de la luz.
48. Un método para modificar genéticamente una célula de planta, tal que una planta, producida a partir de dicha célula, sea caracterizada por tener una actividad de ecdiesteroide modulada en comparación con una planta tipo silvestre, dicho método comprendiendo: introducir al menos un polinucleótido basl exógeno, un homólogo o fragmento funcional del mismo, a una célula de planta para obtener una célula de planta transformada; y cultivar la célula de planta transformada bajo condiciones que permitan la expresión del producto de gen basl, con ello produciendo una planta que tiene una actividad de ecdiesteroide modulada.
49. El método de la reivindicación 48, donde la modulación incluye hidroxilación alternada del ecdiesteroide.
50. Una planta genéticamente alterada, obtenida por el método de la reivindicación 48.
51. Un método de producir una planta modificada genéticamente, caracterizada por tener una enfermedad ocasionada por un insecto o insectos incrementados en comparación con la planta correspondiente tipo silvestre, dicho método comprendien- -153-do: a) poner en contacto células de planta con ácido nucleico que codifica un polipéptido BAS1, donde dicho ácido nucleico está asociado operativamente con una secuencia de control de expresión, para obtener células de planta transformadas ; b) producir plantas a partir de dichas células de planta transformadas bajo condiciones que permitan la expresión de BAS1; c) seleccionar una planta que exhibe dicha enfermedad o dicho insecto.
52. El método de la reivindicación 51, donde dicha enfermedad o dicho insecto incrementados son resistencia incrementada a un patógeno bacteriano.
53. El método de la reivindicación 52, donde dicho patógeno bacteriano es seleccionado del grupo que consiste en Pseudomonas syringe pv. tomate (Pst) y Pseudomonas syringe pv. maculicola (Psm) .
54. El método de la reivindicación 51, donde la secuencia de control de expresión es un promotor.
55. El método de la reivindicación 51, donde el contacto es por medios físicos.
56. El método de la reivindicación 51, donde el contacto es por medios químicos.
57. El método de la reivindicación 51, donde la célula JMA¿sjJj?.ia.a...,i>11.^?J<l ^_ , a> ?*-k &~ *-.* # -154- de planta es seleccionada del grupo que consiste en protoplastos, células productoras de gametos, y células que se regeneran en plantas completas.
58. El método de la reivindicación 51, donde dicho ácido nucleico está contenido en un vector derivado de ADN-T.
59. Una planta producida por el método de la reivindicación 51.
60. Tejido de planta derivado de una planta de la reivindicación 59.
61. Una semilla derivada de una planta de la reivindicación 59.
62. Un método para modificar genéticamente una célula de planta, tal que una planta, producida a partir de dicha célula, esté caracterizada por tener una enfermedad o un insecto incrementados, en comparación con una planta tipo silvestre, dicho método comprendiendo: a) introducir un polinucleótido BAS1 es una célula de planta para obtener una célula de planta transformada; y b) cultivar dicha célula de planta transformada bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido BAS1, con ello produciendo una planta teniendo una enfermedad o un insecto incrementados .
63. El método de la reivindicación 62, donde dicha enfermedad o dicho insecto incrementados son resistencia incrementada a un patógeno bacteriano. -155-
64. El método de la reivindicación 63, donde dicho patógeno bacteriano es seleccionado del grupo que consiste en Pseudomonas syringe pv. tomate (Pst) y Pseudomonas syringe pv. maculicola (Psm) .
65. Un método de producir una planta, caracterizado por tener una enfermedad o un insecto incrementados en comparación con una planta tipo silvestre, dicho método comprendiendo poner en contacto una planta susceptible con una cantidad inductora del promotor BAS1 de un agente necesario para elevar la expresión del gen BAS1 sobre la expresión de BAS1 en una planta no puesta en contacto con el agente.
66. El método de la reivindicación 65, donde el agente es un factor de transcripción.
67. El método de la reivindicación 65, donde el agente es un agente químico.
68. El método de la reivindicación 65, donde dicha enfermedad o dicho insecto incrementados son resistencia incrementada a un patógeno bacteriano.
69. El método de la reivindicación 68, donde dicho patógeno bacteriano es seleccionado del grupo que consiste en Pseudomonas syringe pv. tomate (Pst) y Pseudomonas syringe pv. maculicola (Psm) .
70. Un método de producir plantas genéticamente transformadas, resistentes a enfermedades, que comprende introducir en el genoma de una célula de planta para obtener una Í& MMÍ^M iS ^i.l - lt J-* S-MMÍ.J: : i._ M-_MM..£m.m . . - . -156- célula de planta transformada, una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de control de expresión enlazada operativamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASl.
71. El método de la reivindicación 70, donde dicha secuencia de control de expresión pone en objetivo la expresión a un tejido de planta seleccionado del grupo que consiste en hojas, raíces, brotes, y tallos.
72. El método de la reivindicación 70, donde dicha enfermedad o dicho insecto son resistencia a un patógeno bacteriano .
73. El método de la reivindicación 73, donde dicho patógeno bacteriano es seleccionado del grupo que consiste en Pseudomonas syringe pv. tomate (Pst) y Pseudomonas syringe pv. maculicola (Psm) .
74. Una planta producida por el método de la reivindicación 70.
75. Tejido de planta derivado de una planta producida por el método de la reivindicación 70.
76. Una semilla derivada de una planta producida por el método de la reivindicación 70.
77. Un método para identificar genes novedosos de enfermedad o de insecto, dicho método comprendiendo: a) sondear una biblioteca de ácidos nucleicos con al menos un fragmento de un polinucleótido que codifica un citocromo -157- P450 que tiene actividad basl; y b) seleccionar aquellos clones de dicha biblioteca que hibriden con dicho fragmento.
78. Un método para producir una planta transgénica resistente a insectos, acáridos, o nemátodos, que comprende: a) introducir en una célula de planta o te ido de planta que puede regenerarse en una planta completa, ADN que comprende un gen capaz de expresarse en dicha planta que codifica un citocromo P450 que tiene homología de secuencia y actividad biológica de Basl; b) seleccionar plantas transgénicas; y c) identificar plantas transgénicas que son resistentes a insectos, acáridos, o nemátodos.
79. Una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia regulatoria que no codifica, aislada corriente arriba de un gen basl, donde dicha secuencia regulatoria que no codifica está asociada operativamente con una secuencia de ácido nucleico que expresa una proteína de interés o ARN anti-sentido, donde dicha secuencia de ácido nucleico es heteróloga a dicha secuencia que no codifica, y donde la región regulatoria que no codifica comprende una secuencia como se señala en la SEQ ID NO: 16.
80. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 79, donde dicha secuencia que no codifica comprende una región de iniciación transcripcional y traslacional . -158-
81. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 80, comprendiendo además una región de terminación transcripcional funcional en una célula de planta. S ,
82. La construcción de ácido nucleico de la reivindi-cación 79, donde dicha secuencia de ácido nucleico codifica una toxina de Bacillus thuringi ensi s .
83. Una célula de planta transgénica que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 79.
84. La célula de planta transgénica de la reivindicación 83, comprendiendo además un marcador seleccionable.
85. Una planta que comprende una célula de planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 83.
86. Una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia regulatoria que no codifica aislada corriente arriba de un gen basl, donde dicha secuencia de ácido nucleico contiene al menos un sitio de restricción para clonar una secuencia de ácido nucleico heteróloga de interés.
87. La secuencia de la reivindicación 86, donde la secuencia es señalada en la SEQ ID NO: 16. I A- .A J,.J, . j*A ? .,? ... ajA.... -159- Resumen La presente invención provee el citocromo P450s, útil para producir plantas modificadas genéticamente, caracterizadas por tener el rasgo fenotípico de síntesis modulada de señalización de brasinólidas, por ejemplo, dando como resultado resistencia a insectos, enanismo y follaje verde mas oscuro en comparación con plantas tipo silvestre. Tales plantas pueden ser modificadas, por ejemplo, usando "basl " , u homólogos funcionales del mismo, un polipéptido codificado por basl que modula la 10 síntesis y/o señalización de brasinólidas en plantas. La invención también provee métodos para modular la actividad de ecdiesteroides en una planta y para ensayar la unción de brasinoesteroides en una planta. Este último método puede ser usado para crear una serie alélica de ganancia de función de 15 plantas caracterizadas por niveles incrementados de sobre- expresión de un citocromo P450 para examinar la actividad de brasinólidas en especies de plantas.