RU2114911C1 - Способ получения трансгенного растения кукурузы - Google Patents

Способ получения трансгенного растения кукурузы Download PDF

Info

Publication number
RU2114911C1
RU2114911C1 SU5052752A SU5052752A RU2114911C1 RU 2114911 C1 RU2114911 C1 RU 2114911C1 SU 5052752 A SU5052752 A SU 5052752A SU 5052752 A SU5052752 A SU 5052752A RU 2114911 C1 RU2114911 C1 RU 2114911C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
dna
callus
plants
gene
medium
Prior art date
Application number
SU5052752A
Other languages
English (en)
Inventor
Роналд С. Ландквист
Дэвид А. Уолтерс
Джули А. Кирихара
Original Assignee
Дикэлб Дженетикс Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23857948&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2114911(C1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Дикэлб Дженетикс Корпорейшн filed Critical Дикэлб Дженетикс Корпорейшн
Application granted granted Critical
Publication of RU2114911C1 publication Critical patent/RU2114911C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C07K14/425—Zeins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
    • C12N15/8253—Methionine or cysteine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
    • C12N15/8254—Tryptophan or lysine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Способ предназначен для получения фертильных трансгенных растений кукурузы и может быть использован для введения в хромосому рекомбинантной ДНК. Реципиентные клетки, полученные из способной к регенерации рыхлой эмбриогенной каллусной культуры, обстреливают микрочастицами, покрытыми ДНК. Используется каллусная культура незрелых зародышей в виде комочков 30 - 80 мг, которая культивируется на твердой питательной среде. Вводимая ДНК может содержать ген, кодирующий белок семян, в результате чего содержание аминокислот увеличивается. 3 з.п.ф-лы. 8 ил., 9 табл.

Description

Изобретение относится к получению трансгенных растений, в частности трансгенных растений кукурузы, и может быть использовано в сельском хозяйстве.
Генетическая инженерия растений, которая предполагает изоляцию и обработку генетического материала (обычно в форме ДНК или РНК) с последующим введением этого генетического материала в растение или растительные клетки, открывает значительные перспективы для современного сельского хозяйства и селекции растений. Методами генетической инженерии можно увеличивать пищевую ценность сельскохозяйственных культур, повышать урожай, снижать затраты на производство продукции, обеспечивать устойчивость к вредителям, стрессу и засухе, осуществлять производство фармацевтического сырья, химических соединений и биологических молекул, а также получать другие полезные результаты. После идентификации, клонирования и переконструирования гена его необходимо также внедрить в нужное растение таким образом, чтобы полученное растение было одновременно фертильно и способно передавать данный ген своему потомству.
В настоящее время разработано и доступно множество методов трансформации различных растений и растительных клеток при помощи ДНК. В основном это относится к двудольным растениям, но имеются также сообщения и об определенных достижениях в трансформации некоторых однодольных злаков. Однако некоторые виды злаков до сих пор было невозможно трансформировать каким-либо методом. Так, до настоящего изобретения не были известны технологии, которые позволяли бы получать устойчиво трансформированные растения Zea mays, в которых внесенная рекомбинантная ДНК передавалась бы в течение по крайней мере одного полового цикла. Отсутствие достижений в данной области подтверждается литературой и обсуждалось в ряде последних обзоров [40, 50, 5].
Некоторые испытанные или предложенные способы введения ДНК в клетки кукурузы предполагают использование электропорации, микроинъекции, обстрела микроскопическими частицами, слияния с липосомами, переноса, опосредованного Agrobacterium, макроинъекции или обработки раствором очищенной ДНК.
Так например, в [14 и 37] сообщается о введении ДНК в кукурузу путем смешивания пыльцевых зерен с растворами ДНК и последующего нанесения этой пыльцы на пестики кукурузы. В упомянутых работах отсутствуют молекулярные данные, подтверждающие введение экзогенной ДНК в клетки кукурузы. В [54] описывается инкубация ДНК с пыльцой кукурузы с последующим опылением початков кукурузы и образованием семян. Сообщается, что растения, выращенные из этих семян, содержат внесенную ДНК, но отсутствует указание на то, что внесенная ДНК передается в течение полного полового цикла.
В [19] сообщается о трансформации проростков Zea mays, опосредованной Agrobacterium. Доказательства были основаны на экспериментах, которые иногда могут быть ненадежными. К настоящему времени не сообщалось о дальнейших успехах в области трансформации с использованием пыльцы или переноса, опосредованного Agrobacterium.
Сообщалось также, что в результате обстрела микрочастицами получались трансформированные клетки кукурузы. Данный метод описан в [45], а также в [55] . В [29] описывается получение трансформированных клеток кукурузы с помощью бомбардировки микрочастицами. Использованные клетки, однако, не были способны образовывать растения путем регенерации. Таким образом, не существует опубликованных протоколов, описывающих введение ДНК путем бомбардировки в способные к регенерации культуры кукурузных клеток любого типа. Не сообщалось также о стабильном введении гена в результате бомбардировки кукурузного каллуса с последующей регенерацией фертильных растений и передачей введенного гена в течение хотя бы одного полового цикла. В [53] описывается бомбардировка ДНК кукурузной пыльцы, нанесение ее на рыльца и образование семян, которые, по сообщению авторов, содержат экзогенную ДНК. Однако при этом отсутствуют доказательства того, что эта ДНК передавалась в течение полного полового цикла, и данная группа исследователей не сообщала о получении ими дальнейших результатов.
Согласно [16] электропорация кукурузных протопластов приводила к образованию трансформированных клеток, хотя эти клетки не образовывали регенерированных растений.
Следующая серьезная проблема, мешающая успешному получению фертильных растений кукурузы, заключается в отборе этих немногих трансформантов таким образом, чтобы ни регенерационная способность (в случае использования протопластов или клеточных культур), ни фертильность трансформантов не были нарушены. В связи с общей низкой частотой трансформантов, полученных при трансформации, та или иная процедура отбора часто оказывается необходимой. Такой отбор, однако, обычно предполагает использование какого-либо токсичного агента, например гербицида или антибиотика, который может отрицательно влиять на регенерационную способность или фертильность получаемых растений.
С другой стороны, известно, что нетрансформированные протопласты, культивируемые клетки и каллусы кукурузы по меньшей мере могут регенерировать с образованием зрелых растений и что получаемые растения часто фертильны. Так, например, в [46] и [41] обсуждаются методы получения протопластов из клеточных культур и восстановления фертильных растений из этих протопластов. В [42] описываются попытки регенерации растений кукурузы из протопластов, изолированных из культур эмбриогенных клеток кукурузы.
Однако до сих пор исследователям не удавалось определить, какие ткани или культуры кукурузы являются подходящими реципиентами экзогенной ДНК, в частности содержат полезное число клеток, которые рецептивны к экзогенной ДНК и будут стабильно ее интегрировать, и, в то же время, являются частью зародышевой линии, т.е. частью клеточной линии, ведущей к следующему поколению растений.
Таким образом, исследования сталкиваются с дилеммой. В то время как некоторые способы трансформации приводили, по данным исследований, к получению трансформированных клеток кукурузы и определенные клетки и ткани были предложены в качестве потенциальных реципиентов в связи с их способностью образовывать растения путем регенерации, исследователям не удалось найти комбинацию приемов, которые обеспечили бы успешное получение трансформированных растений кукурузы, способных передавать введенную ДНК в течение одного полного полового цикла.
Известен [43] способ получения трансгенного растения кукурузы (Zea mays), включающий в себя получение из растения реципиентных клеток, их трансформацию, отбор трансформированных клеток и регенерацию из них растения, причем реципиентные клетки представляют собой протопласты, а трансформацию осуществляют путем электропорации.
Однако полученные растения являются стерильными, кроме того, использованные методы получения клеточной линии были невоспроизводимы.
Таким образом, задачей данного изобретения является создание способа получения трансгенных растений Zea mays, который бы позволил получить фертильные растения, которые бы передавали введенный ген потомству, а метод получения клеточной линии был бы воспроизводимым.
Данная задача решается тем, что предложен способ получения трансгенного растения Zea mays, содержащего стабильно интегрированную в хромосому рекомбинантную ДНК, включающий получение реципиентных клеток, их трансформацию путем введения в них экзогенной ДНК, отбор трансформированных клеток и последующую регенерацию из них растений, в котором, согласно изобретению, реципиентные клетки получают из способной к регенерации рыхлой эмбриогенной каллусной культуры, а трансформацию осуществляют путем обстрела реципиентных клеток микрочастицами, покрытыми рекомбинантной ДНК.
Целесообразно получать каллусную культуру из незрелых зародышей.
Целесообразно для обстрела микрочастицами использовать каллусную культуру, имеющую вид комочков, масса каждого из которых составляет 30 - 80 мг.
Целесообразно каллусную культуру культивировать на твердой питательной среде.
На фиг. 1,а показана карта плазмидного вектора pHYGI1, использованного в примере 1. На фиг. 1,б показана соответствующая часть линеаризированного плазмидного вектора pHYGI1, включающая кодирующую последовательность НРТ и ассоциированные регуляторные элементы. Номера пар оснований начинаются с 5'-нуклеотида в последовательности, распознающейся указанными рестрикционными ферментами, начиная с сайта EcоRI на 5'-конце промотора 35S ВТМ.
На фиг. 2,а показана карта плазмидного вектора pBII221, использованного в примере 1.
На фиг. 2,б показан линеаризованный вектор pBII221, в частности участок от сайта расщепления Hind III до сайта EcoRI.
На фиг. 3 показаны Саузерн-блот ДНК изолированной из каллусной линии РН1 и из контрольной нетрансформированной каллусной линии, а также схематическое изображение зондов pHYGIl, использованных в эксперименте.
На фиг. 4 показаны Саузерн-блот ДНК листьев, изолированной из растений R0, регенерированных из линии РН1 и из нетрансформированного каллуса, а также схематическое изображение зондов PHYGI1, использованных в эксперименте.
На фиг. 5 показаны Саузерн-блот ДНК листьев, изолированной из потомства R1 растений R0 PH1 и нетрансформированных растений R0, а также схематическое изображение зондов pHYGI1, использованных в эксперименте.
На фиг. 6 показаны Саузерн-блот ДНК, изолированной из каллусной линии PH2 и из нетрансформированной контрольной каллусной линии, а также схематическое изображение зондов pHYGI1, использованных в эксперименте.
На фиг. 7,а показана карта плазмидного вектора pZ27Z10, использованного в примере 2.
На фиг. 7,б показана линеаризованная плазмида pZ27Z10, включающая кодирующую последовательность Z10 и ассоциированные регуляторные элементы.
На фиг. 8 схематически показано положение ПЦР-праймеров в пределах химерного гена Z27 - Z10.
Изобретение направлено на получение фертильных трансгенных растений и семян вида Zea mays, преимущественно имеющих повышенную пищевую ценность, растений, растительных тканей и семян, получаемых из этих трансгенных растений, а также их потомства и получаемых из них продуктов. Описанным способом могут быть получены любые растения данного вида, включая полевую, сладкую, кормовую кукурузу, а также другие разновидности кукурузы.
"Трансгенными" в данном случае считаются любые клетки, клеточные линии, каллусы, ткани, части растений или растения, генотипы которых были изменены присутствием рекомбинантной ДНК (называемой в генной инженерии также гетерологичной, экзогенной или чужеродной ДНК), которая была введена в генотип растения в процессе генной инженерии или же была первоначально введена в генотип родительского растения в ходе такого процесса и затем передана последующим поколениям путем полового процесса или бесполого размножения. Генотипом в данном случае считается совокупность всего генетического материала клетки как хромосомного, так и внехромосомного. Таким образом, используемый в данном случае термин "трансгенный" не включает растения, генотипы которых изменены обычными методами скрещивания растений или в результате имеющих место в природе процессов случайного оплодотворения, вирусной инфекции или спонтанного мутирования.
"Наследуемой" считается ДНК, способная передаваться в течение по меньшей мере одного полового цикла растения, то есть от растения через его гаметы к растению-потомку.
В соответствии с данным изобретением трансгенные растения могут быть получены путем (1) основания способной к регенерации клеточной культуры, предпочтительно рыхлого эмбриогенного каллуса, (2) трансформации упомянутой клеточной культуры методом обстрела микрочастицами, (3) идентификации или отбора трансформированных клеток и (4) регенерации фертильных трансгенных растений из трансформированных клеток. Некоторые из растений, описываемых в данном изобретении, могут быть получены из трансгенных семян, полученных от фертильных трансгенных растений с использованием обычных методов скрещивания с целью получения трансгенных элитных линий и сортов или коммерческих гибридных семян, содержащих рекомбинантную ДНК.
Линии растений и культуры тканей
Особенно полезными для получения фертильных трансгенных растений кукурузы оказались клетки каллусов, способные к регенерации как до, так и после селекционных процедур, детально описанных ниже. Такие клетки получают в основном из меристемной ткани, содержащей клетки, не прошедшие терминальную дифференцировку. Эта ткань у злаков вообще и у кукурузы в частности включает ткани, находящиеся в основаниях молодых листьев, молодых кистей, незрелых зародышах и узлах стеблей. Использовались преимущественно незрелые зародыши. Методы получения и поддержания каллуса из таких растений и таких тканей хорошо известны и подробно описаны в литературе, например в [39].
Конкретный используемый каллус должен быть способен образовывать путем регенерации фертильное растение. Специфическая регенерационная способность определенного каллуса важна для успеха используемого в данном случае процесса обстрела/отбора, поскольку в ходе селекции регенерационная способность существенно снижается. Поэтому важно работать с самого начала с культурами, имеющими максимально возможную регенерационную способность. Было установлено, что каллус в возрасте от 3 до 36 месяцев имеет достаточно высокую способность к регенерации и поэтому предпочтителен. Регенерационная способность конкретной культуры легко может быть определена путем перенесения проб этой культуры на регенерационную питательную среду и отслеживания роста побегов, корней и проростков. Относительное число проростков на чашку Петри или на грамм живого веса ткани может быть использовано для грубой количественной оценки регенерационной способности. В целом предпочтительна культура, производящая по меньшей мере одно растение на грамм ткани каллуса.
Хотя каллусные культуры кукурузы могут быть основаны от различных тканей растения, использованные в данном случае культуры получаются предпочтительно из незрелых зародышей кукурузы, которые извлекаются из зерновок, находящихся в початке кукурузы, при достижении зародышами длины 1 - 3 мм. Такого размера они достигают обычно через 9 - 14 дн после опыления. Зародыши в стерильных условиях помещаются на обычную твердую среду таким образом, чтобы эмбриональная ось была направлена вниз (скутеллюмом вверх). Каллусная ткань появляется на скутеллюме через несколько дней или недель. После значительного подрастания каллуса пролиферация клеток скутеллюма может быть оценена на рыхлость и на присутствие сформированных зародышей. Под "рыхлостью" понимается способность ткани легко диспергироваться без повреждения клеток. Ткань такой морфологии переносится затем на свежую среду и пассируется обычными методами через каждые 2 недели. Просеивание с целью уменьшения образования комков и или для увеличения поверхности клеток также может использоваться при пассировании.
Для инициации каллуса используются предпочтительно твердые среды. В предпочтительном варианте среда для основания и поддержания каллуса принципиально основана на солевой среде N 6 по [9], как описано в [3], или на солевой среде MS [34]. К минимальной среде добавляется сахароза и 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д). Было установлено, что добавки типа L-пролина и гидролизата казеина увеличивают частоту образования каллусных культур, а также улучшают их рост и морфологию. Обычно культуры поддерживаются в темноте, хотя возможно также использование низкой освещенности. Содержание синтетического гормона 2,4-Д, необходимого для поддержания и наращивания каллуса, обычно должно составлять от 0,3 до 3,0 мг л.
Хотя в данном случае успешная трансформация и регенерация была достигнута с использованием рыхлого эмбриогенного каллуса, это не обязательно означает, что для получения фертильных трансгенных растений, предлагаемых в данном изобретении, не могут быть использованы другие способные к трансформации и регенерации клетки, ткани и органы. Единственное обязательное требование к трансформируемым клеткам заключается в том, что после трансформации они должны быть способны образовывать путем регенерации растения, несущие рекомбинантные ДНК, после использования каких-либо процедур отбора или скрининга. Например, могут быть использованы клетки, выращенные в жидкой суспензионной культуре. Для основания таких культур каллус второго типа в возрасте 4 - 6 месяцев переносится в жидкую ростовую среду. Методы получения способных к регенерации суспензионных клеточных культур и соответствующие ссылки приводятся в [21, 39 и 48]. Обычно жидкие ростовые среды для суспензионных культур сходны по составу с твердыми средами для индукции каллусов. Для повышения регенерационной способности и жизнеспособности культуры в жидкие ростовые среды может добавляться абсцизиновая кислота (АВА) в концентрации 10-7 М. Предпочтительно не просеивать каллус перед внесением в жидкую среду.
Жидкие культуры пассируются так, как это необходимо для поддержания их активного роста и регенерационных свойств. В предпочтительном варианте применения культуры пассируются один раз в неделю путем разбавления свежей ростовой средой в отношении 1:8 - 1:9.
ДНК, использованная для трансформации
Используемый термин "рекомбинантная ДНК" означает в данном случае ДНК, произведенную или выделенную (изолированную) из любого источника, которая затем может быть химически изменена и введена в Zea mays. Примером рекомбинантной ДНК, "произведенной" из некоторого источника, может быть последовательность ДНК, идентифицированная как полезный фрагмент в геноме какого-либо организма и затем химически синтезированная в практически чистом виде. Примером рекомбинантной ДНК, "выделенной" из некоторого источника, может быть полезная последовательность ДНК, вырезанная или извлеченная из этого источника химическими методами, например с использованием рестрикционных эндонуклеаз, таким образом, что в дальнейшем она может быть подвергнута обработке, например амплификации, с целью ее введения в организм методами генетической инженерии.
Таким образом, понятие "рекомбинантная ДНК" включает в себя полностью синтетическую ДНК, полусинтетическую ДНК, ДНК, выделенную из биологических источников, и ДНК, происходящую от введенной РНК. Обычно рекомбинантная ДНК не происходит из генотипа Zea mays, являющегося реципиентом этой ДНК, но данное изобретение предусматривает возможность выделения гена из некоторого генотипа Zea mays с последующим введением множественных копий этого гена в тот же самый генотип, например с целью увеличения выхода продукта данного гена, например запасного белка.
Рекомбинантные ДНК включают в себя ДНК генов растений или нерастительные гены, такие как гены бактерий, дрожжей, животных или вирусов, модифицированные гены, участки генов, химерные гены, включающие гены из того же самого или другого генотипа Zea mays; этот перечень, однако, не является исчерпывающим.
Используемые для трансформации рекомбинантные ДНК могут быть кольцевыми или линейными, одно- или двунитевыми. Обычно ДНК присутствует в форме химерной, например плазмидной ДНК, которая может также включать кодирующие участки, фланкированные регуляторными последовательностями, обеспечивающими экспрессию рекомбинантной ДНК в полученных растениях кукурузы. Например, рекомбинантная ДНК может сама включать или нести промотор, активный в Zea mays, или может использовать промотор, уже существующий в генотипе Zea mays и являющийся мишенью трансформации.
Состав и методы конструирования рекомбинантной ДНК, способной трансформировать определенные растения, хорошо известны опытным специалистам, и эти методы и составы могут быть использованы для получения ДНК, применяемой в данном случае. Конкретный состав ДНК не является принципиальным для данного изобретения, и при осуществлении изобретения могут использоваться различные рекомбинантные ДНК. В [50] описаны подходящие компоненты ДНК, пригодные для отбора маркерные гены, энхансеры, интроны и т.д., а также приведены соответствующие ссылки на получаемые составы. В [44] предложены подходящие методы конструирования. Обычно рекомбинантная ДНК относительно невелика, т.е. не превышает по длине 30 kb (30 000 пар оснований), что необходимо для снижения чувствительности к физической, химической или ферментативной деградации, которая, как известно, возрастает с увеличением размера ДНК.
В качестве рекомбинантных ДНК в данном случае приемлемы любые ДНК, обеспечивающие или усиливающие какое-либо полезное свойство получаемого в результате трансгенного растения кукурузы. Эти ДНК могут кодировать белки или антисмысловые РНК-транскрипты, способствующие повышению пищевой ценности, устойчивости к вредителям, болезням и гербицидам и т.п. Например, ДНК может кодировать DHDP-синтетазу, как это делает ген dap A, что повышает количество получаемого лизина, бактерии Bacillus thuringiensis (Bt), δ-эндотоксин или ингибитор протеазы, что повышает устойчивость к насекомым, бактериальную EPSP-синтетазу, увеличивающую устойчивость к гербицидам, хитиназу или глюкан-эндо-1,3-β- гликозидазу, сообщающие растениям фунгицидные свойства.
Важное значение для повышения пищевой ценности имеют гены, кодирующие белки, содержащие большие количества незаменимых аминокислот. Например, для обеспечения адекватного питания и поддержания оптимального роста цыплят в корм, приготовляемый из кукурузы и сои, обычно добавляют синтетический метионин или аналог метионина. Создание сортов кукурузы с более высоким содержанием метионина может уменьшить потребность в добавках этого вещества. Создание линий кукурузы с высоким содержанием метионина может быть достигнуто путем внедрения в геном кукурузы активно экспрессирующихся гена или генов, кодирующих белок с высоким содержанием метионина.
Примерами генов, кодирующих белки с высоким содержанием метионина, являются: (1) ген, кодирующий кукурузный белок zein размером 15 кДа (11% метионина) [38] , (2) ген, кодирующий запасной белок бразильского ореха (18% метионина) [2], и (3) ген, кодирующий белок zein размером 10 кДа (22,5% метионина) [27] . Предпочтительно использование гена белка zein размером 10 кДа, поскольку это собственный ген кукурузы, продукт которого в норме накапливается в зерновках и по содержанию метионина вдвое превышает белок размером 15 кДа. Для достижения высокого уровня экспрессии в семенах кодирующая последовательность этого гена может быть слита с регуляторной последовательностью активно экспрессирующегося специфичного для семян гена. С другой стороны, возможно также введение дополнительных копий интактного гена белка эндосперма размером 10 кДа в геном кукурузы, что также увеличит содержание метионина в семенах кукурузы.
Лизин, аминокислота, незаменимая в диетах человека и животных с простым желудком, является одной из трех аминокислот, недостаточное количество которых ограничивает пищевую ценность основных сельскохозяйственных культур, в частности злаковых. Следовательно, основанные на зерне диеты должны дополняться синтетическим лизином или белковой пищей, содержащей лизин. Далее, поскольку большинство масляно-зерновых диет сами по себе не являются адекватными источниками лизина, уравновешивание пищевых смесей по лизину часто приводит к их перегрузке другими, менее необходимыми питательными веществами. Таким образом, повышение содержания лизина в злаках, или масляно-зерновых культурах, или в том и в другом привел бы к значительному увеличению пищевой ценности, а также к существенному снижению затрат для конечных потребителей, таких как производители свинины и домашней птицы.
Один из возможных подходов к увеличению содержания лизина в злаковых культурах заключается в нарушении биосинтетических путей, позволяющем накапливаться свободному лизину. Ген dap A Escherichia coli кодирует синтетазу дигидродипиколиновой кислоты (DHDPS), ключевой регуляторный фермент, активность которого у растений сильно ингибируется лизином по принципу обратной связи. Бактериальный фермент приблизительно в 200 раз менее чувствителен к ингибированию лизином. Введение гена dap A и его экспрессия в растительных клетках позволили бы продолжать синтез свободного лизина после того, как нативная синтетаза DHDPS растения будет полностью ингибирована.
Особое значение для поддержания урожайности кукурузы и значительного снижения затрат на ее выращивание имеет защита кукурузы от вреда, наносимого насекомыми. В США в число основных вредителей кукурузы входят различные вредители из отряда Lepidoptera, например европейский кукурузный сверлильщик, озимый червь и др., а также различные виды Goleoptera, например Diabrotica spp. Защита кукурузы от вреда, наносимого насекомыми, требует больших затрат со стороны производителей и использования периодически вносимых токсичных химических инсектицидов. Поскольку традиционные способы разведения и селекции не позволили создать новые линии кукурузы, имеющие хорошую устойчивость к основным насекомым-вредителям, внесение и наследование в растениях кукурузы генов или последовательностей, обеспечивающих устойчивость к насекомым, в соответствии с настоящим изобретением, позволило бы снизить затраты производителя, уменьшить использование токсичных химических инсектицидов, а также обеспечило бы более эффективное снижение численности насекомых-вредителей.
Существенной особенностью изобретения является введение гена устойчивости к насекомым в клетку кукурузы, митотическая репликация его таким образом, что он оказывается встроенных в растение кукурузы и в конечном итоге наследуется потомством этого растения в процессе митотических и мейотических делений. Бактерии Bacillus thuringlensis (Bt), включающие около 20 известных подвидов бактерий, продуцируют эндотоксические полипептидазы, токсичные для многих насекомых при поглощении с пищей. Биология и молекулярная биология эндотоксических белков (Bt-белков) и соответствующих генов (Bt-генов) была рассмотрена в [51] и (25]. Гены, кодирующие различные Bt-белки, были клонированы и секвинированы. Исследования показали, что сегмент Bt-полипептида, существенный для токсичности по отношению к различным вредителям из отряда Lepidoptera, содержится приблизительно в первой половине этого полипептида. Следовательно, укороченный полипептид, кодируемый укороченным Bt-геном, во многих случаях сохранит свою токсичность для многих вредоносных Lepidoptera. Было показано, что Bt-полипептиды HD73 и HD1 токсичны для личинок важных американских вредителей кукурузы из отряда Lepidoptera, таких как европейский кукурузный сверлильщик, озимый червь и др. Гены, кодирующие Bt-полипептиды HD73 и HD1, были клонированы и секвинированы соответственно Гайзером [17] и Адангом [1]; они могут быть клонированы из штаммов HD1 и HD73, полученных из коллекции культур (например. Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, Ohio, или USDA Bt stock collection, Peoria, Illinois) c использованием стандартных процедур.
ДНК, кодирующие новые, ранее не охарактеризованные Bt-токсины, могут быть клонированы из хозяйского организма Bacillus с использованием протоколов, ранее применявшихся для клонирования Bt-генов. Эти протоколы предполагают создание банка ДНК, изолированной из организма Bacillus, в подходящем плазмидном или фаговом векторе, реплицируемом в подходящем хозяине, и использование антител против Bt-белка или ДНК, изолированной из гомологичной последовательности Bt-гена, для идентификации трансформантов, несущих клонированную последовательность Bt. Приблизительное местоположение кодирующей последовательности Bt может быть первоначально определено делекционным картированием клонированной ДНК. Точное положение кодирующей последовательности Bt может быть определено с использованием различных стандартных методов, включая определение последовательности клонированного сегмента ДНК, определение наличия в этой последовательности протяженной открытой рамки считывания, которая могла бы кодировать Bt-белок, и подтверждение того, что эта последовательность ДНК действительно кодирует Bt-белок, путем сравнения аминокислотной последовательности, выведенной на основании последовательности ДНК, с последовательностью, полученной при частичном аминокислотном секвинировании Bt-белка.
Химерный Bt-ген, используемый в данном изобретении, включает 5'-последовательность ДНК, включающую, в свою очередь, последовательность ДНК, делающую возможной инициацию транскрипции (промотор) и трансляцию расположенной ниже последовательности Bt в растении кукурузы. Химерный Bt-ген включает также 3'-последовательность ДНК, включающую последовательность, происходящую из 3'-некодирующего района гена, который может экспрессироваться в кукурузе. Наиболее важно то, что химерный Bt-ген будет включать последовательность ДНК, кодирующую токсичный Вt-полипептид, продуцируемый бактериями Bacillus thuringiensis, или его сегменты, обуславливающие токсичность или имеющие с ним значительную гомологию по аминокислотной последовательности. Кодирующая последовательность Bt включает : (1) последовательности ДНК, кодирующие белки с инсектицидной активностью, имеющие значительную гомологию с Bt-эндотоксинами, активными по отношению к насекомым-вредителям кукурузы, например Bt-последовательности HD73 или HD1; (2) последовательности, кодирующие сегменты эндотоксического Bt-полипептида, имеющие инсектицидную активность, например имеющие инсектицидную активность полипептиды HD73 или HD1, укороченные с карбоксильного или аминоконца; (3) укороченную Bt-последовательность, соединенную в рамке считывания с последовательностью или последовательностями, кодирующими полипептид, обеспечивающий некоторые дополнительные преимущества, например; (а) с генами, доступными для отбора, например генами, сообщающими устойчивость к антибиотикам или гербицидам, (b) с репортерными генами, продукты которых легко выявляются или анализируются, например генами люциферазы или β-глюкуронидазы (с) с последовательностями ДНК, кодирующими последовательности полипептидов, дополнительно стабилизирующие Bt-белок против деградации или увеличивающие эффективность Bt-белка по отношению к насекомым, например ингибиторами протеазы; (D) с последовательностями, способствующими транспорту Bt-белка в специфические компартменты внутри или вне клеток кукурузы, например сигнальными последовательностями.
Для достижения оптимального синтеза Bt-белка в кукурузе может также оказаться целесообразной корректировка последовательности Bt-гена с тем, чтобы она более приближалась к последовательности генов, эффективно экспрессирующихся в кукурузе. Поскольку частота использования кодонов во многих Bt-генах, включая гены HD73 и HD1, более сходна с этой частотой у видов Bacillus и не сходна с этой частотой в генах, экспрессирующихся в кукурузе, экспрессия Bt-гена в клетках кукурузы может быть повышена путем замены редко используемых кодонов Bacillus на кодоны, наиболее часто употребляющиеся у кукурузы [35] . Такая замена кодонов потребует замены оснований без изменения аминокислотной последовательности результирующего Bt-полипептида. Bt-полипептид будет идентичен по своей последовательности продукту бактериального гена или его сегментов. Полная кодирующая Bt-последовательность или ее участки, содержащие более значительную долю кодонов часто встречающихся у кукурузы чем первоначальный бактериальный ген, могут быть синтезированы по стандартным протоколам химического синтеза и введены в Bt-ген или соединены с ним также по стандартным методикам, например с использованием сайт-специфического мутагенеза или полимеризации и лигирования ДНК и т.п.
Помимо рекомбинантных последовательностей ДНК, служащих единицами транскрипции или их участками, полезны могут быть также рекомбинантные ДНК, несущие регуляторную или структурную функцию. Кроме того, ДНК может быть использована также в качестве генетического инструмента для генерирования мутантов или идентификации, выделения или генетического маркирования участков ДНК кукурузы. Дополнительные примеры могут быть найдены в [50].
Рекомбинантные ДНК, предназначенные для внедрения в растительные клетки, обычно должны включать также селективный маркер, или репортерный ген, или то и другое, что облегчает идентификацию и отбор трансформированных клеток. В другом варианте селективный маркер может находиться на отдельном сегменте ДНК и использоваться в котрансформации. Как селективные маркеры, так и репортерные гены могут быть фланкированы подходящими регуляторными последовательностями, делающими возможной их экспрессию у растений. Полезные селективные маркеры хорошо известны в литературе и включают, например, гены устойчивости к антибиотикам и гербицидам.
Конкретные примеры селективных маркерных генов даны в [50]. Предпочтительным селективным маркерным геном является последовательность, кодирующая гигромицин-фосфотрансферазу (НРТ), которая может быть получена из E.coll и которая сообщает устойчивость к антибиотику гигромицину В. Другие селективные маркеры включают ген аминогликозид-фосфотрансферазы транспозона Tn5 (AphII), сообщающий устойчивость к антибиотикам канамицину, неомицину и G418, а также гены, обеспечивающие устойчивость или толерантность к глифосфату, 2,2- дихлоропропионовой кислоте, метатрексату, имидазолиновым гербицидам, гербицидам на основе сульфонилмочевины, бромоксинилу, фосфинотрицину и другим веществам с гербицидными свойствами. Селективные маркерные гены, обуславливающие устойчивость или толерантность к этим фитотоксическим соединениям, также придают коммерческую ценность получаемым трансформированным растениям. Селективные маркерные гены, кодирующие ферменты, сообщающие устойчивость к фитотоксическим соединениям, приведены в табл. 1.
Репортерные гены используются для идентификации потенциально трансформированных клеток и для функциональных свойств регуляторных последовательностей. Репортерные гены, кодирующие легко анализируемые маркерные белки, хорошо известны в литературе. Обычно в качестве репортерного выбирается ген, отсутствующий или не экспрессирующийся в реципиентном организме и кодирующий белок, экспрессия которого влияет на легко анализируемое свойство, например на фенотип или на ферментативную активность. Примеры таких генов представлены в [50]. Используемые гены предпочтительно включают ген хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (cat), транспозона Tn9 E.coli, ген β-глюкуронидазы (gus) локуса uidA E. coli и ген люцеферазы огневки Photinus pyralis. Экспрессия репортерного гена анализируется через нужное время после введения ДНК в реципиентные клетки. Предпочтительный вариант такого анализа предполагает использование гена β-глюкуронидазы (GUS) [26]. Трансформированные клетки кукурузы, экспрессирующие данный ген, будут окрашиваться в синий цвет при соприкосновении с субстратом 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-D-глюкоронидом (X-GLUC), добавляемым во внеклеточную среду.
Используемые в данном случае регуляторные последовательности включают специфичные для органов, тканей или стадий развития индуцибельные или конститутивные промоторы, способные экспрессироваться в клетках конкретного растения. Пригодные для данного случая промоторы описаны в [50]. Ниже приводится частичный выборочный список промоторов, пригодных для наших целей: регуляторные последовательности Т-ДНК Agrobacterium tumifaciens, включающей манопинсинтетазу, нопалинсинтетазу и октопинсинтетазу; промотор алкогольдегидрогеназы кукурузы; индуцируемые светом промоторы, например промоторы генов малой субъединицы рибулозодифосфат- карбоксилазы/оксигеназы различных видов; промоторы генов основного хлорофил а/b-связывающего белка; 35S- и 19S-промоторы вируса табачной мозаики (ВТМ); регулируемые в развитии промоторы кукурузы, например промоторы генов waxy, zein, bronze; другие природные или синтетические конститутивные или индуцибельные промоторы, в том числе проявляющие у растений орган- или стадиеспецифичную экспрессию.
В состав рекомбинантной ДНК могут входить также другие элементы: интроны, энхансеры, сигналы полиаденилирования и т.д. Эти элементы могут быть обязательны или необязательны для функционирования ДНК, но могут также повышать уровень ее экспрессии, влияя на транскрипцию, стабильность мРНК и т.д. Упомянутые элементы могут включаться в состав ДНК таким образом, чтобы обеспечить максимальную эффективность трансформирующей ДНК. Например, первый интрон гена AdhIS кукурузы в некоторой конструкции рекомбинантной ДНК может быть помещен между промотором и кодирующей последовательностью. Известно, что при включении в конструкцию ДНК этот интрон усиливает синтез белка в растительных клетках [8]. Однако достаточный уровень экспрессии селективного маркера может быть достигнут и в отсутствии интрона [29]. Другим примером подходящего интрона может служить первый интрон гена shrunken-1 Zea mays. Упомянутые дополнительные элементы должны быть совместимы с остальной конструкцией ДНК.
3. Процесс введения ДНК.
Рекомбинантная ДНК может быть введена в культуры клеток кукурузы, способных к регенерации, предпочтительно в каллусные культуры, методом обстрела частицами. Общее описание подходящего устройства для обстрела частицами приводится в [45]. Хотя протоколы для применения этого устройства для обстрела суспензионной культуры неспособных к регенерации клеток кукурузы описаны в [29, 30 и 31], опубликованных протоколов для обстрела каллусных культур или способных к регенерации клеток кукурузы не существует.
При обстреле микрочастицами, называемом также биолистическим процессом, транспорт рекомбинантной ДНК в каллус опосредуется очень маленькими частицами биологически инертного материала. Одна или несколько таких инертных частиц, покрытых ДНК и ускоренных до необходимой скорости, способны проникать в одну или более клеток, где ДНК освобождается из частиц и экспрессируется в клетке. Некоторые из реципиентных клеток стабильно сохраняют и экспрессируют введенную ДНК.
Эти микрочастицы обычно состоят из материала с высокой плотностью, например вольфрама или золота. Они покрываются нужной ДНК. Затем микрочастицы помещаются на поверхность макрочастицы, которая служит для передачи движущей силы от подходящего источника энергии на микрочастицы. После разгона макро- и микрочастиц до необходимой скорости они попадают на блокирующее устройство, препятствующее дальнейшему движению макрочастиц, но пропускающее покрытые ДНК микрочастицы и позволяющее им попадать в реципиентные каллусные клетки. Пригодные в данном случае устройства могут использовать различные движущие силы, например порох или ударные волны разряда электрической дуги [11] . В настоящее время чаще применяется устройство, использующее порох в качестве движущей силы; такое устройство описано в [45]. Протокол для использования порохового устройства предоставлен в [30 и 31] и включает два основных типа. Во-первых, вольфрамовые микрочастицы смешиваются в водном растворе с ДНК, хлоридом кальция и спермидином в указанном порядке. Предлагаются различные концентрации различных компонентов. Выбранная методика в точности повторяет методику, описанную в [31], за исключением того что концентрация ДНК, указанная в этой методике как оптимальная, удваивается. Во-вторых, покрытые ДНК микрочастицы, макрочастицы и реципиентные клетки размещаются в устройстве нужным образом, и к макрочастицам прикладывается движущая сила. Измеряемые параметры этого этапа включают расстояние от реципиентных клеток до границы рабочего объема, а также уровень вакуума в камере для образцов. Реципиентные клетки помещаются на 2 - 15 см, а предпочтительно на 5 см ниже останавливающей пластины.
Используемые здесь для получения трансгенных растений каллусные культуры обычно должны пройти примерно половину периода пересева после последнего пересева и, следовательно, должны пройти лаг-фазу, следующую за пересевом на новую среду, но не должны достигнуть стационарной фазы, наступающей со временем в случае отсутствия пересева на свежую среду. Ткань может использоваться в виде кусочков массой 30 - 80, а лучше 40 - 60 мг. Комочки могут быть помещены на чашку Петри или другую поверхность и расположены практически произвольно, но так, чтобы (1) область в центре чашки получила наибольшую концентрацию покрытых ДНК металлических частиц и расположенная в этой области ткань с наибольшей вероятностью была повреждена при обстреле и (2) число частиц, попадающих на ткань, уменьшалось при удалении от центрального участка ткани так, чтобы ткань, удаленная от центра чашки, подвергалась обстрелу с наименьшей вероятностью. Перфорированный экран, предпочтительно металлический, может быть помещен на чашку для предотвращения выбрасывания или разбрызгивания ткани. Согласно другому способу экспонирования ткани для обстрела она может быть распределена тонким слоем на фильтровальной бумаге. Ткань может обстреливаться покрытыми ДНК металлическими частицами один или более раз.
4. Процедура отбора.
После того как каллусы были обстреляны рекомбинантной ДНК и эта ДНК проникла в некоторые клетки, необходимо идентифицировать и отобрать клетки, которые несут рекомбинантную ДНК и в то же время сохранили достаточную регенерационную способность. Для достижения этого были выбраны два основных подхода. В первом случае трансформированные каллусы или регенерированные из них растения могут быть скринированы на предмет присутствия рекомбинантной ДНК различными стандартными методами, которые могут включать тесты на экспрессию репортерных генов или оценку фенотипических эффектов рекомбинантной ДНК, если таковые имеются. Во втором, предпочтительном варианте, когда селективный маркерный ген передается как часть рекомбинантной ДНК или вместе с ней, трансформированные клетки каллуса могут быть идентифицированы путем использования селективного агента для выявления экспрессии селективного маркерного гена.
Отбор предполагаемых трансформантов является критическим этапом для успешного процесса трансформации, поскольку условия отбора должны быть выбраны таким образом, чтобы сделать возможным рост и увеличение численности трансформированных клеток, одновременно подавляя рост нетрансформированных клеток. Ситуация осложняется тем, что жизнеспособность отдельных клеток в клеточной популяции часто сильно зависит от жизнеспособности соседних клеток. Кроме того, условия отбора не должны быть слишком жесткими, чтобы не подавлять регенерационную способность каллусных клеток и фертильность получаемого растения. Таким образом, необходимо оценивать влияние селективного агента на жизнеспособность и морфологию клеток. Для этого предварительно может быть построена экспериментальная кривая ингибирования роста при воздействии данного селективного агента на трансформируемую ткань. Это позволит выявить область концентраций, подавляющих рост.
При использовании селективного маркерного гена комочки каллуса могут быть после обстрела подрощены для их восстановления на неселективной среде или, в предпочтительном варианте, немедленно перенесены на среду, содержавшую селективный агент.
Процедуры отбора предполагают воздействие токсичного агента и могут включать последовательные изменения концентрации агента и многократные циклы отбора. Очевидно, что конкретные концентрации и продолжительность циклов должны варьироваться для каждого конкретного агента. Предпочитаемая в настоящее время процедура отбора включает начальный цикл селекции с относительно низкой концентрацией токсичного агента и затем последующие цикл или циклы с более высокими концентрациями. Это позволяет селективному агенту проявлять свои токсичные свойства медленно, в течение продолжительного времени. Предпочтительно начальная концентрация агента составляет примерно 5 - 40% от концентрации, при которой происходит подавление роста, определенной на основании кривой подавления роста. Это может позволить трансформированным клеткам избирательно расти и делиться, тогда как нетрансформированные клетки будут подавлены, но не до такой степени, что рост нетрансформированных клеток будет полностью остановлен. После того как немногие трансформированные клетки поделятся достаточное число раз, ткань может быть перенесена на среду, содержащую более высокую концентрацию токсичного агента, с тем чтобы убить практически все нетрансформированные клетки. Дискретное увеличение концентрации также уменьшает вероятность того, что нетрансформированные клетки адаптируются к агенту. Высшая концентрация предпочтительно должна находиться в области концентраций, подавляющих рост на 30 - 100%. Первый цикл отбора может продолжаться 1 - 4, а предпочтительно 2 нед. Продолжительность второго цикла может составлять 1 - 12, а предпочтительно 2 - 10 нед. Предположительные трансформанты кукурузы обычно могут быть определены как пролиферирующие участки ткани на фоне непролиферирующих клеток. В ходе общей процедуры отбора каллус может также некоторое время культивироваться на неселективной среде.
После того, как участок каллуса определен как предположительный трансформант, факт трансформации может быть подтвержден фенотипическим и или генотипическим анализом. При использовании селективного агента примером фенотипического анализа может быть измерение увеличения живого веса предположительного трансформанта по сравнению с контрольным при различных концентрациях селективного агента. Другие возможные варианты анализа могут быть основаны на функции рекомбинантной ДНК. Например, если ДНК кодирует фермент или белок, возможен ферментный или иммунологический анализ данного конкретного фермента или белка. Другие продукты генов могут быть проанализированы подходящими биологическими или химическими методами. Такие альтернативные методики хорошо известны в литературе и здесь не описываются. Присутствие гена может быть также подтверждено обычными методами, например Саузерн-блотом или полимеразной цепной реакцией (ПЦР) и т.п.
5. Регенерация растений и получение семян.
Клеточные линии, которые были трансформированы, как описано выше, затем должны быть регенерированы в растения, после чего должна быть определена фертильность полученных растений. Трансформированные линии, давшие положительный ответ при генотипическом и или фенотипическом анализе, помещаются затем на среду, стимулирующую дифференциацию тканей и регенерацию растений. Регенерация может быть осуществлена в соответствии с хорошо известными по литературе стандартными методами. Обычно эти методы предполагают снижение концентрации ауксина, что приостанавливает пролиферацию каллуса и стимулирует развитие соматических зародышей или другую дифференциацию тканей. Один из примеров подобного метода регенерации описан в [21]. Растения выращиваются до созревания в ростовой комнате или теплице, после чего производятся необходимые половые скрещивания, как описано в [36].
Регенерация, важная для данного изобретения, может быть осуществлена любым обычным методом. Если клетки были трансформированы с участием селективного маркера, в регенерационную среду может быть включен селективный агент для дальнейшего контроля того, что регенерирующие проростки действительно трансформированы. Поскольку методы регенерации хорошо известны и не являются определяющими для данного изобретения, любой метод, позволяющий достигнуть регенерации и получить фертильное растение, является подходящим.
6. Анализ поколения R1.
Растения, регенерированные из трансформированного каллуса, обозначаются как поколение R0 или растения R0. Растения, полученные в различных половых скрещиваниях с участием поколения R0, обозначаются как потомство R1 или поколение R1. Получаемые при проращивании семян растения также обозначаются как поколение R1.
Для подтверждения успешной передачи и наследования рекомбинантной ДНК в течение одного полового цикла поколение R1 должно быть проанализировано для выяснения присутствия трансформирующей ДНК. Этот анализ может быть произведен любым методом, описанным выше для анализа обстрелянного каллуса с целью подтверждения трансформации, с учетом того факта, что вместо каллуса используются растения или части растений.
Рекомбинантная ДНК может проявлять различные картины наследования в различных трансформированных линиях. Например, рекомбинантная ДНК может наследоваться потомством в соответствии с правилами менделевской наследственности. Такой тип наследования означает передачу ДНК через мужские и женские гаметы и связан со стабильной интеграцией или встраиванием в ядерную ДНК кукурузы. Другим типом наследования является материнское наследование, при котором рекомбинантная ДНК передается преимущественно или исключительно через женские гаметы. Картина наследования у конкретного трансформанта может быть уточнена анализом потомства от различных половых скрещиваний.
7. Введение рекомбинантной ДНК в другие разновидности кукурузы.
Фертильные трансгенные растения затем могут быть использованы в обычных программах разведения кукурузы с целью введения внедренной рекомбинантной ДНК в нужные линии или сорта. Методы конвергентного улучшения кукурузы и соответствующие ссылки приводятся в [24]. В число подходов, используемых обычными программами разведения, входит процесс конверсии (возвратного скрещивания). Вкратце, конверсия осуществляется путем скрещивания начального трансгенного фертильного растения с элитными инбредными линиями. В потомстве от этого скрещивания будет происходить расщепление, так что некоторые растения будут нести рекомбинантную ДНК, тогда как другие не будут. Растения, несущие эту ДНК, снова скрещиваются затем с элитными инбредными линиями, и в потомстве вновь происходит расщепление. Этот процесс возвратного скрещивания происходит до тех пор, пока первоначальная инбредная элитная линия не превратится в линию, несущую рекомбинантную ДНК, но в то же время сохраняющую все существенные признаки, изначально присущие родителю. Обычно это требует примерно 6 - 8 поколений. Для каждой элитной линии, которую необходимо превратить в генетически перестроенную элитную линию, обычно используется отдельная программа возвратного скрещивания. Как правило, коммерческая ценность созданной таким образом трансформированной кукурузы будет максимальна, если рекомбинантная ДНК будет встроена в большое число различных гибридных комбинаций. Чаще всего фермер выращивает несколько гибридов, основываясь на различиях в сроках созревания, устойчивости или других агрономических свойствах. Кроме того, при выборе гибрида фермер должен исходить из географического положения своей фермы, поскольку гибрид, адаптированный для одного региона, обычно инадаптивен для другого из-за различий по таким свойствам, как сроки созревания, устойчивость к насекомым и болезням. Поэтому необходимо встраивать рекомбинантную ДНК в большое число родительских линий, чтобы можно было получить большое число гибридных комбинаций, содержащих требуемую гетерологическую ДНК.
Методы разведения кукурузы и методы, необходимые для переноса генов из одной линии или сорта в другую линию или сорт, хорошо известны специалистам. Таким образом, эти методы могут быть использованы для введения рекомбинантной ДНК в любую другую линию или сорт.
8. Применение трансгенных растений.
Ожидается, что полученные описанным способом трансгенные растения окажутся полезными для различных коммерческих и исследовательских целей. Могут быть созданы трансгенные растения для традиционного сельского хозяйства, обладающие свойствами, полезными для производителя зерна (например, такими агрономическими свойствами, как устойчивость к гербицидам, вредителям или повышенная урожайность), а также свойствами, полезными для потребителя зерна, полученного из этих растений (например, повышенное содержание питательных веществ в человеческой пище или корме для животных), или для пищевой промышленности (например, свойствами, облегчающими обработку). В таких случаях растения обычно выращиваются с целью использования их зерна в пище для человека или животных. Однако другие части растений, включая стебли, шелуху, вегетативные части и т.д., могут найти применение, например, как часть силоса для животных или как материал для облицовки. Часто химические составляющие кукурузы и других сельскохозяйственных культур (например, масла или крахмалы) извлекаются из растений для пищевых или промышленных целей; поэтому могут быть созданы трансгенные растения с увеличенным или измененным содержанием таких компонентов.
Трансгенные растения могут также найти применение в коммерческом производстве белков или других молекул, где нужная молекула извлекается или очищается из частей растений, семян и т.п. Возможно также культивирование, выращивание in vitro или ферментация полученных из растений клеток или тканей с целью получения таких молекул.
Трансгенные растения также могут быть использованы в коммерческих селекционных программах или скрещены с растениями родственных сельскохозяйственных культур. Полезные свойства, кодируемые рекомбинантной ДНК, могут передаваться, например, от клеток кукурузы клеткам других видов, например путем слияния протопластов.
Трансгенные растения могут иметь многочисленные применения в исследованиях и селекции, включая создание новых мутантных растений путем инсерционного мутагенеза с целью определения благоприятных мутантов, которые впоследствии могут создаваться путем традиционного мутагенеза и отбора. Примером может служить введение рекомбинантной последовательности ДНК, кодирующей мобильный элемент, который может быть использован для генерации генетической изменчивости. Методы данного изобретения могут также использоваться для создания растений, имеющих уникальные опознавательные последовательности, которые могут использоваться для идентификации принадлежности линий или сортов.
Изобретение иллюстрируется (но не ограничивается) нижеследующими примерами. Эти примеры даны в целях лучшего пояснения общих методик, использованных для получения фертильных растений Zea mays, предложенных согласно данному изобретению, которые стабильно экспрессируют рекомбинантную ДНК и передают ее потомству. Все части и процентные отношения считаются по массе, если не оговорено иначе. Необходимо учитывать, что вероятность происходящего конкретного события трансформации зависит от количества материала, подвергнутого процессу трансформации. Поэтому при возникновении ситуаций, в которых описанные здесь процедуры не дают трансформантов, потребуется повторение этих процедур.
Пример 1. Фертильные трансгенные растения Zea mays из каллусной линии AB11
1. Основание и поддержание культур клеток кукурузы, сохраняющих способность к регенерации растений. Были основаны рыхлые эмбриогенные каллусные культуры кукурузы из незрелых зародышей, полученных при опылении растений инбредной линии Al 88 (University of Minnesota, Crop Improvement Association) пыльцой растений инбредной линии В73 (Iowa State University). Початки были собраны по достижении зародышами длины 1,5 - 2 мм. Поверхность каждого початка была стерилизована разбавленным наполовину (по объему) промышленным отбеливателем (2,63%-ным (по массе к объему) гипохлоритом натрия), в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем початки были промыты стерильной дистиллированной деионизированной водой. Незрелые зародыши были изолированы в стерильных условиях и помещены в питательную среду для основания и поддержания культур так, чтобы стеблекорневая ось оказалась в среде. Среда для основания и поддержания культур (в дальнейшем обозначаемая как среда F) состояла из минимальной среды N6 [9] с добавлением 2% (масса к объему) сахарозы, 1,5 мг/л 2,4- дихлорфеноксиуксуоной кислоты (2,4-Д), 6 мМ пролина и 0,25% гельрита (Kelco, Inc., San Diego). Перед автоклавированием величина pH была доведена до 5,8. Все манипуляции с культурами ткани производились в стерильных условиях, если не оговорено иначе.
Незрелые зародыши инкубировались при 26oC в темноте. Пролиферация клеток скутеллюма незрелых зародышей оценивалась на рыхлость и на наличие сформированных соматических зародышей. Ткань с такой морфологией переносилась на свежую среду через 10 - 14 дн после первоначального высевания незрелых зародышей. Затем ткань пассировалась стандартными методами каждые 14 - 21 дн. Из кусочков ткани, достигших приблизительно 1 г, отбиралось и переносилось на свежую среду 60 - 70 мг ткани. При пассировании всегда производилось тщательное визуальное наблюдение за тем, чтобы поддерживалась только ткань с правильной морфологией. Наличие соматических зародышей гарантировало, что в подходящих условиях культуры произведут растения. Примером такой культуры была использованная в Данном примере культура клеток, названная AB11, основанная за один год до обстрела.
2. Плазмиды. Плазмида pHYGI1 была создана на основе вектора pBS+ (Stratagene, Inc., San Diego, CA), представляющего собой кольцевую плазмиду размером 3,2 kb), с использованием стандартных методов работы с рекомбинантной ДНК. Фермент Bc1-BamHI размером 553 пары оснований (п.н.), содержащий первый интрон гена Adh-1 кукурузы [8], был вставлен между 35S-промотором ВТМ и гигромицин-кодирующей последовательностью pCHN1-I, представляющей собой плазмиду, сконструированную в соответствии с примером 5. Карта pHYGI1 приведена на фиг. 1. В соответствии с Будапештским договором образец pHYGI1 был депонирован 16.03.90 под номером 40744 в American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA. Плазмида рВII221 содержит последовательность, кодирующую β-глюкуронидазу E. coli, фланкированную с 5'-конца 35S-промотором ВТМ и с 3'-конца - сигналом полиаденилирования гена nos. Плазмида была сконструирована путем встраивания первого интрона гена Adh-1 кукурузы между 35S-промотором и кодирующей последовательностью рВII221 [Л26]. Карта рВII221 приведена на фиг. 2.
Плазмида была введена в эмбриогенную каллусную культуру AB11 методом обстрела микрочастицами.
3. Процесс введения ДНК. Линия эмбриогенного каллуса кукурузы AB11 была субкультивирована в течение 7 - 12 дн перед обстрелом микрочастицами. Пять комочков каллуса приблизительно по 50 мг живого веса каждый были крестообразно расположены в центре стерильной чашки Петри размером 60/15 мм (Falkon 1007). Чашки хранились в закрытой емкости с мокрыми бумажными полотенцами в течение всего процесса обстрела. Всего было приготовлено 12 чашек.
Вольфрамовые частицы N-10 (Biolistics) были покрыты плазмидой в точном соответствии с [31], за исключением того что (1) было использовано количество ДНК, вдвое большее рекомендованного, (2) осаждение ДНК на частицы производилось при 0oC и (3) пробирки с покрытыми ДНК вольфрамовыми частицами держались на льду в течение всего процесса обстрела.
Все пробирки содержали по 25 мкл взвеси, 50 мг/л вольфрама M-10 в воде, 25 мкл 2,5 M CaCl, 10 мкл 100 mM спермидина, а также 5 мкл раствора 1 мг/мл плазмидной ДНК. Одна пробирка содержала только плазмиду рВ11221, и одна пробирка содержала буфер ТЕ (табл. 2).
Все пробирки инкубировались на льду в течение 10 мин, частицы осаждались центрифугированием в центрифуге Eppendorf в течение 5 с при комнатной температуре, и удалялось 25 мкл супернатанта. В течение всего процесса обстрела пробирки держались на льду. Каждая порция использовалась не более чем для пяти обстрелов.
Использовались макрочастицы и останавливающие пластины фирмы Biolistics, lnc. (Ithaca, NY). Они были стерилизованы в соответствии с указаниями фирмы. В качестве устройства для обстрела микрочастицами использовалось также устройство фирмы Biolistics.
Поддон с образцами помещался на 5 см ниже дна останавливающей пластины устройства обстрела микрочастицами так, чтобы останавливающая пластина находилась в ближнем к полости прибора пазу. Приготовленные описанным выше способом чашки с тканью каллуса помещались в центре поддона для образцов, после чего крышки чашек удалялись. Поверх открытой чашки для удержания ткани во время обстрела помещалась квадратная жесткая проволочная сетка размером 7х7 см с ячейкой 3х3 мм, изготовленная из стали с гальваническим покрытием. ДНК/вольфрамовые образцы обрабатывались в соответствии с указаниями фирмы Biolistics, Inc. , и 2,5 мкл суспензии наносились пипеткой на верхушку макрочастицы для каждого обстрела. Устройство эксплуатировалось в соответствии с указаниями изготовителя. Информация о произведенных обстрелах дана в табл. 2.
Каждая из двух чашек каллуса, обстрелянного рВII221, была перенесена на чашку среды F (без гигромицина), и каллус культивировался при 26oC в темноте. Через два дня каллус из каждой чашки полностью переносился на чашку Петри размером 35х10мм (Falcon 1008), содержащую 2 мл буфера для анализа GUS (1 мг/мл 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-D-глюкуронида) (Researsch Organis), 100мМ фосфата натрия (pH 7,0), по 5 мМ феррицианида калия и ферроцианида калия, 10 мМ ЭДТА и 0,6% тритона Х-100. Чашки инкубировались при 37oC в течение трех дней, после чего было подсчитано число синих клеток, оказавшееся равным в общей сложности 313 клеткам, экспрессирующим GUS, на обеих чашках, при 355 клетках с промежуточной окраской; это показывало, что процесс введения ДНК успешно произошел также на других обстрелянных чашках. Чашки, использованные при анализе на GUS, были после подсчета выброшены, поскольку анализ на GUS убивает клетки.
4. Процесс отбора. До заполнения чашек Петри в среду добавлялся гигромицин В (Calbiochem) путем вливания необходимого объема стерилизованного фильтрованием водного раствора гигромицина В (100 мг/мл) после охлаждения среды до 45oC. Сразу после обстрела всех образцов каллус из каждой чашки, обработанной pHYGI1/pBII221, и из каждой из двух чашек, обработанных буфером ТЕ, переносился на отдельную чашку со средой F, содержащей 15 мг/л гигромицина В (10 кусочков каллуса на чашку). В дальнейшем эти чашки называются чашками первого цикла селекции. Каллус из чашек, обработанных ТЕ, переносился на среду F без гигромицина. Эта ткань затем пассировалась каждые 2 - 3 нед на неселективной среде и в дальнейшем называется неселектируемым контрольным каллусом.
После 14 дн отбора ткань выглядела приблизительно одинаково на селективной и неселективной среде. Каллус из семи чашек, обработанных pHYGI1/pBII221, и одной чашки, обработанной ТЕ, переносился с чашек первого цикла селекции на чашки второго цикла селекции, содержавшие 60 мг/л гигромицина. На каждую чашку второго цикла селекции помещалось 10 кусочков каллуса по 30 мг каждый, что приводило к увеличению общего числа чашек.
После 21 дн второго цикла селекции весь материал был перенесен на чашки третьего цикла, среда в которых содержала 60 мг/л гигромицина. Через 79 дн после обстрела было проверено наличие живых участков каллуса на чашках третьего цикла селекции. Один из таких секторов, пролиферирующий на фоне некротической ткани, был обнаружен на чашке с каллусом, обработанным pHYGI1/pBII221. Этот сектор был обозначен как РНЗ и перенесен на среду F без гигромицина.
Через 19 дн роста на среде F без гигромицина каллус РНЗ был перенесен на среду F, содержащую 60 мг/л гигромицина. Каллус РНЗ оказался способным поддерживать свой рост при многократном пассировании в присутствии 60 мг/л гигромицина.
5. Подтверждение трансформации каллуса. Для подтверждения того, что каллус РНЗ действительно приобрел ген устойчивости к гигромицину, была выделена и проанализирована при помощи Саузерн-блоттинга геномная ДНК каллуса РНЗ и неселектируемого контрольного каллуса в соответствии с примером 5. Выделенная ДНК (10 мкг) расщеплялась рестриктазой BamHI(NEB) и разделялась при помощи электрофореза в агарозном геле (0,8%) в течение 16 ч при напряжении 15 В в буфере ТАЕ (40 мМ Трис-ацетата (pH 7,6), 1 мМ ЭДТА). ДНК переносилась на фильтр Nytran (Schleicher and Schuell). Условия переноса, гибридизации и отмывки выбирались в соответствии с рекомендациями изготовителя.
Меченные изотопом 32P зонды были получены путем мечения со случайными праймерами с использованием стандартного набора реактивов для олигонуклеотидного мечения фирмы Pharmacia в соответствии с рекомендациями поставщика. Для мечения был использован нуклеотид α-32P-dCTP (ICN Radiochemicals). В качестве ДНК-матрицы использовался BamHI-фрагмент плазмиды pHYGI1 размером 1055 bp, содержавший полную кодирующую последовательность НРТ.
Фильтры фотографировались на пленку Kodak Х-ОМАТ AR в кассете X-OMATIC с использованием усиливающих экранов. В ДНК каллуса РНЗ в ожидаемой области 1,05 была отмечена полоса, показывающая наличие кодирующей последовательности НРТ. В ДНК контрольного каллуса полос отмечено не было.
Для демонстрации того, что гигромициновый ген встроен в ДНК с большой молекулярной массой, нерасщепленная ДНК из каллуса РНЗ и контрольного каллуса была разделена электрофорезом, перенесена на блот и проанализирована гибридизацией, как описано выше. Нерасщепленная ДНК РНЗ гибридизировалась с зондом только в зоне, соответствующей по своей подвижности нерезаной ДНК. ДНК контрольного каллуса не гибридизовалась c зондом. Эти результаты показывают, что кодирующая последовательность НРТ не присутствует в каллусе РНЗ в качестве интактной плазмиды pHYGI1 или небольшой внехромосомной плазмиды. Эти результаты подтверждают также встраивание гигромицинового гена в ДНК с большой молекулярной массой.
Регенерация растений и получение семян. Порции каллуса РНЗ переносились непосредственно с чашек, содержащих 60 мг/л гигромицина на среду RM5, состоящую из минимальной солевой среды MS [34] с добавлением 0,5 мг/л тиамин•HCl, 0,75 мг/л 2,4-Д, 50 г/л сахарозы, 150 мг/л аспарагина и 2,5 г/л гельрита (Kelco Inc., San Diego).
Через 14 дн культивирования на среде RM5 большинство каллусов РНЗ и неселектируемых контрольных каллусов переносилась на среду R5 (среда RM5 без 2,4-Д). Чашки поддерживались в темноте в течение 7 дн при 26oC и затем выдерживались в режиме с 14 ч светлого времени и 10 ч темного в течение 14 дн при 26oC. После этого сформировавшиеся проростки переносились в банки объемом в одну кварту (Ball), содержащие по 100 мл среды R5. Растения затем переносились из баночек на вермикулит на 7 - 8 дн перед последующим пересаживанием в почву и выращиванием до созревания. В общей сложности было получено 45 растений из каллуса РНЗ и 10 растений из контрольного каллуса.
Контролируемое опыление зрелых растений РНЗ производилось по стандартным методикам с участием инбредных линий Zea mays MBS501 (Mike Brayton Seeds), FR4326 (Illinois Foudation Research) и являющейся нашей собственностью инбредной линии LM1112. Семена собирались через 45 дн после опыления и затем подсушивались в течение 1 - 2 нед.
7. Анализ потомства R1. Растения RI анализировались на присутствие последовательностей генов НРТ и GUS методом ПЦР. Экспрессия гена НТР определялась при помощи ферментного анализа активности НТР. Данные сведены в табл. 3. Эти данные подтверждают передачу и экспрессию рекомбинантной ДНК через мужских и женских родителей в соответствии с менделевскими принципами наследственности. Данные Саузерн-блота, свидетельствующие об интеграции последовательности, кодирующей НРТ, в ДНК с большой молекулярной массой в исходном каллусе, в сочетании с картиной наследования, показывает, что изучаемые последовательности ДНК интегрированы в хромосомы. Присутствие последовательностей гена GUS в потомстве R1 свидетельствует о котрасформации и о наследовании неселектируемого гена.
Ферментный анализ НРТ был основан на методах, описанных в [12, 47 и 7].
Образцы корешков (по 0,2 г) срезались с 7 - 10-дневных проростков и быстро замораживались в жидком азоте. Образцы покрывались алюминием и 400 мкл ЕВ (50 мМ Трис-HCI, 10% (по объему) глицерина, 0,1 мМ ФМСФ, (pH 7,0) в течение 30 - 60 с с использованием пестика и пробирки (Kontes), затем центрифугировались в микроцентрифуге Eppendorf в течение 40 мин. Супернатант переносился в фильтровальную ячейку Centricon 30 и обессоливался центрифугованием в роторе с фиксированным углом в центрифуге Beckman GPR при 5000 об/мин в течение 30 мин при 4oC. Каждая фильтровальная ячейка промывалась 1 мл ЕВ и затем центрифугировалась 60 мин при 5000 об/мин. Центрифугат затем извлекался и хранился при -70oC. Образцы трансгенного и неселектируемого контрольного каллуса обрабатывались описанным выше образом, и супернатанты использовались в качестве позитивного и негативного контролей.
Содержание белка было определено по методу, описанному в [6], с использованием стандартного набора фирмы BioRad. Концентрации белка в экстрактах корней изменились от 0,2 до 2,0 мкг/мкл.
К реакционной смеси, содержащей 20 мМ Трио-малеата, 13 мМ MgCl, 120 мM NH4Cl, 0,5 мМ ДТТ, 50 мкМ АТФ, 0,61 мкг/мкл гигромицина В, 25 мкг/мкл бычьего сывороточного альбумина и 12 μ Ci γ 32Р-АТФ, добавлялся экстракт корней (с общим содержанием белка 4 мкг). Реакционный объем составлял 33 мкл. Реакционная смесь инкубировалась в течение 30 мин при 37oC.
1 мкл реакционной смеси наносился на полиэтилениминцеллюлозный носитель для тонкослойной хроматографии (Sigma Chem. Co.). Пластины носителя элюировались муравьиной кислотой (50 мМ, pH 5,4), высушивались на воздухе и фотографировались на пленку XAR-5. Продукт реакции, фосфат гигромицина, в описанных условиях мигрировал близко к фронту растворителя.
Для проведения ПЦР из растительных тканей были выделены и заморожены в жидком азоте образцы ткани по 0,1 г. Затем эти образцы смешивались с шариками карборунда в растворе, содержавшем 200 мкл 0,1 M Трис-HCl, 0,1 M NaCl, 20 мМ ЭДТА, и 1% саркозила (pH 8,5), при 4oC. После экстракции фенолом и хлороформом и осаждения ДНК этанолом и изопропанолом образцы ДНК ресуспендировались в буфере ТЕ и анализировались при помощи полимеразной цепной реакции [56].
ПЦР проводилась в 100 мкл раствора, содержащего 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4), 3 мМ MgCl, 100 мкг мл желатина, 0,25 мкМ каждого из соответствующих праймеров 0,2 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), 2,5 единицы Taq-полимеразы (Cetus) и 10 мкл раствора ДНК. На реакционную смесь наслаивалось парафиновое масло, затем смесь прогревалась 3 мин при 94oC, после чего проводилось 35 циклов амплификации, включая 1 мин при 55oC, 1 мин при 72oC и 1 мин при 94oC. Затем смесь инкубировалась 2 мин при 50oC и 5 мин при 72oC. 10 мкл раствора, содержавшего продукты ПЦР, были подвергнуты электрофорезу в агарозном геле и ДНК визуализировалась добавлением бромистого этидия.
Для анализа присутствия гена НРТ использовались два праймера: один комплементарный 35S-промотору и один комплементарный кодирующей последовательности НРТ. Для получения продуктов ПЦР подходящих размеров ДНК-матрица НРТ должна была содержать непрерывный район 35S- промотора, интрон Adh1 и белок-кодирующую последовательность с 5'- конца.
Для анализа присутствия гена GUS использовались ПЦР-праймеры, комплементарные последовательностям в пределах белок-кодирующего участка гена GUS. Если матрица ДНК содержит ненарушенный кодирующий участок между двумя праймерами, то предположительно должен получаться продукт ПЦР размером 797 пар оснований.
Пример 2. Фертильные трансгенные растения из линии каллуса 63S, содержащие рекомбинантную ДНК, кодирующую запасной блок семян
Запасной белок zein размером 10 кДа продуцируется в эндосперме зерновок кукурузы и является представителем класса белков, обозначаемых как "запасные белки семян". Этот белок содержит исключительно большое количество метионина (22,5%) и кодируется геном Zps10/(22) [4]; этот ген ниже обозначается как z10. Таким образом, повышенная экспрессия гена z10 может быть использована для увеличения содержания метионина в кукурузе. Получение фертильной трансгенной кукурузы, не сущей химерный ген z10, было достигнуто методами, описанными в примере 1, с некоторыми незначительными модификациями. В примере 2 также демонстрируется введение рекомбинантной ДНК с использованием линии каллуса, отличной от линии, использованной в примере 1.
1. Линии и культуры ткани. Линия эмбриогенного каллуса кукурузы, названная AB63S, использованная в данном примере, была получена из незрелых зародышей, полученных от скрещивания элитных инбредных линий A188 и В73 с использованием методов основания и поддержания, описанных в примере 1. Линия каллуса была основана примерно за 7 мес до обстрела. За 11 нед до обстрела ткань была просеяна под давлением через сеть с ячейками 1,3 мм и высеяна на среду для поддержания N6. Из полученной ткани через 1 - 2 нед роста был отобран рыхлый эмбрионный каллус, который затем был перенесен на свежую среду и подрощен в течение 1,5 - 3 нед перед повторным просеиванием. Этот цикл просеивания и восстановления рыхлого каллуса был повторен 3 раза перед обстрелом ткани.
2. Плазмиды. В данном примере были использованы описанные в примере 1 плазмиды pHYGI1 и рВII221. Кроме того, в ДНК/вольфрамовые образцы добавлялась плазмида pZ27Z10. Плазмида pZ27Z10 была сконструирована на основе вектора pUC118 [49], представляющего собой кольцевую плазмиду длиной 3,2 kb с использованием стандартных методов работы с рекомбинантными ДНК. Плазмида pZ27Z10 содержит 5'-область регуляции транскрипции гена 27кДа-zein кукурузы [18], обозначаемого здесь как Z27, помещенную непосредственно рядом с кодирующей последовательностью и 3'-некодирующей последовательностью гена 10кДа-zein кукурузы [37], обозначаемого здесь как Z10. Комбинация регуляторной последовательности Z27 с кодирующей и 3'- последовательностями Z10 обозначается здесь как химерный ген Z27-Z10. С 3'-конца последовательностей гена Z10 в плазмиде pZ27Z10 располагается сигнал полиаденилирования из района генома ВТМ, прилежащего к 35S-промотору. Карта этой плазмиды представлена на фиг. 7.
Образец плазмиды pZ27Z10 депонирован в American Type Culture Collection, Rockville, MD, в соответствии c Будапештским договором под номером АТСС 40938.
3. Процесс введения ДНК. Ткань линии эмбриогенного каллуса кукурузы AB63S субкультивировалась в течение трех недель обстрелом микрочастицами. Ткань была подготовлена для обстрела путем просеивания через сито с размером ячейки 1,9 мм. Просеянная ткань высаживалась на стерильные круглые фильтры Whatman No. l диаметром 5,5 см в виде тонкого газона (примерно 500 мг ткани на фильтр). Всего было приготовлено 6 фильтров с тканью. Перед обстрелом микрочастицами фильтры с тканью переносились в пустые чашки Петри. Ткань слегка высушивалась в открытых чашках в ламинарном потоке в течение 20 мин. Для предотвращения дальнейшего высыхания ткани чашки хранились в резервуаре с высокой влажностью до самого обстрела.
Использованная для обстрела ДНК состояла из плазмид pHYGI1 pZ27Z10 и pBII221 в соотношении 1:1:1 (по массе). Осаждение ДНК на вольфрамовых частицах производилось, как описано в примере 1.
Обстрел производился, как описано выше в примере 1, за исключением того что использовался прибор Biolistic PDS 1000 (DuPont) и над тканью не помещалось никакой сетки. Шесть фильтров с каллусной тканью были обработаны следующим образом: два фильтра были обстреляны ДНК/вольфрамовыми образцами по два раза каждый (потенциальная позитивная обработка 2Х); три фильтра были обстреляны по одному разу (потенциальная позитивная обработка IX) теми же ДНК/вольфрамовыми образцами; и один фильтр был обстрелян водно-вольфрамовой суспензией с тем же количеством вольфрама (по массе), что и в ДНК/вольфрамовых обработках (негативный контроль).
4. Отбор трансформированного каллуса. После обстрела фильтры с каллусной тканью из обработки 2X были перенесены на чашки первого цикла отбора, а именно на среду F, содержащую 15мг/мл гигромицина. Два фильтра из обработки 1X и фильтр из негативного контроля также были перенесены на среду первого цикла отбора. Третий фильтр обработки 1X был перенесен на среду F без гигромицина для использования в качестве неселектируемого контроля. Поскольку этот неселектируемый контрольный каллус был потенциально позитивным, он единственный поддерживался в течение первых двух циклов отбора в целях сравнения; впоследствии в качестве неселектируемого контрольного каллуса использовался необстрелянный каллус AB63S, поддерживаемый на среде F без гигромицина.
Через 5 дн каллус был перенесен в виде маленьких комочков (приблизительно по 25 мг) с фильтров на свежую среду первого цикла отбора. Плотность посева составляла 10 комочков на чашку. К этому времени масса каллуса увеличилась приблизительно в два раза. Неселектируемый контрольный каллус был перенесен сходным образом на среду F без гигромицина. На девятнадцатый день после обстрела все образцы ткани были перенесены со среды первого цикла отбора на среду второго цикла отбора (на среду F, содержащую 60 мг/л гигромицина). Плотность посева составляла при этом переносе 14 комочков каллуса на чашку. За 14 дн после предыдущего пересева объем каллуса увеличился примерно втрое. Через 23 дн все каллусы были перенесены со среды второго цикла отбора на среду третьего цикла отбора, содержащую 60 мг/л гигромицина.
Через 59 дн после обстрела среди отмирающих комочков каллуса было обнаружено пять живых пролиферирующих участков. Предполагается, что эти пять участков происходили из единственного комочка каллуса, прошедшего второй цикл отбора, поскольку они находились близко один к другому на последовательных чашках с предыдущего посева. Эти участки происходили из обработки 2Х и были обозначены как линия каллуса Met1.
Линия каллуса Met1 была перенесена на среду F, содержащую 60 мг/л гигромицина, и на среду F без гигромицина. После 22 дн инкубации отсутствовали видимые различия в росте и внешнем виде ткани на этих двух типах среды. Линия каллуса Met1 росла быстро и, очевидно, не ингибировалась присутствием гигромицина в среде. Каллус Met1 оказался очень рыхлым и эмбриогенным на обеих средах и был визуально неотличим от контрольного каллуса AB63S, выращиваемого на среде F без гигромицина.
5. Подтверждение трансформации каллуса. Было изучено ингибирование каллуса Met1 и контрольного каллуса AB63S. До начала изучения ингибирования каллус Met1 подращивался на среде F без гигромицина в течение 21 дн. Каллус Met1 и контрольный каллус AB63S переносились на чашки со средой F, содержавшей 0, 15, 60, 100 и 200 мг/л гигромицина. Для каждой концентрации гигромицина было приготовлено по 3 чашки с каждой линией каллуса; на каждую чашку помещалось по 5 - 6 кусочков каллуса приблизительно по 50 мг (в общей сложности на каждую чашку приходилось по 300 мг каллуса).
Через 28 дн инкубации была измерена масса каллуса на каждой чашке. Степень ингибирования роста (в %) определялась путем деления средней массы каллуса, полученного при каждой концентрации гигромицина. Результаты показали, что рост каллуса Met1 абсолютно не ингибировался при концентрации гигромицина 15, 60 и 100 мг л. На среде, содержащей 200 мг/л гигромицина, рост каллуса Met1 был подавлен примерно на 20%. В отличие от этого, рост каллуса AB63S был подавлен при любой концентрации гигромицина; при концентрации гигромицина 200 мг/л рост каллуса AB63S подавлялся на 90%. Эти результаты подтверждали, что линия каллуса Met1 проявляла устойчивость к гигромицину в ростовой среде.
Для доказательства присутствия в ДНК каллуса Met1 гена устойчивости к гигромицину и для установления того, приобрел ли этот каллус также химерный ген Z27-Z10, был проведен Саузерен-блоттинг. Для обнаружения последовательности, кодирующей НРТ, образцы ДНК, выделенные из каллуса Met1 и из контрольного каллуса, расщеплялись рестриктазами BamHI, HindIII и BstEII. Образцы расщепленной ДНК разделялись элекрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле и переносились на фильтр Nytran, как описано в примере 1. Проведенный перед блоттингом визуальный анализ геля, окрашенного бромистым этидием, показал, что рестриктаза BamHI полностью расщепляла ДНК, тогда как ни HindIII, ни BstEII не расщепляли ДНК в значительной степени. Блоты гибридизировались с BamHI-фрагментами кодирующей последовательности НРТ размером 1,05 Kb, меченными биотином. Условия гибридизации, отмывки и проявления соответствовали указанным в наборе реактивов BRL Photone, использованном в этом эксперименте.
После гибридизации на дорожках, содержащих ДНК Met1, расцепленную BamHI, были обнаружены меченые полосы в ожидаемой области 1,05 kb, а также в областях приблизительно 2,7, 4,5 и 6,5 kb. Эти результаты показали, что в ДНК из линии каллуса Met1 присутствовала последовательность, кодирующая НРТ. Дополнительные полосы в областях 2,7, 4,5 и 6,5 kb показывали, что или ферментативное расщепление было неполным, или в ДНК присутствовали множественные перестроенные копии последовательности НРТ. При неполном расщеплении рестриктазами HindIII и BstEII на обеих дорожках были видны сигналы гибридизации в области, соответствующей нерасщепленной ДНК. Этот результат показывал, что последовательность, кодирующая НРТ, в геноме Met1 была интегрирована в ДНК с большой молекулярной массой. На дорожках, содержащих расщепленную ДНК из контрольного каллуса, сигналы гибридизации отсутствовали.
Образцы ДНК, выделенные из каллуса Met1 и из контрольного каллуса, были проанализированы Саузерн-блоттингом для обнаружения химерного гена Z27-Z10. Образцы ДНК расщеплялись рестриктазами BamHI и EcoRI. При расщеплении BamHI высвобождался фрагмент размером 2,76 кb, содержащий кодирующую последовательность Z10 и 3'-некодирующую последовательность конструкции pZ27Z10, использованной в данной трансформации. Плазмида pZ27Z10 размером 7,26 Kb содержит уникальный сайт EcoRI. Приготовленный блот гибридизовался с меченным биотином зондом, содержащим полную кодирующую последовательность Z10, в условиях, описанных в наборе реактивов Photogene.
При расщеплении ДНК BamHI эндогенные последовательности Z10 давали сигналы гибридизации в областях 9 kb и около 15 kb как на дорожках, содержащих ДНК Met1, так и на дорожках с ДНК контрольного каллуса. В образце ДНК Met1, но не в ДНК контрольных образцов была отмечена также дополнительная полоса в области приблизительно 3,5 kb. В ожидаемой области 2,76 kb ДНК Met1 отсутствовали сильные сигналы гибридизации. Отсутствие маркированной полосы 2,7 kb при расщеплении ДНК Met1 BamHI свидетельствовало или о неполном расщеплении ДНК, или о перестройке введенной ДНК.
При расщеплении ДНК Met1 и ДНК контрольного каллуса рестриктазой EcoRI эндогенные последовательности Z10 в обоих случаях давали гибридизационные сигналы в областях приблизительно 12 и 16 kb. В образце ДНК Met1, но не в контрольном образце, была отмечена дополнительная полоса в области приблизительно 14 kb. Эти результаты показывали, что в ДНК каллуса Met1 присутствовали новые последовательности Z10, отсутствовавшие в образцах ДНК контрольного каллуса.
Эти результаты были подтверждены другим Саузерн-блоттингом, для которого ДНК Met1 и контрольного каллуса была расщеплена рестриктазами BamHI, NcoI и Nsil. Были проанализированы также образцы нерасщепленной ДНК Met1 и контрольного каллуса. Фильтр гибридизовался с зондом, содержавшим кодирующую последовательность Z10 и меченным 32Р. При всех вариантах расщепления в ДНК каллуса Met1 были отмечены новые сигналы гибридизации Z10, отсутствовавшие в образцах ДНК из каллуса негативного контроля. Эти результаты подтверждали присутствие новых кодирующих последовательностей Z10 в каллусе Met1. На дорожках с нерасщепленной ДНК, как каллуса Met1, так и контрольного каллуса, были отмечены сигналы гибридизации в области нерасщепленной ДНК. Эти результаты показали, что введенные последовательности Z10 были интегрированы в хромосомную ДНК каллуса Met1.
6. Регенерация растений и получение трансгенных семян. Каллус линии Met1 и контрольной линии AB63S был помещен на среду RM5, как описано в примере 1. Через 14 дн инкубации при 26oC в темноте каллус был перенесен на среду R5, описанную в примере 1. Каллус инкубировался в течение 7 дн при 26oC в темноте и затем был перенесен в световой режим, описанный в примере 1. Через 14 дн на свету проростки были пронесены в коробки Magenta (Sigma Chemical Co.), содержащие по 10 мл среды R5. Через 7 - 14 дн нахождения в этой среде проростки были перенесены на вермикулит на 7 дн и затем в почву, где выращивались до созревания. Всего из каллуса Met1 было регенерировано 49 растений (обозначенных как Met1.1 - Met1.49), а из контрольного каллуса AB63S было регенерировано в общей сложности 25 растений.
Для подтверждения того, что растения, регенерированные из каллуса Met1, сохранили введенную ДНК, был проведен ПЦР-анализ образцов ДНК, выделенных из листовой ткани. Для этой цели было использовано шесть олигодезоксирибонуклеотидных праймеров. Последовательности этих олигонуклеотидов, их ориентация и относительное положение в химерной конструкции гена Z27-Z10 приведены на фиг. 8 и в табл. 4.
Набор олигонуклеотидов (праймеров) был выбран таким образом, чтобы пара олигонуклеотидов, состоящая из одного олигонуклеотида Z27 (Z275' или Z27mid) и одного олигонуклеотида Z10 (Z10mid. или Z103') делала бы возможной амплификацию фрагментов только химерного гена Z27-Z10, но не собственных генов кукурузы Z27 или Z10. Появление амплифицированных фрагментов ожидаемой длины в полимеразных цепных реакциях, использующих эти специфичные для Z27-Z10 пары олигонуклеотидов, свидетельствовало о наличии в образце ДНК конкретного каллуса или растения химерного гена Z27-Z10.
Использование пары олигонуклеотидов Z27 (Z275' или Z27mid в сочетании с Z273') или пары олигонуклеотидов Z10 (Z10mid или Z103' в сочетании с Z105') приводило к амплификации соответственно кодирующих последовательностей Z10 или регуляторных последовательностей Z27 в полимеразных цепных реакциях с участием ДНК контрольного каллуса AB63S, ДНК каллуса Met1 или плазмиды pZ27Z10. Эти реакции служили в качестве позитивных контролей при амплификации последовательностей собственных генов кукурузы в образцах ДНК конкретного каллуса или растения.
Из листьев двух растений R0 Met1 (обозначенных как Met1 и Met1-2) и одного контрольного растения R0 AB63S была выделена ДНК, как описано выше. В полимеразных цепных реакциях с участием этих образцов ДНК использовались пары олигонуклеотидов, специфичных для кодирующей последовательности НРТ, химерного гена Z27-Z10, регуляторной последовательности Z27 и кодирующей последовательности Z10. Разделение продуктов ПЦР в геле показало, что во всех реакциях с участием ДНК Met1-1 и Met1-2 были получены продукты амплификации ожидаемого размера. В контрольной ДНК AB63S отсутствовали кодирующая последовательность НРТ и химерный ген Z27-Z10, но присутствовали собственная регуляторная последовательность Z27 и кодирующая последовательность Z10. Эти результаты показали, что изученные растения R0 Met1 сохранили введенную ДНК НРТ и химерную ДНК Z27-Z10.
Для дополнительного подтверждения того, что продукты диагностической полимеразной цепной реакции Z27-Z10 действительно содержали регуляторные последовательности Z27 и кодирующие последовательности Z10, был проведен Саузерн-блоттинг продуктов ПЦР. Были получены Саузерн-блоты двух агарозных гелей, на которые были нанесены одинаковые образцы. Образцы содержали продукты ПЦР, полученные при амплификации регуляторных последовательностей Z27, кодирующих последовательностей Z10 и последовательностей химерного гена Z27-Z10 описанным выше способом. Один из блотов гибридизовался с зондом, представляющим собой кодирующую последовательность Z10, а другой - с регуляторной последовательностью Z27. Результаты показали, что кодирующая последовательность Z10 гибридизовалась с амплифицированными фрагментами, полученными в полимеразных цепных реакциях с участием кодирующей последовательности Z10 и химерного гена Z27-Z10, но не с амплифицированными фрагментами, полученными в полимеразных цепных реакциях с участием регуляторной последовательности Z27. Сходным образом, зонд Z27 гибридизовался с амплифицированными фрагментами, полученными в полимеразных цепных реакциях с участием регуляторной последовательности Z27 и химерного гена Z27-Z10, но не с амплифицированными фрагментами, полученными в полимеразных цепных реакциях с участием кодирующей последовательности Z10. Эти результаты показали также, что амплифицированные в полимеразных цепных реакциях фрагменты содержали ожидаемые последовательности генов и что продукт диагностической ПЦР-амплификации химерного гена Z27-Z10 содержал как регуляторные последовательности Z27, так и кодирующие последовательности Z10.
Было проведено контролируемое опыление зрелых растений R0 Met1 с участием инбредных линий кукурузы A188, В73, А654 и Н99. Кроме того, было проведено несколько актов самоопыления и опыления сибсов. Всего было проведено 130 опылений, причем растения R0 Met1 использовались и как мужские (доноры пыльцы), и как женские (реципиенты). Зрелые семена были собраны через 45 дн после опыления и затем подсушены в течение 1-2 нед.
7. Анализ потомства R1. Наличие последовательности НРТ и химерного гена Z27-Z10 в ДНК тканей растений R1 оценивалось в трех выборках потомства R1 при помощи ПЦР.
Первая пранализированная выборка потомства R1 содержала четыре незрелых соплодия R0 Met 1-7. Эти соплодия были получены путем открытого опыления пестиков соцветий Met 1-7. Приблизительно через 18 дн после опыления соплодия были отделены от растения, и их поверхность была стерилизована. Эндосперм каждого семени вырезался, замораживался сухим льдом и хранился при -70oC вплоть до его использования для выделения ДНК.
Зародыш из каждого семени переносился на среду R5 и проращивался. Через 10 дн проростки переносились на вермикулит на 7 дн и затем в почву, где выращивались до созревания. ДНК каждого эндосперма выделялась и анализировалась при помощи ПЦР с использованием набора олигонуклеотидов, специфичных для кодирующей последовательности НРТ, химерного гена Z27-Z10 и гена Adh-1 кукурузы. В трех из четырех образцов ДНК эндосперма были обнаружены все упомянутые последовательности. В четвертом образце ДНК эндосперма отсутствовали кодирующая последовательность НРТ и последовательность химерного гена Z27-Z10, но присутствовала собственная последовательность Adh-1. Эти результаты показали, что последовательности НРТ и химерного гена Z27- Z10 были переданы потомству R1 растений Met1-7.
Аналогичным образом было проанализировано 24 семени из скрещивания А654 Х Met1-1. Через 24 дн после опыления семена извлекались из початков и их поверхность стерилизовалась. Зародыши и эндоспермы изолировались и обрабатывались описанным выше образом. ПЦР-анализ образцов ДНК эндосперма показал, что 9 из 24 потомков унаследовали как последовательности НРТ, так и химерный ген Z27-Z10. Остальные 15 потомков не несли ни одной из введенных последовательностей. Третья проанализированная выборка растений поколения R1 состояла из 28 растений R1, полученных при самоопылении растения Met1-6 поколения R0. Образцы ДНК выделялись из ткани листьев 28 двухнедельных проростков.
ПЦР-анализ образцов ДНК листьев показал, что 24 потомка поколения R1 несли как последовательности НРТ, так и химерный ген Z27-Z10. Оставшиеся четыре потомка R1 не несли ни одной из введенных последовательностей. Результаты описанного выше анализа приведены в табл. 5 и показывают, что значительная часть поколения R1 потомства Met1 унаследовала введенную ДНК.
Отношение числа растений Z27Z10+/HPT+ к числу растений Z27Z10-/HPT-, полученных в перекрестно скрещивающейся популяции, соответствует отношению 1: 1, характерному для расщепления по одному локусу. Кроме того, отношение числа растений Z27Z10+/HPT+ к числу растений Z27Z10-/HPT-, полученных в самоопыляющейся популяции, соответствует однолокусному расщеплению 3:1. Данные свидетельствуют также о сцеплении введенных последовательностей НРТ и Z27-Z10.
Пример 3. Фертильные трансгенные растения из линии каллуса AB12, содержащие рекомбинантную ДНК, кодирующую инсектицидный белок
Было показано, что белки, кодирующиеся различными генами Bacillus thuringiensis, в ряде случаев могут быть использованы в качестве пестицидов. Получение трансгенных растений кукурузы со специфическими гетерологическими генами Bt может усилить устойчивость растений к специфическим вредителям. Фертильные трансгенные растения, содержащие рекомбинантный ген Bt, были получены по методам, описанным в примере 1, с несколькими незначительными модификациями, описанными ниже.
Одновременно с линией каллуса AB11, использованной в примере 1, была основана другая линия. Линия AB12 была получена от отдельного скрещивания растений с теми же самыми родительскими генотипами (A188 Х В73). Этот пример демонстрирует регенерацию фертильных трансгенных растений из третьей линии каллуса в дополнение к линиям AB11 и AB63S и показывает, что получение фертильных трансгенных растений не было связано со свойствами, уникальными для одной линии каллуса.
Была использована плазмида pHYGI1, описанная в примере 1, а также плазмида pMS533, содержащая ген инсектицидного эндотоксина Bacillus thuringlensis (ВТ), слитый в одной рамке считывания с геном неомицинфосфотрансферазы (NPTII). С 5'-конца от слитного гена расположены участки ДНК промоторов ВТМ и нопалинсинтетазы. С 3'-конца от слитного гена расположены последовательности ДНК, входящие в ген ингибитора протеазы I томатов и район полиаденилирования гена нопалинсинтетазы.
Каллус был обстрелян так, как описано в примере 1, за исключением того что ДНК, использованная в ДНК/вольфрамовых образцах, содержала плазмиды pHYGI1 и рМS533. Одна пробирка содержала только 5 мкл ТЕ (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА).
Были проведены следующие варианты обстрела: 11 X pHYGI1/pMS533 (потенциальная позитивная обработка) и 3 х ТЕ (контрольная обработка).
После обстрела каллус, обработанный pHYGI1/pMS533, помещался на чашки первого цикла отбора со средой F, содержащей 15 мг/л гигромицина, по 10 кусочков каллуса на чашку. То же самое было проделано с двумя чашками, обстрелянными ТЕ (селектируемый контрольный каллус). Каллус с одной из чашек, обстрелянных ТЕ, был перенесен на среду F, без гигромицина; этот каллус поддерживался в течение всего эксперимента в качестве источника контрольной ткани (неселектируемый контрольный каллус).
Через 18 дн каллус был перенесен с чашек первого цикла селекции на чашки второго цикла селекции со средой, содержавшей 60 мг/л гигромицина; на каждую чашку было помещено 10 кусочков каллуса по 30 мг. Через 21 дн отбора на чашках второго цикла каллус оказался полностью подавлен. Все каллусы были перенесены на чашки третьего цикла отбора со средой, содержавшей 60 мг/л гигромицина.
Через 42 дн отбора на чашках третьего цикла на фоне некротической ткани было обнаружено 6 участков пролиферирующего каллуса; все они происходили от материала, обработанного pHYGI1/pMS533. Эти линии каллуса были перенесены на среду F.
Через 24 дн одна из каллусных линий, обозначенная как СВ2, значительно выросла. После этого части каждой каллусной линии были перенесены на среду F, содержащую 15 мг/л гигромицина, и на среду F, содержащую 60 мг/л гигромицина. Контрольный каллус был помещен на среду F, содержащую 15 мг/л гигромицина.
Только одна из шести каллусных линий, СВ2, была способна поддерживать устойчивый рост при многократном пассировании в присутствии 60 мг/л гигромицина. Из выборок этого каллуса была выделена ДНК, и присутствие гена Bt было подтверждено Саузерн- блоттингом.
ДНК была расщеплена одновременно рестриктазами BamHI и Xhol. BamHI режет 5'- конец кодирующей последовательности Bt, a XhoI режет 3'-конец кодирующего района. Из рестрикционного BamHI/XhoI-фрагмента плазмиды pMS533 размером 1,8 kb был приготовлен меченный 32P зонд. После гибридизации и авторадиографии была отмечена предсказанная полоса в области 1,8 kb. В ДНК из нетрансформированного каллуса полос отмечено не было.
Из каллуса СВ2 были регенерированы растения, и были проведены контролируемые опыления описанным выше способом, что позволило получить поколение R1. Растения R1 были проанализированы на присутствие последовательностей генов НРТ и Bt при помощи ПНР и на экспрессию гена НРТ при помощи ферментного анализа, как описано в примере 1.
Для проведения ПЦР использовалась ДНК, выделенная из корневой ткани проростков, при этом использовались методы, описанные в примере 1. Для проверки пригодности каждого образца ДНК для проведения ПЦР была проведена ПЦР с использованием праймеров, специфичных для нативного гена 10 кДа-zein кукурузы. Один из праймеров, использованных для ПЦР-анализа гена Bt, был комплементарен 35S-промотору, а другой - кодирующей последовательности Bt. Для ПЦР-анализа гена НРТ были использованы те же праймеры, что и в примере 1. Результаты этого анализа приведены в табл. 6. Эти результаты показывают, что введенные гены НРТ и Bt передаются и через мужских, и через женских родителей и что наблюдаемые частоты соответствуют менделевскому наследованию. Эти результаты подтверждают гипотезу о встраивании генов НРТ и Bt в хромосомную ДНК. Было также показано, что гены НРТ и Bt наследуются сцепленно; это показывает, что эти два гена встроены в одну и ту же хромосому недалеко друг от друга.
Пример 4. Фертильные трансгенные растения из каллусной линии AB12, передающие рекомбинантную ДНК в течение двух полных половых циклов
1. Линии растений и культура тканей. Была использована каллусная линия AB12, описанная в примере 3.
2. Плазмиды. Были использованы плазмиды рВII221 и pHYGI1, описанные в примере 1.
3. Процесс введения ДНК. Каллус был обстрелян, как в примере 1, за исключением того, что в ДНК/вольфрамовых образцах была использована другая ДНК. Каждая пробирка содержала по 25 мкл взвеси вольфрама N-10 в воде (50 мг/мл), 25 мкл 2,5 M CaCl2 и 10 мкл 100 мМ спермидина, а также 5 мкл раствора плазмидной ДНК с общей концентрацией ДНК 1 мг/мл. Одна пробирка содержала только плазмиду рВII221, две пробирки содержали только плазмиду pHYGI1 и одна пробирка вообще не содержала плазмид, но содержала 5 мкл буфера ТЕ.
Были проведены следующие варианты обстрела: 2 Х рВII221 (для промежуточной экспрессии), 7 X pHYGI1 (потенциальная позитивная обработка) и 3 x ТЕ (негативная контрольная обработка).
После проведения всех обстрелов каллус, обработанный рВII221, был перенесен на среду F. С каждой чашки каллуса на отдельную чашку со средой F переносилось 5 кусочков по 50 мг. Через два дня каллус был помещен в буфер для анализа GUS, описанный в примере 1. Было подсчитано число клеток с промежуточной экспрессией GUS, оказавшееся равным 686 и 845 GUS-положительным клеткам; это показывало, что процесс введения частиц произошел и на других обстрелянных чашках.
4. Отбор трансформированного каллуса После обстрела каллус, обработанный pHYGI1, был помещен на чашки первого цикла отбора со средой F, содержащей 15 мг/л гигромицина; на каждую чашку было помещено 10 кусочков каллуса по 25 мг. То же самое было проделано с каллусом из двух чашек, обстрелянных ТЕ (селектируемый контрольный каллус). Каллус c одной из чашек, обстрелянных ТЕ, был помещен на среду F без гигромицина; этот каллус поддерживался на протяжении всего эксперимента в качестве источника контрольной ткани (неселектируемый контрольный каллус).
Через 13 дн каллус на чашках первого цикла отбора был неотличим от неселектируемого контрольного каллуса. Все каллусы были перенесены с чашек первого цикла отбора на чашки второго цикла отбора со средой, содержащей 60 мг/л гигромицина. Количество чашек увеличилось приблизительно в 5 раз.
Через 23 дн масса каллуса на чашках второго цикла отбора существенно увеличилась, но к этому моменту каллус оказался близок к некротическому состоянию. Все каллусы были перенесены с чашек второго цикла отбора на чашки третьего цикла отбора со средой, содержащей 60 мг/л гигромицина.
Через 58 дн после обстрела на фоне мертвой ткани было обнаружено 3 живых полиферирующих участка. Эти три линии происходили из обработок pHYGI1 и были обозначены как 24C, 56A и 55A.
Через 15 дн на поддерживающей среде был отмечен рост линий. Линия 24С росла хорошо, тогда как линии 55A и 56A росли медленнее. Все три линии были перенесены на среду F, содержащую 60 мг/л гигромицина. Неселектируемый контрольный каллус также был перенесен с поддерживающей среды на среду F с 60 мг/л гигромицина.
Через 19 дн на среде с 60 мг/л гигромицина рост линии 24C оказался абсолютно не подавленным, тогда как увеличение массы контрольного каллуса составило 80% от массы линии 24C. Линия 56A полностью некротировала, а линия 55A была очень близка к некротическому состоянию. Линии 24C и 55A были вновь перенесены на среду F, содержащую HPT. B ДНК контрольной ткани полос отмечено не было. Линия каллуса 24С была переименована в PHS.
Для доказательства того, что ген устойчивости к гигромицину встроен в ДНК с большой молекулярной массой, выделенная из каллуса РНЗ и из контрольного каллуса ДНК была обработана (1) без рестриктаз, (2) рестриктазой BamHI, как описано выше, и (3) рестриктазой PstI, имеющей уникальный сайт в пределах кодирующей последовательности HPT плазмиды pHYGI1. ДНК переносилась на фильтр и гибридизовалась с использованной в качестве зонда кодирующей последовательностью HPT описанным выше образом.
Нерасщепленная ДНК PH2 гибридизовалась с зондом только в области, соответствовавшей нерезаной ДНК; это показывало, что ген устойчивости к гигромицину встроен в ДНК с большой молекулярной массой. Как было показано ранее, при рестрикции ДНК PH2 рестриктазой BamHI наблюдается ожидаемая полоса в области 1,05 kb. Если бы ген устойчивости к гигромицину находился в составе интактной плазмиды pHYGI1, то при рестрикции ДНК PH2 рестриктазой PstI следовало бы ожидать появления полосы в области 5,9 kb. В случае интеграции гена в геномную ДНК следует ожидать появления двух и более полос изменчивого размера (размер зависит от положения сайтов PstI в последовательностях, фланкирующих ген в хозяйской ДНК). Реально были обнаружены две полосы с молекулярной массой приблизительно 6,0 и 3,0 kb. Эти данные подтверждают встраивание гена устойчивости к гигромицину в ДНК с большой молекулярной массой. ДНК контрольного каллуса не гибридизовалась с зондом ни при какой из описанных обработок.
Эти результаты показывают, что кодирующая последовательность HPT присутствует в каллусе PH2 не в составе интактной плазмиды pHYGI1 и не в составе небольшой внехромосомной плазмиды. Напротив, они подтверждают встраивание гена устойчивости к гигромицину в ДНК с большой молекулярной массой. Проведенный впоследствии Саузерн- блоттинг показал, что кодирующая последовательность НРТ и 35S-промотор входят в состав одной непрерывной последовательности.
6. Регенерация растений и получение семян. Линия PH2 и неселектируемый контрольный каллус были помещены на среду RM5 для регенерации растений, как в примере 1. Через 16 дн каллус был перенесен на среду R5, также описанную в примере 1. Через 25 дн на среде R5 проростки были перенесены на свежую среду R5 и выращивались на ней в течение 20 дн. После этого проростки были перенесены на вермикулит на одну неделю и затем высажены в почву, где выращивались до полового созревания. Затем были проведены контролируемые опыления с участием линии В73.
7. Анализ потомства R1. A. РН2 в качестве донора пыльцы. Десять растений R1 от скрещивания В73 Х РН2.6 были проанализированы на экспрессию НРТ с использованием корневой и листовой ткани. Одно из растений дало положительный ответ. Наличие гена НРТ в этом растении было подтверждено Саузерн-блоттингом с использованием зонда НРТ, как описано в примере 1.
Для анализа удлинения корня семена были стерилизованы разбавленным в два раза промышленным отбеливателем (водный раствор) с добавлением 0,1% алканокса в течение 20 мин в баночках Erlenmeyer объемом 125 мл и 3 раза отмыты стерильной водой. Семена насыщались водой с добавлением 50 мг мл каптана в течение ночи при встряхивании с частотой 150 об/мин.
После набухания семян раствор сливался и семена переносились в проточные коробки (Flow Laboratories) с тремя слоями пропитанной водой бумаги для проращивания семян. Четвертый слой пропитанной водой бумаги для проращивания семян был помещен поверх семян. Затем семена проращивались в течение четырех дней.
После прорастания семян с каждого проростка срезался приблизительно 1 см верхушки первичного корешка, который затем помещался на среду, содержавшую соли MS, 20 г/л сахарозы, 50 мг/л гигромицина и 0,25% гельрита, и инкубировался в темноте четыре дня при 26oC.
Корни анализировались на присутствие либо отсутствие обильных корневых волосков и боковых корней. Корни классифицировались на трансгенные (устойчивые к гигромицину), если они имели корневые волоски и боковые корни, и нетрансформированные (чувствительные к гигромицину), если они имели ограниченное число ответвлений.
После отрезания верхушек корешков проростки с одного початка РН2 и одного контрольного початка переносились на влажный вермикулит и подращивались в темноте в течение пяти дней. После этого для проведения анализа этиолированных листьев с верхушки первичного побега делались срезы по 1 мм, поверхность которых затем стерилизовалась в течение 10 с, после чего они помещались на среду, содержавшую соли MS, 20 г/л гельрита и (кроме контроля) 100 мг/л гигромицина, и инкубировались 18 ч в темноте при 26oC. На каждую чашку помещалось по 2 среза каждого побега. Затем чашки инкубировались при световом режиме, включающем 14 ч света и 10 ч темноты, при 26oC в течение 48 ч, после чего их цвет оценивался по шкале от 0 (полностью коричневые) до 6 (полностью зеленые) для определения процента зеленой окраски в ткани листьев. Побеги классифицировались на нетрансформированные (чувствительные к гигромицину), если им был присвоен нулевой балл, и трансформированные (устойчивые к гигромицину), если им был присвоен балл 3 или более.
В. PH2 в качестве реципиентов пыльцы. 80 растений поколения R1 потомства РН2 от скрещивания РН2.23 Х В73 были проанализированы на экспрессию НРТ с помощью анализа удлинения корня, 26 из них дали положительный ответ. Для всех 26 растений экспрессия гена НРТ была затем подтверждена непосредственным высаживанием проростков на гигромицинсодержащую среду в проточных коробках. Два устойчивых растения были проанализированы при помощи ПЦР, и в них было подтверждено присутствие последовательности НРТ.
8. Анализ поколения потомства R2. Трансгенное растение R1, имевшее PH2 в качестве мужского родителя, было выращено до созревания и использовано для опыления растения FR 4326.
Семена R2 от этого скрещивания были пророщены и проанализированы на присутствие последовательностей НРТ при помощи ПЦР. Экспрессия гена НРТ была определена при помощи ферментного анализа НРТ, описанного в примере 1.
Три из 19 проанализированных потомков содержали последовательности гена НРТ и экспрессировали фермент НРТ. Остальные не содержали последовательностей НРТ и не проявляли активности фермента. Этот результат подтверждает передачу через пыльцу и экспрессию ДНК, введенной при помощи генной инженерии, через два последовательных поколения, показывая тем самым, что ген стабилен.
Пример 5. Использовалась рыхлая эмбриогенная каллусная культура кукурузы AB12, описанная в примере 3.
Плазмиды pGHN1-1 и pLUC-1 были сконструированы на основе вектора pBS+ (Stratagene, Inc., San Diego, CA), являющегося кольцевой плазмидой размером 3,2 kb, c использованием стандартных методов работы с рекомбинантными ДНК. Плазмида pCHN1-1 содержит кодирующую последовательность гигромицин В-фосфотрансферазы (НРТ) E.coli [22], фланкированную с 3'-конца сигналом полиаденилирования гена нопалинсинтетазы (nos) Agrobacterium tumifaclens (Chilton and Barnes, 1983). Экспрессия регулируется 35S-промотором вируса табачной мозаики (ВТМ) [23], расположенным выше кодирующей последовательности НРТ. В данном примере были также использованы плазмиды pBII221 и pHYGI1.
Плазмида pLUC-1 содержит кодирующую последовательность люциферазы огневки (DeWet et al.,1987), фланкированную с 5'-конца 35S-промотором ВТМ, а с 3'-конца - сигналом полиаденилирования nos. Данная плазмида использовалась исключительно в качестве негативной контрольной ДНК. Плазмиды вводились в культуру AB12 методом обстрела микрочастицами. Было приготовлено 26 чашек описанными в примере 1 методами. Одна пробирка содержала только плазмиду pBII221, две пробирки содержали и pHYGI1, и pBII221, две пробирки содержали и pGHNI-1, и pBII221, и одна пробирка содержала только pLUC-1. Информация о проведенных обстрелах приведена в табл. 7.
Две чашки с каллусом, обстрелянным pBII221, были проанализированы на промежуточную экспрессию GUS. Было подсчитано число синих клеток, оказавшееся равным 291 и 477 клеткам с промежуточной экспрессией GUS; это показывало, что процесс введения ДНК произошел и на других обстрелянных чашках.
Сразу после обстрела всех образцов каллус во всех чашках, обработанных pHYGI1/pBII221, pCHNI-1/pBII221, и с трех чашек, обработанных pLUC-1, был перенесен на чашки первого цикла отбора со средой F, содержащей 15 мг/л гигромицина В (с каждой чашки 5 кусочков каллуса переносилось на отдельную чашку). Каллус с четвертой чашки, обработанной pLUC-1, был перенесен на среду F без гигромицина. Эта ткань поддерживалась на неселективной среде, пересевалась каждые 2 - 3 недели и в дальнейшем обозначается как неселектируемый контрольный каллус.
Через 2 нед отбора ткань выглядела практически одинаково на селективной и неселективной среде. Все каллусы, обработанные pHYGI1/pBII221 и pCHN1-1/pBII221 (по 8 чашек), и два контрольных каллуса (с селективной среды) были перенесены с чашек первого цикла отбора на чашки второго цикла отбора со средой, содержавшей 60 мг/л гигромицина. На каждую чашку второго цикла отбора было помещено 10 кусочков каллуса по 30 мг, в результате чего общее число чашек увеличилось.
Оставшаяся ткань, поддерживаемая на селективной среде (по две чашки с обработок pHYGI1/pBII221 и pGHN1-1/pBII221 и одна чашка с контрольным каллусом) была перенесена в буфер для анализа GUS при 37oC для определения того, видны ли синие кластеры клеток через две недели после обстрела. Через 6 дн пребывания ткани в буфере для анализа она была проанализирована на предмет экспрессии GUS. Результаты анализа приведены в табл. 8.
Через 21 дн на чашках второго цикла отбора все живые участки материала были перенесены на чашки третьего цикла отбора со средой, содержавшей 60 мг/л гигромицина. Чашки второго цикла, содержавшие только мертвую на вид ткань, были сохранены. Чашки второго и третьего циклов отбора периодически просматривались для обнаружения живых пролиферирующих участков.
Через 35 дн на чашках третьего цикла отбора все чашки обоих циклов были проверены на наличие живых участков каллуса. Два таких участка, пролиферирующих на фоне мертвой ткани, были обнаружены на чашках, обработанных pHYGI1/pBII221. Первый участок, названный 3AA, был обнаружен на чашке третьего цикла, а второй, названный РН1, на чашке второго цикла. Обе линии были перенесены на среду F без гигромицина.
Через 19 дн на среде F без гигромицина линия 3AA подросла очень мало, тогда как линия РН1 росла быстро. Обе линии были вновь перенесены на среду F без гигромицина на 9 дн. Затем линии 3AA и РН1 были перенесены на среду F, содержавшую 15 мг/л гигромицина, на 14 дн. При этом оказалось, что линия 3AA росла медленно и имела очень низкое качество. Однако линия РН1 быстро росла на среде F с 15 мг/л гигромицина; эта линия пассировалась затем на среде F без гигромицина.
Через 10 дн на среде F было начато изучение ингибирования линии РН1. Каллус РН1 был перенесен на среду F, содержавшую 1, 10, 30, 100 и 250 мг/л гигромицина В. Для каждой концентрации было приготовлено 5 чашек, и каждая чашка содержала по 10 кусочков каллуса приблизительно по 50 мг. Для каждой концентрации гигромицина была приготовлена одна чашка неселектируемой контрольной ткани.
Выяснилось, что линия РН1 способна к устойчивому росту при концентрации гигромицина 0, 10, 30, 100 и 250 мг/л после 9 пассажей.
С чашек второго и третьего циклов отбора в разное время были также восстановлены дополнительные участки ткани. Ни один из них не был способен расти в присутствии гигромицина при многократном (двух- и трехкратном) пассировании.
Для доказательства того, что каллус РН1 приобрел ген устойчивости к гигромицину, этот каллус был проанализирован методом Саузерн-блоттинга, для чего была выделена ДНК из РН1 и неселектируемого контрольного каллуса. Для выделения ДНК 2 г каллуса замораживались в жидком азоте и растирались в тонкий порошок, который затем переносился в пробирку объемом 30 мл (Oak Ridge), содержащую 6 мл буфера для экстракции (7 M мочевина, 250 мМ NaCl, 50мМ Трис-HCl (pH 8,0), 20 мМ ЭДТА (pH 8,0) и 1% саркозина). К этому добавлялись 7 мл смеси фенол/хлороформ (1:1), пробирки встряхивались и инкубировались при 37oC в течение 15 мин. Образцы центрифуговались при 8 К в течение 10 мин при 4oC. Супернатант переносился пипеткой через фильтр Calbiochem 475855 в пробирку объемом 15 мл (American Scientific Products, C3920-15A), содержащую 1 мл 4,4 M ацетата аммония (pH 5,2). Затем добавлялось 6 мл изопропанола, пробирка встряхивалась и выдерживалась в течение 15 мин при -20oC. ДНК осаждалась в центрифуге Beckman TJ-6 при максимальной скорости в течение 5 мин при 4oC. Супернатант сливался, и осадок растворялся в 500 мкл ТЕ (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 10 мМ ЭДТА) в течение 15 мин при комнатной температуре. Образцы переносились в пробирку Eppendorf объемом 1,5 мл, и к ним добавлялись 100 мкл 4,4 M ацетата аммония (pH 5,2) и 700 мкл изопропанола. Смесь инкубировалась в течение 15 мин при -20oC, после чего ДНК осаждалась в течение 5 мин при 1200 об/мин в центрифуге Eppendorf. Осадок промывался 70%-ным этанолом, высушивался и ресуспендировался в ТЕ-1 (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА).
10 мкг изолированной ДНК расщеплялось рестриктазой BamHI (NEB) и анализировалось описанным в примере 1 способом с использованием зонда НРТ. Как видно на фиг. 3, в ДНК каллуса РН1 была отмечена полоса в ожидаемой области 1,05 kb, что показывало наличие кодирующей последовательности НРТ. В ДНК контрольного каллуса полос отмечено не было.
Для доказательства того, что ген устойчивости к гигромицину встроен в ДНК с большой молекулярной массой, ДНК, изолированная из каллуса РН1 и из контрольного каллуса, была обработана (1) без рестриктаз, (2) рестриктазой BamHI описанным выше способом и (3) рестриктазой Pst1, которая расщепляет плазмиду pHYGI1 только по одному сайту в пределах кодирующей последовательности НРТ. Образцы были перенесены на блот и проанализированы при помощи зонда, представляющего собой кодирующую последовательность НРТ, описанным выше способом.
Нерасщепленная ДНК каллуса РН1 гибридизовалась с зондом только в области, соответствующей нерасщепленной ДНК; это показывало, что ген устойчивости к гигромицину встроен в ДНК с большой молекулярной массой. При расщеплении ДНК РН1 рестриктазой BamHI была отмечена полоса в ожидаемой области 1,05 kb, как было показано выше. При расщеплении ДНК РН1 рестриктазой Pst1 в случае, если ген устойчивости к гигромицину присутствовал бы в составе интактной плазмиды pHYGI1, ожидалась бы полоса в области 5,9 kb. Если ген встроен в ДНК с большой молекулярной массой, то следует ожидать появления двух или более полос различного размера (размер зависит от положения сайтов расщепления Pst1 в последовательностях, фланкирующих ген в ДНК хозяина). Было отмечено три полосы с приблизительными размерами 12, 5,1 и 4,9 kb. Этот результат свидетельствует о встраивании гена устойчивости к гигромицину в ДНК с большой молекулярной массой. Интенсивность полосы в области 4,9 kb примерно вдвое больше интенсивности других полос; это наводит на мысль, что или расщепление ДНК было неполным, или ген НРТ тандемно повторен. Ни в одной из описанных выше обработок не было отмечено гибридизации с зондом ДНК контрольного каллуса.
Эти результаты показывают, что кодирующая последовательность НРТ присутствует в каллусе РН1 не в виде интактной плазмиды pHYGI1 и не в виде небольшой внехромосомной плазмиды. Они подтверждают встраивание гена устойчивости к гигромицину в ДНК с большой молекулярной массой. Кроме того, Саузерн-блоттинг показал, что кодирующая последовательность НРТ входит в состав одного непрерывного района с 35S-промотором.
Из всех чашек с разными концентрациями гигромицина, использованных при изучении ингибирования каллуса, каллус РН1 был перенесен на среду RM5, и растения были регенерированы так, как описано в примере 1. Всего было получено 65 растений из каллуса РН1 и 30 растений из контрольного каллуса.
Для доказательства того, что введенная ДНК сохранилась в тканях растений R0, был проведен Саузерн-блоттинг расщепленной рестриктазой BamHI ДНК листьев трех случайно выбранных растений поколения R0, полученных из каллуса РН1. Методы проведения Саузерн-блоттинга описаны выше. Блот гибридизовался с зондом НРТ, как описано в примере 1. Как видно на фиг. 4, в ДНК всех трех растений была отмечена полоса в области 1,05 kb, что свидетельствовало о присутствии кодирующей последовательности НРТ. В ДНК контрольных растений полос отмечено не было.
Были проведены контролируемые опыления растений РН1 при помощи стандартных методов с участием инбредных линий Zea mays A188, В73 и Oh43. Семена были собраны через 45 дн после опыления и подсушены в течение 2-3 нед.
Наличие устойчивости к гигромицину у потомства поколения R1 оценивалось при помощи анализа удлинения корня, анализа этиолированных листьев и Саузерн-блоттинга. С каждого растения, регенерированного из каллуса РН1 или контрольного каллуса, было отобрано для анализа по два початка. Для всех початков донором пыльцы была инбредная линия A188. Результаты приведены в табл. 9 и на фиг. 5.
Присутствие гена НРТ было подтверждено в двух растениях поколения R2, происходящих от материнского растения РН1.
Растение РН1.3.1 (табл. 9) было опылено пыльцой Oh43. Девять семян, полученных от этого скрещивания, были пророщены, и из листьев четырех дочерних растений была выделена ДНК, которая затем была проанализирована методом Саузерн-блоттинга с использованием зонда, представляющего собой кодирующую последовательность НРТ. Два из четырех проанализированных растений содержали большое число копий последовательности НРТ. Хотя в двух растениях присутствовал ген НРТ, экспрессия этого гена не была отмечена при анализе этиолированных листьев.
Растение РН1.10.8 (табл. 9) было использовано для опыления растений линии В73 и, кроме того, самоопылено. Пятьдесят дочерних растений, полученных в скрещивании, было проверено на экспрессию НРТ при помощи анализа как корней, так и листьев. Экспрессия не была отмечена. Кроме того, Саузерн-блоттинг ДНК восьми дочерних растений не показал присутствия гена НРТ. В потомстве от самооплодотворения при анализе листьев девяти растений не было получено данных, которые свидетельствовали бы о присутствии гена НРТ; Саузерн-блоттинг ДНК четырех из этих растений также не дал таких данных.
Наследование рекомбинантной ДНК потомством было отмечено только тогда, когда трансгенное растение (R0 или R1) использовалось в качестве женского родителя. Это свидетельствует о материнском наследовании рекомбинантной ДНК у РН1.
Все цитированные выше публикации и патентные документы включены в данное описание в качестве ссылок. Изобретение было описано в связи с различными конкретными и предпочтительными вариантами его осуществления; однако необходимо иметь в виду, что возможны и другие его модификации и варианты, соответствующие его сущности и находящиеся в пределах его объема. -
Литература.
1. Adang M.J. et al. Gene, 36, 1985, 289
2. Altenbach et al. Plant Mol. Biol., 8, 1987, 239
3. Armstrong C.L, et al. Planta, 164, 1985, 207 - 214
4. Benner M.S. et al. Theor. Appl. Genet., 78, 1989, 761
5. Bevan M. et al. Nuc. Acids. Res., 11, 1983, 36a
6. Bradford. Anal. Biochem., 72, 1976, 248
7. Cabanes-Bastos E. Gene, 77, 1989, 169
8. Callis J. et al. Genes & Develop., 1, 1987, 1183 - 1200
9. Chu, C.C. et al. Sci.Sin. (Peking), 18, 1975, 659 - 668
10. Cocking А. et al. Science, 236, 1987, 1259 - 1262
11. Cristou P. et al. Plant Physiol., 87, 1988, 671
12. Datta S.K. et al. Bio/Technology, 8, 1990, 736
13. DeWet et al.Proc. Natl. Sci. USA, 82, 1985, 7870 - 7873
14. DeWet J. et al. Experimental Manipulation of Ovule Tissue, G. Chapman et al., eds., Longman, Inc., New York, 1985, 197 - 269
15. Freeling J.C. et al. Maydica XXI, 1976, 97 - 112
16. Fromm M.E. et al. Nature, 319, 1986, 791
17. Geiser M. et al. Gene, 48, 1986, 109
18. Geraghty D.E. Ph.D. Thesis, University of Minnesota, 1987
19. Graves A. et al. Plant Mol. Biol., 3, 1986, 43 - 50
20. Green C. et al. Crop Sci. 15, 1975, 417 - 421
21. Green C. et al. Maize for Biological Research, Plant Molec. Biol. Assoc., 1982, 367 - 372
22. Gritz L. et al. Gene, 25, 1983, 179 - 188
23. Guilley H. et al. Gell, 30, 1982, 763 - 773
24. Hallauer A.R. et al. Corn and Corn Improvement, 3rd. ed., Agronomy Society of America, 1988, 469 - 564
25. Hofte H. et al. Microbiol. Rev., 53, 1989, 242
26. Jefferson R. et al. EMBO J., 6, 1987, 3901 - 3907
27. Kirihara et al. Gene, 7, 1988, 359
28. Kamo K. et al. Bot. Gaz., 146, 1985, 327 - 334
29. Klein T. et al. Plant Physiol., 91, 1989, 440 - 444
30. Klein T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 1988, 4305 - 4309
31. Klein T. et al. Bio/Technology, 6, 1988, 559 - 563
32. Lu C. et al. Theor. Appl, Genet., 62, 1982, 109 -112
33. McCabe D, et al. Bio/Technology, 6, 1988, 923 - 926
34. Murashige T. et al. Physiol. Plant, 15, 1962, 473 - 497
35. Murray et al. Nucl. Acids Res., 17, 1987, 477
36. Neuffer M. Maize for Biological Research, Plant. Mol. Biol. Assoc., 1982, 19-30
37. Ohta Y. PNAS USA, 83, 1986, 715
38. Pedersen et al. J. Biol. Chem., 261, 1986, 6279
39. Phillips R. et al. Corn and. Corn Improvement, 3rd ed., Agronomy Society of America, 1988, 345 - 387
40. Potrykus l. Trends in Biotechnology, 7, 1989, 269 - 273
41. Prioli L.M. et al. Bio/Technology, 7, 1989, 589
42. Rhodes C.A. et al. Bio/Technology, 6, 1988, 56
43. Rhodes C.A. et al. Science, 240, 1988, 204 - 207
44. Sambrook J. et al. Molecular Cloning. A Laboranory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989
45. Sanford J. et al. Part. Sci. & Techn., 5, 1987, 27 - 37
46. Shillito R.D. et al. Bio/Technology, 7, 1989, 581
47. Staebell M. et al. Anal. Biochem., 185, 1990, 319
48. Vasil l.. Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol.I, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, 152 - 158
49. Vietra J. et al. Methods Enzymol., 153, 1987, 3
50. Weising K. et al., Ann.Rev. of Genetics, 22, 1988, 421 - 478
51. Whitely H.R. et al. Ann. Rev. Microbiol., 40, 1986, 549
52. Yanisch-Perron L. et al. Gene, 33, 1985, 109 - 119
53. Опубликованная заявка на европейский патент N 270356 (McCabe et al.)
54. Опубликованная заявка на европейский патент N 275069 (Arntzen et al. )
55. Опубликованная заявка на европейский патент N 331855 (Sanford J. C. et al.), основанная на заявке N 07/161807 от 29.03.88 на патент США.
56. Патент США N 4683202 (K.B. Mullis).

Claims (4)

1. Способ получения трансгенного растения Zea mays, содержащего стабильно интегрированную в хромосому рекомбинантную ДНК, включающий получение реципиентных клеток, их трансформацию путем введения в них экзогенной ДНК, отбор трансформированных клеток и последующую регенерацию из них растений, отличающийся тем, что реципиентные клетки получают из способной к регенерации рыхлой эмбриогенной каллусной культуры, а трансформацию осуществляют путем обстрела реципиентных клеток микрочастицами, покрытыми рекомбинантной ДНК.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что каллусную культуру получают из незрелых зародышей.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для обстрела микрочастицами используют каллусную культуру, имеющую вид комочков, масса каждого из которых составляет 30 - 80 мг.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что каллусную культуру культивируют на твердой питательной среде.
SU5052752A 1990-01-22 1991-01-14 Способ получения трансгенного растения кукурузы RU2114911C1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US46798390A 1990-01-22 1990-01-22
US467983 1990-01-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2114911C1 true RU2114911C1 (ru) 1998-07-10

Family

ID=23857948

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU5052752A RU2114911C1 (ru) 1990-01-22 1991-01-14 Способ получения трансгенного растения кукурузы

Country Status (3)

Country Link
US (4) US5484956A (ru)
RU (1) RU2114911C1 (ru)
ZA (1) ZA91342B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2623176C2 (ru) * 2009-11-23 2017-06-22 Монсанто Текнолоджи Ллс Трансгенное событие mon 87427 маиса и относительная шкала развития

Families Citing this family (728)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6376234B1 (en) * 1986-05-05 2002-04-23 Ciba-Geigy Method of inserting viral DNA into plant material
US5350689A (en) * 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US5550318A (en) * 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6803499B1 (en) 1989-08-09 2004-10-12 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
CA2074355C (en) 1990-01-22 2008-10-28 Ronald C. Lundquist Method of producing fertile transgenic corn plants
US6777589B1 (en) * 1990-01-22 2004-08-17 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6329574B1 (en) * 1990-01-22 2001-12-11 Dekalb Genetics Corporation High lysine fertile transgenic corn plants
US6946587B1 (en) * 1990-01-22 2005-09-20 Dekalb Genetics Corporation Method for preparing fertile transgenic corn plants
US6025545A (en) * 1990-01-22 2000-02-15 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6395966B1 (en) * 1990-08-09 2002-05-28 Dekalb Genetics Corp. Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein
US6403865B1 (en) * 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
CA2096843C (en) * 1990-11-23 2007-08-07 Kathleen D'halluin Process for transforming monocotyledonous plants
US6605712B1 (en) * 1990-12-20 2003-08-12 Arch Development Corporation Gene transcription and ionizing radiation: methods and compositions
USRE36449E (en) * 1991-03-05 1999-12-14 Rhone-Poulenc Agro Chimeric gene for the transformation of plants
FR2673643B1 (fr) 1991-03-05 1993-05-21 Rhone Poulenc Agrochimie Peptide de transit pour l'insertion d'un gene etranger dans un gene vegetal et plantes transformees en utilisant ce peptide.
UA48104C2 (ru) * 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, содержащий последовательность, которая кодирует инсектицидный протеин, оптимизированную для кукурузы, фрагмент днк, обеспечивающий направленную желательную для сердцевины стебля экспрессию связанного с ней структурного гена в растении, фрагмент днк, обеспечивающий специфическую для пыльцы экспрессию связанного с ней структурного гена в растении, рекомбинантная молекула днк, способ получения оптимизированной для кукурузы кодирующей последовательности инсектицидного протеина, способ защиты растений кукурузы по меньшей мере от одного насекомого-вредителя
GB9211130D0 (en) * 1992-05-26 1992-07-08 Ici Plc Herbicide resistant plants
US6118047A (en) * 1993-08-25 2000-09-12 Dekalb Genetic Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
US5780709A (en) * 1993-08-25 1998-07-14 Dekalb Genetics Corporation Transgenic maize with increased mannitol content
US6281411B1 (en) 1993-08-25 2001-08-28 Dekalb Genetics Corporation Transgenic monocots plants with increased glycine-betaine content
US6326527B1 (en) 1993-08-25 2001-12-04 Dekalb Genetics Corporation Method for altering the nutritional content of plant seed
US5792931A (en) * 1994-08-12 1998-08-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Fumonisin detoxification compositions and methods
US5631152A (en) * 1994-10-26 1997-05-20 Monsanto Company Rapid and efficient regeneration of transgenic plants
US6114608A (en) * 1997-03-14 2000-09-05 Novartis Ag Nucleic acid construct comprising bacillus thuringiensis cry1Ab gene
FR2736926B1 (fr) 1995-07-19 1997-08-22 Rhone Poulenc Agrochimie 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene
HUP9902123A3 (en) * 1996-06-21 2002-01-28 Monsanto Technology Llc St Louis Methods for the production of stably-transformed, fertile wheat employing agrobacterium-mediated transformation
US6093695A (en) 1996-09-26 2000-07-25 Monsanto Company Bacillus thuringiensis CryET29 compositions toxic to coleopteran insects and ctenocephalides SPP
US5981840A (en) * 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
US6376754B1 (en) 1997-03-07 2002-04-23 Asgrow Seed Company Plants having resistance to multiple herbicides and its use
WO1998040505A1 (en) 1997-03-13 1998-09-17 Dekalb Genetics Corporation Maize dimboa biosynthesis genes
US6573438B1 (en) 1997-03-14 2003-06-03 Syngenta Participations Ag Inbred Maize line 2044BT
US6040497A (en) * 1997-04-03 2000-03-21 Dekalb Genetics Corporation Glyphosate resistant maize lines
AU6882298A (en) 1997-04-03 1998-10-22 Dekalb Genetics Corporation Glyphosate resistant maize lines
US6307128B1 (en) 1997-06-03 2001-10-23 Miami University Fatty acid elongases
US7161064B2 (en) * 1997-08-12 2007-01-09 North Carolina State University Method for producing stably transformed duckweed using microprojectile bombardment
AU9117598A (en) * 1997-08-27 1999-03-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes encoding enzymes for lignin biosynthesis and uses thereof
WO1999016890A2 (en) 1997-09-30 1999-04-08 The Regents Of The University Of California Production of proteins in plant seeds
US5986182A (en) * 1997-10-01 1999-11-16 Thompson; Steven A. Inbred maize line 4SQ601
CA2279258A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Novartis Ag Glyphosate resistant transgenic plants
US6455762B1 (en) * 1997-11-12 2002-09-24 Board Of Control Of Michigan Technological University Methods of modifying lignin in plants by transformation with a 4-coumarate coenzyme a ligase nucleic acid
US6060315A (en) * 1997-12-01 2000-05-09 Lockheed Martin Energy Research Corporation Method for facilitating the introduction of material into cells
US6153811A (en) * 1997-12-22 2000-11-28 Dekalb Genetics Corporation Method for reduction of transgene copy number
US20060260005A1 (en) * 1998-02-26 2006-11-16 Zhizhen Chen Transformation of Brassica
US20040045056A1 (en) * 1998-02-26 2004-03-04 Zhizheng Chen Transformation of Brassica
US6586658B1 (en) * 1998-03-06 2003-07-01 Metabolix, Inc. Modification of fatty acid metabolism in plants
US5973227A (en) * 1998-05-06 1999-10-26 University Of Saskatchewan Flax transformation
US6635806B1 (en) * 1998-05-14 2003-10-21 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for expression of transgenes in plants
US6066786A (en) * 1998-06-17 2000-05-23 Pure Seed Testing, Inc. Glyphosate tolerant fescue grasses
MXPA01001049A (es) * 1998-07-30 2002-08-20 Metabolix Inc Enzimas para produccion de biopolimeros.
US7897843B2 (en) 1999-03-23 2011-03-01 Mendel Biotechnology, Inc. Transcriptional regulation of plant biomass and abiotic stress tolerance
US20050086718A1 (en) 1999-03-23 2005-04-21 Mendel Biotechnology, Inc. Plant transcriptional regulators of abiotic stress
AU1211600A (en) * 1998-10-16 2000-05-08 Regents Of The University Of California, The Methods of suppressing flowering in transgenic plants
US6987214B1 (en) 1998-10-16 2006-01-17 The Regents Of The University Of California Methods of suppressing flowering in transgenic plants
US6987025B1 (en) * 1999-02-11 2006-01-17 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Dwf4 polynucleotides, polypeptides and uses thereof
EP1586645A3 (en) * 1999-02-25 2006-02-22 Ceres Incorporated Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
US20040029167A1 (en) * 1999-03-22 2004-02-12 Bernard Fritig Inducible COMT_II promoter, chimeric gene containing same and plants transformed therewith
CA2267014A1 (en) * 1999-03-26 2000-09-26 Brenda Rojas Monocot transformation using acrobacterium
US6084163A (en) * 1999-04-09 2000-07-04 Cargill Incorporated Inbred corn line BE4547
US6137038A (en) * 1999-05-13 2000-10-24 Cargill Incorporated Inbred corn line SM4603
US6429357B1 (en) 1999-05-14 2002-08-06 Dekalb Genetics Corp. Rice actin 2 promoter and intron and methods for use thereof
US7399850B2 (en) * 1999-06-18 2008-07-15 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments encoding AP2 domain proteins
US7485715B2 (en) 1999-06-18 2009-02-03 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA encoding AP2 domain polypeptides
AU5890400A (en) * 1999-06-24 2001-01-09 Baylor College Of Medicine System and method to detect compounds and mutations that upregulate and downregulate expression of nucleotide sequences
US7479555B2 (en) * 1999-07-21 2009-01-20 Ceres, Inc. Polynucleotides having a nucleotide sequence that encodes a polypeptide having MOV34 family activity
GB9923306D0 (en) * 1999-10-01 1999-12-08 Isis Innovation Diagnostic and therapeutic epitope, and transgenic plant
EP2308974A3 (en) 1999-10-14 2011-08-10 Clontech Laboratories Inc. Anthozoa derived chromo/fluoroproteins and methods for using the same
US20060194958A1 (en) * 1999-11-10 2006-08-31 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments encoding AN1-like zinc finger proteins
US7534933B2 (en) * 2000-08-18 2009-05-19 University Of Connecticut Transgenic plants overexpressing a plant vacuolar H + -ATPase
US8697950B2 (en) * 1999-11-10 2014-04-15 University Of Connecticut Vacuolar pyrophosphatases and uses in plants
US20020178464A1 (en) * 1999-11-10 2002-11-28 Whitehead Institute For Biomedical Research Proton transporters and uses in plants
EP1950306A1 (en) 1999-11-17 2008-07-30 Mendel Biotechnology, Inc. Environmental stress tolerance genes
WO2001035725A1 (en) 1999-11-17 2001-05-25 Mendel Biotechnology, Inc. Yield-related genes
AU2001236839A1 (en) 2000-02-11 2001-08-20 Metabolix, Inc. Multi-gene expression constructs containing modified inteins
JP2004512007A (ja) * 2000-02-28 2004-04-22 エール　ユニヴァーシティ トランス遺伝子の伝達を削減または排除する方法および組成物
US6750379B2 (en) 2000-03-09 2004-06-15 Dekalb Genetics Corporation Homologous recombination-mediated transgene alterations in plants
US6580019B1 (en) 2000-03-09 2003-06-17 Dekalb Genetics Corporation Non-reciprocal recombination-mediated transgene deletion in transgenic plants
US6747189B1 (en) 2000-03-21 2004-06-08 Dekalb Genetics Corporation Maize glycine rich protein promoter compositions and methods for use thereof
US7691991B2 (en) * 2000-04-17 2010-04-06 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments encoding cytochrome P450 proteins
WO2002015675A1 (en) 2000-08-22 2002-02-28 Mendel Biotechnology, Inc. Genes for modifying plant traits iv
FR2815969B1 (fr) 2000-10-30 2004-12-10 Aventis Cropscience Sa Plantes tolerantes aux herbicides par contournement de voie metabolique
US7385046B2 (en) * 2001-01-03 2008-06-10 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments encoding ethylene responsive element binding proteins
ATE495261T1 (de) * 2001-02-22 2011-01-15 Biogemma Fr Konstitutiver promotor aus arabidopsis
US6849790B2 (en) 2001-03-15 2005-02-01 Advanta Technology, Ltd. Inbred corn line G3601
US6828492B2 (en) 2001-03-15 2004-12-07 Advanta Technology Ltd Inbred corn line G4901
JP2004536577A (ja) * 2001-03-19 2004-12-09 カーギル，インコーポレーテッド ミオイノシトールオキシゲナーゼ
JP2004532213A (ja) * 2001-04-06 2004-10-21 ザ ユニヴァーシティ オヴ シカゴ Ｅｇｒ−１プロモーター活性の化学療法誘導
US8034791B2 (en) 2001-04-06 2011-10-11 The University Of Chicago Activation of Egr-1 promoter by DNA damaging chemotherapeutics
US20040242523A1 (en) * 2003-03-06 2004-12-02 Ana-Farber Cancer Institue And The Univiersity Of Chicago Chemo-inducible cancer gene therapy
US7977046B2 (en) * 2002-05-10 2011-07-12 Monsanto Technology Llc Method of selecting DNA constructs for herbicide tolerance in plants
CA2448097A1 (en) 2001-05-22 2002-11-28 University Of Chicago N4 virion single-stranded dna dependent rna polymerase
US20050287647A9 (en) * 2001-05-30 2005-12-29 Carl Perez Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes
EP1279737A1 (en) 2001-07-27 2003-01-29 Coöperatieve Verkoop- en Productievereniging, van Aardappelmeel en Derivaten AVEBE B.A. Transformation method for obtaining marker-free plants
US20030084473A1 (en) * 2001-08-09 2003-05-01 Valigen Non-transgenic herbicide resistant plants
CN100417419C (zh) * 2001-10-26 2008-09-10 贝勒医学院 改变个体的瘦体重和骨特性的组合物和方法
EP1438417B1 (en) * 2001-10-26 2014-05-14 Danisco US Inc. Phytase enzymes, nucleic acid sequences encoding phytase enzymes and vectors and host cells incorporating same
WO2003038035A2 (en) * 2001-10-26 2003-05-08 Genencor International, Inc. T. reesei phytase enzymes, polynucleides encoding the enzymes, vectors and host cells thereof, and methods of using
MY142457A (en) 2001-12-11 2010-11-30 Advisys Inc Plasmid mediated supplementation for treating chronically ill subjects
DE60233347D1 (de) * 2001-12-19 2009-09-24 Univ Chicago Schnellreifende fluoreszierende proteine und verfahren zu deren anwendung
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
US20030166282A1 (en) 2002-02-01 2003-09-04 David Brown High potency siRNAS for reducing the expression of target genes
WO2003064625A2 (en) 2002-02-01 2003-08-07 Sequitur, Inc. Oligonucleotide compositions with enhanced efficiency
US6815594B2 (en) * 2002-03-13 2004-11-09 Advanta Technology Ltd. Inbred corn line G1202
US6815593B2 (en) * 2002-03-13 2004-11-09 Advanta Technology, Ltd. Inbred corn line G0302
US6818812B2 (en) 2002-03-13 2004-11-16 Advanta Technology Ltd. Inbred corn line G2202
EP1549133B1 (en) 2002-05-22 2015-04-22 Monsanto Technology LLC Fatty acid desaturases from fungi
GB0212885D0 (en) * 2002-06-05 2002-07-17 Isis Innovation Therapeutic epitopes and uses thereof
JP4570565B2 (ja) 2002-07-15 2010-10-27 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム ペリプラズム発現によるコンビナトリアルタンパク質ライブラリーのスクリーニング
US7364901B2 (en) * 2002-07-15 2008-04-29 University Of Kentucky Research Foundation Recombinant Stokesia epoxygenase gene
US20060194959A1 (en) * 2002-07-15 2006-08-31 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments encoding SRF-type transcription factors
WO2004009761A2 (en) 2002-07-18 2004-01-29 Monsanto Technology Llc Methods for using artificial polynucleotides and compositions thereof to reduce transgene silencing
US8876532B2 (en) 2002-07-31 2014-11-04 Dentsply International Inc. Bone repair putty
US20060099224A1 (en) 2002-08-12 2006-05-11 David Kirn Methods and compositions concerning poxviruses and cancer
WO2005007801A2 (en) 2002-08-16 2005-01-27 Royster-Clark, Inc. Plant seed mixtures
US7045684B1 (en) 2002-08-19 2006-05-16 Mertec, Llc Glyphosate-resistant plants
US20050257293A1 (en) * 2002-09-17 2005-11-17 Mascia Peter N Biological containment system
US7476777B2 (en) * 2002-09-17 2009-01-13 Ceres, Inc. Biological containment system
EP2270166A3 (en) 2002-09-18 2011-08-10 Mendel Biotechnology, Inc. Polynucleotides and polypeptides in plants
DE03779067T1 (de) 2002-11-12 2006-06-22 Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo "Evrogen" Fluoreszenzproteine und chromoproteine aus nicht-aequorea-hydrozoa-spezies sowie verfahren zur verwendung davon
US7078234B2 (en) 2002-12-18 2006-07-18 Monsanto Technology Llc Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof
US7460252B2 (en) * 2003-01-13 2008-12-02 Axiohm Transaction Solutions, Inc. Graphical printing system and method using text triggers
BRPI0407173B1 (pt) 2003-01-31 2019-10-01 Monsanto Technology Llc Métodos para produzir planta que tolera aplicação de herbicida glifosato e para produzir feno de alfafa
BRPI0407296A (pt) * 2003-02-05 2006-03-07 Divergence Inc ácidos nucléicos que codificam agentes antelmìnticos e plantas produzidas a partir deles
EP2933334B1 (en) 2003-02-18 2019-09-18 Baylor College of Medicine Induced activation in dendritic cells
EP2116606B1 (en) 2003-03-28 2012-12-19 Monsanto Technology, LLC Novel plant promoters for use in early seed development
TW200424214A (en) * 2003-04-21 2004-11-16 Advisys Inc Plasmid mediated GHRH supplementation for renal failures
EP1921152A1 (en) 2003-05-05 2008-05-14 Monsanto Technology, LLC Transgenic plants with glycine-betaine specific promoter
DE10333712A1 (de) * 2003-07-23 2005-03-03 Carl Zeiss Verfahren zum fehlerreduzierten Abbilden eines Objekts
US7560611B2 (en) 2003-08-05 2009-07-14 Monsanto Technology Llc Method and apparatus for substantially isolating plant tissues
US7150993B2 (en) * 2003-08-05 2006-12-19 Monsanto Technology Llc Method for excision of plant embryos for transformation
DK1656449T3 (da) * 2003-08-21 2009-06-02 Monsanto Technology Llc Fedtsyredesaturaser fra primula
EP1658364B1 (en) 2003-08-25 2017-05-31 Monsanto Technology LLC Tubulin regulatory elements for use in plants
WO2005033319A2 (en) 2003-10-02 2005-04-14 Monsanto Technology Llc Stacking crop improvement traits in transgenic plants
EP1697391B1 (en) * 2003-12-23 2011-10-05 Monsanto Technology, LLC Use of a low-oxygen environment in plant transformation
EP1709188A1 (en) * 2004-01-16 2006-10-11 Ceres, Inc. Plant cells having receptor polypeptides
WO2005069986A2 (en) 2004-01-20 2005-08-04 Monsanto Technology Llc Chimeric promoters for use in plants
US7368629B2 (en) * 2004-02-04 2008-05-06 Divergence, Inc. Nucleic acids encoding anthelmintic agents and plants made therefrom
US7683237B2 (en) 2004-02-10 2010-03-23 Monsanto Technology Llc Maize seed with synergistically enhanced lysine content
AR047598A1 (es) 2004-02-10 2006-01-25 Monsanto Technology Llc Semilla de maiz transgenica con mayor contenido de aminoacidos
WO2005087007A1 (en) 2004-03-10 2005-09-22 Monsanto Technology Llc Herbicidal compositions containing n-phosphonomethyl glycine and an auxin herbicide
US20050220901A1 (en) * 2004-03-22 2005-10-06 Huttenbauer Samuel Jr Methods of pharmaceutical separation from plants
US20060041961A1 (en) 2004-03-25 2006-02-23 Abad Mark S Genes and uses for pant improvement
US20070197474A1 (en) * 2004-03-30 2007-08-23 Clinton William P Methods for controlling plants pathogens using N-phosphonomethylglycine
US7250298B2 (en) * 2004-04-07 2007-07-31 The University Of Chicago Monomeric red fluorescent proteins
CA2562022C (en) 2004-04-09 2016-01-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for control of insect infestations in plants
AU2005235081B2 (en) * 2004-04-16 2011-06-16 Monsanto Technology Llc Expression of fatty acid desaturases in corn
AU2005238475A1 (en) * 2004-04-23 2005-11-10 Ceres Inc. Methods and materials for improving plant drought tolerance
NZ550600A (en) 2004-04-28 2010-03-26 Btg Int Ltd Epitopes related to coeliac disease
US10105437B2 (en) 2004-04-28 2018-10-23 Btg International Limited Epitopes related to coeliac disease
US20060075522A1 (en) 2004-07-31 2006-04-06 Jaclyn Cleveland Genes and uses for plant improvement
CA2577736A1 (en) * 2004-08-20 2006-03-02 Ceres, Inc. P450 polynucleotides, polypeptides, and uses thereof
EP1788861B1 (en) 2004-08-24 2017-04-12 Monsanto Technology, LLC Adenylate translocator protein gene non-coding regulatory elements for use in plants
EP1789539A2 (en) 2004-09-14 2007-05-30 Monsanto Technology, LLC Promoter molecules for use in plants
US7595433B2 (en) 2004-09-14 2009-09-29 Ceres, Inc. Modulations of amino acid and sugar content in plants
US20060059585A1 (en) * 2004-09-14 2006-03-16 Boris Jankowski Modulating plant sugar levels
US7429692B2 (en) * 2004-10-14 2008-09-30 Ceres, Inc. Sucrose synthase 3 promoter from rice and uses thereof
CA2584960A1 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Charles L. Niblett Methods and materials for conferring resistance to pests and pathogens of plants
ES2503765T3 (es) 2004-11-12 2014-10-07 Asuragen, Inc. Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN
US9758790B2 (en) 2004-12-08 2017-09-12 Ceres, Inc. Modulating the level of components within plants
WO2007089610A1 (en) * 2006-01-26 2007-08-09 Ceres, Inc. Modulating plant oil levels
US7329797B2 (en) * 2004-12-08 2008-02-12 Ceres, Inc. Modulating plant carbon levels
WO2007050625A1 (en) * 2005-10-25 2007-05-03 Ceres, Inc. Modulation of triterpenoid content in plants
WO2008069878A2 (en) 2006-10-27 2008-06-12 Ceres, Inc. Modulating lignin in plants
US7335510B2 (en) * 2004-12-16 2008-02-26 Ceres, Inc. Modulating plant nitrogen levels
WO2007044043A2 (en) 2004-12-21 2007-04-19 Monsanto Technology, Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US8314290B2 (en) 2004-12-21 2012-11-20 Monsanto Technology Llc Temporal regulation of gene expression by MicroRNAs
EP3372676A1 (en) 2004-12-21 2018-09-12 Monsanto Technology, LLC Recombinant dna constructs and methods for controlling gene expression
CN101384167A (zh) 2004-12-21 2009-03-11 孟山都技术有限公司 具有改良农业性状的转基因植物
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
US7335760B2 (en) * 2004-12-22 2008-02-26 Ceres, Inc. Nucleic acid sequences encoding zinc finger proteins
WO2006076423A2 (en) 2005-01-12 2006-07-20 Monsanto Technology, Llc Genes and uses for plant improvement
WO2006091676A2 (en) * 2005-02-22 2006-08-31 Ceres Inc. Modulating plant alkaloids
US7273974B1 (en) 2005-02-28 2007-09-25 Syngenta (At) Limited Inbred corn line G0805
US7205463B1 (en) 2005-02-28 2007-04-17 Syngenta (At) Limited Inbred corn line G1505
US7358426B1 (en) 2005-03-01 2008-04-15 Syngenta (At) Limited Inbred corn line G7905
US7411116B1 (en) 2005-03-01 2008-08-12 Syngenta Participations Ag Inbred corn line G5205
CA2800359A1 (en) 2005-03-16 2006-09-28 Metabolix, Inc. Chemically inducible expression of biosynthetic pathways
US7498493B1 (en) 2005-03-31 2009-03-03 Syngenta Participations Ag Inbred corn line GH05-60231
US7339095B1 (en) 2005-03-31 2008-03-04 Golden Harvest Seeds, Inc. Inbred corn line GH05-60071
US7276651B1 (en) 2005-03-31 2007-10-02 Golden Harvest Seeds, Inc. Inbred corn line GN05-61211
US7179973B1 (en) 2005-03-31 2007-02-20 Golden Harvest Seeds, Inc Inbred corn line GS05-32431
US20060236421A1 (en) * 2005-04-14 2006-10-19 Pennell Roger I Secondary metabolite production via manipulation of genome methylation
US7312376B2 (en) * 2005-04-20 2007-12-25 Ceres, Inc. Regulatory regions from Papaveraceae
WO2006121902A2 (en) 2005-05-05 2006-11-16 Monsanto Technology Llc Interaction of glyphosate with photosystem ii inhibitor herbicides as a selection tool for roundup ready events
WO2006138005A2 (en) 2005-05-10 2006-12-28 Monsanto Technology, Llc Genes and uses for plant improvement
AR053269A1 (es) 2005-05-16 2007-04-25 Monsanto Technology Llc Plantas y semillas de maiz con mejoramiento de asparagina y proteina
AP2693A (en) 2005-05-27 2013-07-16 Monsanto Technology Llc Soybean event MON89788 and methods for detection thereof
US8124839B2 (en) * 2005-06-08 2012-02-28 Ceres, Inc. Identification of terpenoid-biosynthesis related regulatory protein-regulatory region associations
US8046280B2 (en) * 2005-06-10 2011-10-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for using environmental classification to assist in financial management and services
US20070005451A1 (en) * 2005-06-10 2007-01-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Crop value chain optimization
WO2007019634A1 (en) * 2005-08-19 2007-02-22 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Arachnocampa luciferases
WO2007030674A2 (en) * 2005-09-07 2007-03-15 Maxcyte, Inc. Use of nucleases to improve viability and enhance transgene expression in transfected cells
JP2009507853A (ja) * 2005-09-07 2009-02-26 ジェンネレックス インコーポレイティッド Ｇｍ−ｃｓｆ発現ポックスウイルスを用いる転移性および／または全身播種性癌の全身処置
US8980246B2 (en) 2005-09-07 2015-03-17 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy
US9121028B2 (en) * 2005-09-09 2015-09-01 Monsanto Technology Llc Selective gene expression in plants
TWI390037B (zh) 2005-09-16 2013-03-21 Monsanto Technology Llc 用於植物之昆蟲感染的基因控制方法及其組合物
US20100062137A1 (en) * 2005-09-30 2010-03-11 Steven Craig Bobzin Modulating plant tocopherol levels
US20070079396A1 (en) 2005-10-03 2007-04-05 Malvar Thomas M Transgenic plant seed with increased lysine
EP3339441A1 (en) 2005-10-13 2018-06-27 Monsanto Technology LLC Methods for producing hybrid seed
RU2412250C2 (ru) * 2005-11-04 2011-02-20 Закрытое акционерное общество "ЕВРОГЕН" Модифицированные зеленые флуоресцентные белки и способы их использования
WO2007078280A2 (en) 2005-12-21 2007-07-12 Monsanto Technology, Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US7663020B2 (en) * 2006-01-11 2010-02-16 Agrinomics Llc Generation of plants with altered oil content
PT2465341E (pt) 2006-01-12 2015-03-09 Cibus Europe Bv Mutantes de epsps
US20090317421A1 (en) 2006-01-18 2009-12-24 Dominique Missiakas Compositions and methods related to staphylococcal bacterium proteins
CA2639900C (en) * 2006-01-23 2014-08-26 Board Of Trustees Of Michigan State University Methods for breeding glyphosate resistant plants and compositions thereof
US20090304901A1 (en) * 2006-01-25 2009-12-10 Steven Craig Bobzin Modulating plant protein levels
US8563703B2 (en) 2006-01-25 2013-10-22 Evrogen IP Joint Stock Company Fluorescent proteins and methods for using same
ATE483018T1 (de) * 2006-01-25 2010-10-15 Evrogen Ip Neue fluoreszenzproteine und verfahren zur verwendung davon
US7534942B2 (en) * 2006-01-30 2009-05-19 Syngenta Participations Ag Inbred corn line G06-NP2536
US7378580B2 (en) * 2006-01-30 2008-05-27 Syngenta Participations Ag Inbred corn line G06-NP2546
US7368641B2 (en) * 2006-01-30 2008-05-06 Syngenta Participations Ag Inbred corn line G06-NP2414
US20070180557A1 (en) * 2006-01-30 2007-08-02 David Uhr Inbred corn line G06-NP2405
US7371942B2 (en) * 2006-01-30 2008-05-13 Syngenta Participation Inbred corn line G06-NP2482
US7868228B2 (en) 2006-01-31 2011-01-11 Monsanto Technology Llc Phosphopantetheinyl transferases from bacteria
CN101501199B (zh) 2006-02-10 2016-11-09 孟山都技术有限公司 用于控制植物寄生线虫的靶基因的鉴定和用途
CN101384721A (zh) 2006-02-13 2009-03-11 孟山都技术有限公司 选择和稳定dsRNA构建体
CN101421406B (zh) 2006-02-13 2016-08-31 孟山都技术有限公司 用于产生改变的种子油组成的核酸构建体和方法
EP2843053A1 (en) 2006-02-17 2015-03-04 Monsanto Technology LLC Chimeric regulatory sequences comprising introns for plant gene expression
US20070199090A1 (en) * 2006-02-22 2007-08-23 Nestor Apuya Modulating alkaloid biosynthesis
WO2007120989A2 (en) * 2006-02-24 2007-10-25 Ceres, Inc. Shade regulatory regions
US7390943B1 (en) 2006-02-27 2008-06-24 Syngenta Participation Ag Inbred corn line G06-NP2598
US7326834B1 (en) 2006-02-27 2008-02-05 Syngenta Participations Ag Inbred corn line G06-NP2744
US7435884B1 (en) 2006-02-27 2008-10-14 Bruce Skillings Inbred corn line G06-NP2593
US7390944B1 (en) 2006-02-27 2008-06-24 Syngeata Participations Ag Inbred corn line G06-NP2739
US7371943B1 (en) 2006-02-28 2008-05-13 Syngenta Participations Ag Inbred corn line G06-NP2760
US7351889B1 (en) 2006-02-28 2008-04-01 Syngenta Participations Ag Inbred corn line G06-NP2873
US7348474B1 (en) 2006-02-28 2008-03-25 Syngenta Participations Ag Inbred corn line G06-NP2907
US7388138B1 (en) 2006-02-28 2008-06-17 Syngenta Participations Ag Inbred corn line G06-NP2608
US7323626B1 (en) 2006-02-28 2008-01-29 Syngenta Participations Ag Inbred corn line G06-NP2623
US7361816B1 (en) 2006-02-28 2008-04-22 Syngenta Participations Ag Inbred corn line G06-NP2742
US7368642B1 (en) 2006-02-28 2008-05-06 Syngenta Paricipations Ag Inbred corn line G06-NP2743
US7820883B2 (en) 2006-03-15 2010-10-26 Dow Agrosciences Llc Resistance to auxinic herbicides
CA2647984A1 (en) 2006-03-31 2008-01-31 Reliance Life Sciences Pvt Ltd Direct regeneration of plantlets in jatropha curcas
WO2007117693A2 (en) * 2006-04-07 2007-10-18 Ceres, Inc. Regulatory protein-regulatory region associations related to alkaloid biosynthesis
JP2009536029A (ja) * 2006-05-09 2009-10-08 リライアンス ライフ サイエンシーズ プライベイト リミテッド ヤトロファ・クルカス（Ｊａｔｒｏｐｈａｃｕｒｃａｓ）由来のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）遺伝子の分子クローニングおよび配列決定
CA2651895C (en) 2006-05-09 2014-05-06 The Curators Of The University Of Missouri Plant artificial chromosome platforms via telomere truncation
WO2008005619A2 (en) * 2006-05-10 2008-01-10 Ceres, Inc. Shade tolerance in plants
EP2016181B1 (en) 2006-05-12 2013-04-17 Monsanto Technology, LLC Methods and compositions for obtaining marker-free transgenic plants
WO2007133804A2 (en) * 2006-05-15 2007-11-22 Ceres, Inc. Modulation of oil levels in plants
BRPI0712514B1 (pt) 2006-05-25 2018-06-05 Monsanto Technology Llc Processo para seleção de uma planta de soja resistente à ferrugem asiática da soja
US7855326B2 (en) 2006-06-06 2010-12-21 Monsanto Technology Llc Methods for weed control using plants having dicamba-degrading enzymatic activity
WO2007147068A2 (en) * 2006-06-14 2007-12-21 Ceres, Inc. Increasing uv-b tolerance in plants
WO2007149570A2 (en) * 2006-06-21 2007-12-27 Ceres, Inc. Modulation of protein levels in plants
WO2008064222A2 (en) * 2006-11-20 2008-05-29 Ceres, Inc. Shade tolerance in plants
US20130191941A1 (en) 2006-07-05 2013-07-25 Shing Kwok Modulating light response pathways in plants, increasing light-related tolerances in plants, and increasing biomass in plants
US8344210B2 (en) * 2006-07-05 2013-01-01 Ceres, Inc. Increasing low light tolerance in plants
WO2008011468A2 (en) * 2006-07-19 2008-01-24 Monsanto Technology Llc Fatty acid desaturases from tetraselmis suecica
ATE543097T1 (de) 2006-07-27 2012-02-15 Univ Maryland Zellulärer rezeptor für antiproliferativen faktor
BRPI0716748A2 (pt) 2006-08-15 2013-09-17 Monsanto Technology Llc composiÇÕes e mÉtodos de procriaÇço de planta usando informaÇço de marcadores de densidade alta.
WO2008021543A2 (en) 2006-08-17 2008-02-21 Monsanto Technology, Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US8124411B2 (en) 2006-08-31 2012-02-28 Monsanto Technology Llc Methods for producing transgenic plants
CL2007002532A1 (es) * 2006-08-31 2008-01-11 Monsanto Technology Llc Soc Organizada Bajo Las Leyes Del Estado De Delaware Procedimiento para identificar genes que confieren rasgos mejorados de una población de plantas.
EP2059596B1 (en) 2006-08-31 2017-10-04 Monsanto Technology, LLC Phased small rnas
CN105769931B (zh) 2006-09-15 2021-04-27 渥太华医院研究机构 溶瘤弹状病毒
WO2008094316A2 (en) * 2006-09-22 2008-08-07 Stowers Institute Of Medical Research Novel branchiostoma derived fluorescent proteins
US20080086340A1 (en) * 2006-10-04 2008-04-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Crop quality insurance
EP2985353A1 (en) 2006-10-12 2016-02-17 Monsanto Technology LLC Plant micrornas and methods of use thereof
EP2053916A2 (en) 2006-10-16 2009-05-06 Monsanto Technology, LLC Methods and compositions for improving plant health
EP2465510B1 (en) 2006-10-19 2018-11-28 Baylor College Of Medicine Methods and compositions for generating an immune response by inducing CD40 and pattern recognition receptors and adaptors thereof
CN101617039A (zh) * 2006-10-20 2009-12-30 代表亚利桑那大学的亚利桑那校董会 经修饰的蓝细菌
US7939721B2 (en) 2006-10-25 2011-05-10 Monsanto Technology Llc Cropping systems for managing weeds
US20100205688A1 (en) * 2006-11-03 2010-08-12 Shing Kwok Increasing tolerance of plants to low light conditions
WO2008061153A2 (en) 2006-11-15 2008-05-22 Agrigenetics, Inc. Generation of plants with altered protein, fiber, or oil content
CA2669875C (en) 2006-11-15 2017-01-03 Agrigenetics, Inc. Generation of plants with altered protein, fiber, or oil content
WO2008061159A2 (en) * 2006-11-15 2008-05-22 Agrigenetics, Inc. Generation of plants with altered protein, fiber, or oil, content
WO2008079545A2 (en) * 2006-11-15 2008-07-03 Agrigenetics, Inc. Generation of plants with altered protein, fiber, or oil content
WO2008061157A2 (en) 2006-11-15 2008-05-22 Agrigenetics, Inc. Generation of plants with altered protein, fiber, or oil content
WO2008064128A2 (en) * 2006-11-22 2008-05-29 Ceres, Inc. Broadly expressing regulatory regions
CA2671264C (en) 2006-11-30 2015-11-24 Research Development Foundation Improved immunoglobulin libraries
MX2009006464A (es) * 2006-12-15 2009-08-25 Agrinomics Llc Generacion de plantas con contenido de aceite, proteina o fibra alterado.
US7851673B2 (en) 2006-12-15 2010-12-14 Agrinomics Llc Generation of plants with altered oil, protein, or fiber content
WO2008076831A2 (en) * 2006-12-15 2008-06-26 Agrinomics Llc Generation of plants with altered oil, protein, or fiber content
US20100151109A1 (en) * 2006-12-15 2010-06-17 Amr Saad Ragab Modulation of plant protein levels
MX2009006465A (es) * 2006-12-15 2009-08-21 Agrinomics Llc Generacion de plantas con contenido de aceite, proteina o fibra alterado.
CA2672488C (en) 2006-12-15 2017-06-13 Agrigenetics, Inc. Generation of plants with altered oil, protein, or fiber content
US8417534B2 (en) * 2006-12-29 2013-04-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Automated location-based information recall
EP1949785A1 (en) 2007-01-26 2008-07-30 Coöperatie AVEBE U.A. Use of R-genes as a selection marker in plant transformation and use of cisgenes in plant transformation
EP2115141A4 (en) 2007-02-20 2010-08-04 Monsanto Technology Llc INVERTEBRA MICRO-RNA
US7838729B2 (en) 2007-02-26 2010-11-23 Monsanto Technology Llc Chloroplast transit peptides for efficient targeting of DMO and uses thereof
EP2126096B1 (en) 2007-03-09 2013-12-18 Monsanto Technology, LLC Methods for plant transformation using spectinomycin selection
KR20080084528A (ko) 2007-03-15 2008-09-19 제네렉스 바이오테라퓨틱스 인크. 종양살상형 백시니아 바이러스 암 치료
AU2008245611B2 (en) 2007-04-27 2014-09-18 University Of California Plant CO2 sensors, nucleic acids encoding them, and methods for making and using them
US8609936B2 (en) 2007-04-27 2013-12-17 Monsanto Technology Llc Hemipteran-and coleopteran active toxin proteins from Bacillus thuringiensis
US8629245B2 (en) 2007-05-01 2014-01-14 Research Development Foundation Immunoglobulin Fc libraries
US20110214199A1 (en) 2007-06-06 2011-09-01 Monsanto Technology Llc Genes and uses for plant enhancement
AR066922A1 (es) 2007-06-08 2009-09-23 Monsanto Technology Llc Metodos de mejoramiento molecular del germoplasma de una planta por secuenciamiento dirigido
BRPI0813098A2 (pt) * 2007-06-18 2014-11-11 Agrinomics Llc Geração de plantas com teor alterado de óleo, proteína ou fibra
EP2175714A4 (en) 2007-07-10 2011-01-26 Monsanto Technology Llc TRANSGENIC PLANTS WITH IMPROVED AGRONOMIC CHARACTERISTICS
US20090070903A1 (en) 2007-08-29 2009-03-12 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Goss' Wilt Resistance in Corn
CN101951948B (zh) 2007-08-31 2015-12-09 芝加哥大学 与针对葡萄球菌性肺部疾病和病症进行免疫相关的方法和组合物
CA2937438C (en) 2007-09-27 2020-07-07 Dow Agrosciences Llc Engineered zinc finger proteins targeting 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase genes
WO2009059305A2 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 The University Of Chicago Red fluorescent proteins with enhanced bacterial expression, increased brightness and reduced aggregation
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
WO2009085982A1 (en) * 2007-12-19 2009-07-09 Monsanto Technology Llc Method to enhance yield and purity of hybrid crops
US20090183276A1 (en) * 2008-01-10 2009-07-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel Bacillus Thuringiensis Gene with Coleopteran Activity
US9605035B2 (en) 2008-01-10 2017-03-28 Research Development Foundation Vaccines and diagnostics for the ehrlichioses
JP5674476B2 (ja) 2008-01-25 2015-02-25 ピー５３ インコーポレイテッド Ｐ５３バイオマーカー
CA3224206A1 (en) 2008-02-15 2009-08-20 Ceres, Inc. Drought and heat tolerance in plants
CN102027115A (zh) 2008-03-31 2011-04-20 希尔雷斯股份有限公司 启动子、启动子控制元件以及其组合和用途
EP2607488B1 (en) 2008-04-07 2016-11-02 Monsanto Technology LLC Plant regulatory elements and uses thereof
EP2336332A3 (en) 2008-04-29 2011-11-09 Monsanto Technology LLC Genes and uses for plant enhancement
JP2011522540A (ja) 2008-06-04 2011-08-04 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド 非ウイルスアプローチを用いたｉＰＳ細胞の産生のための方法
US20110214196A1 (en) * 2008-06-20 2011-09-01 University Of Georgia Research Foundation Development of herbicide-resistant grass species
WO2009155580A1 (en) * 2008-06-20 2009-12-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Development of herbicide-resistant grass species
CA2729713C (en) 2008-07-01 2020-07-28 Monsanto Technology Llc Recombinant dna constructs and methods for modulating expression of a target gene
US8338665B2 (en) 2008-07-16 2012-12-25 Monsanto Technology Llc Methods and vectors for producing transgenic plants
US8419145B2 (en) * 2008-07-25 2013-04-16 Eastman Kodak Company Inkjet printhead and method of printing with multiple drop volumes
JP2012500005A (ja) 2008-08-12 2012-01-05 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド ｉＰＳ細胞を生成するための方法
AU2009282625A1 (en) 2008-08-18 2010-02-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Derivatives of APF and methods of use
AU2009292996B2 (en) 2008-09-22 2015-04-23 Baylor College Of Medicine Methods and compositions for generating an immune response by inducing CD40 and pattern recognition receptor adapters
CA2739581A1 (en) 2008-10-06 2010-04-15 University Of Chicago Compositions and methods related to bacterial eap, emp, and/or adsa proteins
US8298794B2 (en) * 2008-10-09 2012-10-30 Ceres, Inc. Cinnamyl-alcohol dehydrogenases
DK2337791T3 (da) 2008-10-14 2013-11-04 Monsanto Technology Llc Anvendelse af fedtsyredesaturaser fra Hemiselmis SPP
EP2370568B1 (en) 2008-12-10 2017-07-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Mek mutations conferring resistance to mek inhibitors
US20110258735A1 (en) 2008-12-22 2011-10-20 Marie Coffin Genes and uses for plant enhancement
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
WO2010084488A1 (en) 2009-01-20 2010-07-29 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Mir-21 promoter driven targeted cancer therapy
US20120058523A1 (en) 2009-02-17 2012-03-08 Edenspace Systems Corporation Tempering of cellulosic biomass
US8383887B2 (en) * 2009-02-18 2013-02-26 Southern Illinois University Carbondale Methods of using plants containing the gdhA gene
US20120277117A1 (en) 2009-02-27 2012-11-01 Adel Zayed Hydroponic apparatus and methods of use
CA2754108A1 (en) 2009-03-05 2010-09-10 Metabolix, Inc. Propagation of transgenic plants
WO2010102293A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Metabolix, Inc. Method of positive plant selection using sorbitol dehydrogenase
WO2011005341A2 (en) 2009-04-03 2011-01-13 University Of Chicago Compositions and methods related to protein a (spa) variants
US8071865B2 (en) * 2009-04-15 2011-12-06 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of corn variety CV589782
US8362332B2 (en) * 2009-04-15 2013-01-29 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of corn variety CV165560
US8071864B2 (en) * 2009-04-15 2011-12-06 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of corn variety CV897903
BRPI1013833A2 (pt) 2009-04-20 2019-04-09 Monsanto Technology Llc resistência a múltiplos vírus em plantas
US8748381B2 (en) 2009-04-28 2014-06-10 Vanderbilt University Compositions and methods for the treatment of disorders involving epithelial cell apoptosis
US10555527B2 (en) 2009-05-18 2020-02-11 Monsanto Technology Llc Use of glyphosate for disease suppression and yield enhancement in soybean
WO2010138971A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Edenspace Systems Corporation Plant gene regulatory elements
EP3150701B1 (en) 2009-06-05 2018-10-03 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Reprogramming t cells and hematopoietic cells
CA2764503A1 (en) 2009-06-05 2010-12-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Isolation and targeted suppression of lignin biosynthetic genes from sugarcane
US20110010213A1 (en) * 2009-07-09 2011-01-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for capturing and reporting relevant crop genotype-specific performance information to scientists for continued crop genetic improvement
EA202091701A1 (ru) 2009-07-20 2021-01-29 Серес, Инк. Увеличение биомассы трансгенных растений
WO2011019652A2 (en) 2009-08-10 2011-02-17 Monsanto Technology Llc Low volatility auxin herbicide formulations
EP2470653A1 (en) 2009-08-26 2012-07-04 Research Development Foundation Methods for creating antibody libraries
KR101759888B1 (ko) 2009-09-14 2017-07-20 신라젠(주) 종양 용해 백시니아 바이러스 병용 암 치료요법
WO2011034433A1 (en) 2009-09-18 2011-03-24 Wageningen Universiteit Cloning and exploitation of a functional r-gene from solanum chacoense
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
US8937214B2 (en) 2009-10-23 2015-01-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for expression of transgenes in plants
AU2010329551B2 (en) 2009-12-10 2016-02-11 Turnstone Limited Partnership Oncolytic rhabdovirus
PL2816112T3 (pl) 2009-12-10 2019-03-29 Regents Of The University Of Minnesota Modyfikacja DNA za pośrednictwem efektorów TAL
BR112012015690A2 (pt) 2009-12-23 2015-08-25 Bayer Intelectual Property Gmbh Plantas tolerantes a herbicidas inibidores de hppd.
EA201290559A1 (ru) 2009-12-23 2013-01-30 Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх Растения, устойчивые к гербицидам - ингибиторам hppd
AR079882A1 (es) 2009-12-23 2012-02-29 Bayer Cropscience Ag Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd
AU2010334818B2 (en) 2009-12-23 2015-07-09 Bayer Intellectual Property Gmbh Plants tolerant to HPPD inhibitor herbicides
MX2012007358A (es) 2009-12-23 2012-11-06 Bayer Ip Gmbh Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd.
BR112012019582B1 (pt) 2010-01-14 2021-09-21 Monsanto Technology Llc Molécula de dna compreendendo elementos reguladores de plantas
NZ600546A (en) 2010-01-22 2014-08-29 Dow Agrosciences Llc Excision of transgenes in genetically modified organisms
EP2531602B1 (en) 2010-02-04 2017-05-03 Bayer Intellectual Property GmbH A method for increasing photosynthetic carbon fixation using glycolate dehydrogenase multi-subunit fusion protein
WO2011100508A2 (en) 2010-02-12 2011-08-18 Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Methods and compositions related to glycoprotein-immunoglobulin fusions
EP3028699B1 (en) 2010-02-25 2018-03-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Braf mutations conferring resistance to braf inhibitors
ES2631458T3 (es) 2010-03-04 2017-08-31 Interna Technologies B.V. Molécula de ARNmi definida por su fuente y sus usos terapéuticos en el cáncer asociado a la EMT
EP3231872B1 (en) 2010-03-08 2020-05-06 Monsanto Technology LLC Polynucleotide molecules for gene regulation in plants
JP2013523818A (ja) 2010-04-05 2013-06-17 ザ・ユニバーシティー・オブ・シカゴ 免疫反応のエンハンサーとしてのプロテインＡ（ＳｐＡ）抗体に関連する組成物および方法
WO2011126976A1 (en) 2010-04-07 2011-10-13 Vanderbilt University Reovirus vaccines and methods of use therefor
CA2796601C (en) 2010-04-19 2019-03-26 Research Development Foundation Rtef-1 variants and uses thereof
US9441233B2 (en) 2010-05-06 2016-09-13 Ceres, Inc. Transgenic plants having increased biomass
CA2798988C (en) 2010-05-17 2020-03-10 Sangamo Biosciences, Inc. Tal-effector (tale) dna-binding polypeptides and uses thereof
BR112012029422A2 (pt) 2010-05-19 2017-10-03 The Samuel Roberts Noble Found Inc Morfologia de folha alterada e propriedades agronômicas melhoradas em plantas
US9089520B2 (en) 2010-05-21 2015-07-28 Baylor College Of Medicine Methods for inducing selective apoptosis
EP2390332A1 (en) 2010-05-31 2011-11-30 Coöperatie Avebe U.A. Cloning and exploitation of a functional R-gene from Solanum x edinense
CA3176307A1 (en) 2010-06-02 2011-12-08 Evolva Nutrition, Inc. Recombinant production of steviol glycosides
CN103097526B (zh) 2010-06-09 2015-09-16 达纳－法伯癌症研究所公司 赋予针对raf和mek抑制剂的抗性的mek1突变
US20110312001A1 (en) 2010-06-15 2011-12-22 Emile Nuwaysir Compendium of ready-built stem cell models for interrogation of biological response
AU2011267849B2 (en) 2010-06-15 2015-02-05 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Generation of induced pluripotent stem cells from small volumes of peripheral blood
FR2961375B1 (fr) 2010-06-16 2016-05-13 Inst De Rech Pour Le Dev (Ird) Surproduction d'acide jasmonique dans des plantes transgeniques
DK2862931T3 (en) 2010-06-24 2017-05-01 Dow Agrosciences Llc REDUCTION OF Saturated fatty acids from plant seeds
AR081302A1 (es) 2010-06-24 2012-08-01 Brookhaven Science Ass Llc Acumulacion de acidos grasos omega-7 ( -7) en semillas de plantas
CA2803298C (en) 2010-07-02 2020-07-14 The University Of Chicago Compositions and methods related to protein a (spa) variants
WO2012005572A1 (en) 2010-07-06 2012-01-12 Interna Technologies Bv Mirna and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with melanoma, or in diseases or conditions associated with activated braf pathway
EP2591093B1 (en) 2010-07-07 2018-11-28 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Endothelial cell production by programming
US9441235B2 (en) 2010-07-23 2016-09-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Feruloyl-CoA:monolignol transferase
US8765470B2 (en) 2010-08-04 2014-07-01 Cellular Dynamics International, Inc. Reprogramming immortalized B-cells to induced pluripotent stem cells
US8816153B2 (en) 2010-08-27 2014-08-26 Monsanto Technology Llc Recombinant DNA constructs employing site-specific recombination
KR20140016865A (ko) 2010-08-30 2014-02-10 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 사탕수수 간균형 바이러스(scbv) 인핸서 및 식물 기능유전체학에서의 그의 용도
US9095540B2 (en) 2010-09-09 2015-08-04 The University Of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens
JP6124791B2 (ja) 2010-09-22 2017-05-10 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイトＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＯＬＯＲＡＤＯ，ａ ｂｏｄｙ ｃｏｒｐｏｒａｔｅ Ｓｍａｄ７の治療的適用
BR112013010278B1 (pt) 2010-10-27 2020-12-29 Ceres, Inc método para produzir uma planta, método para modular a composição de biomassa em uma planta, ácido nucleico isolado e método para alterar a composição de biomassa em uma planta
WO2012061615A1 (en) 2010-11-03 2012-05-10 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Transcription factors for modification of lignin content in plants
AR083029A1 (es) 2010-12-09 2013-01-23 Syngenta Participations Ag Metodos y composiciones que utilizan arn interferente pequeño (arnip) para el control de nematodos en plantas
AU2011351946B2 (en) 2010-12-30 2017-05-18 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that target the vacuolar ATPase C subunit and confer resistance to coleopteran pests
JP6223187B2 (ja) 2010-12-30 2017-11-01 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 鞘翅目有害生物に対する抵抗性を付与する核酸分子
EP2658975A4 (en) 2010-12-30 2014-10-22 Dow Agrosciences Llc NUCLEIC ACID MOLECULES PROVIDED TO THE V ATPASE H SUB-UNIT AND RESISTANT TO COLEOPTERAN PENGUES
CN103429258B (zh) 2011-01-04 2016-03-09 新罗杰公司 通过施用溶瘤痘苗病毒生成针对肿瘤抗原的抗体和生成肿瘤特异性补体依赖性细胞毒性
EP2474617A1 (en) 2011-01-11 2012-07-11 InteRNA Technologies BV Mir for treating neo-angiogenesis
JP6228014B2 (ja) 2011-02-07 2017-11-08 リサーチ ディベロップメント ファウンデーション 操作された免疫グロブリンＦｃポリペプチド
EP2673358B1 (en) 2011-02-08 2019-01-09 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Hematopoietic precursor cell production by programming
NL2006378C2 (en) 2011-03-11 2012-09-12 Univ Wageningen Tyclv resistance.
WO2012136653A1 (en) 2011-04-08 2012-10-11 Novvac Aps Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus
AU2012242991B2 (en) 2011-04-11 2017-03-02 Targeted Growth, Inc. Identification and the use of KRP mutants in plants
US8901371B2 (en) 2011-05-06 2014-12-02 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Compositions and methods for improved plant feedstock
US8945588B2 (en) 2011-05-06 2015-02-03 The University Of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens, such as EBH polypeptides
WO2012170304A2 (en) 2011-06-02 2012-12-13 The Regents Of The University Of California Plants with elevated levels of glucan
WO2012168124A1 (en) 2011-06-06 2012-12-13 Bayer Cropscience Nv Methods and means to modify a plant genome at a preselected site
WO2012167382A1 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Compositions and methods for glioblastoma treatment
PE20141518A1 (es) 2011-07-01 2014-11-17 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para la regulacion selectiva de la expresion de proteinas
WO2013006861A1 (en) 2011-07-07 2013-01-10 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Sorghum grain shattering gene and uses thereof in altering seed dispersal
CA2841165A1 (en) 2011-07-11 2013-01-17 Cellular Dynamics International, Inc. Methods for cell reprogramming and genome engineering
EP3792350A1 (en) 2011-08-08 2021-03-17 Evolva SA Recombinant production of steviol glycosides
US20140248668A1 (en) 2011-08-08 2014-09-04 Evolva Sa Methods and Materials for Recombinant Production of Saffron Compounds
EP2742126B1 (en) 2011-08-08 2018-11-07 International Flavors & Fragrances Inc. Compositions and methods for the biosynthesis of vanillin or vanillin beta-d-glucoside
US9562236B2 (en) 2011-08-12 2017-02-07 Ceres, Inc. Transcription terminators
WO2013025834A2 (en) 2011-08-15 2013-02-21 The University Of Chicago Compositions and methods related to antibodies to staphylococcal protein a
WO2013026015A1 (en) 2011-08-18 2013-02-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Muc1 ligand traps for use in treating cancers
CN103890181A (zh) 2011-08-22 2014-06-25 拜尔作物科学公司 修饰植物基因组的方法和手段
UA116093C2 (uk) 2011-09-13 2018-02-12 Монсанто Текнолоджи Ллс Спосіб та композиція для боротьби з бур'янами (варіанти)
CA2848685A1 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control comprising topical application of a glutamine synthetase polynucleotide
CN104160028A (zh) 2011-09-13 2014-11-19 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9840715B1 (en) 2011-09-13 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants
MX350771B (es) 2011-09-13 2017-09-15 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para el control de malezas.
US9920326B1 (en) 2011-09-14 2018-03-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing invertase activity in plants
CA2851231C (en) 2011-10-06 2018-06-12 Board Of Trustees Of Michigan State University Hibiscus cannabinus feruloyl-coa:monolignol transferase
WO2013053899A1 (en) 2011-10-12 2013-04-18 Moeller Niels Iversen Peptides derived from campylobacter jejuni and their use in vaccination
BR122019001001B1 (pt) 2011-10-26 2019-08-27 Monsanto Technology Llc sais herbicidas de auxina, mistura de aplicação herbicida compreendendo os mesmos para uso na eliminação e controle do crescimento de plantas indesejadas, bem como métodos de controle de plantas indesejadas e de plantas suscetíveis ao herbicida de auxina
WO2013067128A1 (en) 2011-11-02 2013-05-10 Ceres, Inc. Transgenic plants having increased tolerance to aluminum
US10323256B2 (en) 2011-12-09 2019-06-18 Ceres, Inc. Transgenic plants having altered biomass composition
FR2984076A1 (fr) 2011-12-15 2013-06-21 Inst Rech Developpement Ird Surproduction de jasmonates dans des plantes transgeniques
US10428342B2 (en) 2011-12-16 2019-10-01 Board Of Trustees Of Michigan State University P-coumaroyl-CoA:monolignol transferase
US10174314B2 (en) 2011-12-22 2019-01-08 Interna Technologies B.V. MiRNA for treating head and neck cancer
US9540654B2 (en) 2012-02-01 2017-01-10 Dow Agrosciences Llc Synthetic brassica-derived chloroplast transit peptides
KR102076728B1 (ko) 2012-02-02 2020-02-12 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 식물 전사활성화 상호작용 모티프 및 그의 용도
EP2814965B1 (en) 2012-02-16 2018-03-21 Syngenta Participations AG Engineered pesticidal proteins
US8952229B1 (en) 2012-02-21 2015-02-10 Pioneer Hi Bred International Inc Maize inbred PH1K0H1
US8975469B1 (en) 2012-02-21 2015-03-10 Pioneer Hi Bred International Inc Maize hybrid X13C704HR
CA2865787C (en) 2012-02-27 2023-06-27 Board Of Trustees Of Michigan State University Control of cellulose biosynthesis by overexpession of a transcription factor myb46
RU2639517C2 (ru) 2012-02-29 2017-12-21 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Энхансер палочковидного вируса сахарного тростника (scbv) и его применение в функциональной геномике растений
WO2013136274A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 University Of Guelph Myb55 promoter and use thereof
EP3715365A1 (en) 2012-03-26 2020-09-30 Axcella Health Inc. Nutritive fragments, proteins and methods
AU2013205557B2 (en) 2012-04-17 2016-04-21 Corteva Agriscience Llc Synthetic brassica-derived chloroplast transit peptides
BR112014026861A2 (pt) 2012-04-26 2018-05-15 Univ Chicago antígenos de estafilococos coagulase e métodos de seu uso
EP2841101B1 (en) 2012-04-26 2019-08-07 University Of Chicago Compositions and methods related to antibodies that neutralize coagulase activity during staphylococcus aureus disease
WO2013169802A1 (en) 2012-05-07 2013-11-14 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
CN104619843B (zh) 2012-05-24 2020-03-06 A.B.种子有限公司 用于使基因表达沉默的组合物和方法
CA2873360A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 Wageningen Universiteit New plant resistance gene
WO2013184622A2 (en) 2012-06-04 2013-12-12 Monsanto Technology Llc Aqueous concentrated herbicidal compositions containing glyphosate salts and dicamba salts
WO2013184768A1 (en) 2012-06-05 2013-12-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of gene silencing in plants
BR112014031891A2 (pt) 2012-06-19 2017-08-01 Univ Minnesota direcionamento genético nas plantas utilizando vírus de dna
AU2013278070B2 (en) 2012-06-22 2019-07-11 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for mediating plant stomatal development in response to carbon dioxide and applications for engineering drought tolerance in plants
WO2014004683A2 (en) 2012-06-26 2014-01-03 Monsanto Technology Llc Methods and composition for enhanced forage quality
WO2014004487A1 (en) * 2012-06-29 2014-01-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Manipulation of serine/threonine protein phosphatases for crop improvement
DK2880167T3 (en) 2012-07-31 2018-07-30 Univ Texas METHODS AND COMPOSITIONS FOR IN VIVO-INDUCTION OF PANCREAS BETA CELL CREATION
WO2014028426A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for increasing pest resistance in plants
AU2013302947B2 (en) 2012-08-17 2017-06-01 Diaa ALABED Use of a maize untranslated region for transgene expression in plants
EP3406715B1 (en) 2012-09-07 2023-12-13 Corteva Agriscience LLC Fad3 performance loci and corresponding target site specific binding proteins capable of inducing targeted breaks
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
UA119532C2 (uk) 2012-09-14 2019-07-10 Байєр Кропсайєнс Лп Варіант hppd та спосіб його застосування
PT3622810T (pt) 2012-09-24 2024-04-03 Seminis Vegetable Seeds Inc Métodos e composições para prolongar a vida útil de produtos vegetais
AR093058A1 (es) 2012-10-18 2015-05-13 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para el control de pestes en plantas
WO2014065945A1 (en) 2012-10-23 2014-05-01 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Antibodies with engineered igg fc domains
EP2911519A4 (en) 2012-10-23 2016-06-01 Univ Montana State PRODUCTION OF HIGH QUALITY HARD WHEAT WITH INCREASED AMYLOSIS CONTENT
JP6450683B2 (ja) 2012-11-01 2019-01-09 セレクティス 治療用タンパク質の生産のための植物
EP2914733A1 (en) 2012-11-05 2015-09-09 Evolva SA Vanillin synthase
WO2014072357A1 (en) 2012-11-06 2014-05-15 Interna Technologies B.V. Combination for use in treating diseases or conditions associated with melanoma, or treating diseases or conditions associated with activated b-raf pathway
US20150307894A1 (en) 2012-11-28 2015-10-29 Monsanto Technology Llc Transgenic Plants With Enhanced Traits
ES2673864T3 (es) 2012-12-21 2018-06-26 Cellectis Patatas con endulzamiento inducido en frío reducido
WO2014100525A2 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for auxin-analog conjugation
AU2013371825B2 (en) 2013-01-01 2019-10-24 A.B. Seeds Ltd. Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
EP3919505B1 (en) 2013-01-16 2023-08-30 Emory University Uses of cas9-nucleic acid complexes
WO2014112875A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Wageningen Universiteit A new method to provide resistance to bacterial soft rot in plants
WO2014116721A1 (en) 2013-01-22 2014-07-31 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Geminiviral vector for expression of rituximab
US10000767B2 (en) 2013-01-28 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
AU2014211570A1 (en) 2013-01-29 2015-07-23 The University Court Of The University Of Glasgow Methods and means for increasing stress tolerance and biomass in plants
AU2014214004B2 (en) 2013-02-06 2018-05-24 Danstar Ferment Ag Methods for improved production of Rebaudioside D and Rebaudioside M
SG11201506127WA (en) 2013-02-11 2015-09-29 Evolva Sa Efficient production of steviol glycosides in recombinant hosts
US8921672B1 (en) 2013-02-13 2014-12-30 Pioneer Hi Bred International Inc Maize inbred PH24DS
US8907159B1 (en) 2013-02-13 2014-12-09 Pioneer Hi Bred International Inc Maize inbred PH24DM
US8916744B1 (en) 2013-02-13 2014-12-23 Pioneer Hi Bred International Inc Maize inbred PH24DV
CN105658790A (zh) 2013-02-21 2016-06-08 东安大略研究所儿童医院有限公司 疫苗组合物
EP2958992A1 (en) 2013-02-22 2015-12-30 Cellular Dynamics International, Inc. Hepatocyte production via forward programming by combined genetic and chemical engineering
WO2014134235A1 (en) 2013-02-27 2014-09-04 Monsanto Technology Llc Glyphosate composition for dicamba tank mixtures with improved volatility
WO2014134144A1 (en) 2013-02-28 2014-09-04 The General Hospital Corporation Mirna profiling compositions and methods of use
WO2014132137A2 (en) 2013-03-01 2014-09-04 Université De Genève Transgenic cell selection
JP6576251B2 (ja) 2013-03-08 2019-09-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイトＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＯＬＯＲＡＤＯ，ａ ｂｏｄｙ ｃｏｒｐｏｒａｔｅ ＰＴＤ−Ｓｍａｄ７薬物療法
US9434935B2 (en) 2013-03-10 2016-09-06 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Modified caspase polypeptides and uses thereof
AU2014248958A1 (en) 2013-03-13 2015-10-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
UY35379A (es) 2013-03-13 2014-09-30 Monsanto Technology Llc ?métodos y composiciones para el control de malezas?.
CA2942826A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Evolutionary Genomics, Inc. Identification and use of tomato genes controlling salt/drought tolerance and fruit sweetness
US9944690B2 (en) 2013-03-14 2018-04-17 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for controlling T cell proliferation
BR112015023286A2 (pt) 2013-03-14 2018-03-06 Arzeda Corp polipeptídeo recombinante com atividade da dicamba descarboxilase, construto de polinucleotídeo, célula, método de produção de uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo tendo atividade da dicamba descarboxilase, método para descarboxilar dicamba, um derivado de dicamba ou um metabolito de dicamba, método para a detecção de um polipeptideo e método para a detecção da presença de um polinucleotideo que codifica um polipeptideo tendo atividade da dicamba descarboxilase
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
CA2905595A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions having dicamba decarboxylase activity and methods of use
LT2966984T (lt) 2013-03-15 2022-05-25 Cibus Us Llc Tikslinė genų modifikacija, naudojant oligonukleotidų sukeltą genų taisymą
US10113162B2 (en) 2013-03-15 2018-10-30 Cellectis Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the FAD2-1A/1B genes
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
EP2810952A1 (en) 2013-06-03 2014-12-10 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Novel pest control methods
AU2014274916B2 (en) 2013-06-05 2019-10-31 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for inducing partial apoptosis using caspase polypeptides
EP3431606A1 (en) 2013-07-01 2019-01-23 Bayer CropScience NV Methods and means for modulating flowering time in monocot plants
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
EP3030663B1 (en) 2013-07-19 2019-09-04 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for controlling leptinotarsa
CA2923857A1 (en) 2013-09-09 2015-03-12 Figene, Llc Gene therapy for the regeneration of chondrocytes or cartilage type cells
ES2791364T3 (es) 2013-09-11 2020-11-04 Impossible Foods Inc Secreción de polipéptidos que contienen hemo
MX2016003845A (es) 2013-09-23 2017-01-05 Centro De Investigación Y De Estudios Avanzados Del Inst Politecnico Nac (Cinvestav) Sistemas para el clonaje de plantas a través de medios asexuales.
US9777286B2 (en) 2013-10-04 2017-10-03 Dow Agrosciences Llc Zea mays metallothionein-like regulatory elements and uses thereof
WO2015054106A1 (en) 2013-10-07 2015-04-16 Monsanto Technology Llc Transgenic plants with enhanced traits
BR102014025499A2 (pt) 2013-10-15 2015-09-29 Dow Agrosciences Llc elementos regulatórios de zea mays e uso dos mesmos
BR102014025574A2 (pt) 2013-10-15 2015-09-29 Dow Agrosciences Llc elementos regulatórios de zea mays e usos dos mesmos
SI3062606T1 (sl) 2013-10-29 2019-09-30 Biotech Institute, Llc Gojenje, priprava, predelava in uporaba posebnega kanabisa
NZ719544A (en) 2013-11-04 2022-09-30 Beeologics Inc Compositions and methods for controlling arthropod parasite and pest infestations
NZ719494A (en) 2013-11-04 2017-09-29 Dow Agrosciences Llc Optimal maize loci
AU2014341929B2 (en) 2013-11-04 2017-11-30 Corteva Agriscience Llc Optimal maize loci
EP3862434A1 (en) 2013-11-04 2021-08-11 Dow AgroSciences LLC Optimal soybean loci
WO2015070009A2 (en) 2013-11-08 2015-05-14 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Vh4 antibodies against gray matter neuron and astrocyte
US10028902B2 (en) 2013-11-08 2018-07-24 Baylor Research Institute Nuclear localization of GLP-1 stimulates myocardial regeneration and reverses heart failure
BR102014029437A2 (pt) 2013-11-26 2015-07-07 Dow Agrosciences Llc Produção de ácidos graxos ômega-3 polinsaturados de cadeia longa em culturas oleaginosas por uma pufa sintase de traustoquitrídio
WO2015082536A1 (en) 2013-12-03 2015-06-11 Evaxion Biotech Aps Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
NL2011980C2 (en) 2013-12-17 2015-06-18 Univ Leiden New effects of plant ahl proteins.
KR20160093728A (ko) 2013-12-20 2016-08-08 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 딱정벌레류 해충에 대한 저항성을 부여하는 rnapii-140 핵산 분자
BR102014031844A2 (pt) 2013-12-20 2015-10-06 Dow Agrosciences Llc ras oposto (rop) e moléculas de ácido nucleico relacionadas que conferem resistência a pragas de coleópteros e hemípteros
TW201527314A (zh) 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（三）
TW201527313A (zh) 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（二）
TW201527312A (zh) 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（一）
TW201527316A (zh) 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（五）
US10334848B2 (en) 2014-01-15 2019-07-02 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control using EPSPS polynucleotides
BR102015000943A2 (pt) 2014-01-17 2016-06-07 Dow Agrosciences Llc expressão aumentada de proteína em planta
EP3099719B1 (en) 2014-01-29 2020-04-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies against the muc1-c/extracellular domain (muc1-c/ecd)
EP3099803A1 (en) 2014-01-31 2016-12-07 University of Copenhagen Methods for producing diterpenes
US10053717B2 (en) 2014-01-31 2018-08-21 University Of Copenhagen Biosynthesis of forskolin and related compounds
JP6772063B2 (ja) 2014-02-14 2020-10-21 ベリカム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 誘導可能なキメラポリペプチドを使用して細胞を活性化するための方法
WO2015123561A2 (en) 2014-02-14 2015-08-20 University Of Utah Research Foundation Methods and compositions for inhibiting retinopathy of prematurity
WO2015130783A1 (en) 2014-02-25 2015-09-03 Research Development Foundation Sty peptides for inhibition of angiogenesis
EP3971283A1 (en) 2014-02-27 2022-03-23 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for site directed genomic modification
TW201538518A (zh) 2014-02-28 2015-10-16 Dow Agrosciences Llc 藉由嵌合基因調控元件所賦予之根部特異性表現
CA2942171C (en) 2014-03-11 2023-05-09 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
BR112016022711A2 (pt) 2014-04-01 2017-10-31 Monsanto Technology Llc composições e métodos para controle de pragas de inseto
WO2015164228A1 (en) 2014-04-21 2015-10-29 Cellular Dynamics International, Inc. Hepatocyte production via forward programming by combined genetic and chemical engineering
WO2015168124A1 (en) 2014-04-28 2015-11-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for controlling plant growth and development
US9101100B1 (en) 2014-04-30 2015-08-11 Ceres, Inc. Methods and materials for high throughput testing of transgene combinations
US10435687B2 (en) 2014-05-07 2019-10-08 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
AR100874A1 (es) 2014-06-16 2016-11-09 Consejo Nac De Investig Científicas Y Técnicas (Conicet) Genes quiméricos y proteínas de resistencia oxidativa, y plantas transgénicas que incluyen los mismos
EP3158072B1 (en) 2014-06-20 2021-01-13 Cellectis Potatoes with reduced granule-bound starch synthase
AU2015280252A1 (en) 2014-06-23 2017-01-12 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for regulating gene expression via RNA interference
WO2015197075A1 (en) 2014-06-23 2015-12-30 University Of Copenhagen Methods and materials for production of terpenoids
US11807857B2 (en) 2014-06-25 2023-11-07 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
CA2955191C (en) 2014-07-15 2024-03-12 Ceres, Inc. Methods of increasing crop yield under abiotic stress
RU2021123470A (ru) 2014-07-29 2021-09-06 Монсанто Текнолоджи Ллс Композиции и способы борьбы с насекомыми-вредителями
BR112017002783A2 (pt) 2014-08-11 2017-12-19 Evolva Sa produção de glicosídeos de esteviol em hospedeiros recombinantes
EP3189148A4 (en) 2014-09-02 2018-05-02 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Costimulation of chimeric antigen receptors by myd88 and cd40 polypeptides
EP3190905A2 (en) 2014-09-09 2017-07-19 Evolva SA Production of steviol glycosides in recombinant hosts
WO2016050512A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Bayer Cropscience Nv Methods and means for increasing stress tolerance and biomass in plants
AU2015341481C1 (en) 2014-11-03 2021-09-16 ACADEMISCH ZIEKENHUIS LEIDEN (h.o.d.n. LUMC) T cell receptors directed against Bob1 and uses thereof
WO2016070885A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 University Of Copenhagen Biosynthesis of oxidised 13r-mo and related compounds
EP3218497A1 (en) 2014-11-12 2017-09-20 NMC Inc. Transgenic plants with engineered redox sensitive modulation of photosynthetic antenna complex pigments and methods for making the same
US10208326B2 (en) 2014-11-13 2019-02-19 Evolva Sa Methods and materials for biosynthesis of manoyl oxide
US20180169211A1 (en) 2014-11-13 2018-06-21 Evaxion Biotech Aps Peptides derived from acinetobacter baumannii and their use in vaccination
BR112017012362A2 (pt) 2014-12-12 2018-07-31 Syngenta Participations Ag composições e métodos para controle de pragas de plantas.
JP6720176B2 (ja) 2014-12-15 2020-07-08 ベリカム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 治療用細胞のコントロールされた活性化または排除のための方法
MA41180A (fr) 2014-12-17 2017-10-24 Bayer Cropscience Nv Plantes caractérisées par une capacité améliorée de fixation du carbone photosynthétique
EP3037432B1 (en) 2014-12-22 2020-06-17 Dow AgroSciences LLC Nucampholin nucleic acid molecules to control coleopteran insect pests
NL2014107B1 (en) 2015-01-09 2016-09-29 Limgroup B V New methods and products for breeding of asparagus.
ES2957554T3 (es) 2015-01-12 2024-01-22 Evaxion Biotech Aps Tratamiento y profilaxis de infección por K. pneumoniae
EP3256589B1 (en) 2015-01-22 2021-12-22 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for controlling leptinotarsa
EP3250675A1 (en) 2015-01-28 2017-12-06 SABIC Global Technologies B.V. Methods and compositions for high-efficiency production of biofuel and/or biomass
CA2973674A1 (en) 2015-01-30 2016-08-04 Evolva Sa Production of steviol glycosides in recombinant hosts
WO2016130516A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin fc polypeptides displaying improved complement activation
WO2016134293A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Baylor College Of Medicine p63 INACTIVATION FOR THE TREATMENT OF HEART FAILURE
JP2018510627A (ja) 2015-03-10 2018-04-19 レイデン ユニバーシティ メディカル センター メラノーマ優先発現抗原に対して向けられたｔ細胞レセプターおよびその使用
US20160264991A1 (en) 2015-03-13 2016-09-15 Dow Agrosciences Llc Rna polymerase i1 nucleic acid molecules to control insect pests
EP3862426A3 (en) 2015-03-16 2021-11-17 DSM IP Assets B.V. Udp-glycosyltransferases
RU2017138918A (ru) 2015-04-13 2019-05-13 Фраунхофер-Гезелльшафт Цур Фердерунг Дер Ангевандтен Форшунг Е.Ф. Новые способы борьбы с афлатоксином и грибковыми инфекциями
BR112017021903B1 (pt) 2015-04-15 2023-12-05 Corteva Agriscience Llc Promotor de planta para expressão de transgene
JP2018511331A (ja) 2015-04-15 2018-04-26 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 導入遺伝子発現のための植物プロモーター
EP3603651B1 (en) 2015-05-22 2021-07-21 STCube & Co., Inc. Screening methods for targets for cancer therapy
BR102016012010A2 (pt) 2015-05-29 2020-03-24 Dow Agrosciences Llc Molécula de ácido nucleico, de ácido ribonucleico (rna) e de ácido ribonucleico de filamento duplo (dsrna), usos de célula, planta e semente, produto primário, bem como métodos para controlar uma população de pragas coleópteras e/ou hemípteras, para melhorar o rendimento de uma cultura, e para produzir uma célula vegetal transgênica e uma planta transgênica
CN107750125A (zh) 2015-06-02 2018-03-02 孟山都技术有限公司 用于将多核苷酸递送至植物中的组合物和方法
WO2016196782A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants
WO2016207219A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Carbon-neutral and carbon-positive photorespiration bypass routes supporting higher photosynthetic rate and yield
EP3317295B1 (en) 2015-07-04 2022-05-18 Evaxion Biotech A/S Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting pseudomonas aeruginosa
EP3332018B1 (en) 2015-08-07 2022-07-27 Evolva SA Production of steviol glycosides in recombinant hosts
WO2017040380A2 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Research Development Foundation Engineered antibody fc variants
IL241462A0 (en) 2015-09-10 2015-11-30 Yeda Res & Dev Heterologous engineering of betalain pigments in plants
US10837024B2 (en) 2015-09-17 2020-11-17 Cellectis Modifying messenger RNA stability in plant transformations
TW201718861A (zh) 2015-09-22 2017-06-01 道禮責任有限公司 用於轉殖基因表現之植物啟動子及３’ｕｔｒ
TW201718862A (zh) 2015-09-22 2017-06-01 Dow Agrosciences Llc 用於轉殖基因表現之植物啟動子及３’ｕｔｒ
MX2018004063A (es) 2015-10-02 2019-04-01 Monsanto Technology Llc Secuencias recombinantes de cromosoma b de maíz y sus usos.
CN105219767B (zh) 2015-10-09 2018-02-13 上海交通大学 大豆转化事件shzd32‑01及其应用方法
US10865381B2 (en) 2015-10-20 2020-12-15 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Multi-lineage hematopoietic precursor cell production by genetic programming
US10280429B2 (en) 2015-10-22 2019-05-07 Dow Agrosciences Llc Plant promoter for transgene expression
WO2017075389A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 The Regents Of The Universtiy Of California Methods of generating t-cells from stem cells and immunotherapeutic methods using the t-cells
LT3370733T (lt) 2015-11-02 2021-10-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Cd40 aktyvinimo ir imuninės kontrolės taškų blokados būdai
WO2017078935A1 (en) 2015-11-04 2017-05-11 Dow Agrosciences Llc Plant promoter for transgene expression
KR20180104597A (ko) 2015-11-07 2018-09-21 멀티비르 인코포레이티드 암 치료를 위한 종양 억제 유전자 요법 및 면역관문 봉쇄를 포함하는 조성물
JP6987068B2 (ja) 2015-11-09 2021-12-22 ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィアThe Children’S Hospital Of Philadelphia 癌マーカーおよび治療標的としてのグリピカン２
UY37108A (es) 2016-02-02 2017-08-31 Cellectis Modificación de la composición de aceites de soja mediante el knockout dirigido de los genes fad3a/b/c
US10946084B2 (en) 2016-02-22 2021-03-16 Evaxion Biotech Aps Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting Staphylococcus aureus
US20190177391A1 (en) 2016-03-31 2019-06-13 Baylor Research Institute Angiopoietin-like protein 8 (angptl8)
WO2017178632A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Evolva Sa Production of steviol glycosides in recombinant hosts
WO2017184727A1 (en) 2016-04-21 2017-10-26 Bayer Cropscience Lp Tal-effector mediated herbicide tolerance
CN109312378A (zh) 2016-05-16 2019-02-05 埃沃尔瓦公司 在重组宿主中产生甜菊醇糖苷
CN109415737A (zh) 2016-05-25 2019-03-01 嘉吉公司 用于在植物中产生突变的工程化核酸酶
WO2017216384A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 Evaxion Biotech Aps Vaccination targeting ichthyophthirius multifiliis
WO2017220787A1 (en) 2016-06-24 2017-12-28 Evaxion Biotech Aps Vaccines against aearomonas salmonicida infection
US11732268B2 (en) 2016-06-28 2023-08-22 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for use in genome modification in plants
AU2017290805B2 (en) 2016-07-01 2023-11-16 Research Development Foundation Elimination of proliferating cells from stem cell-derived grafts
WO2018015512A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Evolva Sa Biosynthesis of 13r-manoyl oxide derivatives
EP3889167A1 (en) 2016-07-22 2021-10-06 Evaxion Biotech ApS Chimeric proteins for inducing immunity towards infection with s. aureus
CA3033246A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 River Stone Biotech, LLC Biosynthesis of benzylisoquinoline alkaloids and benzylisoquinoline alkaloid precursors
CN118546979A (zh) 2016-08-17 2024-08-27 孟山都技术公司 通过操纵赤霉素代谢增加可收获产量的用于矮株型植物的方法和组合物
WO2018035429A1 (en) 2016-08-18 2018-02-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Peptides that inhibit syndecan-1 activation of vla-4 and igf-1r
WO2018037281A1 (en) 2016-08-22 2018-03-01 Biolumic Limited System, device and methods of seed treatment
EP3504334B1 (en) 2016-08-26 2023-12-06 Board of Trustees of Michigan State University Transcription factors to improve resistance to environmental stress in plants
AU2017319702A1 (en) 2016-09-02 2019-04-11 The Regents Of The University Of California Methods and compositions involving interleukin-6 receptor alpha-binding single chain variable fragments
IL247752A0 (en) 2016-09-11 2016-11-30 Yeda Res & Dev Compositions and methods for modulating gene expression for site-directed mutagenesis
US10400246B2 (en) 2016-10-03 2019-09-03 Dow Agrosciences Llc Plant promoter for transgene expression
BR112019005687A2 (pt) 2016-10-03 2019-07-02 Dow Agrosciences Llc promotor vegetal para expressão de transgenes
WO2018067836A1 (en) 2016-10-05 2018-04-12 Cellular Dynamics International, Inc. Methods for directed differentiation of pluripotent stem cells to hla homozygous immune cells
US10961505B2 (en) 2016-10-05 2021-03-30 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Generating mature lineages from induced pluripotent stem cells with MECP2 disruption
US10584350B2 (en) 2016-10-27 2020-03-10 Board Of Trustees Of Michigan State University Structurally modified COI1
WO2018083338A1 (en) 2016-11-07 2018-05-11 Evolva Sa Production of steviol glycosides in recombinant hosts
WO2018092072A1 (en) 2016-11-16 2018-05-24 Cellectis Methods for altering amino acid content in plants through frameshift mutations
JP2020510624A (ja) 2016-12-12 2020-04-09 マルチビア インコーポレイテッド がんおよび感染性疾患の治療および予防のための、ウイルス遺伝子治療および免疫チェックポイント阻害剤を含む方法および組成物
EP3342780A1 (en) 2016-12-30 2018-07-04 Dow AgroSciences LLC Pre-mrna processing factor 8 (prp8) nucleic acid molecules to control insect pests
US11718648B2 (en) 2017-01-05 2023-08-08 Evaxion Biotech A/S Vaccines targeting Pseudomonas aeruginosa
RU2674894C2 (ru) 2017-01-30 2018-12-13 Общество с ограниченной ответственностью "ПЛАНТА" Новые люциферазы и способы их использования
US11371056B2 (en) 2017-03-07 2022-06-28 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC HPPD variants and methods of use
US11180770B2 (en) 2017-03-07 2021-11-23 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC HPPD variants and methods of use
WO2018165091A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
US10883089B2 (en) 2017-04-04 2021-01-05 Wisconsin Alumni Research Foundation Feruloyl-CoA:monolignol transferases
US10883090B2 (en) 2017-04-18 2021-01-05 Wisconsin Alumni Research Foundation P-coumaroyl-CoA:monolignol transferases
DK3612557T3 (da) 2017-04-18 2022-04-19 Fujifilm Cellular Dynamics Inc Antigenspecifikke immuneffektorceller
EP3615668B1 (en) 2017-04-25 2024-02-28 Cellectis Alfalfa with reduced lignin composition
WO2018208849A1 (en) 2017-05-09 2018-11-15 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods to augment or alter signal transduction
GB201708662D0 (en) 2017-05-31 2017-07-12 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for increasing shelf-life of banana
GB201708665D0 (en) 2017-05-31 2017-07-12 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for increasing extractability of solids from coffee beans
EP3630973A1 (en) 2017-05-31 2020-04-08 Tropic Biosciences UK Limited Methods of selecting cells comprising genome editing events
IL253370A0 (en) 2017-07-09 2017-09-28 Ilana Kolodkin Gal Preparations containing hydroxy-cinnamic acid, conjugates, analogues, derivatives and methods of using them
WO2019038594A2 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Biolumic Limited TRANSGENIC PLANTS WITH HIGH GROWTH AND HIGH RUSTICITY
US20210054404A1 (en) 2017-08-22 2021-02-25 Napigen, Inc. Organelle genome modification using polynucleotide guided endonuclease
CA3073050A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Dow Agrosciences Llc Compositions and methods for expressing transgenes using regulatory elements from chlorophyll binding ab genes
AU2018336126A1 (en) 2017-09-19 2020-04-30 Tropic Biosciences UK Limited Modifying the specificity of non-coding RNA molecules for silencing gene expression in eukaryotic cells
CA3076020A1 (en) 2017-10-02 2019-04-11 Syngenta Participations Ag Engineered pesticidal proteins and methods of controlling plant pests
US11279944B2 (en) 2017-10-24 2022-03-22 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Of herbicide tolerance to 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) inhibitors by down-regulation of HPPD expression in soybean
BR112020008096A2 (pt) 2017-10-24 2020-11-03 Basf Se método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica
US11578334B2 (en) 2017-10-25 2023-02-14 Monsanto Technology Llc Targeted endonuclease activity of the RNA-guided endonuclease CasX in eukaryotes
US11497762B2 (en) 2017-11-03 2022-11-15 Interna Technologies B.V. MiRNA molecule, equivalent, antagomir, or source thereof for treating and/or diagnosing a condition and/or a disease associated with neuronal deficiency or for neuronal (re)generation
EP3710014A1 (en) 2017-11-14 2020-09-23 Henry Ford Health System Compositions for use in the treatment and prevention of cardiovascular disorders resulting from cerebrovascular injury
EP3732295A1 (en) 2017-12-27 2020-11-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transformation of dicot plants
EP4137578A1 (en) 2018-01-05 2023-02-22 Ottawa Hospital Research Institute Modified vaccinia vectors
CN111819285B (zh) 2018-01-09 2024-08-09 希博斯美国有限公司 防碎基因和突变
WO2019145399A1 (en) 2018-01-24 2019-08-01 Evaxion Biotech Aps Vaccines for prophylaxis of s. aureus infections
WO2019161151A1 (en) 2018-02-15 2019-08-22 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking
MX2020008593A (es) 2018-02-15 2020-11-13 Monsanto Technology Llc Composiciones y metodos para mejorar rendimientos de cultivos a traves del apilamiento de rasgos.
CA3094329A1 (en) 2018-03-19 2020-02-20 Multivir Inc. Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and cd122/cd132 agonists for the treatment of cancer
WO2019186274A2 (en) 2018-03-30 2019-10-03 University Of Geneva Micro rna expression constructs and uses thereof
GB201807192D0 (en) 2018-05-01 2018-06-13 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for reducing caffeine content in coffee beans
AU2019275110A1 (en) 2018-05-24 2020-10-22 Monsanto Technology Llc Genome editing in plants
CN112384063A (zh) 2018-06-07 2021-02-19 以色列国家农业部、农村发展农业研究组织·沃尔卡尼中心 再生及转殖大麻的方法
CN112424365A (zh) 2018-06-07 2021-02-26 以色列国家农业部、农村发展农业研究组织·沃尔卡尼中心 核酸构建体及其使用方法
RU2730038C2 (ru) 2018-06-28 2020-08-14 Общество с ограниченной ответственностью "ПЛАНТА" Ферменты биосинтеза люциферина и их применение
WO2020069313A2 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Henry Ford Health System Use of extracellular vesicles in combination with tissue plasminogen activator and/or thrombectomy to treat stroke
EP3870207A1 (en) 2018-10-22 2021-09-01 Evaxion Biotech ApS Vaccines targeting m. catharrhalis
BR112021007864A2 (pt) 2018-11-09 2021-08-10 Wisconsin Alumni Research Foundation ácido nucleico recombinante, métodos e vegetal transgênico fértil
US20220064657A1 (en) 2019-01-04 2022-03-03 Cargill, Incorporated Engineered nucleases to generate mutations in plants
WO2020171889A1 (en) 2019-02-19 2020-08-27 University Of Rochester Blocking lipid accumulation or inflammation in thyroid eye disease
US20220194994A1 (en) 2019-02-20 2022-06-23 Syngenta Crop Protection Ag Engineered pesticidal proteins and methods of controlling plant pests
WO2020174044A1 (en) 2019-02-27 2020-09-03 Evaxion Biotech Aps Vaccines targeting h. influenzae
MX2021010559A (es) 2019-03-07 2021-12-15 Univ California Polipéptidos efectores de crispr-cas y métodos de uso de estos.
GB201903521D0 (en) 2019-03-14 2019-05-01 Tropic Biosciences Uk Ltd No title
GB201903519D0 (en) 2019-03-14 2019-05-01 Tropic Biosciences Uk Ltd Introducing silencing activity to dysfunctional rna molecules and modifying their specificity against a gene of interest
GB201903520D0 (en) 2019-03-14 2019-05-01 Tropic Biosciences Uk Ltd Modifying the specificity of non-coding rna molecules for silencing genes in eukaryotic cells
US20200299637A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 Massachusetts Institute Of Technology Control of nitrogen fixation in rhizobia that associate with cereals
WO2020212756A2 (en) 2019-04-18 2020-10-22 Genkin Dmitry Dmitrievich Reprogramming of polymorphonuclear leukocytes
KR20220004090A (ko) 2019-04-25 2022-01-11 임파서블 푸즈 인크. 헴-함유 단백질의 생산을 위한 균주 및 방법
US11447790B2 (en) 2019-05-29 2022-09-20 Altria Client Services Llc Compositions and methods for producing tobacco plants and products having reduced or eliminated suckers
US11473086B2 (en) 2019-06-19 2022-10-18 Ut-Battelle, Llc Loss of function alleles of PtEPSP-TF and its regulatory targets in rice
WO2021016062A1 (en) 2019-07-19 2021-01-28 The Children's Hospital Of Philadelphia Chimeric antigen receptors containing glypican 2 binding domains
US11827893B2 (en) 2019-10-10 2023-11-28 Altria Client Services Llc Pale yellow locus and its applications in tobacco
US11939588B2 (en) 2019-10-17 2024-03-26 Board Of Trustees Of Michigan State University Elevated resistance to insects and plant pathogens without compromising seed production
WO2021076930A1 (en) 2019-10-18 2021-04-22 The Regents Of The University Of California Plxdc activators and their use in the treatment of blood vessel disorders
EP3825408A1 (en) 2019-11-19 2021-05-26 FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Methods of multi-species insect pest control
US11326176B2 (en) 2019-11-22 2022-05-10 Mozza Foods, Inc. Recombinant micelle and method of in vivo assembly
WO2021113644A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Multivir Inc. Combinations comprising a cd8+ t cell enhancer, an immune checkpoint inhibitor and radiotherapy for targeted and abscopal effects for the treatment of cancer
EP4087593A1 (en) 2020-01-06 2022-11-16 Evaxion Biotech A/S Vaccines targeting neisseria gonorrhoeae
JP2023537558A (ja) 2020-05-27 2023-09-04 アンチオン バイオサイエンシーズ エスアー 目的の抗原にｃａｒ ｔ細胞をリダイレクトするためのアダプター分子
JP2023536210A (ja) 2020-05-29 2023-08-24 フジフィルム セルラー ダイナミクス，インコーポレイテッド 網膜色素上皮及び光受容体の二重層、並びにその使用
AU2021280343A1 (en) 2020-05-29 2022-12-08 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Retinal pigmented epithelium and photoreceptor dual cell aggregates and methods of use thereof
WO2022053130A1 (en) 2020-09-09 2022-03-17 Sid Alex Group, S.R.O. Antago-mir-155 for treatment of v-src, c-src-tyrosine kinase-induced cancers
AU2021338707A1 (en) 2020-09-10 2023-04-06 Monsanto Technology Llc Increasing gene editing and site-directed integration events utilizing meiotic and germline promoters
WO2022072833A2 (en) 2020-10-02 2022-04-07 Impossible Foods Inc. Expression constructs and methods of genetically engineering cells
WO2022072846A2 (en) 2020-10-02 2022-04-07 Impossible Foods Inc. Transgenic plants with altered fatty acid profiles and upregulated heme biosynthesis
WO2022093977A1 (en) 2020-10-30 2022-05-05 Fortiphyte, Inc. Pathogen resistance in plants
AR124414A1 (es) 2020-12-18 2023-03-22 Century Therapeutics Inc Sistema de receptor de antígeno quimérico con especificidad de receptor adaptable
US20220243216A1 (en) 2021-02-03 2022-08-04 Altria Client Services Llc Increasing trichome density and improving transport of metabolites in plant trichomes
CN114875060B (zh) * 2021-02-05 2023-08-18 武汉大学 dORF在增强上游编码基因翻译中的应用
US20240123004A1 (en) 2021-02-09 2024-04-18 University Of Houston System Oncolytic virus for systemic delivery and enhanced anti-tumor activities
US20240122865A1 (en) 2021-02-19 2024-04-18 Pfizer Inc. Methods of Protecting RNA
GB202103256D0 (en) 2021-03-09 2021-04-21 Tropic Biosciences Uk Ltd Method for silencing genes
JP2024513453A (ja) 2021-04-08 2024-03-25 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 増強された幹細胞様メモリーｔ細胞操作のための材料及び方法
JP2024519218A (ja) 2021-05-03 2024-05-09 アステラス インスティテュート フォー リジェネレイティブ メディシン 成熟角膜内皮細胞を作製する方法
MX2023013186A (es) 2021-05-07 2023-12-06 Astellas Inst For Regenerative Medicine Metodos de generacion de hepatocitos maduros.
US20220389436A1 (en) 2021-05-26 2022-12-08 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods to prevent rapid silencing of genes in pluripotent stem cells
EP4351621A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 Morehouse School of Medicine Hevamine-related plant composition and methods
JP2024524924A (ja) 2021-07-02 2024-07-09 トロピック バイオサイエンシーズ ユーケー リミテッド バナナ果実における褐変の遅延又は防止
GB202109586D0 (en) 2021-07-02 2021-08-18 Tropic Biosciences Uk Ltd Method for editing banana genes
EP4366762A1 (en) 2021-07-05 2024-05-15 Evaxion Biotech A/S Vaccines targeting neisseria gonorrhoeae
GB202112866D0 (en) 2021-09-09 2021-10-27 Tropic Biosciences Uk Ltd Resistance to fusarium wilt in a banana
WO2023081813A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Zip cytokine receptors
WO2023081894A2 (en) 2021-11-08 2023-05-11 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Pre-effector car-t cell gene signatures
WO2023089556A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 Pfizer Inc. Reducing risk of antigen mimicry in immunogenic medicaments
WO2023144779A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Pfizer Inc. Coronavirus antigen variants
AU2023216314A1 (en) 2022-02-02 2024-08-22 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nickase fusion proteins
WO2023154887A1 (en) 2022-02-11 2023-08-17 Northeast Agricultural University Methods and compositions for increasing protein and/or oil content and modifying oil profile in a plant
US20230295661A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 University Of Houston System Persistent hsv gene delivery system
WO2023199198A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 John Innes Centre Compositions and methods for increasing genome editing efficiency
GB202206507D0 (en) 2022-05-04 2022-06-15 Antion Biosciences Sa Expression construct
WO2023213393A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Evaxion Biotech A/S Staphylococcal protein variants and truncates
WO2023230433A1 (en) 2022-05-23 2023-11-30 Altria Client Services Llc Methods and compositions for regulating alkaloids in tobacco field
WO2023240109A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific molecules for modulating t-cell activity, and uses thereof
WO2023240182A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Disruption of kdm4a in t cells to enhance immunotherapy
WO2023239940A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Research Development Foundation Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof
US20240003871A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Ipsc-derived astrocytes and methods of use thereof
WO2024020360A1 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Pairwise Plants Services, Inc. Mustard green plants named 'pwrg-1', 'pwrg-2,' and 'pwsgc'
US20240229054A9 (en) 2022-08-05 2024-07-11 Altria Client Services Llc Methods and compositions for regulating alkaloids in tobacco
WO2024052856A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Friedrich Alexander Universität Erlangen-Nürnberg Plant regulatory elements and uses thereof
WO2024059787A1 (en) 2022-09-16 2024-03-21 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Disruption of asxl1 in t cells to enhance immunotherapy
WO2024130212A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Turnstone Biologics Corp. Recombinant vaccinia virus encoding one or more natural killer cell and t lymphocyte inhibitors
WO2024155597A1 (en) 2023-01-17 2024-07-25 Inscripta, Inc. Methods and compositions of co-expression of t7rna polymerase and inhibitory rna aptamers
WO2024160989A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Syngenta Crop Protection Ag Herbicide resistant plants
WO2024186630A1 (en) 2023-03-03 2024-09-12 Henry Ford Health System Use of extracellular vesicles for the treatment of cancer
GB202305021D0 (en) 2023-04-04 2023-05-17 Tropic Biosciences Uk Ltd Methods for generating breaks in a genome
EP4442817A1 (en) 2023-04-04 2024-10-09 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Paclitaxel (taxol) biosynthesis pathway

Family Cites Families (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE18970C (de) * G. VAN WAGENEN in New-York und A. POLLOCK in Nyack (V. St. A.) Hohle Stopf büchsenpackung
US4370160A (en) * 1978-06-27 1983-01-25 Dow Corning Corporation Process for preparing silicone microparticles
US4399216A (en) * 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) * 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4727028A (en) * 1981-06-22 1988-02-23 Eli Lilly And Company Recombinant DNA cloning vectors and the eukaryotic and prokaryotic transformants thereof
US4583320A (en) * 1982-10-12 1986-04-22 Plant Genetics, Inc. Delivery system for meristematic tissue
US4559302A (en) * 1982-11-01 1985-12-17 Eli Lilly And Company DNA for directing transcription and expression of structural genes
US4535060A (en) * 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US5094945A (en) * 1983-01-05 1992-03-10 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase, production and use
US5034322A (en) * 1983-01-17 1991-07-23 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
US5352605A (en) * 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
JPH0714349B2 (ja) * 1983-01-17 1995-02-22 モンサント カンパニ− 植物細胞での発現に適したキメラ遺伝子
US4559301A (en) * 1983-03-03 1985-12-17 Eli Lilly And Company Process for preparing macrocin derivatives
AU567155B2 (en) * 1983-04-15 1987-11-12 Damon Biotech Inc. Capsules for releasing core material at constant rate
WO1985001856A1 (en) * 1983-11-03 1985-05-09 Johannes Martenis Jacob De Wet Method for the transfer of exogenous genes in plants using pollen as a vector
NL8304498A (nl) * 1983-12-30 1985-07-16 Ir Roelof Geert Middel En Rink Inrichting voor het melken van vee en werkwijze voor het bedrijven van een dergelijke inrichting.
AU586620B2 (en) * 1984-01-13 1989-07-20 Plant Genetics, Inc. Artificial seed coats for botanic see analogs
US4761373A (en) * 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
DE3587718T2 (de) * 1984-03-06 1994-08-04 Mgi Pharma Inc Herbizide Resistenz in Pflanzen.
EP0160390A3 (en) * 1984-04-16 1987-04-08 Sandoz Ltd. Embryogenic callus and cell suspension of inbred corn
ATE204017T1 (de) * 1984-05-11 2001-08-15 Syngenta Participations Ag Transformation von pflanzenerbgut
US4581847A (en) * 1984-09-04 1986-04-15 Molecular Genetics Research And Development Tryptophan overproducer mutants of cereal crops
US4642411A (en) * 1984-09-04 1987-02-10 Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership Tryptophan overproducer mutants of cereal crops
US4666844A (en) * 1984-09-07 1987-05-19 Sungene Technologies Corporation Process for regenerating cereals
US4830966A (en) * 1984-09-07 1989-05-16 Sungene Technologies Corporation Process for regenerating corn
US4665030A (en) * 1984-09-07 1987-05-12 Sungene Technologies Corporation Process for regenerating corn
US4743548A (en) * 1984-09-25 1988-05-10 Calgene, Inc. Plant cell microinjection technique
JPS61134343A (ja) * 1984-12-05 1986-06-21 Nippon Peroxide Co Ltd アクリル酸あるいはアクリル酸エステルの光塩素化方法
US5254799A (en) * 1985-01-18 1993-10-19 Plant Genetic Systems N.V. Transformation vectors allowing expression of Bacillus thuringiensis endotoxins in plants
BR8600161A (pt) * 1985-01-18 1986-09-23 Plant Genetic Systems Nv Gene quimerico,vetores de plasmidio hibrido,intermediario,processo para controlar insetos em agricultura ou horticultura,composicao inseticida,processo para transformar celulas de plantas para expressar uma toxina de polipeptideo produzida por bacillus thuringiensis,planta,semente de planta,cultura de celulas e plasmidio
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
JPS61265086A (ja) * 1985-05-21 1986-11-22 Mitsui Toatsu Chem Inc プロトプラストの培養法
US4935340A (en) * 1985-06-07 1990-06-19 Eli Lilly And Company Method of isolating antibiotic biosynthetic genes
EP0218571B1 (en) * 1985-08-07 1993-02-03 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
US4940835A (en) * 1985-10-29 1990-07-10 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
JPH0795952B2 (ja) * 1986-01-08 1995-10-18 カルジ−ン・インコ−ポレイテツド ハロアリ−ルニトリル分解遺伝子、その使用および該遺伝子含有細胞
DE3765449D1 (de) * 1986-03-11 1990-11-15 Plant Genetic Systems Nv Durch gentechnologie erhaltene und gegen glutaminsynthetase-inhibitoren resistente pflanzenzellen.
US5188958A (en) * 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5134074A (en) * 1986-06-20 1992-07-28 Dekalb Plant Genetics Embryogenic callus and cell suspensions of corn inbred B73
US5187073A (en) * 1986-06-30 1993-02-16 The University Of Toledo Process for transforming gramineae and the products thereof
US5177010A (en) * 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
JPS63123325A (ja) * 1986-08-14 1988-05-27 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エ−・ファウ トランスジェニック単子葉植物、その種子および植物の調製方法
US4806483A (en) * 1986-08-18 1989-02-21 Sungene Technologies Corporation Process for regenerating corn
IL84064A0 (en) * 1986-10-01 1988-03-31 Plant Cell Res Inst Method and medium for controlled regeneration of cucumis sp.plants in vitro from explant tissue
EP0267159A3 (de) * 1986-11-07 1990-05-02 Ciba-Geigy Ag Verfahren zur genetischen Modifikation monokotyler Pflanzen
US5268463A (en) * 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5004863B2 (en) * 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
US5015580A (en) * 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
IL84459A (en) * 1986-12-05 1993-07-08 Agracetus Apparatus and method for the injection of carrier particles carrying genetic material into living cells
JPS63192383A (ja) * 1986-12-08 1988-08-09 サンジェン・テクノロジーズ・コーポレイション トウモロコシにおけるフリー・プール・リジン含有量の増加方法
EP0275069A3 (en) * 1987-01-13 1990-04-25 DNA PLANT TECHNOLOGY CORPORATION (under the laws of the state of Delaware) Pollen-mediated gene transformation in plants
US5049500A (en) * 1987-01-13 1991-09-17 E. I. Du Pont De Nemours Pollen-mediated gene transformation in plants
GB2200367B (en) * 1987-01-29 1990-08-08 Inst Botan Im N G Kholodnogo A Method of preparing genetically transformed cellular plant matter by micro- injection.
US4753035A (en) * 1987-02-04 1988-06-28 Dow Corning Corporation Crosslinked silicone coatings for botanical seeds
US5001060A (en) * 1987-02-06 1991-03-19 Lubrizol Enterprises, Inc. Plant anaerobic regulatory element
US5290924A (en) * 1987-02-06 1994-03-01 Last David I Recombinant promoter for gene expression in monocotyledonous plants
JPH0822224B2 (ja) * 1987-02-09 1996-03-06 三井石油化学工業株式会社 植物の組織培養方法
TR27832A (tr) * 1987-04-29 1995-08-31 Monsanto Co Zararli ucucu hasarata mukavim bitkiler.
US5371003A (en) * 1987-05-05 1994-12-06 Sandoz Ltd. Electrotransformation process
CA1328236C (en) * 1987-05-05 1994-04-05 Novartis Ag Plant tissue transformation
US5350689A (en) * 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
EP0846771A1 (en) * 1987-05-20 1998-06-10 Novartis AG Zea mays plants and transgenic zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
US4971908A (en) * 1987-05-26 1990-11-20 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
NL8701450A (nl) * 1987-06-22 1989-01-16 Solvay Werkwijze voor het transformeren van cellen.
WO1989004371A1 (en) * 1987-11-02 1989-05-18 Louisiana State University Agricultural And Mechan Plants genetically enhanced for disease resistance
GB8800558D0 (en) * 1988-01-12 1988-02-10 Cochrane I R Frame apparatus
DE3853278T2 (de) * 1988-02-29 1995-07-13 Du Pont Vorrichtung für das Liefern von Substanzen in Zellen und Gewebe auf eine nichtletale Weise.
GB8806643D0 (en) * 1988-03-21 1988-04-20 Ici Plc Genetic manipulation
US5250515A (en) * 1988-04-11 1993-10-05 Monsanto Company Method for improving the efficacy of insect toxins
EP0419533A1 (en) * 1988-06-01 1991-04-03 THE TEXAS A&M UNIVERSITY SYSTEM Method for transforming plants via the shoot apex
NL8801444A (nl) * 1988-06-06 1990-01-02 Solvay Werkwijze voor het genetisch transformeren van cellen van een multicellulair eukaryotisch organisme.
US5258300A (en) * 1988-06-09 1993-11-02 Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership Method of inducing lysine overproduction in plants
ES2150410T3 (es) * 1988-06-20 2000-12-01 Novartis Ag Procedimiento para el combate de parasitos de plantas.
GB8818706D0 (en) * 1988-08-05 1988-09-07 Ici Plc Dna constructs & plants incorporating them
WO1990001869A1 (en) * 1988-08-19 1990-03-08 Regents Of The University Of Minnesota High lysine corn
EP0359617A3 (en) * 1988-09-02 1990-04-04 Plant Genetic Systems, N.V. Stress-tolerant plants
ES2071671T3 (es) * 1988-09-06 1995-07-01 Plant Genetic Systems Nv Plantas transformadas con una secuencia de adn originaria de bacillus thuringiensis, letales para los lepidopteros.
EP0360750A3 (en) * 1988-09-22 1991-01-02 Ciba-Geigy Ag Novel herbicide tolerant plants
ES2164633T3 (es) * 1989-02-24 2002-03-01 Monsanto Technology Llc Genes vegetales sinteticos y procedimiento para su preparacion.
KR920700306A (ko) * 1989-03-10 1992-02-19 홍고오 므쯔미 다이아몬드 피복부재 및 그 제조방법
WO1990010691A1 (en) * 1989-03-10 1990-09-20 Grace-Sierra Horticultural Products Company Tissue culturing
US5110732A (en) * 1989-03-14 1992-05-05 The Rockefeller University Selective gene expression in plants
EP0400246A1 (en) * 1989-05-31 1990-12-05 Plant Genetic Systems, N.V. Prevention of Bt resistance development
US5302523A (en) * 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
CA2035881C (en) * 1989-07-04 1999-10-12 Sigeru Fukai Apparatus for preparing data recording cards
US5310667A (en) * 1989-07-17 1994-05-10 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
EP0814166A3 (en) * 1989-08-09 1998-05-13 DeKalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed fertile monocot plants and cells thereof
US5322783A (en) * 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
EP0442174A1 (en) * 1990-02-13 1991-08-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
EP0442175A1 (en) * 1990-02-13 1991-08-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plants with increased tissue culture and regeneration potential
EP0452269B1 (en) * 1990-04-12 2002-10-09 Syngenta Participations AG Tissue-preferential promoters
DE4013099A1 (de) * 1990-04-25 1991-10-31 Hoechst Ag Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen
DE69132366T2 (de) * 1990-05-18 2001-04-05 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation, Campbell Rekombinanter Promoter zur Genexpression in Monokotylen
ES2213740T3 (es) * 1990-06-23 2004-09-01 Bayer Cropscience Gmbh Plantas fertiles de maiz transgenico con un gen ajeno asi como procedimiento para su produccion.
US5367110A (en) * 1990-11-13 1994-11-22 Yeda Research And Development Co. Ltd. Transgenic plants overproducing threonine and lysine
US5405765A (en) * 1991-08-23 1995-04-11 University Of Florida Method for the production of transgenic wheat plants
EP0589110A1 (en) * 1992-08-19 1994-03-30 Plant Genetic Systems N.V. Control of ostrinia

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Rhode C.A. etal., Science, 240, 1988, 204-207. *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2623176C2 (ru) * 2009-11-23 2017-06-22 Монсанто Текнолоджи Ллс Трансгенное событие mon 87427 маиса и относительная шкала развития
US10561083B2 (en) 2009-11-23 2020-02-18 Monsanto Technology Llc Transgenic maize event MON 87427 and the relative development scale
RU2764586C2 (ru) * 2009-11-23 2022-01-18 Монсанто Текнолоджи Ллс Трансгенное событие mon 87427 маиса и относительная шкала развития
US11441155B2 (en) 2009-11-23 2022-09-13 Monsanto Technology, Llc Transgenic maize event MON 87427 and the relative development scale

Also Published As

Publication number Publication date
US5538877A (en) 1996-07-23
US5554798A (en) 1996-09-10
ZA91342B (en) 1992-09-30
US5484956A (en) 1996-01-16
US5538880A (en) 1996-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2114911C1 (ru) Способ получения трансгенного растения кукурузы
US5508468A (en) Fertile transgenic corn plants
US8440886B2 (en) Fertile transgenic corn plants
US6777589B1 (en) Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
JP5323044B2 (ja) 植物においてストレス耐性を高める方法およびその方法
US6399861B1 (en) Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7615685B2 (en) Methods of producing human or animal food from stably transformed, fertile maize plants
US6025545A (en) Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
WO1995006128A9 (en) Fertile, transgenic maize plants and methods for their production
JP2000503541A (ja) アントラニル酸シンターゼ遺伝子およびその使用
WO2004053055A2 (en) Transgenic maize with enhanced phenotype
US6803499B1 (en) Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
JP2000516812A (ja) 植物病原性真菌に対する阻害活性を有するペプチド
US20030150027A1 (en) Transgenic plants with increased seed yield, biomass and harvest index
WO1997048719A1 (en) Pheromone compositions and methods of use in controlling fungal diseases in plants
WO2023216140A1 (zh) 杀虫蛋白的用途
WO2023216141A1 (zh) 杀虫蛋白的用途
AU712874B2 (en) Fertile, transgenic maize plants and methods for their production
JPH11318250A (ja) 繁殖能力のある遺伝子変換コーン
Swain The control of pollen transmission in maize by the 5'end of the Glu-1Dx5 gene from wheat