ES2651909T3

ES2651909T3 - Resistencia a múltiples virus en plantas

Info

Publication number: ES2651909T3
Application number: ES10718360.0T
Authority: ES
Inventors: Shihshieh Huang; Stanislaw Flasinski; Alessandra Frizzi; Brad Gabor; Charles Hagen; John Kao; Raquel Salati
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2009-04-20
Filing date: 2010-04-20
Publication date: 2018-01-30
Anticipated expiration: 2030-04-20
Also published as: AU2010239381B2; JP2012523850A; IL215853A; EP3260545A1; US8455716B2; AU2010239381A1; WO2010123904A1; BRPI1013833A2; CN102428187A; KR20140014374A; EP2421977B1; EP3260545B1; CA2759291A1; ZA201107675B; MX2011011076A; US20130198902A1; US20190249189A1; US20170356004A1; US9670502B2; US20100269224A1

Abstract

Una planta transgénica de tomate o una semilla transgénica de tomate, o una célula vegetal transgénica de tomate que comprende resistencia a especies de virus de plantas de al menos dos de las familias Geminiviridae, Bunyaviridae y Flexiviridae, en la que la resistencia se proporciona por al menos dos modos diferentes de acción seleccionados de (a) expresión de una construcción de ácido nucleico que produce ARNbc interferente con la expresión de un gen de la proteína de la envuelta del virus, un gen de la proteína del movimiento del virus o un gen de la replicación del virus; (b) expresión de una construcción de ácido nucleico que produce miARN interferente con la expresión de un gen de la proteína de la cubierta del virus, un gen de la proteína del movimiento del virus o un gen de la replicación del virus; y (c) expresión de una secuencia terminal del segmento genómico de tospovirus que inhibe el ensamblaje del virión, en el que la resistencia proporcionada contra al menos una de las especies de virus de plantas se proporciona por la expresión de una secuencia de repetición terminal del segmento genómico de tospovirus que inhibe el ensamblaje del virión de tospovirus, en el que además la secuencia de repetición terminal genómica de tospovirus se selecciona de una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 167, una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 168, una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 376, una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 377, una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 378 y una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 455.

Description

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DESCRIPCION

Resistencia a multiples virus en plantas Antecedentes de la invencion

1. Campo de la invencion

La presente invencion se refiere en lmeas generales a procedimientos para potenciar la resistencia a multiples virus de plantas en plantas de tomate.

2. Descripcion de la tecnica relacionada

Las plantas solanaceas estan sometidas a multiples agentes que causan enfermedades potenciales, incluyendo enfermedades inducidas por virus que son responsables de perdidas de cultivos principales en todo el mundo. Para muchos virus de ARN, la expresion de la protema de la envuelta transgenica (CP) o la replicasa bloquea la progresion de los procesos infecciosos vmcos. La resistencia basada en ARN hace uso del mecanismo de silenciamiento genico postranscripcional de la planta (PTGS) para degradar los ARN vmcos. Sin embargo, dichas estrategias pueden producir resistencia de base muy estrecha y/o no es duradera, especialmente con una rapida propagacion/evolucion de nuevas especies de virus o aislados. En algunos casos, los rasgos de resistencia clasicamente definidos (no transgenicos) estan disponibles para ayudar al desarrollo de plantas resistentes a virus. Ademas, el control de plagas vegetales, tales como insectos que sirven para transmitir virus de las plantas, pueden ayudar a limitar las perdidas debido a infeccion vmca de las plantas.

Se han descrito en la tecnica diversas maneras posibles para llegar a una resistencia a virus de amplio espectro, por ejemplo, por Shepherd y col. (2009), Niu y col. (2006), Lin y col. (2006), Ramesh y col. (2007), Praveen y col. (2007), Bucher y col. (2006), Zrachya y col. (2006) y Safarnejad y col. (2009). Se ha informado de plantas de tomate resistentes a varios tospovirus, asf como la resistencia combinada contra geminivirus y tospovirus, aunque en tabaco, en el estudio "Establishment of the broad-spectrum resistance to tospoviruses in crops" publicado en lmea en
http://btc.nchu.edu.tw/myweb/new_page_3.htm el 16 de julio de 2008.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1: Diagrama esquematico de la organizacion genomica de los virus de interes.

Figura 2A: Diagrama esquematico que ilustra la estrategia para identificar la secuencia eficaz para el control de virus de plantas.

Figura 2B: Diagrama esquematico de un genoma de ADN-A de begomovirus tfpico que muestra la localizacion de regiones cribadas por su eficacia para el control de virus cuando se expresa como repeticiones invertidas. Las flechas grises numeradas representan partes del genoma que se ensayaron.

Figura 2C: Diagrama esquematico de un genoma de potexvirus tfpico (virus del mosaico del pepino; PepMV) que muestra la localizacion de regiones cribadas por su eficacia para el control de virus cuando se expresa en repeticiones invertidas. Las flechas grises numeradas representan partes del genoma que se ensayaron.

Figura 2D: Diagrama esquematico de un genoma de tospovirus (por ejemplo, el virus del marchitamiento moteado del tomate (TSWV)) que muestra la localizacion de regiones cribadas por su eficacia para el control de virus cuando se expresa como repeticiones invertidas. Las flechas grises numeradas representan partes del genoma que se ensayaron.

Figura 3: Correlacion de la resistencia a virus con produccion de ARNip en plantas de tomate transformadas.

Figura 4: Construcciones de fusion de ARNbc artificiales ejemplares para conferir resistencia a multiples virus ("MVR").

Figura 5: Secuencias de 21 nt adecuadas (entre las SEQ ID NO: 1-42) que se analizaron frente a cinco geminivirus diana (emparejamiento perfecto: doble subrayado; emparejamiento incorrecto G:U: subrayado sencillo; otros emparejamientos incorrectos o no utilizados: no subrayado).

Figura 6: Secuencias de 21 nt adecuadas (entre las SEQ ID NO: 43-70) que se analizaron frente a tospovirus (emparejamiento perfecto: doble subrayado; emparejamiento incorrecto G:U: subrayado sencillo; otros emparejamientos incorrectos o no utilizados: no subrayado).

Figura 7A, 7B: Secuencias de 21 nt adecuadas (entre las SEQ ID NO: 71-154) que se analizaron frente a potexvirus diana (emparejamiento perfecto: doble subrayado; emparejamiento incorrecto G:U: subrayado sencillo; otros emparejamientos incorrectos o no utilizados: no subrayado).

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Figura 8: Esquema de la construccion ejemplar para destacar multiples miARN modificados por ingeniena en un casete transgenico, tal como con ARNip progresivo.

Figura 9: Diagrama esquematico que ilustra el casete de expresion para destacar multiples modos de accion para resistencia a virus.

Figura 10: Construcciones ejemplares adicionales para destacar multiples miARN modificados por ingeniena en un casete transgenico, asf como para expresar miARN junto con ARNbc.

Figura 11A, 11B: Barrido de regiones del genoma de tospovirus para definir segmentos que pueden expresarse como ARNbc con eficacia antivmca. El eje X representa eventos individuales y regiones diana (CP: protema de la cubierta; GP: glucoprotema de la envuelta; y RdRP: ARN polimerasa dependiente de ARN). El eje Y representa el % de plantas Ri transgenicas que presentan resistencia a virus. Figura 11A: resultados de TSWV; figura 11B: resultados de CaCV y GBNV. "CP4 +" se refiere a la presencia del gen marcador de seleccion unido a la secuencia codificante de ARNbc, en plantas Ri.

Figura 12: Regiones del genoma PepMV ensayadas para la eficacia en la generacion de resistencia mediada por ARNbc contra este potexvirus (CP: protema de la cubierta; Mov: protema de movimiento; RdRP o RdR: ARN polimerasa dependiente ARN; TGB: protema de tripe bloque genico).

Figura 13A, 13B: Regiones de genoma de geminivirus ensayadas para la eficacia en la generacion de resistencia mediada por ARNbc contra este grupo de virus (CP: protema de la cubierta; Rep: protema de replicacion). Otras plantas transgenicas contienen un gen de resistencia a glifosato. "0 %-100 %" indica el porcentaje de plantas Ri que son positivas al marcador de seleccion y resistentes a virus. Figura 13A: resultados representativos para TYLCV y ToSLCV; figura 13B: resultados representativos para PepGMV, PHYVV y ToLCNDV. Para eventos PHYVV y ToLCNDV, "Spc" se refiere a la presencia de un gen marcador de seleccion que confiere resistencia a espectinomicina. Otros eventos se transformaron con una construccion que comprende un gen marcador de seleccion que confiere resistencia a glifosato ("CP4 positiva").

Figura 14: Diagrama esquematico que ilustra casetes de expresion representativos para abordar multiples virus en multiples familias de virus.

Figura 15: Resultados del uso de una construccion de fusion de ARNbc artificial que dirige la expresion de CP de tospovirus y PepMV (potexvirus) para resistencia a multiples virus como se analiza en el ejemplo 3.

La construccion usada se muestra esquematicamente en la figura 4B, construccion inferior: TSWV (16 pb), TSWV (296 pb), PepMV (231 pb), CaCV/GBNV (232 pb).

Figura 16: Representa la resistencia observada contra CaCV inoculado en plantas R1 CP4 positivas inoculadas transformadas con una construccion que comprende secuencias de repeticion terminal de tospovirus (SEQ ID NO: 167, 168, 376, 377, 378, encontradas en la SEQ ID NO: 455).

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona plantas de tomate resistentes a al menos dos de las familias Geminiviridae, Bunyaviridae y Flexiviridae y procedimientos para su produccion. En un aspecto, la presente invencion proporciona una planta transgenica de tomate o semilla transgenica de tomate, o celula vegetal transgenica de tomate que comprende resistencia a especies de virus de plantas de al menos dos de las familias Geminiviridae, Bunyaviridae y Flexiviridae, en la que la resistencia se proporciona por al menos dos modos diferentes de accion seleccionados de (a) expresion de una construccion de acido nucleico que produce ARNbc, (b) expresion de una construccion de acido nucleico que produce miARN y (c) expresion de una secuencia terminal del segmento genomico de tospovirus que inhibe el ensamblaje del virion, en la que la resistencia proporcionada a al menos una de las especies de virus de plantas se proporciona por la expresion de una secuencia de repeticion terminal del segmento genomico de tospovirus que inhibe el ensamblaje del virion de tospovirus, en la que ademas la secuencia de repeticion terminal genomica de tospovirus se selecciona de una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 167, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 168, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 376, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 377, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 378 y una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 455. En otras realizaciones, la resistencia se proporciona por al menos tres modos diferentes de accion. La resistencia de la planta de tomate puede comprender resistencia contra un begomovirus, tospovirus o potexvirus.

En ciertas realizaciones, la resistencia proporcionada a al menos una de las especies de virus de plantas se proporciona por la expresion de una construccion de acido nucleico que produce ARNbc. En algunas realizaciones, la resistencia proporcionada a al menos una de las especies de virus de plantas se proporciona por la expresion de una construccion de fusion de ARNbc. En algunas realizaciones de la invencion, el ARNbc interfiere con la expresion de un gen de la protema de la cubierta del virus, un gen de la protema del movimiento del virus o un gen de la replicacion del virus. En realizaciones particulares, la construccion de acido nucleico que produce ARNbc comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 379-455.

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En otras realizaciones, la resistencia proporcionada a al menos una de las especies de virus de plantas se proporciona por la expresion de una construccion de acido nucleico que produce miARN. Por tanto, en ciertas realizaciones, la resistencia contra un begomovirus o tospovirus se proporciona por una secuencia codificada por un casete de expresion de miARN apilado. En otras realizaciones mas, el miARN interfiere con la expresion de un gen de la protema de la cubierta del virus, un gen de la protema del movimiento del virus o un gen de la replicacion del virus. En realizaciones particulares, el miARN comprende una secuencia seleccionada de la SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 85, 99, 113, 127 y 141.

En ciertas realizaciones, la planta de tomate comprende (a) resistencia contra un begomovirus que se proporciona por la expresion de ARNbc que interfiere con la expresion de un gen de la replicacion de begomovirus; (b) resistencia contra un tospovirus o potexvirus que se proporciona por la expresion de un ARNbc que interfiere con la expresion de un gen de la protema de la cubierta del virus o gen de la protema del movimiento del virus; (c) resistencia contra un potexvirus que se proporciona por la expresion de una construccion de acido nucleico que produce miARN; o (d) resistencia contra un begomovirus o tospovirus que se proporciona por una secuencia codificada por un casete de expresion de miARN apilado.

Se proporciona una planta de tomate en la que la resistencia proporcionada a al menos una de las especies de virus de plantas se proporciona por la expresion de una secuencia terminal del segmento genomico de tospovirus que inhibe el ensamblaje del virion, en la que la resistencia proporcionada a al menos una de las especies de virus de plantas se proporciona por la expresion de una secuencia de repeticion terminal del segmento genomico de tospovirus que inhibe el ensamblaje del virion de tospovirus, en la que ademas la secuencia de repeticion terminal genomica de tospovirus se selecciona de una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 167, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 168, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 376, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 377, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 378 y una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 455. En ciertas realizaciones, la resistencia proporcionada a al menos una de las especies de virus de plantas se proporciona inhibiendo el ensamblaje del virion, en la que el ensamblaje del virion se inhibe por una secuencia comprendida dentro de una construccion de acido nucleico que comprende un primer segmento de acido nucleico y un segundo segmento de acido nucleico, en la que el primer y el segundo segmento son repeticiones sustancialmente invertidas entre sf y estan unidas juntas por un tercer segmento de acido nucleico, y en la que el tercer segmento comprende al menos una secuencia terminal de un segmento genomico de tospovirus que inhibe el ensamblaje del virion. En realizaciones particulares, el tercer acido nucleico comprende una secuencia terminal genomica de tospovirus seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia terminal de un segmento genomico L de CaCV o GBNV, una secuencia terminal de un segmento genomico M de CaCV o GBNV, una secuencia terminal de un segmento genomico S de CaCV o GBNV, una secuencia de repeticion terminal genomica de tospovirus, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 167, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 168, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 376, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 377, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 378 y una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 455.

La planta de tomate comprende resistencia a virus de al menos dos de las familias Geminiviridae, Bunyaviridae y Flexiviridae. Por tanto, en algunas realizaciones, los virus se seleccionan de los generos potexvirus, tospovirus y begomovirus. En realizaciones particulares los virus se seleccionan de: al menos uno de TYLCV, ToSLCV, ToLCNDV, PHYVV, PepGMV; b) uno o mas de TSWV, GBNV, CaCV; y c) PepMV. En una realizacion mas particular, el potexvirus es el virus del mosaico del pepino. En ciertas realizaciones, el begomovirus es TYLCV, ToLCNDV, PHYVV, ToSLCV o PepGMV. En algunas realizaciones, el tospovirus es CaCV, GBNV, o TSWV. En realizaciones particulares, el begomovirus es TYLCV y el potexvirus es el virus del mosaico del pepino; o el tospovirus es TSWV y el potexvirus es el virus del mosaico del pepino; o en la que el begomovirus es TYLCV, el potexvirus es el virus del mosaico del pepino y el tospovirus es TSWV.

En algunas realizaciones la planta de tomate puede comprender una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 156, 160, 162, 164, 363-371, 373 y 375. En esas u otras realizaciones, la planta de tomate comprende, o comprende ademas, una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 85, 99, 113, 127, 141 y 379-454. Por tanto, una planta de tomate de la invencion puede comprender: (a) al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 379-454 y al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 167, 168, 376, 377, 378 y 455; (b) al menos una secuencia selecciona de las SEQ ID NO: 379-454 y al menos una secuencia seleccionada de las SeQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 85, 99, 113, 127 y 141; o (c) al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 85, 99, 113, 127 y 141 y al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 167, 168, 376, 377, 378 y 455.

En otras realizaciones mas, la planta de tomate comprende al menos una secuencia de acido nucleico heterologa que confiere resistencia a virus seleccionada de a) una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia de ARN que es complementaria a la totalidad o una parte de un primer gen diana; b) una secuencia de acido nucleico que comprende multiples copias de al menos un segmento de ADN anti-sentido que es anti-sentido para al menos un segmento de dicho al menos un primer gen diana; c) una secuencia de acido nucleico que comprende un segmento de ADN sentido de al menos un gen diana; d) una secuencia de acido nucleico que comprende multiples

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copias de al menos un segmento de ADN sentido de un gen diana; e) una secuencia de acido nucleico que se transcribe en ARN para suprimir un gen diana formando ARN bicatenario y que comprende al menos un segmento que es anti-sentido para la totalidad o una parte del gen diana y al menos un segmento de ADN sentido que comprende un segmento de dicho gen diana; f) una secuencia de acido nucleico que se transcribe en ARN para suprimir un gen diana formando un ARN bicatenario que comprende multiples segmentos en serie de ADN anti- sentido y que son anti-sentido para al menos un segmento del gen diana y multiples segmentos en serie de ADN sentido que comprenden al menos un segmento de dicho gen diana; g) una secuencia de acido nucleico que se transcribe en ARN para suprimir un gen diana formando multiples hebras dobles de ARN y comprende multiples segmentos que son anti-sentido para al menos un segmento de dicho gen diana y multiples segmentos de ADN sentido del gen diana, y en la que dichos multiples segmentos de ADN anti-sentido y dichos multiples segmentos sentido estan dispuestos en una serie de repeticiones invertidas; h) una secuencia de acido nucleico que comprende nucleotidos derivados de un miARN de plantas; e i) una secuencia de acido nucleico que codifica al menos una secuencia terminal de tospovirus que interfiere con el ensamblaje del virion. La invencion tambien proporciona una planta en la que la expresion de la al menos una secuencia de acido nucleico heterologa provoca resistencia a dos o mas virus seleccionados de: tospovirus, begomovirus y potexvirus. La planta tambien puede comprender ademas un rasgo de resistencia a virus de plantas no transgenico.

En otro aspecto mas, la invencion proporciona un procedimiento para conferir resistencia en una planta de tomate a especies de virus de plantas de al menos dos de las familias Geminiviridae, Bunyaviridae y Flexiviridae, comprendiendo el procedimiento transformar la planta con y expresar en el planta al menos dos secuencias de acido nucleico que proporcionan de forma colectiva resistencia a dichas al menos dos especies de virus de plantas, en la que se utilizan al menos dos modos diferentes de accion para proporcionar dicha resistencia, que comprende (a) expresion de una construccion de acido nucleico que produce ARNbc, (b) expresion de una construccion de acido nucleico que produce miARN y (c) expresion de una secuencia terminal del segmento genomico de tospovirus que inhibe el ensamblaje del virion, en la que la resistencia proporcionada a al menos una de las especies de virus de plantas se proporciona por la expresion de una secuencia de repeticion terminal del segmento genomico de tospovirus que inhibe el ensamblaje del virion de tospovirus, en la que ademas la secuencia de repeticion terminal del genoma de tospovirus se selecciona de una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 167, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 168, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 376, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 377, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 378 y una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 455. En ciertas realizaciones, la resistencia comprende resistencia contra un begomovirus, tospovirus o potexvirus.

La resistencia puede proporcionarse a al menos una de las especies de virus de plantas por transformacion y expresion de una construccion de acido nucleico que produce ARNbc. En realizaciones particulares, la resistencia proporcionada a al menos una de las especies de virus de plantas se proporciona por transformacion y expresion de una construccion de fusion de ARNbc. En realizaciones mas particulares, el ARNbc interfiere con la expresion de un gen de la protema de la cubierta del virus, un gen de la protema del movimiento del virus o un gen de la replicacion del virus. En mas realizaciones mas particulares, la construccion de acido nucleico comprende una secuencia selecciona de las SEQ ID NO: 379-455.

En otras realizaciones, la resistencia proporcionada a al menos una de las especies de virus de plantas se proporciona por transformacion y expresion de una construccion de acido nucleico que produce miARN. En una realizacion, se contempla que la resistencia contra un begomovirus o tospovirus se proporciona por una secuencia codificada por un casete de expresion de miARN apilado. El miARN producido puede interferir ademas con la expresion de un gen de la protema de la cubierta del virus, un gen de la protema del movimiento del virus o un gen de la replicacion del virus. En realizaciones particulares el miARN comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 85, 99, 113, 127 y 141.

Por tanto, en ciertas realizaciones, (a) se proporciona resistencia contra un begomovirus por transformacion y expresion de ARNbc que interfiere con la expresion de un gen de replicacion de begomovirus; (b) se proporciona resistencia contra un tospovirus o potexvirus por la expresion de un ARNbc que interfiere con la expresion de un gen de la protema de la cubierta del virus o gen de la protema del movimiento del virus; (c) se proporciona resistencia contra un potexvirus por expresion de una construccion de acido nucleico que produce miARN; o (d) se proporciona resistencia contra un begomovirus o tospovirus por una secuencia codificada por un casete de expresion de miARN apilado.

La resistencia proporcionada a al menos una de las especies de virus de plantas se proporciona por la expresion de una secuencia terminal del segmento genomico de tospovirus que inhibe el ensamblaje del virion, en la que la resistencia proporcionada a al menos una de las especies de virus de plantas se proporciona por la expresion de una secuencia de repeticion terminal del segmento genomico de tospovirus que inhibe el ensamblaje del virion de tospovirus, en la que ademas la secuencia de repeticion terminal genomica de tospovirus se selecciona de una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 167, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 168, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 376, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 377, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 378 y una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 455. En ciertas realizaciones, la resistencia se

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proporciona a al menos una de dichas especies de virus de plantas inhibiendo el ensamblaje del virion, en la que el ensamblaje del virion se inhibe por una secuencia comprendida dentro de una construccion de acido nucleico que comprende un primer segmento de acido nucleico y un segundo segmento de acido nucleico, en la que el primer y el segundo segmento son repeticiones sustancialmente invertidas entre sf y estan unidas juntas por un tercer segmento de acido nucleico, y en la que el tercer segmento comprende al menos una secuencia terminal de un segmento genomico de tospovirus, cuya expresion inhibe el ensamblaje del virion. Ademas, en realizaciones particulares, el tercer acido nucleico puede comprender una secuencia terminal del genoma de tospovirus seleccionada de: una secuencia terminal de un segmento genomico L de CaCV o GBNV, una secuencia terminal de un segmento genomico M de CaCV o GBNV, una secuencia terminal de un segmento genomico S de CaCV o GBNV y una secuencia de repeticion terminal genomica de tospovirus. En realizaciones mas particulares, la secuencia terminal o la secuencia de repeticion terminal comprende la SEQ ID NO: 167, la SEQ ID NO: 168, la SEQ ID NO: 376, la SEQ ID NO: 377 o la SEQ ID NO: 378.

En otras realizaciones de la invencion, la pluralidad de especies de virus de plantas se selecciona de al menos dos de las familias Geminiviridae, Bunyaviridae y Flexiviridae. Por tanto, los virus pueden seleccionarse de los generos Potexvirus, Tospovirus, y Begomovirus. En ciertas realizaciones, los virus se seleccionan de: a) uno o mas de TYLCV, ToSLCV, ToLCNDV, PHYVV, PepGMV; b) uno o mas de TSWV, GBNV, CaCV; y c) PepMV.

La secuencia de acido nucleico puede comprender al menos un elemento de supresion genica para suprimir al menos un primer gen diana. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender la expresion en la planta de: (a) al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 379-454 y al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 167, 168, 376, 377, 378 y 455; (b) al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 379-454 y al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 85, 99, 113, 127 y 141; o (c) al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 85, 99, 113, 127 y 141 y al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 167, 168, 376, 377, 378 y 455.

Otros objetivos, caractensticas y ventajas de la presente invencion llegaran a ser evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada.

Descripcion detallada de la invencion

Lo siguiente es una descripcion detallada de la invencion proporcionada para ayudar a los expertos en la materia a poner en practica la presente invencion. Los expertos en la materia pueden hacer modificaciones y variaciones en las realizaciones descritas en el presente documento.

La presente invencion proporciona procedimientos para el control genetico de enfermedades vmcas en plantas de tomate (es decir, Lycopersicon o Solanum sp.). la supresion genica mediada por ARN puede conferirse por la expresion de un casete transgenico de repeticion invertida que genera una poblacion de pequenos ARN interferentes (ARNip) derivados de la region de ARNbc de un transcrito transgenico. Otra estrategia mediada por ARN para la supresion genica es por la expresion de uno o mas segmentos de miARN que "abordan" transcritos espedficos y dan lugar a su degradacion. Por tanto, pueden utilizarse estrategias que incluyen el diseno por ingeniena de ARNbc, miARN, ta-ARNip y/o ARNip progresivo. Por ejemplo, tambien pueden utilizarse secuencias derivadas de begomovirus o derivadas de otros virus, dirigidas a la replicacion, la protema de la cubierta, y las protemas C2 y/o C3. Asimismo, para el control de potexvirus tales como el virus del mosaico del pepino, pueden usarse secuencias dirigidas a partes de la protema de la cubierta (capsida) ("CP"), la protema de la replicacion tal como la ARN polimerasa dependiente de aRn ("RdRP") y/o una o mas protemas del movimiento ("MP") que pueden incluir un bloque de tres genes ("TGB") o un MP "30K". Para el control de tospovirus, pueden utilizarse de forma similar secuencias dirigidas a, por ejemplo, la protema de la cubierta ("CP", tambien llamada la nucleocapsida, protema "N"), RdRP, la protema del movimiento ("NsM") y/o glucoprotemas no estructurales (codificadas por los genes "G1" o "G2"). Dichas secuencias pueden corresponder exactamente a secuencias de uno o mas aislados vmcos, o pueden ser variantes, por ejemplo, disenadas para aumentar su eficacia antivmca, o para evitar efectos no diana.

Puede conseguirse resistencia a multiples virus ("MVR") utilizando ARNbc y/o miARN expresado a partir de una unica construccion transformada, o mas de una construccion. Ademas, una unica construccion puede comprender uno o mas casetes de expresion que producen ARNbc y/o miARN dirigido a una o mas funciones necesarias para la infeccion vmca de la planta, la multiplicacion y/o la transmision, asf como uno o mas casetes de expresion que producen al menos un ARNm que codifica una protema o parte de una protema que es la diana. Por tanto, la resistencia a multiples virus de plantas puede conseguirse en un unico "evento" transgenico. La resistencia mediada por ARN puede potenciarse ademas por estrategias basadas en protemas utilizando uno o mas aptameros que inhiben la replicacion, la expresion o la mutacion en la replicasa o proteinasa asociadas con la replicacion, protemas de union a ADNmc tale como m13-G5 (por ejemplo, patente de Estados Unidos 6.852.907; Padidam y col., 1999), para resistencia a geminivirus o tambien puede emplearse un aptamero peptfdico que interfiere con la replicacion de geminivirus (por ejemplo, Lopez-Ochoa y col., 2006).

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Tambien se contempla que la inhibicion del ensamblaje del virion, por ejemplo, por una estrategia basada en acido nucleico, puede utilizarse como a modo de accion para proporcionar resistencia a virus a una planta de tomate. Esta inhibicion del ensamblaje del virion se proporciona, por ejemplo, por el uso de una secuencia terminal de tospovirus, tal como una secuencia de repeticion terminal. Por "inhibicion del ensamblaje del virion" se entiende la interferencia con la interaccion entre las protemas de la capsida vmca y uno o mas acidos nucleicos que juntos pueden formar una partfcula vmca ("virion"). Dicha interferencia puede producirse, por ejemplo, por la expresion de una secuencia que puede servir como sustrato artificial que compite por la transcriptasa inversa y/o puede producirse por interferencia con la circularizacion apropiada de los componentes del genoma vmco de replicacion.

Ademas, pueden utilizarse locus de resistencia genetica clasicos para la tolerancia en tomate, pimientos y otras plantas solanaceas, por ejemplo, a traves de estrategias clasicas de reproduccion. Tambien se contemplan estrategias basadas en protemas usando el gen "N" de tospovirus (nucleocapsida; protema de la cubierta) mas/menos repeticiones invertidas y una protema de la cubierta de potexvirus (por ejemplo, virus del mosaico del pepino) (CP) y la replicasa para la resistencia.

Los procedimientos de supresion genica pueden incluir el uso de ARN anti-sentido, cosupresion e interferencia de ARN. La supresion genica anti-sentido en plantas se describe por Shewmaker y col. en las patentes de Estados Unidos 5.107.065, 5.453.566 y 5.759.829. la supresion genica en bacterias usando ADN que es complementario al ARNm que codifica el gen a suprimir se divulga por Inouye y col. en las patentes de Estados Unidos 5.190.931, 5.208.149, y 5.272.065. la interferencia de ARN o supresion genica mediada por ARN se ha descrito, por ejemplo, por Redenbaugh y col., 1992; Chuang y col., 2000; y Wesley y col., 2001.

Se han descrito diversas rutas celulares implicadas en la supresion genica mediada por ARN, cada una distinguida por una ruta caractenstica y componentes espedficos. Veanse, por ejemplo, las revisiones de Brodersen y Voinnet (2006), y Tomari y Zamore (2005). La ruta de ARNip implica la escision no progresiva de un ARN bicatenario en ARN interferentes pequenos ("ARNip "). La ruta de micro-ARN implica micro-ARN ("miARN"), ARN no codificantes de protemas generalmente entre 19 y 25 nucleotidos (habitualmente 20-24 nucleotidos en plantas) que grnan la escision en trans de transcritos diana, regulando negativamente la expresion de genes implicados en diversas rutas de regulacion y desarrollo; vease Ambros y col. (2003). Los miARN de plantas se han definido por un conjunto de caractensticas incluyendo un precursor de tallo-bucle emparejado que se procesa por DCL 1 en un unico miARN de ~21 nucleotidos espedfico, la expresion de un unico par de miARN y especies de miARN* del precursor de ARN bicatenario con salientes 3' de dos nucleotidos y silenciamiento de dianas espedficas en trans (vease, Bartel (2004); Kim (2005); Jones-Rhoades y col. (2006); Ambros y col. (2003)). En la ruta de ARNip de accion en trans ("ta-ARNip"), los miARN sirven para guiar el procesamiento en fase de los transcritos primarios de ARNip en un proceso que requiere una ARN polimerasa dependiente de ARN para la produccion de un precursor de ARN bicatenario; los ARNip de accion en trans se definen por la ausencia de estructura secundaria, un sitio diana de miARN que inicia la produccion de ARN bicatenario, requisitos de DCL4 y una ARN polimerasa dependiente de ARN (RDR6) y la produccion de multiples ARN pequenos de ~21 nt perfectamente progresivos con duplex perfectamente emparejados con salientes 3' de dos nucleotidos (vease, Allen y col., 2005).

Se han identificado muchos genes de micro-ARN (genes MIR) y estan disponibles al publico en una base de datos ("miRBase" disponible en lmea en
www.microrna.sanger.ac.uk/sequences; vease tambien, Griffiths-Jones y col. (2003)). Tambien se describen genes MIR adicionales y miARN maduros en las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos 2005/0120415 y 2005/144669. Las familias de genes MIR parecen ser sustanciales, y se estima que representan un 1 % de al menos algunos genomas y son capaces de influir o regular la expresion de aproximadamente un tercio de todos los genes (vease, por ejemplo, Tomari y col. (2005); Tang (2005); y Kim (2005)). Se ha informado de que los genes MIR se producen en regiones intergenicas, tanto aisladas como en grupos en el genoma, pero tambien pueden estar localizados completa o parcialmente dentro de intrones de otros genes (tanto codificantes de protemas como no codificantes de protemas). Para una revision reciente de la biogenesis de miARN, vease Kim (2005). La transcripcion de los genes MIR puede ser, al menos en algunos casos, bajo el control de un promotor del propio gen MIR. El transcrito primario, llamado "pri-miARN", puede ser bastante grande (varias kilobases) y puede ser policistronico, que contiene uno o mas pre-miARN (estructuras retroplegadas que contienen una disposicion de tallo-bucle que se procesa en el miARN maduro), asf como la "capucha" 5' habitual y la cola poliadenilada de un ARNm. Vease, por ejemplo, la figura 1 en Kim (2005).

Tambien puede emplearse un "locus de ARN pequeno progresivo" que se transcribe en un transcrito de ARN que forma una unica estructura retroplegada que se escinde en fase in vivo en multiples ARN bicatenarios pequenos (llamados "ARN pequenos progresivos") capaces de suprimir un gen diana (por ejemplo, publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos 20080066206). En contraste con los ARNip, un transcrito de aRn pequeno progresivo se escinde en fase. En contraste con los miARN, un transcrito de ARN pequeno progresivo se escinde por DCL4 o una ribonucleasa ortologa de tipo DCL4 (no DCL1) para producir multiples ARN pequenos abundantes capaces de silenciar un gen diana. En contraste con la ruta de ta-ARNip, el locus de ARN pequeno progresivo se transcribe en un transcrito de ARN que forma ARN hibridado independientemente de un ARN polimerasa dependiente de ARN y sin un sitio diana de miARN que inicia la produccion de ARN bicatenario. Las novedosas construcciones de ADN recombinante que se disenan basandose en un locus de ARN pequeno progresivo son utiles para la supresion de uno o multiples genes diana, sin el uso de miARN, ta-ARNip o vectores de expresion disenados para formar una estructura de horquilla para procesarse en ARNip. Ademas, los sitios de reconocimiento correspondientes a un ARN

pequeno progresivo son utiles para la supresion de una secuencia diana en una celula o tejido donde se expresa el ARN pequeno progresivo apropiado de forma endogena o como un transgen.

A. Dianas vincas

De acuerdo con la invencion, se proporcionan procedimientos para conferir resistencia a multiples virus a plantas de 5 tomate. Los virus a los que puede estar dirigida la resistencia en la presente invencion incluyen dos o mas virus entre los geminivirus, tospovirus y potexvirus. La figura 1 ilustra la organizacion genomica de estos generos vmcos representativos.

1. Begomovirus

Las Geminiviridae son una familia diversa y grande de virus de plantas que infectan una amplia diversidad de 10 plantas y causan perdidas significativas de cultivos en todo el mundo. Se caracterizan por capsidas icosaedricas dobles y genomas circulares de ADNmc que se replican a traves de intermedios de ADNbc. Los geminivirus ("begomovirus" y "geminivirus" se usan de forma intercambiable en el presente documento) dependen de las ADN y ARN polimerasas nucleares de la planta para la replicacion y la transcripcion. Estos virus aportan unicamente unos pocos factores para su replicacion y transcripcion. La familia Geminiviridae contiene tres generos principales 15 (antiguamente llamados "subgrupos") que difieren con respecto al insecto vector, al rango de hospedador y a la estructura genomica.

Los Geminiviridae subgrupo I (genero Mastrevirus) incluyen virus transmitidos por saltahojas que generalmente infectan plantas monocotiledoneas y tienen genomas de un unico componente.

Los Geminiviridae subgrupo III (genero Begomovirus) incluyen virus transmitidos por la mosca blanca que infectan 20 plantas dicotiledoneas y muy habitualmente tienen genomas bipartitos.

Los virus Geminiviridae subgrupo II (genero Curtovirus) se transmiten por saltahojas y tienen genomas de un unico componente como el subgrupo I, pero infectan plantas dicotiledoneas como el subgrupo III.

2. Tospovirus

Los virus del genero Tospovirus causan perdidas de cultivos significativas en todo el mundo. El nombre del genero 25 deriva del virus del marchitamiento moteado del tomate ("TSWV"). La enfermedad del marchitamiento moteado del tomate se observo por primera vez en Australia en 1915 y posteriormente demostro ser de origen vmco. Hasta principios de la decada de 1990 se consideraba que TSWv era el unico miembro del grupo del marchitamiento moteado del tomate de virus de plantas. La identificacion y caracterizacion de varios virus similares, incluyendo el virus del moteado necrotico de la Impatiens (INSV), el virus de la clorosis de Capsicum ("CaCV"), el virus de la 30 necrosis de las yemas del cacahuete (tambien conocida como virus de la necrosis de las yemas del mam, "GBNV") y el virus del moteado necrotico del tomate dio lugar a la creacion del genero tospovirus que infecta plantas dentro de la familia Bunyaviridae. Esta familia incluye un gran grupo de virus de infeccion predominantemente de animales. Ya se han identificado y caracterizado mas de 20 tospovirus y siguen describiendose especies previamente desconocidas del genero en una base regular.

35 Los tospovirus tienen un genoma de ARN tripatito de polaridad ambisentido. Las tres partes del genoma se llaman el segmento "L", el segmento "M" y el segmento "S". Se encuentra una secuencia terminal consenso de cada parte del genoma de ARN, definida por los segmentos UCUCGUUAGC (SEQ ID NO: 167) en el extremo 3' y AGAGCAAUCG (SEQ ID NO: 168) en el extremo 5'. El ARN mas grande, el "segmento L", codifica la replicasa. El ARN de tamano medio, "segmento "M", codifica las glucoprotemas G1 y G2 en el ARN sentido complementario y una protema no 40 estructural, NSm, en el ARN sentido del genoma. El segmento mas pequeno, "segmento S", codifica la protema de la nucleocapsida (N) en el ARN sentido complementario y una de movimiento de una celula a otra, NSs, en el ARN sentido del genoma. El virus se transmite por aranuelas de los generos Frankliniella (cinco especies) y Thrips (tres especies). La transmision mecanica del virus tambien es posible. TSWV puede infectar a mas de 925 especies de plantas que pertenecen a 70 familias botanicas, mientras que las otras especies de tospovirus tienen rangos de 45 hospedador mucho mas estrechos.

3. Potexvirus

El virus del mosaico del pepino (PepMV) es un potexvirus representativo entre los Flexiviridae, y es muy contagioso con un potencial significativo de causar danos en la produccion protegida de tomates. Las perdidas de cultivos significativas son posibles si no se toman acciones para eliminar la infeccion. El virus se propaga facilmente 50 mediante herramientas contaminadas, las manos de las personas o la ropa, y por contacto directo de una planta a otra. Tambien puede transmitirse por injerto o cuando se recogen esquejes de plantas madre infectadas. El uso de resistencia mediada por la protema de la cubierta puede proporcionar buena resistencia. Sin embargo, incluir repeticiones invertidas del CP puede potenciar la produccion de una lmea resistente.

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B. Composiciones y construcciones de acido nucleico

Se divulgan en el presente documento construcciones de ADN recombinante y procedimientos para su uso para conseguir resistencia a multiples (es decir, mas de una) especies de virus y cepas entre los begomovirus, tospovirus y potexvirus en plantas transgenicas. La resistencia puede conferirse a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o mas especies de virus seleccionados de al menos dos de los siguientes grupos: begomovirus, tospovirus y potexvirus. La resistencia puede estar dirigida por la produccion de ARNip o miARN, y tambien puede complementarse por estrategias basadas en protemas tales como resistencia mediada por la protema de la cubierta o replicasa expresada, formas mutadas de las replicasas y produccion de aptameros. Tambien puede utilizarse la tolerancia de base genetica (es decir, identificada en una estrategia clasica de reproduccion).

Como se usa en el presente documento, la expresion "acido nucleico" se refiere a un polfmero mono o bicatenario de bases desoxirribonucleotfdicas o ribonucleotfdicas lefdas desde el extremo 5' hasta el 3'. El "acido nucleico" tambien puede contener opcionalmente bases nucleotfdicas que no son de origen natural o alteradas que permiten la lectura correcta por una polimerasa y no reducen la expresion de un polipeptido codificado por ese acido nucleico. La expresion "secuencia de nucleotidos" o "secuencia de acido nucleico" se refiere a las hebras tanto sentido como anti-sentido de un acido nucleico como hebras simples individuales o en el duplex. La expresion "acido ribonucleico" (ARN) incluye ARNbc (ARN bicatenario), ARNip (ArN interferente pequeno), ARNhp (ArN de horquilla pequena), ARNm (ARN mensajero), miARN (micro-ARN), ARNt (ARN transferente, ya este cargado o descargado del aminoacido acilado correspondiente) y ARNc (ARN complementario) y la expresion "acido desoxirribonucleico" (ADN) incluye ADNc y ADN genomico e hubridos de ADN-ARN. Las expresiones "segmento de acido nucleico", "segmento de secuencia de nucleotidos" o mas generalmente "segmentos" se entenderan por los expertos en la materia como una expresion funcional que incluye tanto secuencias genomicas, como secuencias de ARN ribosomico, secuencias de ARN transferente, secuencias de ARN mensajero, secuencias de operon y secuencias de nucleotidos modificadas por ingeniena mas pequenas que expresan o pueden adaptarse para expresar protemas, polipeptidos o peptidos.

Como se usa en el presente documento, la expresion "sustancialmente homologa" u "homologfa sustancial", con referencia a un secuencia de acido nucleico, incluye una secuencia de nucleotidos que hibrida en condiciones rigurosas con cualquiera de la SEQ ID NO: 169-455, o una parte o complemento de las mismas, asf como aquellas que permiten que tenga lugar una alineacion antiparalela entre las dos secuencias, y las dos secuencias entonces son capaces, en condiciones rigurosas, de formar enlaces de hidrogeno con las bases correspondientes en la hebra opuesta para formar una molecula duplex que es suficientemente estable en condiciones de rigurosidad apropiada, incluyendo rigurosidad elevada, que es detectable usando procedimientos bien conocidos en la tecnica. Las secuencias sustancialmente homologas pueden tener de un 70 % a un 80 % de identidad de secuencia, o mas preferentemente de un 80 % a un 85 % de identidad de secuencia, o mucho mas preferentemente de un 90 % a un 95 % de identidad de secuencia, hasta un 99 % de identidad de secuencia, con las secuencias de nucleotidos de referencia expuestas en la lista de secuencias, o los complementos de las mismas.

Como se usa en el presente documento, el termino "ortologo" se refiere a un gen en dos o mas especies que ha evolucionado desde una secuencia de nucleotidos ancestral comun, y puede retener la misma funcion en las dos o mas especies.

Como se usa en el presente documento, la expresion "identidad de secuencia", "similitud de secuencia" u "homologfa" se usa para describir las relaciones de secuencia entre dos o mas secuencias de nucleotidos. El porcentaje de "identidad de secuencia" entre dos secuencias se determina comparando dos secuencias alineadas de forma optima sobre una ventana de comparacion tal como la longitud completa de una SEQ ID NO de referencia, en la que la parte de la secuencia en la ventana de comparacion puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) en comparacion con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para una alineacion optima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando la cantidad de posiciones en que aparece la base de acido nucleico o resto aminoaddico identico en ambas secuencias para producir la cantidad de posiciones emparejadas, dividiendo la cantidad de posiciones emparejadas por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparacion, y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Una secuencia que es identica en cada posicion en comparacion con una secuencia de referencia se dice que es identica a la secuencia de referencia y viceversa. Una primera secuencia de nucleotidos, cuando se observa en la direccion 5' a 3', se dice que es un "complemento" de, o complementaria a, una segunda secuencia de nucleotidos o de referencia observada en la direccion 3' a 5' si la primera secuencia de nucleotidos muestra complementariedad completa con la segunda secuencia o de referencia. Como se usa en el presente documento, se dice que las moleculas de secuencia de acido nucleico muestran "complementariedad completa" cuando cada nucleotido de una de las secuencias lefdas de 5' a 3' es complementario a cada nucleotido de la otra secuencia cuando se lee de 3' a 5'. Una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia de nucleotidos de referencia mostrara una secuencia identica a la secuencia del complemento inverso de la secuencia de nucleotidos de referencia. Estos terminos y descripciones estan bien definidos en la tecnica y se comprenden facilmente por los expertos en la materia.

Como se usa en el presente documento, una "ventana de comparacion" se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, habitualmente de 50 a 100, mas habitualmente de 100 a 150, en que se compara

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una secuencia con una secuencia de referencia de la misma cantidad de posiciones contiguas despues de alinear de forma optima las dos secuencias. La ventana de comparacion puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) de un 20 % o menos en comparacion con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para la alineacion optima de las dos secuencias. Los expertos en la materia deben remitirse a los procedimientos detallados usados para la alineacion de secuencias, tales como en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wis., EE. UU.).

Se divulgan en el presente documento secuencias de ADN capaces de expresarse como un transcrito de ARN en una celula o microorganismo para inhibir la expresion de un gen diana de al menos un virus de plantas. Las secuencias comprenden una molecula de ADN que codifica una o mas secuencias de nucleotidos diferentes, en las que cada una de las secuencias de nucleotidos diferentes comprenden una secuencia de nucleotidos sentido y una secuencia de nucleotidos anti-sentido. Las secuencias pueden estar conectadas por una secuencia espaciadora. La secuencia espaciadora puede constituir parte de la secuencia de nucleotidos sentido o la secuencia de nucleotidos anti-sentido o una secuencia de nucleotidos no relacionada y se forma dentro de la molecula de ARNbc entre las secuencias sentido y anti-sentido. La secuencia espaciadora puede comprender, por ejemplo, una secuencia de nucleotidos de al menos 10-100 nucleotidos de longitud, o como alternativa de al menos 100-200 nucleotidos de longitud, al menos 200-400 nucleotidos de longitud o al menos 400-500 nucleotidos de longitud. La secuencia de nucleotidos sentido o la secuencia de nucleotidos anti-sentido puede ser sustancialmente identica a la secuencia de nucleotidos del gen diana o un derivado del mismo o una secuencia complementaria al mismo. La molecula de ADNbc puede situarse funcionalmente bajo el control de una o mas secuencias promotoras que funcionan en la celula, tejido u organo del hospedador que expresa el ADNbc para producir moleculas de ARN. Como se usa en el presente documento, "expresar" o "expresion" se refiere a la transcripcion de una molecula de ARN a partir de un polinucleotido transcrito. La molecula de ARN puede traducirse o no en una secuencia polipeptfdica.

En el presente documento se divulga tambien una secuencia de ADN para su expresion en una celula de una planta que, tras la expresion del ADN en ARN y el contacto con un virus de plantas consigue la supresion de un gen vmco diana o la replicacion vmca o sintomatologfa (es decir, expresion de smtomas). Los procedimientos para expresar una molecula de supresion genica en plantas son conocidos (por ejemplo, publicacion de Estados Unidos 2006/0200878 A1; publicacion de Estados Unidos 2006/0174380; publicacion de Estados Unidos 2008/0066206; Niu y col., 2006), y pueden usarse para expresar una secuencia de nucleotidos.

Los promotores no constitutivos adecuados para su uso con construcciones de ADN recombinante incluyen promotores espedficos de forma espacial, promotores espedficos respecto al desarrollo y promotores inducibles. Los promotores espedficos respecto al espacio pueden incluir promotores espedficos de organulo, celula, tejido u organo (por ejemplo, un promotor espedfico de plastidios, espedfico de rafces, espedfico de polen o espedfico de semillas para suprimir la expresion del primer ARN diana en plastidios, rafces, polen o semillas, respectivamente). En muchos casos, se usa especialmente un promotor espedfico de semillas, espedfico de embriones, espedfico de aleurona o espedfico de endosperma. Los promotores espedficos respecto al desarrollo pueden incluir promotores que tienden a promover la expresion durante ciertas fases del desarrollo en el ciclo de crecimiento de una planta, o en diferentes estaciones en un ano. Los promotores inducibles incluyen promotores inducidos por agentes qmmicos o por condiciones ambientales tales como sobrecarga biotica o abiotica (por ejemplo, escasez de agua o seqrna, calor, fno, altos o bajos niveles de nutrientes o sales, altos o bajos niveles de luz, o infeccion por plagas o patogenos). Tambien son de interes los promotores de micro-ARN, especialmente aquellos que tienen un patron de expresion espedfico respecto al desarrollo, espedfico en el espacio o inducible. Un promotor espedfico de la expresion tambien puede incluir promotores que generalmente se expresan de forma constitutiva, pero en diferentes grados o "fuerza" de expresion, incluyendo promotores habitualmente considerados como "promotores fuertes" o como "promotores debiles".

Por tanto, una secuencia genica o fragmento para el control de virus de plantas puede clonarse en direccion 3' de un promotor o promotores que son funcionales en una celula de planta transgenica y en la que se expresa para producir ARNm en la celula de la planta transgenica que forma moleculas de ARNbc. Se conocen en la tecnica numerosos ejemplos de promotores expresables en plantas (por ejemplo, CaMV 35S; FMV 35S; PClSV (por ejemplo, patente de Estados Unidos 5.850.019); ScBV; AtAct7). Los promotores utiles para la expresion de polipeptidos en plantas incluyen aquellos que son inducibles, vmcos, sinteticos o constitutivos como se describe en Odell y col. (1985), y/o promotores que estan regulados de forma temporal, regulados de forma espacial o regulados de forma espacio-temporal. Se han identificado varios promotores espedficos de organo y son conocidos en la tecnica (por ejemplo, patentes de Estados Unidos 5.110.732; 5.837.848; 5.459.252; 6.229.067; Hirel y col. 1992). Las moleculas de ARNbc contenidas en tejidos vegetales se expresan en una planta de modo que se consigue la supresion pretendida de la expresion genica del virus diana. El promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, un promotor fuerte arquetfpico comun en aplicaciones de plantas transgenicas, o un promotor relacionado tal como el promotor E35S o FMV, puede emplearse para dirigir genes de resistencia a virus. Tambien se han identificado promotores que dirigen la expresion genica espedfica de tejido.

Una unidad de transcripcion transgenica incluye una secuencia de ADN que codifica un gen de interes. Un gen de interes puede incluir cualquier secuencia codificante o no codificante de una especie de virus. Los ejemplos de una secuencia no codificante a expresar por una unidad de transcripcion transgenica incluyen regiones no traducidas 5', promotores, potenciadores u otras regiones transcripcionales no codificantes, regiones no traducidas 3',

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terminadores, intrones, micro-ARN, secuencias de ADN precursoras de micro-ARN, ARN interferentes pequenos, componentes de ARN de ribosomas o ribozimas, ARN nucleolares pequenos, aptameros de ARN capaces de unirse a un ligando y otros ARN no codificantes.

Los ejemplos de un gen de interes incluyen ademas una secuencia traducible (codificante), tal como genes que codifican factores de transcripcion y genes que codifican enzimas implicadas en la biosmtesis o catabolismo de moleculas de interes (tales como aminoacidos, acidos grasos y otros lfpidos, azucares y otros carbohidratos, poKmeros biologicos y metabolitos secundarios incluyendo alcaloides, terpenoides, policetidos, peptidos no ribosomicos y metabolitos secundarios de origen biosintetico mixto. Un gen de interes puede ser un gen nativo para la celula (por ejemplo, una celula vegetal) en que tiene que transcribirse la construccion de ADN recombinante de la invencion, o puede ser un gen no nativo. Un gen de interes puede ser un gen marcador, por ejemplo, un gen marcador de seleccion que codifica resistencia a antibioticos, a antifungicos o a herbicidas, o un gen marcador que codifica un rasgo facilmente detectable (por ejemplo, en una celula vegetal, la fitoeno sintasa u otros genes que confieren un pigmento particular a la planta) o un gen que codifica una molecula detectable, tal como una protema fluorescente, luciferasa o un polipeptido unico o "marca" de acido nucleico detectable por procedimientos de deteccion de protemas o acidos nucleicos, respectivamente). Los marcadores de seleccion son genes de interes de utilidad particular en la identificacion del procesamiento satisfactorio de construcciones descrita en el presente documento.

Los genes de interes incluyen aquellos genes que pueden describirse como "genes diana". El gen diana puede incluir un unico gen o parte de un unico gen que se aborda para su supresion, o puede incluir, por ejemplo, multiples segmentos consecutivos de un gen diana, multiples segmentos no consecutivos de un gen diana, multiples alelos de un gen diana o multiples genes diana de una o mas especies. El gen diana puede ser una secuencia traducible (codificante), o puede ser una secuencia no codificante (tal como una secuencia reguladora no codificante), o ambas. La unidad de transcripcion transgenica puede incluir ademas una secuencia 5' o 3' o ambas segun lo necesario para la transcripcion del transgen. Cuando es deseable, por ejemplo, suprimir un gen diana en multiples cepas o especies, por ejemplo, de virus, puede ser deseable disenar la construccion de ADN recombinante para que se procese en un miARN maduro para suprimir una secuencia genica diana comun a las multiples cepas o especies en que tiene que silenciarse el gen diana. Por tanto, el miARN procesado de la construccion de ADN recombinante puede disenarse para que sea espedfico para un taxon (por ejemplo, espedfico para un genero, familia, pero no para otros taxones).

Las moleculas de acido nucleico o fragmentos de las moleculas de acido nucleico u otras moleculas de acido nucleico en la lista de secuencias son capaces de hibridar espedficamente con otras moleculas de acido nucleico en ciertas circunstancias. Como se usa en el presente documento, se dice que dos moleculas de acido nucleico son capaces de hibridar espedficamente entre sf si las dos moleculas son capaces de formar una estructura de acido nucleico antiparalela, bicatenaria. Se dice que una molecula de acido nucleico es el complemento de otra molecula de acido nucleico si muestra complementariedad completa. Se dice que dos moleculas son "mmimamente complementarias" si pueden hibridar entre sf con suficiente estabilidad para permitirles permanecer hibridadas entre sf en al menos condiciones convencionales "de baja rigurosidad". Se dice que las moleculas son complementarias si pueden hibridar entre si con suficiente estabilidad para permitirles permanecer hibridadas entre sf en condiciones convencionales "de alta rigurosidad". Las condiciones convencionales de rigurosidad se describen por Sambrook, y col. (1989), y por Haymes y col. (1985).

Por lo tanto, se permiten distanciamientos de la complementariedad completa, siempre que dichos distanciamientos no imposibiliten completamente la capacidad de las moleculas de formar una estructura bicatenaria. Por tanto, para que una molecula de acido nucleico o un fragmento de la molecula de acido nucleico sirva como cebador o sonda, unicamente tiene que ser suficientemente complementaria en la secuencia para ser capaz de formar una estructura bicatenaria estable en las concentraciones particulares de disolvente y sal empleadas.

Las condiciones apropiadas de rigurosidad que promueven la hibridacion del ADN son, por ejemplo, para aplicaciones que requieren alta selectividad, una condicion de relativamente baja salinidad y/o alta temperatura, tal como se proporciona por NaCl de 0,02 M a 0,15 M a temperaturas de 50 °C a 70 °C. Una condicion de alta rigurosidad, por ejemplo, es lavar el filtro de hibridacion al menos dos veces con tampon de lavado de alta rigurosidad (SSC 0,2 x o SSC 1 x, SDS al 0,1 %, a 65 °C). Otras condiciones, tales como cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6,0 x a 45 °C, seguido por un lavado de SSC 2,0 x a 50 °C, tambien son conocidas por los expertos en la materia o pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology (1989). Por ejemplo, la concentracion salina en la etapa de lavado puede seleccionarse de una baja rigurosidad a aproximadamente SSC 2,0 x a 50 °C hasta una alta rigurosidad de SSC 0,2 x a 50 °C. Ademas, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentarse de condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, a 22 °C, hasta condiciones de alta rigurosidad a 65 °C. Tanto la temperatura como la salinidad pueden variarse, o la temperatura o la concentracion salina pueden mantenerse constantes mientras que la otra variable se cambia. Un acido nucleico para su uso en la presente invencion puede hibridar espedficamente con una o mas moleculas de acido nucleico de un virus de plantas seleccionado de un tospovirus, un begomovirus y un potexvirus o complementos de las mismas en dichas condiciones. Espedficamente, un acido nucleico para su uso en la presente invencion puede mostrar al menos de un 80 %, o al menos de un 90 %, o al menos de un 95 %, o al menos de un 98 % o incluso un 100 % de identidad de secuencia con una o mas moleculas de acido nucleico expuestas en la lista de secuencias, o un complemento de las

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mismas.

Los acidos nucleicos tambien pueden sintetizarse, completamente o en parte, especialmente cuando es deseable proporcionar secuencias preferidas de plantas, por procedimientos conocidos en la tecnica. Por tanto, la totalidad o una parte de los acidos nucleicos descritos en el presente documento pueden sintetizarse usando codones preferidos por un hospedador seleccionado. Los codones preferidos de especie pueden determinarse, por ejemplo, a partir de los codones usados mas frecuentemente en las protemas expresadas en una especie hospedadora particular. Otras modificaciones de las secuencias de nucleotidos pueden provocar mutantes que tienen actividad ligeramente alterada.

Las secuencias de nucleotidos de ARNbc o ARNip comprenden hebras dobles de ribonucleotidos polimerizados y pueden incluir modificaciones a la estructura de fosfato-azucar o el nucleosido. Las modificaciones en la estructura de ARN pueden adaptarse para permitir la inhibicion genetica espedfica. Las moleculas de ARNbc pueden modificarse a traves de un procedimiento enzimatico de modo que puedan generarse moleculas de ARNip. Como alternativa, pueden modificarse por ingeniena una construccion para expresar un segmento de nucleotidos para su uso en una estrategia de resistencia mediada por miARN o ARNip. El ARNip puede mediar de forma eficaz el efecto de regulacion negativa para algunos genes diana en algunos patogenos. Este procedimiento enzimatico puede conseguirse utilizando una enzima RNasa III o una enzima DICER, presente en las celulas de un insecto, un animal vertebrado, un hongo o una planta en la ruta de iARN eucariota (Elbashir y col., 2001; Hamilton y Baulcombe, 1999). Este procedimiento tambien puede utilizar una DICER o RNasa III recombinante introducida en las celulas de un insecto diana a traves de tecnicas de ADN recombinante que son muy conocidas para los expertos en la materia. Tanto la enzima DICER como la RNasa III, que se producen de forma natural en un patogeno o se preparan a traves de tecnicas de ADN recombinante, escinden hebras mas grandes de ARNbc en oligonucleotidos mas pequenos. Las enzimas DICER cortan espedficamente las moleculas de ARNbc en trozos de ARNip cada uno de los cuales es de 19-25 nucleotidos de longitud mientras que las enzimas RNasa III normalmente escinden las moleculas de ARNbc en ARNip de 12-15 pares de bases. Las moleculas de ARNip producidas por cualquiera de las enzimas tienen salientes 3' de 2 a 3 nucleotidos, y extremos 5' fosfato y 3' hidroxilo. Las moleculas de ARNip generadas por la enzima RNasa III son igual que las producidas por las enzimas DICER en la ruta de iARN eucariota y, por tanto, despues se abordan y degradan por el mecanismo de degradacion de ARN celular inherente despues de desenrollarse posteriormente, separarse en ARN monocatenario e hibridar con las secuencias de ARN transcritas por el gen diana. Este procedimiento provoca la degradacion eficaz o eliminacion de la secuencia de ARN codificada por la secuencia de nucleotidos del gen diana en el patogeno. El resultado es el silenciamiento de una secuencia de nucleotidos diana particular dentro del patogeno. Pueden encontrarse descripciones detalladas de los procedimientos enzimaticos en Hannon (2002).

La secuencia de nucleotidos puede grabarse en un medio legible por ordenador. Como se usa en el presente documento, "medio legible por ordenador" se refiere a cualquier medio tangible de expresion que pueda leer y al que pueda accederse directamente por un ordenador. Dichos medios incluyen: medio de almacenamiento magnetico, tal como discos flexibles, disco duro, medio de almacenamiento y cinta magnetica: medio de almacenamiento optico tal como CD-ROM; medio de almacenamiento electrico tal como RAM y ROM, archivos de ordenador con formato de reconocimiento de caracteres opticos e hubridos de estas categonas tale como medios de almacenamiento magneticos/opticos. Un experto en la materia puede apreciar facilmente que puede usarse cualquiera de los medios legibles por ordenador actualmente conocidos para crear un producto fabricado que comprenda un medio legible por ordenador que tenga grabado en el mismo una secuencia de nucleotidos divulgada en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, "grabado" se refiere a un procedimiento de almacenar informacion en un medio legible por ordenador. El experto en la materia puede adoptar facilmente cualquiera de los procedimientos actualmente conocidos para grabar informacion en medio legible por ordenador para generar un medio que comprenda la informacion de secuencia de nucleotidos divulgada en el presente documento. Esta disponible una diversidad de estructuras de almacenamiento de datos para los expertos en la materia para crear un medio legible por ordenador que tenga grabada en el mismo una secuencia de nucleotidos divulgada en el presente documento. La eleccion de la estructura de almacenamiento de datos generalmente se basara en el medio elegido para acceder a la informacion almacenada. Ademas, puede usarse una diversidad de programas de procesamiento de datos y formatos para almacenar la informacion de secuencia de nucleotidos en un medio legible por ordenador. La informacion de secuencia puede representarse en un archivo de texto de procesamiento de textos, con formato en software disponible en el mercado tal como WordPerfect y Microsoft Word, o representado en forma de un archivo de texto ASCII, almacenado en una aplicacion de base de datos, tal como DB2, Sybase u Oracle. Los expertos en la materia pueden adaptar facilmente cualquiera de varios formatos de estructuracion de procesamiento de datos (por ejemplo, archivo de texto o base de datos) para obtener un medio legible por ordenador que tenga grabado en el mismo la informacion de secuencia de nucleotidos divulgada en el presente documento.

El software informatico esta disponible al publico, lo que permite a un experto en la materia acceder a la informacion de secuencia proporcionada en un medio legible por ordenador. El software que implementa los algoritmos de busqueda BLAST (Altschul y col., 1990) y BLAZE (Brutlag, y col., 1993) en un sistema Sybase puede usarse para identificar fases de lectura abierta (ORF) dentro de secuencias tales como Unigenes y EST que se describen en el presente documento y que contienen homologfa a las ORF o protemas de otros organismos. Dichas ORF son fragmentos codificantes de protema dentro de las secuencias descritas en el presente documento y son utiles en la

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produccion de protemas comercialmente importantes tales como enzimas usadas en la biosmtesis de aminoacidos, metabolismo, transcripcion, traduccion, procesamiento de ARN, degradacion de acido nucleico y protemas, modificacion de protemas y replicacion de ADN, restriccion, modificacion, recombinacion y reparacion.

Como se usa en el presente documento, una "diana", un "motivo estructural diana" o un "motivo diana" se refiere a cualquier secuencia seleccionada de forma racional o combinacion de secuencias en que la secuencia o secuencias se eligen basandose en una configuracion tridimensional que se forma tras el plegamiento del motivo diana o la secuencia de nucleotidos del mismo, segun lo apropiado. Hay una diversidad de motivos diana conocidos en la tecnica.

C. Expresion de acido nucleico y supresion del gen diana

La presente invencion proporciona, como un ejemplo, una planta de tomate hospedadora transformada de un organismo diana patogeno, celulas de la planta de tomate transformadas y plantas de tomate transformadas y su descendencia. Las celulas de la planta de tomate transformadas y las plantas transformadas pueden modificarse por ingeniena para expresar una o mas de las secuencias de ARNbc, miARN o ARNm, bajo el control de un promotor heterologo, descrito en el presente documento para proporcionar un efecto protector contra patogenos. Estas secuencias pueden usarse para la supresion genica en un patogeno, reduciendo de ese modo el nivel de incidencia de la enfermedad causada por el patogeno en un organismo hospedador transformado por tejido. Como se usa en el presente documento, la expresion "supresion genica" pretende hacer referencia a cualquiera de los procedimientos bien conocidos para reducir los niveles de protema producidos como resultado de la transcripcion genica en ARNm y la posterior traduccion del ARNm.

La supresion genica tambien pretende indicar la reduccion de la expresion proteica desde un gen o una secuencia codificante incluyendo la supresion genica post-transcripcional y la supresion transcripcional. La supresion genica post-transcripcional esta mediada por la homologfa entre la totalidad o una parte del ARNm transcripto desde un gen o secuencia codificante abordad para la supresion y el ARN bicatenario correspondiente para la supresion, y se refiere a la reduccion sustancial y medible de la cantidad de ARNm disponible en la celula para unirse por los ribosomas o la prevencion de la traduccion por los ribosomas. El ARN transcrito puede estar en la orientacion sentido para lograr lo que se llama cosupresion, en la orientacion anti-sentido para lograr lo que se llama supresion anti-sentido o en ambas orientaciones produciendo un ARNbc que logra lo que se llama interferencia de ARN (iARN).

La supresion genica tambien puede ser eficaz contra genes diana en un virus de plantas que puede entrar en contacto con material vegetal que contiene agentes de supresion genica, espedficamente disenados para inhibir o suprimir la expresion de una o mas secuencias homologas o complementarias del virus. La supresion genica post- transcripcional por ARN orientado anti-sentido o sentido para regular la expresion genica en celulas de plantas se divulga en las patentes de Estados Unidos 5.107.065, 5.759.829, 5.283.184 y 5.231.020. El uso de ARNbc para suprimir genes en plantas se divulga en los documentos WO 99/53050, WO 99/49029, en la publicacion de Estados Unidos 2003/017596, en la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos 2004/0029283.

Un procedimiento beneficioso de la supresion genica post-transcripcional frente a un virus de plantas emplea ARN transcrito tanto orientado sentido como orientado anti-sentido, que se estabiliza, por ejemplo, como una horquilla o una estructura de tallo y bucle (por ejemplo, publicacion de Estados Unidos 2007/0259785). Una construccion de ADN para lograr la supresion genica post-transcripcional puede ser una en que un primer segmento codifica un ARN que muestra una orientacion anti-sentido que muestra identidad sustancial con un segmento de un gen abordado para supresion, que esta unido a un segundo segmento que codifica un ARN que muestra complementariedad sustancial con el primer segmento. Dicha construccion forma una estructura de tallo y de bucle por hibridacion del primer segmento con el segundo segmento y una estructura de bucle de las secuencias de nucleotidos que unen los dos segmentos (veanse los documentos WO94/01550, WO98/05770, US 2002/0048814 y US 2003/0018993). Tambien puede expresarse la coexpresion con un segmento genico diana adicional, como se indica anteriormente (por ejemplo, WO05/019408).

Por consiguiente, se divulga una secuencia de nucleotidos exogena (es decir, no encontrada de forma natural en el genoma de la celula vegetal hospedadora), para la que su expresion provoca la transcripcion de una secuencia de ARN que es sustancialmente similar en secuencia a una molecula de ARN de un gen diana de un virus de plantas, seleccionado de un tospovirus, un begomovirus y un potexvirus, que comprende una secuencia de ARN codificada por una secuencia de nucleotidos dentro del genoma del virus. Por sustancialmente similar se entiende que la secuencia de ARN exogena es capaz de lograr la supresion genica mediada por ARN de una secuencia diana en un genoma vmco. Por tanto, se logra una regulacion negativa de la expresion de la secuencia de nucleotidos correspondiente al gen diana.

Puede utilizarse la expresion de un fragmento de al menos 21 nucleotidos contiguos de una secuencia de acido nucleico de cualquiera de las SEQ ID NO: 169-455, o complementos de las mismas, incluyendo la expresion de un fragmento de hasta 21, 36, 60, 100, 550 o 1000 nucleotidos contiguos, o secuencias que presentan un 90-100 % de identidad con dichas secuencias, o sus complementos. Un nucleotido puede comprender una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 85, 99, 113, 127 y 141. Un

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nucleotido tambien puede comprender una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 379-455. Un nucleotido puede describirse ademas comprendiendo uno o mas de los nucleotidos 1-21, 22-50, 51-100, 101-150, 151-200, 201-250, 251-300, 301-350, 351-400, 401-450, 451-500, 501-550, 551-600, 601-650, 651-700, 701-750, 751-800, 801-850, 851-900, 901-950, 951-1000, 1001-1050, 1051-1100, 1101-1150, 1151-1200, 1201-1250, 1251-1300, 1301-1350, 1351-1400, 1401-1450, 1451-1500, 1501-1550, 1551-1600, 1601-1650, 1651-1700, 1701-1750, 17511800, 1801-1850, 1851-1900, 1901-1950, 1951-2000, 2001-2050, 2051-2100, 23-75, 76-125, 126-175, 176-225, 226-275, 276-325, 326-375, 376-425, 426-475, 476-525, 526-575, 576-625, 626-675, 676-725, 726-775, 776-825, 826-875, 876-925, 926-975, 976-1025, 1026-1075, 1076-1125, 1126-1175, 1176-1225, 1226-1275, 1276-1325, 1326-1375, 1376-1425, 1426-1475, 1476-1525, 1526-1575, 1576-1625, 1626-1675, 1676-1725, 1726-1775, 17761825, 1826-1875, 1876-1925, 1926-1975, 1976-2025, 2026-2075, 2076-2125, 1-550, 200-750, 300-850, 400-950, 500-1050, 600-1150, 700-1250, 800-1350, 900-1450, 1000-1550, 1100-1650, 1200-1750, 1300-1850, 1400-1950, 1500-2050, hasta la longitud completa de la secuencia, de una o mas de cualquiera de las SEQ ID NO: 169-455. Se contempla una secuencia complementaria a la totalidad o a una parte de una cualquiera de las SEQ ID NO: 169-455 o SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 85, 99, 113, 127 y 141, en la que la expresion de dicha secuencia suprime la expresion de uno cualquiera o mas de los genes codificados por una secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 169-455. Las secuencias dispuestas para su expresion para producir ARNbc pueden combinarse con: (1) secuencias disenadas para la produccion de miARN, incluyendo en casetes de miARN apilados; y/o (2) secuencias para la inhibicion del ensamblaje del virus, para inhibir de forma sinergica los virus diana. Los procedimientos para seleccionar subsecuencias espedficas como dianas para la supresion genica mediada por miARN o por ARNip son conocidos en la tecnica (por ejemplo, Reynolds y col., 2004).

La inhibicion de un gen diana usando tecnologfa de ARNbc es espedfica de secuencia porque las secuencias de nucleotidos correspondientes a la region duplex del ARN se abordan para su supresion. Habitualmente se prefiere para la inhibicion el ARN que contiene una secuencia de nucleotidos identica a una parte del transcrito del gen diana. Tambien se ha descubierto que las secuencias de ARN con inserciones, eliminaciones y mutaciones puntuales individuales respecto a la secuencia diana son eficaces para la inhibicion. En la realizacion de la presente invencion, el ARNbc inhibidor y la parte del gen diana pueden compartir al menos un 80 % de identidad de secuencia, o de un 90 % de identidad de secuencia, o de un 95 % de identidad de secuencia, o de un 99 % de identidad de secuencia, o incluso de un 100% de identidad de secuencia. Como alternativa, la region duplex del ARN puede definirse funcionalmente como una secuencia de nucleotidos que es capaz de hibridar con una parte del transcrito del gen diana. Una secuencia de longitud menor que la totalidad que muestra una homologfa mayor compensa una secuencia menos homologa mas larga. La longitud de las secuencias de nucleotidos identicas puede ser de al menos 18, 21, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 o al menos 1000 bases. Normalmente, debe usarse una secuencia de mas de 20-100 nucleotidos, aunque puede preferirse una secuencia de mas de 200-300 nucleotidos, y puede preferirse especialmente una secuencia de mas de 500-1000 nucleotidos dependiendo del tamano del gen diana. Pueden tolerarse variaciones de secuencia que podnan esperarse debido a mutacion genetica, polimorfismo de cepas o divergencia evolutiva. La molecula de acido nucleico introducida no tiene que ser absolutamente homologa a la secuencia diana, y no tiene que ser de longitud completa respecto al producto de transcripcion primario o el ARNm completamente procesado del gen diana. Por lo tanto, los expertos en la materia tienen que lograr que, como se divulga en el presente documento, no se requiera un 100 % de identidad de secuencia entre el ARN y el gen diana para poner en practica la presente invencion.

La inhibicion de la expresion del gen diana puede cuantificarse midiendo el ARN diana endogeno con la protema producida por la traduccion del ARN diana y las consecuencias de la inhibicion pueden confirmarse por examen de las propiedades superficiales de la celula u organismo. Las tecnicas para cuantificar el ARN y las protemas son bien conocidas para los expertos en la materia.

La expresion genica puede inhibirse en al menos un 10 %, en al menos un 33 %, en al menos un 50 % o en al menos un 80 %. En particular, la expresion genica puede inhibirse en al menos un 80 %, en al menos un 90 %, en al menos un 95 % o en al menos un 99 % dentro de las celulas hospedadoras infectadas por el virus, de modo que tenga lugar una inhibicion significativa. La inhibicion significativa pretende hacer referencia a una inhibicion suficiente que provoque un fenotipo detectable (por ejemplo, reduccion de la expresion de smtomas) o una disminucion detectable en el ARN y/o en la protema correspondiente al gen diana que se esta inhibiendo.

Las moleculas de ARNbc pueden sintetizarse in vivo o in vitro. El ARNbc puede formarse por una unica hebra de ARN auto-complementaria o a partir de dos hebras de ARN complementarias. La ARN polimerasa endogena de la celula puede mediar la transcripcion in vivo, o puede usarse la ARN polimerasa clonada para la transcripcion in vivo o in vitro. La inhibicion puede abordarse por transcripcion espedfica en un organo, tejido o tipo celular; la estimulacion de una condicion ambiental (por ejemplo, infeccion, sobrecarga, temperatura, inductores qmmicos); y/o modificacion por ingeniena de la transcripcion en una fase o edad del desarrollo. Las hebras de ARN pueden estar poliadeniladas o no; las hebras de ARN pueden ser capaces o no de traducirse en un polipeptido por un aparato de traduccion de la celula.

Como se usa en el presente documento, la expresion "agente de control de enfermedades" o "agente de supresion genica" puede hacer referencia a una molecula de ARN particular que consiste en un primer segmento de aRn y un segundo segmento de ARN unidos por un tercer segmento de ARN. El primer y el segundo segmento de ARN recaen dentro de la longitud de la molecula de ARN y son repeticiones sustancialmente invertidas entre sf y estan

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unidos juntos por el tercer segmento de ARN. La complementariedad entre el primer y el segundo segmento de ARN provoca la capacidad de que los dos segmentos hibriden in vivo e in vitro para formar una molecula bicatenaria, es decir, un tallo, unido en un extremo de cada uno del primer y segundo segmento por el tercer segmento que forma un bucle, de modo que la estructura completa forma una estructura de tallo y bucle, o incluso estructuras de hibridacion mas estrecha pueden formarse en una estructura anudada de tallo-bucle. El primer y el segundo segmento corresponden invariablemente, pero no necesariamente, respectivamente, a una secuencia sentido y una anti-sentido homologa con respecto al ARN diana transcrito a partir del gen diana en el virus diana que se pretende suprimir por la molecula de ARNbc.

Como se usa en el presente documento, el termino "genoma" segun se aplica a un virus de plantas o a un hospedador abarca no solamente ADN o ARN vmico, o ADN cromosomico encontrado dentro del nucleo, sino ADN de organulos encontrado de componentes subcelulares de la celula. El ADN de la presente invencion introducido en celulas vegetales, por lo tanto, puede estar integrado de forma cromosomica o localizado en organulos. El termino "genoma" segun se aplica a bacterias, abarca tanto el cromosoma como los plasmidos dentro de una celula hospedadora bacteriana. El ADN que se introduce en celulas hospedadoras bacterianas, por lo tanto, puede integrarse cromosomicamente o localizarse en plasmidos.

Se preve que las composiciones divulgadas en el presente documento puedan incorporarse dentro de las semillas de una especie de planta como un producto de expresion a partir de un gen recombinante incorporado en el genoma de las celulas vegetales. La celula vegetal que contiene un gen recombinante se considera en el presente documento un evento transgenico.

D. Vectores recombinantes y transformacion de celulas hospedadoras

Un vector de ADN recombinante puede ser, por ejemplo, un plasmido lineal o circular cerrado. El sistema de vector puede ser un vector unico o plasmido o dos o mas vectores o plasmidos que juntos contienen el ADN total a introducir en el genoma del hospedador bacteriano. Ademas, un vector bacteriano puede ser un vector de expresion. Las moleculas de acido nucleico expuestas en la lista de secuencias, o complementos o fragmentos de las mismas, pueden insertarse adecuadamente, por ejemplo, en un vector bajo el control de un promotor adecuado que funciona en uno o mas hospedadores microbianos para dirigir la expresion de una secuencia codificante unida u otra secuencia de ADN. Muchos vectores estan disponibles para este fin, y la seleccion del vector apropiado dependera principalmente del tamano del acido nucleico a insertar en el vector y de la celula hospedadora particular a transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes dependiendo de su funcion (amplificacion de ADN o expresion de ADN) y la celula hospedadora particular con la que es compatible. Los componentes del vector para transformacion bacteriana generalmente incluyen uno o mas de los siguientes: una secuencia senal, un origen de replicacion, uno o mas genes marcadores de seleccion y un promotor inducible que permite la expresion de ADN exogeno.

Los vectores de expresion y de clonacion generalmente contienen un gen de seleccion, tambien mencionado como marcador de seleccion. Este gen codifica una protema necesaria para la supervivencia o crecimiento de celulas hospedadoras transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Los genes de seleccion tfpicos codifican protemas que (a) confieren resistencia a antibioticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotroficas, o (c) suministran nutrientes cnticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para bacilos. Esas celulas que se transforman satisfactoriamente como una protema heterologa o un fragmento de la misma producen protema que confiere resistencia a farmacos y, por tanto, sobreviven al regimen de seleccion.

Un vector de expresion para producir un ARNm tambien puede contener un promotor inducible que se reconoce por un organismo hospedador y esta unido de forma funcional al acido nucleico. La expresion "unido de forma funcional", como se usa en referencia a una secuencia reguladora y a una secuencia de nucleotidos estructural, significa que la secuencia reguladora causa la expresion regulada de la secuencia de nucleotidos estructural unida. "Secuencias reguladoras" o "elementos de control" se refieren a secuencias de nucleotidos localizadas en direccion 5' (secuencias no codificantes 5') dentro o en direccion 3' (secuencias no traducidas 3') de una secuencia de nucleotidos estructural, y que influye en la cronologfa y nivel o la cantidad de la transcripcion, el procesamiento o la estabilidad del ARN, o la traduccion de la secuencia de nucleotidos estructural asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias lfder de traduccion, intrones, potenciadores, estructuras de tallo- bucle, secuencias de union al represor y secuencias de reconocimiento de poliadenilacion.

La construccion de vectores adecuados que contienen uno o mas de los componentes enumerados anteriormente emplea tecnicas convencionales de ADN recombinante. Los plasmidos aislados o los fragmentos de ADN se escinden, adaptan y vuelven a ligar en la forma deseada para generar los plasmidos requeridos. Los ejemplos de vectores de expresion bacterianos disponibles incluyen los vectores de clonacion y de expresion multifuncionales de

E. coli tales como Bluescript™ (Stratagene, La Jolla, CA), en que, por ejemplo, un acido nucleico, o un fragmento del mismo puede ligarse en el vector en fase con secuencias para la Met aminoterminal y los 7 restos posteriores de p- galactosidasa para producir una protema tubrida, y vectores pIN (Van Heeke y Schuster, 1989).

El procedimiento de la presente invencion implica la transformacion de al menos dos secuencias de acido nucleico

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que proporcionan de forma colectiva resistencia a al menos dos especies de virus de plantas de las familias Geminiviridae, Bunyaviridae y Flexiviridae en una planta para conseguir resistencia a virus. Puede prepararse facilmente un vector de transformacion usando procedimientos disponibles en la tecnica. El vector de transformacion comprende una o mas secuencias de nucleotidos que son capaces de transcribirse en una molecula de ARN y que son sustancialmente homologas y/o complementarias a una o mas secuencias de nucleotidos codificadas por el genoma del virus o de los virus diana, de modo que tras el contacto del ARN transcrito a partir de la una o mas secuencias de nucleotidos por el virus parasitario de la planta diana, existe una regulacion negativa de la expresion de al menos una de las secuencias de nucleotidos respectivas del genoma del virus.

El vector de transformacion puede denominarse construccion de ADNbc y tambien puede definirse como una molecula recombinante, un agente de control de enfermedades, una molecula genetica o una construccion genetica quimerica. Una construccion genetica quimerica puede comprender, por ejemplo, secuencias de nucleotidos que codifican uno o mas transcritos anti-sentido, uno o mas transcritos sentido, uno o mas de cada uno de los mencionados anteriormente, en el que todo o parte de un transcrito del mismo es homologo a todo o a parte de una molecula de ARN que comprende una secuencia de ARN codificada por una secuencia de nucleotidos dentro del genoma de un virus de plantas.

Un vector de transformacion de plantas puede comprender una molecula de ADN aislada y purificada que comprende un promotor heterologo unido de forma funcional a una o mas secuencias de nucleotidos divulgadas en el presente documento. La secuencia de nucleotidos incluye un segmento que codifica todo o parte de un ARN presente dentro de un transcrito de ARN diana y puede comprender repeticiones invertidas de todo o parte de un ARN diana. La molecula de ADN que comprende el vector de expresion tambien puede contener una secuencia intronica funcional situada direccion 5' de la secuencia codificante o incluso dentro de la secuencia codificante, y tambien puede contener una secuencia lfder no traducida cinco prima (5') (es decir, una UTR o 5'-UTR) situada entre el promotor y el punto de inicio de la traduccion.

Un vector de transformacion de plantas puede contener secuencias para mas de un gen, permitiendo, por tanto, la produccion de mas de un ARNbc, miARN o ARNip para inhibir la expresion de genes del mas de un virus diana. Por ejemplo, un vector o construccion puede comprender hasta 8 o 10, o mas, segmentos de acido nucleico para la transcripcion de secuencias antivmcas, como se muestra en la figura 10. Un experto en la materia apreciara facilmente que los segmentos de ADN cuya secuencia corresponde a la presente en diferentes genes pueden combinarse en un unico fragmento de aDn compuesto para su expresion en una planta transgenica. Como alternativa, puede modificarse un plasmido que ya contiene al menos un segmento de ADN por la insercion secuencias de segmentos de ADN adicionales entre el potenciador y el promotor y las secuencias terminadoras. En el agente de control de enfermedades disenado para la inhibicion de multiples genes, los genes a inhibir pueden obtenerse de la misma cepa o especie de virus de plantas para potenciar la eficacia del agente de control. Los genes pueden obtenerse de diferentes virus de plantas para ampliar el rango de virus contra los que es eficaz el agente o agentes. Cuando se abordan multiples genes para su supresion o una combinacion de expresion y supresion, puede fabricarse un elemento de ADN policistronico como se ilustra y se divulga en la publicacion de Estados Unidos 2004/0029283.

Un vector o construccion de ADN recombinante puede comprender un marcado de seleccion que confiere un fenotipo de seleccion en celulas vegetales. Los marcadores de seleccion tambien pueden usarse para seleccionar plantas o celulas vegetales que contienen los acidos nucleicos exogenos que codifican polipeptidos o protemas divulgados en el presente documento. El marcador puede codificar resistencia a biocidas, resistencia a antibioticos (por ejemplo, kanamicina, G418, bleomicina, higromicina) o resistencia a herbicidas (por ejemplo, glifosato). Los ejemplos de marcadores de seleccion incluyen un gen neo que codifica resistencia a kanamicina y puede seleccionarse usando kanamicina o G418, un gen bar que codifica resistencia a bialafos; un gen mutante de EPSP sintasa que codifica resistencia a glifosato; un gen de nitrilasa que confiere resistencia a bromoxinilo; un gen mutante de acetolactato sintasa (ALS) que confiere resistencia a imidazolinona o sulfonilurea; y un gen DHFR resistente a metotrexato. Hay multiples marcadores de seleccion disponibles que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina y tetraciclina. Los ejemplos de dichos marcadores de seleccion se ilustran en las patentes de Estados Unidos 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 y 6.118.047.

Un vector o construccion recombinante tambien puede incluir un marcador seleccionable. Los marcadores seleccionables pueden usarse para controlar la expresion. Los marcadores seleccionables ejemplares incluyen el gen de la p-glucuronidasa o uidA (GUS) que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogenicos (Jefferson y col., 1987); uno o mas de los diversos genes de protemas fluorescentes (FP) tales como protema fluorescente verde (GFP), protema fluorescente roja (RFP) o una cualquiera de una gran familia de protemas que tipicamente emiten fluorescencia a una longitud de onda caractenstica; un gen de locus R, que codifica un producto que regula la produccion de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos vegetales (Dellaporta y col., 1988); un gen de p-lactamasa (Sutcliffe y col., 1978), un gen que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogenicos (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromogenica); un gen de luciferasa (Ow y col., 1986); un gen xylE (Zukowski y col., 1983) que codifica una catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromogenicos; un gen de a-amilasa (Ikatu y col., 1990); un gen de tirosinasa (Katz y col., 1983) que codifica una enzima capaz de oxidar tirosina en DOPA y dopaquinona que, a su vez, se condensa en melanina;

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una a-galactosidasa, que cataliza un sustrato cromogenico de a-galactosa.

Los vectores de transformacion de plantas para su uso con la presente invencion pueden incluir, por ejemplo, los derivados de un plasmido Ti de Agrobacterium tumefaciens (por ejemplo, patentes de Estados Unidos 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937, 5.501.967 y el documento EP 0 122 791). Tambien son utiles los plasmidos de Agrobacterium rhizogenes (o "Ri") y son conocidos en la tecnica. Otros vectores de transformacion de plantas preferidos incluyen los divulgados, por ejemplo, por Herrera-Estrella (1983); Bevan (1983), Klee (1985) y el documento EP 0 120 516.

Un ADN recombinante funcional puede introducirse en una ubicacion no espedfica en un genoma de una planta. En casos especiales, puede ser util insertar una construccion de ADN recombinante por integracion espedfica de sitio. Existen varios sistemas de recombinacion espedfica de sitio que se sabe que funcionan en plantas, incluyendo cre-lox como se divulga en la patente de Estados Unidos 4.959.317 y FLP-FRT como se divulga en la patente de Estados Unidos 5.527.695.

Los procedimientos adecuados para la transformacion de celulas hospedadoras para su uso con la presente invencion se cree que incluyen casi cualquier procedimiento por el que pueda introducirse ADN en una celula (vease, por ejemplo, Miki y col., 1993), tal como por transformacion de protoplastos (patente de Estados Unidos 5.508.184; Omirulleh y col., 1993), por desecacion/captacion de ADN mediada por inhibicion (Potrykus y col., 1985), por electroporacion (patente de Estados Unidos 5.384.253), por agitacion con fibras de carburo de silicio (Kaeppler y col., 1990; patentes de Estados Unidos 5.302.523; y 5.464.765), por transformacion mediada por Agrobacterium (patentes de Estados Unidos 5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840; 6.384.301) y por aceleracion de partfculas recubiertas con ADN (patentes de Estados Unidos 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861; 6.403.865; Padgette y col. 1995). A traves de la aplicacion de tecnicas tales como estas, pueden transformarse de forma estable las celulas de casi cualquier especie. En el caso de especies multicelulares, las celulas transgenicas pueden regenerarse en organismos transgenicos.

El procedimiento mas ampliamente utilizado para introducir un vector de expresion en plantas se basa en el sistema de transformacion natural de Agrobacterium (por ejemplo, Horsch y col., 1985). A. tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias del suelo patogenas de plantas que transforman geneticamente celulas vegetales. Los plasmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, portan genes responsables de la transformacion genetica de la planta. Se proporcionan descripciones de sistemas de vector de Agrobacterium y procedimientos para la transferencia genica mediada por Agrobacterium en numerosas referencias, incluyendo Gruber y col. 1993; Miki y col., 1993, Moloney y col., 1989 y las patentes de Estados Unidos 4.940.838 y 5.464.763. Otras bacterias tales como Sinorhizobium, Rhizobium, y Mesorhizobium que interactuan con plantas de forma natural pueden modificarse para que medien la transferencia genica a varias plantas diversas. Estas bacterias simbioticas asociadas con plantas pueden hacerse competentes para la transferencia genica por adquisicion tanto de plasmidos Ti desarmados como de un vector binario adecuado (Broothaerts y col., 2005). Tambien pueden usarse procedimientos para la introduccion de secuencias vmcas en plantas (por ejemplo, Grimsley, 1990, Boulton, 1996).

Los procedimientos para la creacion de plantas transgenicas y la expresion de acidos nucleicos heterologos en plantas en particular son conocidos y pueden usarse con los acidos nucleicos divulgados en el presente documento para preparar plantas transgenicas que muestran susceptibilidad reducida a virus patogenos de plantas. Los vectores de transformacion de plantas pueden prepararse, por ejemplo, insertando los acidos nucleicos productores de ARNbc divulgados en el presente documento en vectores de transformacion de plantas e introduciendo estos en plantas. Un sistema de vector conocido se ha obtenido modificando el sistema de transferencia genica natural de Agrobacterium tumefaciens. El sistema natural comprende plasmidos Ti grandes (inductores de tumor) que contienen un segmento grande, conocido como ADN-T, que se transfiere a plantas transformadas. Otro segmento del plasmido Ti, la region vir, es responsable de la transferencia del ADN-T. La region de ADN-T esta delimitada por repeticiones terminales. En los vectores binarios modificados, se han eliminado los genes inductores de tumor y se utilizan las funciones de la region vir para transferir ADN foraneo delimitado por las secuencias de borde de ADN-T. La region T tambien puede contener un marcador de seleccion para la recuperacion eficaz de plantas y celulas transgenicas, y un sitio de clonacion multiple para insertar secuencias para la transferencia, tal como un acido nucleico codificante de ARNbc.

Los protocolos para la transformacion de celulas de tomate son conocidos en la tecnica (por ejemplo, McCormick, 1991). Se analizan protocolos de transformacion de plantas alternativos en Boulton (1996), y Grimsley (1990). Los protocolos de transformacion y regeneracion para otras plantas, tales como pimiento, son conocidos en la tecnica (por ejemplo, Christopher y Rajam, 1996; patente de Estados Unidos 5.262.316; Liu y col. 1990). Por ejemplo, dicho protocolo para la transformacion de tomate podna incluir etapas bien conocidas de esterilizacion de semillas, germinacion y crecimiento de semillas, explante de plantulas, crecimiento y preparacion de cultivo de Agrobacterium, cocultivo, seleccion y regeneracion.

E. Plantas y celulas transgenicas

Una planta transgenica formada usando procedimientos de transformacion con Agrobacterium tfpicamente puede contener una unica secuencia de ADN recombinante simple insertada en un cromosoma, mencionado como evento transgenico. Dichas plantas transgenicas pueden mencionarse como heterocigoticas para la secuencia exogena

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insertada. Una planta transgenica homocigotica con respecto a un transgen puede obtenerse por apareamiento sexual (autofertilizacion) de una planta transgenica segregante independiente que contiene una unica secuencia genica exogena consigo misma, por ejemplo, una planta F0, para producir semillas F1. Una cuarta parte de las semillas F1 producidas seran homocigoticas con respecto al transgen. La germinacion de semillas F1 produce plantas que pueden ensayarse para la heterocigosidad, tipicamente usando un ensayo de SNP o un ensayo de amplificacion termica que permite la distincion entre heterocigotos y homocigotos (es decir, un ensayo de cigosidad). El cruce de una planta heterocigotica consigo misma u otra planta heterocigotica produce una descendencia heterocigotica, asf como descendencia transgenica homocigotica y nula homocigotica.

Ademas de la transformacion directa de una planta con una construccion de ADN recombinante, pueden prepararse plantas transgenicas cruzando una primera planta que tiene una construccion de ADN recombinante con una segunda planta que carece de la construccion. Por ejemplo, puede introducirse un ADN recombinante para la supresion genica en una primera lmea de plantas que es susceptible a transformacion para producir una planta transgenica que puede cruzarse con una segunda lmea de plantas para producir introgresion del ADN recombinante para supresion genica en la segunda lmea de plantas.

F. Cribados de resistencia a virus

La inoculacion y ensayo de enfermedades con virus tales como TSWV, TYLCV, y PepMV se realizo usando transmision mecanica o agroinfeccion (por ejemplo, Boulton, 1996; Grimsley, 1990). La infeccion de TSWV se consiguio de forma mecanica, esencialmente como se describe por Kumar y col., (1993) con algunas modificaciones. La inoculacion con begomovirus (por ejemplo, TYLCV) y el ensayo de la enfermedad de plantas se consiguio por agroinfeccion de la siguiente manera: Se sembraron semillas de tomate (Lycopersicon esculentum) cvs. (Resistente (R): HP919; Resistente intermedio (IR): Hilario; Susceptible (S): Arletta) y se cultivaron aproximadamente 20 plantas para cada inoculacion, asf como un control no inoculado o de inoculacion simulada, durante 7-10 dfas, hasta la fase de cotiledones sin hojas primarias visibles. Los laterales inferiores de los cotiledones entonces se infiltraron usando una jeringa sin aguja, y se realizaron posteriormente inoculaciones adicionales por inyeccion en los tallos en la fase de 2-3 hojas verdadera, aproximadamente 1-2 semanas despues. La infiltracion o inyeccion utilizo una cepa de A. tumefaciens transformada, inducida con acetosiringona, que contema un clon infeccioso del virus que se habfa cultivado en caldo YEB con antibioticos para la seleccion del vector pBIN durante aproximadamente 15 horas a 28 °C en un agitador (170r.p.m.) a partir de la inoculacion de un cultivo fresco. Despues del crecimiento a 28 °C, el cultivo se centrifugo y se resuspendio en 10 ml de MMA (por 1 litro: 20 g de sacarosa, 5 g de sales MS, 1,95 g de MES, pH 5,6 con NaOH y 1 ml de solucion madre de acetosiringona 200 mM; dH2O hasta 1 litro). Las plantas se cultivaron a 20-25 °C (dfa/noche), con 16 horas de luz en el invernadero o camara de cultivo. Despues de 6 semanas, se valoraron los smtomas de la siguiente manera:

1. sin smtomas visibles (resistente)

3. smtomas muy leves (resistente)

5. smtomas medios 7. smtomas fuertes 9. smtomas muy fuertes

La inoculacion con el potexvirus virus del mosaico del pepino (PepMV) se consiguio de la siguiente manera: Se preparo el inoculo del virus infectando mecanicamente plantulas de tomate (susceptibles cv. Apollo, 9-12 dfas de edad) despues de espolvoreo de las hojas con polvo de carborundo. Los tejidos infectados se recogieron y se homogeneizo 1 g de tejido infectado con 5-10 ml de tampon fosfato (pH 9). Este inoculo preparado entonces se uso para inocular mecanicamente plantas experimentales en la fase de cotiledones (7-10 dfas despues de la siembra). Las plantas inoculadas se cultivaron en el invernadero a 19-23 °C (dfa/noche), con 16 horas de luz por 24 horas, en el invernadero con un 70% de humedad relativa. Las plantas se evaluaron a los 11-21 dfas despues de la inoculacion, y se valoraron de la siguiente manera:

1. sin smtomas visibles (resistente)

3. algo de clorosis foliar

5. clorosis en venas foliares y/o mosaico foliar

7. clorosis en venas foliares y hojas puntiagudas

9. clorosis en venas foliares y hojas puntiagudas y mosaico amarillo

G. Extraccion de ARN y transferencias de Northern de ARNip

Se extrajo el ARN para transferencia de Northern de ARN pequeno usando Trizol® esencialmente de acuerdo con las directrices del fabricante (Invitrogen). En resumen, se molieron aproximadamente 100-200 mg de tejido foliar fresco en nitrogeno lfquido en un tubo de centnfuga de 1,5 ml colocado en hielo seco. La muestra se retiro del hielo seco y se anadio 1 ml de Trizol bajo una campana de extraccion. Esto se mezclo bien y se incubo a temperatura ambiente (TA) durante 10 minutos. A continuacion, se anadieron 0,2 ml de cloroformo, y la muestra se agito a mano durante 30 segundos y se centrifugo 13 000 r.p.m. en una centnfuga de mesa refrigerada durante 15 minutos a 4 °C.

La fase acuosa se transfirio a un nuevo tubo, se le anadio 0,5 ml de isopropanol y los tubos se invirtieron unas pocas

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El sedimento se resuspendio anadiendo 100 jl de ddH2O sin RNasa y se agito con vortice durante unos pocos segundos. Las muestras se congelaron en hielo seco y el ARN se concentro por el uso de un vado por aceleracion durante aproximadamente 20 minutos: esta etapa elimina todos los restos de etanol. El ARN se cuantifico por espectrofotometro (habitualmente se recuperan aproximadamente 80-100 jg de las hojas de tomate). Se cargaron aproximadamente 7 jg de ARN total para el analisis de ARNip.

Transferencia de Northern de ARNip con sonda marcada con DIG: Preejecucion del gel de TBE al 15 %-urea

(Invitrogen EC68855BOX) durante 30 minutos a 110 V. Las muestras se prepararon para su carga anadiendo 7 jl de tampon de muestra de TBE-urea Novex® 2 x (Invitrogen LC6876) a 7 jl de ARN total (5-7 jg), se desnaturalizaron durante 10 min a 94 °C y se enfriaron inmediatamente en hielo. Si se necesitaba visualizacion de la muestra bajo luz UV, se anadio bromuro de etidio al tampon de muestra (1 jl de EtBr a 0,624 mg/ml por cada 10 jl de tampon). Las muestras se centrifugaron brevemente antes de cargarlas en los pocillos del gel y se realizo la electroforesis durante aproximadamente 1,5 h a 180 V en TBE 0,5 x hasta que el colorante azul alcanzo el fondo del gel. Despues de terminar la ejecucion, el gel se observo bajo luz UV.

Transferencia del gel a membrana de nailon Nytran Supercharge (VWR 28151-318) se hizo en una celda de transferencia semiseca Transblot (BioRad 170-3940): la membrana se prehumedecio en agua y se equilibro en TBE 0,5 x junto con 2 trozos de papel extragrueso ((BioRad 170-3968). La transferencia se establecio de acuerdo con las instrucciones del fabricante (anodo-papel de transferencia-membrana-gel-papel de transferencia-catodo) y se realizo durante 50 min a 380 mA. Despues de la transferencia la membrana se dejo secar al aire durante aproximadamente 10 min y despues el ARN se reticulo con la misma en un Stratalinker 1800 (Stratagene).

Hibridacion: La membrana se prehibrido a 42 °C durante 1 h con 10 ml de solucion PerfectHyb (Sigma H7033) en un horno de hibridacion. Se desnaturalizaron 200 ng de sonda marcada con DIG, preparada con la mezcla de marca con DIG de PCR (Roche 11585550910) siguiendo las instrucciones del fabricante, durante 10 min a 94 °C, se enfriaron en hielo y se anadieron a 10 ml de solucion de hibridacion fresca, que se anadio a la membrana prehibridada y se incubo durante 1 noche a 42 °C en el horno de hibridacion.

Lavados y deteccion: Despues de descartar la solucion de hibridacion, las membranas se aclararon brevemente en SSC 2 x y SDS al 0,1 %; y despues se lavaron 2 veces en SSC 2 x y SDS al 0,1 % precalentado durante 20 min a 50 °C, 2 veces en SSC 1 x y SDS al 0,1 % precalentado durante 20 min a 50 °C, 2 veces en SSC 0,5 x y SDS al 0,1 % precalentado durante 20 min a 50 °C. La deteccion se realizo siguiendo las instrucciones proporcionadas por el conjunto de lavado y tampon de bloqueo de DIG (Roche 11585762001). En resumen, la membrana se aclaro durante 2 min en tampon de lavado de DIG 1 x antes de incubar durante 1 h a TA en 100 ml de solucion de bloqueo de DIG (10 ml de tampon de bloqueo 10 x+10 ml de acido maleico 10 x +80 ml de agua). Despues se incubo durante 1 h a temperatura ambiente en 100 ml de solucion de bloqueo DIG fresca a la que se habfan anadido 10 jl de anticuerpo anti-Digoxigenina-AP (Roche 11093274910). La membrana se lavo 15 min a TA dos veces con 100 ml de tampon de lavado de DIG 1 x y se equilibro con 100 ml de tampon de deteccion de DIG 1 x. Se distribuyo aproximadamente 1 ml de solucion CDP-star (Roche 12041677001) en la parte superior de la membrana, que se situo entre 2 laminas de plastico, se incubo a TA durante 5 min y se expuso a una pelfcula durante cantidades variables de tiempo antes del revelado.

H. Validacion de las construcciones en plantas de tomate transgenicas

Las secuencias modificadas por ingeniena para generar ARNbc o miARN se clonaron en vectores binarios para la transformacion de tomate. Se ensayaron plantas transgenicas R0 para la produccion de oligomeros de ~21 unidades espedficos y/o la eficacia de resistencia al virus por analisis de transferencia de Northern de ARN pequeno y ensayos de resistencia resumidos anteriormente y como se describe en el ejemplo 7. Otras secuencias de generacion de ARNbc seleccionadas o secuencias de generacion de miARN, por ejemplo, entre cualquiera de las SEQ ID NO: 1-154, o de las SEQ ID NO: 169-455 o partes de las mismas, pueden utilizarse para crear construcciones eficaces adicionales. Por tanto, por ejemplo, pueden utilizarse una o mas secuencias de estructura MIR, por ejemplo, MON1 de soja, MON5 de soja, MON13 de arroz, MON18 de mafz, miR159a de mafz o mi167g de mafz (SeQ ID NO: 155, 157, 159, 161, 163 o 165) para crear una o mas secuencias generadoras de ARNbc o miARN. En ciertas realizaciones, la secuencia generadora de ARNbc o la secuencia generadora de miARN puede comprender cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 47, 55, 59, 63, 67, 71, 85, 99, 113, 127, 141, o 379-455. En realizaciones particulares, la secuencia puede comprender cualquiera de las SEQ ID NO: 156, 1160, 162, 164, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 373, o 375.

Se contemplan combinaciones con otros rasgos de control de enfermedades en una planta, incluyendo estrategias no transgenicas, para conseguir rasgos deseados para el control potenciado de enfermedades de plantas. Combinar rasgos de control de enfermedades que emplean distinto modos de accion puede proporcionar plantas transgenicas protegidas con durabilidad superior sobre plantas que albergan un unico rasgo de control a causa de la probabilidad

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reducida de que se desarrolle resistencia en el campo. Por tanto, pueden emplearse al menos dos o al menos tres modos de accion para conferir resistencia a virus, en el que dichos modos de accion se seleccionan de la expresion de ARNbc, expresion de miARN, inhibicion del ensamblaje del virion, expresion fenotipica de un rasgo de resistencia a virus no transgenico y expresion de protema transgenica. La expresion de protema transgenica puede comprender la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica la protema de la cubierta, expresion de una secuencia que codifica la protema del movimiento o expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica la replicasa.

Se contemplan espedficamente productos basicos que contienen una o mas de las secuencias divulgadas en el presente documento, y producidos a partir de una planta o semilla recombinante que contiene una o mas de las secuencias de nucleotidos divulgadas en el presente documento. Se pretende que un producto basico que contiene una o mas de las secuencias divulgadas en el presente documento incluya harinas, aceites, granos triturados o completos o semillas de una planta, o cualquier producto alimenticio que comprenda cualquier harina, aceite o grano triturado o completo de una planta o semilla recombinante que contiene una o mas de estas secuencias. La deteccion de una o mas de estas secuencias en uno o mas artmulos o productos basicos contemplados en el presente documento es una evidencia de hecho de que el artmulo o producto basico esta compuesto de una planta transgenica disenada para expresar una o mas de estas secuencias de nucleotidos con el fin de controlar una enfermedad de plantas usando procedimientos de supresion genica mediada por ARNbc.

I. Composiciones de acido nucleico

En el presente documento se divulgan procedimientos para obtener un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos para producir un ARNbc, miARN o ARNip. Dicho procedimiento puede comprender: (a) analizar uno o mas genes diana para su expresion, funcion y fenotipo tras la supresion mediada por ARNbc, o mediada por miARN o ARNip de un gen un virus patogeno de plantas; (b) sondear una biblioteca de acidos nucleicos con una sonda de hibridacion que comprende todo o una parte de una secuencia de nucleotidos, o un homologo de la misma, a partir de un virus diana que presenta un fenotipo alterado en un analisis de supresion mediada por ARNbc; (c) identificar un clon de ADN que hibrida con la sonda de hibridacion; (d) aislar el clon de ADN identificado en la etapa (b); y (e) secuenciar el fragmento de acido nucleico que comprende el clon aislado en la etapa (d), en el que la molecula de acido nucleico secuenciada transcribe todo o una parte sustancial de la secuencia de acido nucleico de ARN o un homologo de la misma. La estrategia de resistencia mediada por ARN utilizando ARNbc, miARN o ARNip puede complementarse situando las secuencias antivmcas en el bucle de una secuencia codificante de ARNbc, o insertando una secuencia que codifica un ARNbc o miARN eficaz en un intron de un casete de expresion de polipeptido (ARNbc/miARN intronico; Frizzi y col., 2008) (por ejemplo, figura 9). Por ejemplo, puede expresarse una o mas protemas vmcas tal como la protema de la cubierta y/o la replicasa en una planta transgenica que tambien expresa un ARNbc, miARN o ARNip, sin el uso de un casete transgenico adicional, insertando la secuencia codificante de la protema en el bucle de un ARNbc.

Un procedimiento para obtener un fragmento de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos para producir una parte sustancial de un ARNbc o ARNip puede comprender ademas: (a) sintetizar un primer y un segundo cebador oligonucleotfdico correspondiente a una parte de una de las secuencias de nucleotidos de un patogeno diana; y (b) amplificar un inserto de acido nucleico presente en un vector de clonacion usando el primer y el segundo cebador oligonucleotfdico de la etapa (a), en el que la molecula de acido nucleico amplificada transcribe una parte sustancial del ARNbc o ARNip.

Los genes diana pueden obtenerse de un begomovirus, tospovirus o potexvirus. Se contempla que pueden emplearse varios criterios en la seleccion de genes diana preferidos. Dichas secuencias pueden identificarse por alineacion, por ejemplo, de secuencias de begomovirus o de tospovirus de multiples cepas y/o especies. Una estrategia de bioinformatica ha identificado numerosos oligomeros de 21 unidades que estan principalmente conservados en mas de 100 cepas y especies de begomovirus. En algunos casos, se permiten emparejamientos incorrectos dentro de un oligomero particular de 21 unidades para un establecimiento de diana mas amplio.

Como se usa en el presente documento, la expresion "derivado de" se refiere a una secuencia de nucleotidos espedfica que puede obtenerse de una fuente o especie espedfica particular, aunque no necesariamente directamente de esa fuente o especie espedfica.

Puede seleccionarse un gen que provoque la supresion de la replicacion del virus y/o la sintomatologfa. Otros genes diana pueden incluir, por ejemplo, los que desempenan funciones importantes en la transmision del virus, el movimiento dentro de una planta o el ensamblaje del virion (por ejemplo, secuencias terminales de tospovirus, que comprenden las secuencias de repeticiones terminal). Para el control de virus, las secuencias diana pueden obtenerse esencialmente de los virus de plantas diana. Algunas de las secuencias diana ejemplares clonadas de un begomovirus, tospovirus o potexvirus pueden encontrarse en la lista de secuencias, por ejemplo, en las SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 85, 99, 113, 127 y 141, asf como dentro de las SEQ ID NO: 169-455.

Las moleculas de ARNbc pueden obtenerse por amplificacion en cadena de la polimerasa (PCR) de una secuencia genica diana derivada de una biblioteca de ADNg o ADNc o partes de la misma. La biblioteca de ADN puede prepararse usando procedimientos conocidos para los expertos en la materia y puede extraerse el ADN/ARN. Las

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bibliotecas de ADN genomico o ADNc de un organismo diana pueden usarse para la amplificacion por PCR para la produccion del ARNbc o del ARNip.

Las secuencias genicas diana entonces pueden amplificarse por PCR y secuenciarse usando los procedimientos facilmente disponibles en la tecnica. Un experto en la materia puede ser capaz de modificar las condiciones de PCR para asegurar la formacion optima del producto de PCR. El producto de PCR confirmado puede usarse como molde para la transcripcion in vitro para generar ARN sentido y anti-sentido con los promotores mmimos incluidos. Las secuencias de nucleotidos aisladas y purificadas pueden usarse como agentes de control de virus de plantas. Las secuencias de nucleotidos aisladas y purificadas pueden comprender las expuestas en la lista de secuencias.

Como se usa en el presente documento, la expresion "secuencia codificante", "secuencia de nucleotidos estructural" o "molecula de acido nucleico estructural" se refiere a una secuencia de nucleotidos que se traduce en un polipeptido, habitualmente mediante ARNm, cuando se situa bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los lfmites de la secuencia codificante se determinan por un codon de inicio de la traduccion en el extremo 5' y un codon de terminacion de la traduccion en el extremo 3'. Una secuencia codificante puede incluir ADN genomico, ADNc, EST y secuencias de nucleotidos recombinantes.

La expresion "ADN recombinante" o "secuencia de nucleotidos recombinante" se refiere al ADN que contienen una modificacion disenada por ingeniena genetica a traves de manipulacion mediante mutagenesis y enzimas de restriccion.

Ejemplos

Los inventores del presente documento han identificado un medio para controlar infecciones de virus en plantas incorporando en las plantas miARN modificados por ingeniena, ta-ARNip y/o ARNip progresivo. Uno cualquiera o cualquier combinacion de estos atributos puede provocar una inhibicion eficaz de la infeccion de la planta, inhibicion de la enfermedad de la planta y/o reduccion en la gravedad de los smtomas de la enfermedad.

Ejemplo 1

Dianas para resistencia a multiples virus

Se ensamblaron secuencias de virus diana de Genbank. La figura 1 muestra esquematicamente la organizacion del genoma de virus diana representativos. Para begomovirus diana, se analizaron 58 aislados de virus del rizado foliar amarillo del tomate (TYLCV), 30 aislados de virus New Delhi del rizado foliar del tomate (ToLCNDV), 5 asilados de virus del rizado foliar severo del tomate (ToSLCV), 5 aislados de virus del mosaico dorado del pimiento (PepGMV) y 2 aislados de virus de las venas amarillas del pimiento huasteco (PHYVV). Para tospovirus diana, se analizaron el virus del marchitamiento moteado del tomate (TSWV), virus de la necrosis de las yemas del cacahuete (GBNV) y virus de la clorosis de Capsicum (CaCV), 6 segmentos L (TSWV: 4; GBNV: 1; CaCV: 1), 23 segmentos M (TsWv: 20; GBNV: 2; CaCV: 1) y 45 segmentos S (TSWV: 41; GbNv: 2; CaCV: 2). Para los aislados de potexvirus diana, se analizaron 13 isolados de virus del mosaico del pepino (PepMV) (por ejemplo, Lopez y col., 2005; Cotillon y col., 2002). Se utilizo una estrategia de bioinformatica para identificar secuencias de aproximadamente 20-24 nucleotidos a usar como miARN artificiales para suprimir la mayor cantidad posible de virus diana.

La siguiente tabla (tabla 1) enumera secuencias analizadas para el posible uso en el diseno de construcciones transgenicas para generar miARN modificados por ingeniena, asf como para identificar secuencias para su uso en estrategias de resistencia a virus mediada por ARNbc:

Tabla 1. Secuencias ejemplares usadas para analisis bioinformatico (SEQ ID NO: 169-362)

Tipo de virus: Nombre del virus Acceso a GenBank

Begomovirus: Virus del rizado foliar amarillo del tomate (TYLCV) AF024715, X15656, X76319, AB014346, AB014347, AB110217, AB110218, AB116629, AB116630, AB116631, AB116632, AB116633, AB116634, AB116635, AB116636, AF071228, AF105975, AF271234, AJ132711, AJ223505, AJ489258, AJ519441, AJ812277, AJ865337, AM282874, AM409201, AM698117, AM698118, AM698119, AY044138, AY134494, AY227892, AY502934, AY530931, AY594174, AY594175. DQ144621, DQ358913, DQ631892, DQ644565, EF051116, EF054893, EF054894, EF060196, EF101929, EF107520, EF110890, EF158044, EF185318,


: EF210554, EF210555, EF433426, EF523478, EF539831, EU031444, EU143745

(continuacion)

Tipo de virus: Nombre del virus Acceso a GenBank

Begomovirus: Virus New Delhi del rizado foliar del tomate (ToLCNDV) NC 004611, U15015, U15016, Y16421, AB330079, AB368447, AB368448, AF102276, AF448058, AF448059, AJ620187, AJ875157, AM286433, AM286434, AM292302, AM850115, AY286316, AY428769, AY939926, DQ116880, DQ116883, DQ116885, DQ169056, EF035482, EF043230, EF043231, EF063145, EF068246, EF450316, EF620534, EU309045

Begomovirus: Virus del rizado foliar severo del tomate (ToSLCV) AF130415, AJ508784, AJ508785, DQ347946, DQ347947

Begomoivirus: Virus de las venas amarillas del pimiento huasteco (PHYVV) NC_001359, X70418, AY044162

Begomovirus: Virus del mosaico dorado del pimiento (PepGMV) NC_004101, U57457, AF149227, AY928512, AY928514, AY928516

Tospovirus: Virus del marchitamiento moteado del tomate (TSWV) (segmento L) NC_002052, D10066, AB190813, AB198742, AY070218

Tospovirus: Virus del marchitamiento moteado del tomate (TSWV) (segmento M) NC 002050, S48091, AB010996, AB190818, AF208497, AF208498, AY744481, AY744482, AY744483, AY744484, AY744485, AY744486, AY744487, AY744488, AY744489, AY744490, AY744491, AY744492, AY744493, AY870389, AY870390

Tospovirus: Virus del marchitamiento moteado del tomate (TSWV) (segmento S) NC 002051, D00645, AB088385, AB190819, AF020659, AF020660, AJ418777, AJ418778, AJ418779, AJ418780, AJ418781, AY744468, AY744469, AY744470, AY744471, AY744472, AY744473, AY744474, AY744475, AY744476, AY744477, AY744478, AY744479, AY744480, AY870391, AY870392, DQ376177, DQ376178, DQ376179, DQ376180, DQ376181, DQ376182, DQ376183, DQ376184, DQ376185, DQ398945, DQ431237, DQ431238, DQ915946, DQ915947, DQ915948

Tospovirus: Virus de la necrosis de las yemas del cacahuete(GBNV) (segmento L) NC_003614, AF025538

Tospovirus: Virus de la necrosis de las yemas del cacahuete(GBNV) (segmento M) NC_003620, U42555, AY871097

Tospovirus: Virus de la necrosis de las yemas del cacahuete(GBNV) (segmento S) NC_003619, U27809, AY871098

Tospovirus: Virus de la clorosis de Capsicum (CaCV) (segmento L) NC_008302, DQ256124

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Tipo de virus: Nombre del virus Acceso a GenBank

Tospovirus: Virus de la clorosis de Capsicum (CaCV) (segmento M) DQ256125

Tospovirus: Virus de la clorosis de Capsicum (CaCV) (segmento S) DQ355974, DQ256123

Potexvirus: Virus del mosaico del pepino (PepMV) EF599605, AY509926, AJ438767, DQ000984, DQ000985, AY509927, EF408821, AM491606, AJ606360, AJ606359, AJ606361, AF484251, AM109896

Ejemplo 2

Segmentos viricos para iARN

Los genomas vmcos seleccionados se dividieron en fragmented de ~350-500 pb, parcialmente solapantes en aproximadamente 50 pb (por ejemplo, figura 2A-2D). Se recogieron los dates de eficacia para la capacidad de las secuencias individuales de controlar especies de virus particulares cuando se expresan individualmente en plantas transformadas. En estudios iniciales, se cribaron segmentos correspondientes a aproximadamente 2,3 kB de los 2,7 kB del genoma de ADN-A de geminivirus (figura 2B; segmentos 1-8). Asimismo, como se muestra en la figura 2C, se ensayaron los segmentos 1-8 que representan aproximadamente 4 kB de los 5,6 kB del genoma de PepMV (potexvirus). La figura 2D muestra las partes del genoma de tospovirus tripartite que se ensayaron para la eficacia: aproximadamente 1,5 kB de los 8,9 kB del ARNv L (es decir, ARN virico) (segmentos 1-3); aproximadamente 1,5 kB de los 5,4 kB de ARNv M (segmentos 4-6); y aproximadamente 1 kB de los 2,9 kB de ARNv S (segmentos 7-8).

En un estudio representativo, se ensayo un segmento de acido nucleico correspondiente a una parte de la protema de la cubierta TSWV (nucleocapsida) para la eficacia cuando se expresaba como una repeticion invertida (figura 3). Se descubrio que la resistencia a virus se correlacionaba con la produccion de ARNip en plantas de tomate. Ademas, en el cribado de resistencia a TYLCV, primero se examinaron plantas R1 para la presencia del transgen y despues se infectaron con el clon infeccioso de TYLCV. Como control, se incluyo una lmea de tomate no transformada (de tipo silvestre); estas plantas de tipo silvestre tfpicamente tienen menos de un 5 % de "resistencia", es decir, menos de un 5 % de las plantas escapan a infeccion por inoculacion en este ensayo. En contraste, entre las plantas CP4 positivas (que contiene el gen marcador de seleccion que especifica resistencia a glifosato, que esta unido al casete de expresion con la secuencia vmca), un 56 % de las plantas R1 que comprenden un segmento de acido nucleico introducido dirigido a la protema de la replicacion (3 construcciones), un 27 % que comprende un segmento de acido nucleico introducido dirigido a la protema de la cubierta (3 construcciones) y un 38 % que comprende un segmento de acido nucleico introducido dirigido al resto de las regiones codificantes (2 construcciones) mostraron resistencia a TYLCV.

Despues se emprendieron estudios adicionales que exploran estas partes adicionales del genoma de tospovirus, para identificar y definir partes del genoma virico que pueden mediar la resistencia a virus relacionada con ARNbc contra virus representativos. Estas secuencias se ensayaron como segmentos de repeticion invertida en construcciones que generan doble hebra (ARNbc), en las que las construcciones ensayadas comprendfan un promotor unido de forma funcional a una secuencia dada en una orientacion anti-sentido (por ejemplo, SEQ ID NO: 379-442 como se describe a continuacion), seguido por una secuencia de bucle, y despues la secuencia dada en una orientacion sentido, y un terminador de la transcripcion. Despues de la transcripcion y del emparejamiento de bases de las secuencias de repeticion invertida, se escindieron las regiones de ARN bicatenario por una RNasa Dicer o de tipo Dicer para generar los ARNip antivmicos espedficos que abordan e impiden la expresion del gen virico.

El virus de la clorosis de Capsicum (CaCV), el virus de la necrosis de las yemas del cacahuete (GBNV) y virus del marchitamiento moteado del tomate (TSWV), entre otros tospovirus. Los ensayos de resistencia a virus de plantas R1 transgenicas demostraron que todas las regiones del genoma de tospovirus son igual de eficaces como diana de ARNbc. Por tanto, se observo resistencia significativa a virus despues de la expresion de los transcritos que altera la expresion de la protema de la cubierta de tospovirus (CP), asf como los segmentos GP1, GP2, GP3 del genoma del virus que codifican glucoprotema y segmentos proteicos de la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP). La figura 11A-B describe los resultados de resistencia observados de plantas transgenicas. Representando cada barra

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un evento transgenico individual y la region diana, por ejemplo, un 50-80 % de las plantas R1 que expresan un ARNbc dirigido a la region CP, eran resistentes a CaCV, mientras que ~25-90 % de las plantas R1 que expresan un ARNbc dirigido a una glucoprotema del virus mostraban resistencia al virus, y aproximadamente un 25-80 % de las plantas R1 que expresan un ARNbc dirigido a RdRP vmca mostraban resistencia (por ejemplo, figura 11B). La resistencia mediada por ARNbc contra TSWV fue particularmente eficaz, mostrando un 100% de las plantas R1 resistencia al virus de todos los eventos ensayados con construcciones dirigidas a la protema de la cubierta (figura 11A). Las secuencias representativas de TSWv, CaCV y GBNV seleccionadas para su uso en la generacion de ARNbc dirigidos a la expresion genica de tospovirus se muestran en las SEQ ID NO: 419-436 (en orientacion anti- sentido segun se enumera).

Estudios adicionales demostraron que todas las regiones del genoma de PepMV son igual de eficaces en la generacion de resistencia mediada por ARNbc contra este potexvirus. La figura 12 muestra que, en la mayona de los casos, un 95-100 % de todas las plantas R1 transgenicas que comprenden segmentos codificados por el virus dirigidos a CP (protema de la cubierta), CP/MOV (secuencias de la protema de la cubierta y de la protema del movimiento), RdRP, TGB (protema de motivo de triple bloque genico implicada en el movimiento vmco de una celula a otra y a larga distancia en una planta hospedadora) o TGB/RdRP eran resistentes a PepMV. Las secuencias representativas de PepMV seleccionadas para su uso en la generacion de ARNbc dirigidos a la expresion genica de potexvirus se enumeran en las SEQ ID NO: 437-442, en orientacion anti-sentido segun se enumera.

Asimismo, se ensayaron las regiones del genoma de begomovirus (geminivirus) para su capacidad de generar resistencia mediada por ARNbc contra este grupo de virus. Se ensayaron TYLCV, ToSLCV, PepGMV, PHYVV y ToLCNDV en bioensayos como begomovirus representativos. Las figuras 13A-B muestran que hasta aproximadamente un 70 % de las plantas R1 transgenicas presentaban resistencia a un virus dado cuando CP era la diana de ARNbc, mientras que hasta aproximadamente un 100% de las plantas R1 transgenicas presentaban resistencia cuando un segmento de acido nucleico que codifica la protema de replicacion vmca era la diana de ARNbc. Las secuencias representativas de tospovirus seleccionadas para su uso en la generacion de ARNbc dirigidos a la expresion genica de begomovirus se enumeran en la SEQ ID NO: 379-418, en orientacion anti-sentido segun se enumera.

En conjunto, se identificaron numerosas dianas de ARNbc eficaces para virus en estos tres generos (es decir, tospovirus, potexvirus, begomovirus).

Basandose en estos resultados de iARN, se seleccionaron secuencias dirigidas a regiones diana eficaces para cada virus y se fusionaron en dos casetes transgenicos en una construccion de acido nucleico, para abordar multiples virus en multiples familias de virus. Un ejemplo de esta estrategia se muestra en la figura 14. Para begomovirus, se uso una region Rep, mientras que para tospovirus y potexvirus, se seleccionaron regiones CP ya que la region CP esta relativamente mas conservada entre las diferentes cepas de los mismos virus. Algunas de las secuencias utilizadas en los casetes se modificaron adicionalmente, en vista de los emparejamientos de bases G::U esperados, para permitir la ampliacion de la proteccion contra cepas vmcas relacionadas. Las secuencias representativas seleccionadas para su uso en la generacion de ARNbc dirigidos a la expresion genica del virus en los casetes se enumeran en las SEQ ID NO: 443-446 para el "casete 1" de la figura 14 y en la SEQ ID NO: 447-451 para el "casete 2" de la figura 14, cada uno en orientacion anti-sentido como se enumera en la lista de secuencias. Por tanto, por ejemplo, el segmento de acido nucleico dirigido a GBNV-CP1 que se encuentra en el casete 1 (SEQ ID NO: 443) es similar al segmento dirigido a GBNV-CP1 que se encuentra en la SEQ ID NO: 429, pero puede tener una modificacion como se indica anteriormente, y asimismo para los otros segmentos de acido nucleico usados en los casetes, respecto a los segmentos diana que se ensayaron inicialmente para la eficacia relativa.

Ejemplo 3

Construcciones de fusion de ARNbc artificial para resistencia a multiples virus

Tambien se combinaron segmentos de nucleotidos para la expresion de ARNbc, de dos o de tres de los grupos de virus diferentes (geminivirus, tospovirus, potexvirus) en un unico casete de expresion y se generaron plantas a partir de las celulas transformadas y se analizaron para la resistencia a mas de un virus. Esto se consiguio fusionando fragmentos genomicos vmcos que dieron resultado positivo en el ensayo para la generacion de ARNip que confieren resistencia a virus, por ejemplo, como se muestra en el ejemplo 2. De forma analoga al ejemplo 2, estas secuencias se ensayaron como segmentos de repeticion invertida en construcciones que generan doble hebra (ARNbc), en el que las construcciones ensayadas comprendfan un promotor unido de forma funcional a una secuencia dada en una orientacion anti-sentido (por ejemplo, las SEQ ID NO: 452-454 como se describe a continuacion), seguido por una secuencia de bucle, y despues la secuencia dada en una orientacion sentido, y un terminador de la transcripcion. Despues de la transcripcion y del emparejamiento de bases de las secuencias de repeticion invertida, las regiones de ARN bicatenario se escinden por una RNasa Dicer o de tipo Dicer para generar los ARNip antivmicos espedficos que abordan e impiden la expresion genica del virus. En esta estrategia, se usaron segmentos de ARNbc espedficos para cada uno de los virus diana para resistencia a multiples virus (figura 4A).

Como alternativa, regiones conservadas de los diversos genomas vmcos pueden proporcionar un espectro mas amplio de resistencia contra diferentes variantes dentro de las especies o especies muy relacionadas. Ademas, las

repeticiones invertidas que comprenden secuencias que son muy similares a, pero menos de un 100 % identicas a, segmentos diana de genomas vmcos pueden disenarse y ensayarse para su eficacia. Esta estrategia, es decir, repeticiones invertidas parcialmente similares o "imperfectas", pueden ampliar la proteccion mediada por ARN contra cepas y especies de virus relacionadas. Por ejemplo, como el emparejamiento de bases G-U a nivel de ARN tiene 5 un grado comparable de estabilidad termodinamica que algunos emparejamientos de bases de Watson-Crick tfpicos (por ejemplo, A-U), algunas repeticiones imperfectas, no obstante, pueden activar RISC y guiar la escision de dianas vmcas tanto perfectas como imperfectas.

En este caso, dichas repeticiones invertidas parcialmente similares tambien pueden comprender una o mas subsecuencias de al menos 21 nucleotidos de longitud que presentan casi un 100 % de identidad con una o mas 10 secuencias diana vmcas, para estimular la resistencia a virus mediada por iARN. Por tanto, por ejemplo, la identidad global de un segmento de repeticion imperfecta con una o mas dianas vmcas puede ser tan baja como de un 75 %, pero con 2-4 o mas subsecuencias de 21-24 nucleotidos que presentan un 100 % de identidad con una secuencia diana vmca. Adicionalmente, la presencia de dicho ARNbc "imperfecto" puede ayudar a aumentar la acumulacion de ARNbc en plantas y evitar la activacion del silenciamiento genico transcripcional. Por tanto, pueden utilizarse 15 segmentos de nucleotidos de mas de una cepa de un virus, o de mas de un virus, en el diseno y la preparacion de una construccion de fusion para la expresion de ARNbc.

Dichas secuencias pueden identificarse alineando, por ejemplo, secuencias de geminivirus o de tospovirus de multiples cepas y/o especies. La tabla 2 muestra los porcentajes de similitud entre las dianas de geminivirus a nivel de genoma completo. La tabla 3 muestra los porcentajes de similitud entre las dianas de tospovirus a nivel de 20 genoma completo.

Tabla 2. Porcentajes de similitud entre dianas de geminivirus (genoma completo)

: TYLCV ToLCNDV PHYW ToSLCV PepGMV

TYLCV: - 71 64 63 60

ToLCNDV: 71 - 62 60 59

PHYVV: 64 62 -

ToSLCV: 63 60 67 - 76

PepGMV: 60 59 66 76 -

Tabla 3. Porcentajes de similitud entre dianas de tospovirus (genoma completo)

Segmento: Virus CapCV GBNV TSWV

ARNv L: CapCV_L - 44 45

8,8 kB: GBNV_L 44 - 58

TSWV_L: 45 58 -

ARNv M: CapCV_M - 78 53

4,8 -5,4 kB: GBNV_M 78 - 54

TSWV_M: 53 54 -

ARNv S: CapCV_S - 65 42

2,9 -3,3 kB: GBNV_S 73 - 48

TSWV_S: 49 49 -

25 La figura 4B ilustra esquematicamente construcciones de fusion ejemplares para la expresion de ARNbc. Las secuencias codificantes, incluyendo secuencias que carecen de identidad significativa con el genoma humano y genomas de plantas hospedadoras, se seleccionaron para la generacion de repeticiones invertidas. Los segmentos derivados de virus pueden orientarse, por ejemplo, "anti-sentido-bucle-sentido" para la expresion de ARNbc. Esta estrategia puede reducir el tamano de un casete de ARNbc transgenico necesario para resistencia a multiples virus.

30 Las construcciones de fusion artificiales descritas esquematicamente de la figura 4B se enumeran como las SEQ ID NO: 452-453. La construccion de la protema de la cubierta artificial de la SEQ ID NO: 452 comprende las siguientes secuencias: pb 1-157: protema de la precubierta de TYLCV para el bucle; pb 158-507 (es decir, segmento de 350 pb) dirigida a CP de TYLCV y ToLCNDV; pb 508-851 (es decir, segmento de 344 pb) dirigida a la expresion de CP de ToSLCV, PepGMV y PHyVv. La SEQ iD NO: 453 comprende los siguientes segmentos: pb 1-160 dirigido a la

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protema de la cubierta de TSWV (CP) para el bucle; pb 161-456 (es dedr, segmento de 296 pb) dirigido a CP de TSWV; pb 457-687 (es dedr, segmento de 231 pb) dirigido a CP de PepMV; pb 688-919 (es dedr, segmento de 232 pb) dirigido a CP de CaCV y GBNV. Los resultados de eficacia para la SEQ ID NO: 453, la secuencia CP artificial contra multiples tospovirus y PepMV, se muestran en la figura 15. Se proporciona una construccion de fusion de ARNbc artificial adicional dirigida a protemas Rep de cinco geminivirus (TYLCV, ToLCNDV, ToSLCV, PepGMV y PHYVV) como la SEQ ID NO: 454. En esta secuencia, el segmento de pb 1-150 esta dirigido a la protema Rep de TYLCV para el bucle; el segmento de pb 151-500 (es decir, de 350 pb) esta dirigido a protema Rep de TYLCV y ToLCNDV; el segmento de pb 501-860 (es decir, de 360 pb) esta dirigido a la protema Rep de ToSLCV, PepGMV y PHYVV.

Ejemplo 4

Estrategia de miARN modificado por ingenieria: Seleccion de secuencias adecuadas

Se uso la estrategia de bioinformatica descrita en el ejemplo 1 para identificar varias secuencias adecuadas, de aproximadamente 21 nt de longitud, dirigidas a secuencias de geminivirus que se cree que son utiles para la supresion mediada por miARN de la replicacion de geminivirus y/o expresion de smtomas (tabla 4; figura 5).

Tabla 4: Secuencias adecuadas de 21 nt contra geminivirus diana

SEQ ID NO:: Nombre Secuencia de miARN (5' ^ 3') Diana

1: Gemini 1 TGTCATCAATGACGTTGTACT Rep

7: Gemini 2 TGGACTTTACATGGGCCTTCA Protema de la cubierta

13: Gemini 3 TACATGCCATATACAATAGCA Protema de la cubierta

19: Gemini 4 TCATAGAAGTAGATCCGGATT Protema de la cubierta

25: Gemini 5 TTCCCCTGTGCGTGAATCCGT C2/C3

31: Gemini 6 TTCCGCCTTTAATTTGGATTG Rep

37: Gemini 7 TTACATGGGCCTTCACAGCCT Protema de la cubierta

La estrategia de bioinformatica descrita en el ejemplo 1 se uso para identificar varias secuencias adecuadas, de aproximadamente 21 nt de longitud, dirigidas a secuencias de tospovirus que se cree que son utiles para la supresion mediada por miARN de la replicacion de tospovirus y/o la expresion de smtomas (tabla 5; figura 6).

Tabla 5: ^ Secuencias adecuadas de 21 nt para cada segmento genomico contra tres tospovirus diana

SEQ ID NO:: Nombre Secuencia de miARN (5' ^ 3') Diana

43: TospoL1-1 TTTAGGCATCAT ATAGATAGCT RdRP

47: Tospo L1-2 TGATTTAGGCATCATATAGAT RdRP

51: Tospo M1 TATCTATATTTTCCATCTACC GP

55: Tospo M2 TTAGTTTGCAGGCTTCAATTA NSm

59: Tospo M3 TTGCATGCTTCAATGAGAGCT NSm

63: Tospo S2 TTGACGTTAGACATGGTGTTT N

67: Tospo S3 TAGAAAGTTTTGAAGTTGAAT N

La estrategia de bioinformatica descrita en el ejemplo 1 se uso para identificar varias secuencias adecuadas, de aproximadamente 21 nt de longitud, dirigidas a secuencias de potexvirus que se cree que son utiles para la supresion mediada por miARN de la replicacion de tospovirus y/o la expresion de smtomas (tabla 6; figura 7A-7B).

________Tabla 6: Secuencias adecuadas de ~21 nt contra potexvirus diana________

SEQ ID NO:: Nombre Secuencia de miARN (5' ^ 3') Diana

71: PepMV1 TCTTCATTGTAGTTAATG GAG RdPR

85: PepMV2 TTGGAAGAGGAAAAGGTGGTT RdPR

99: Pep MV3 TCAATCATGCACCTCCAGTCG RdPR

113: PepMV4 TAAGTAGCAAGGCCTAGGTGA TGBp1

127: PepMV5 TTTGGAAGTAAATGCAGGCTG TGBp2

141: PepMV6 TAACCCGTTCCAAGGGGAGAAG TGBp3

Ejemplo 5

Incorporacion de secuencias generadoras de miARN en una estructura genica MIR

Las secuencias generadoras de miARN de las tablas 4-6 se incorporaron en construcciones transgenicas por smtesis genica. Por ejemplo, la estructura genica MIR de tipo silvestre "MON1" (vease, la publicacion de Estados 5 Unidos 2007/0300329) de soja con la secuencia generadora de miARN de 21 nt de tipo silvestre (SEQ ID NO: 155 de la presente solicitud) se altero para remplazar la secuencia generadora de miARN de tipo silvestre con la diana Geminil (SEQ ID NO: 1), produciendo la construccion Gemini1/MON1 (SEQ ID NO: 156). Por tanto, puede alterarse una estructura MIR (por ejemplo, la estructura MON1 de la SEQ ID NO: 155) remplazando la secuencia generadora de miARN de 21 nt de tipo silvestre con cualquiera de las secuencias de miARN de las tablas 4-6.

10 Asimismo, se usaron MON5 de soja (SEQ ID NO: 157), MON13 de arroz (SEQ ID NO: 159), MON18 de mafz (SEQ ID NO: 161), miR159a de mafz (sEq ID NO: 163) o miR167g (SEQ ID NO: 165) como secuencias estructurales con las secuencias generadoras de miARN de las tablas 4-6. Por tanto, se crearon las siguientes secuencias (tabla 7):

Tabla 7: Secuencias ejemplares incorporadas en la estructura genica MIR

Secuencia generadora de miARN (SEQ ID NO:): Estructura MIR (SEQ ID NO:) Construccion incorporada (SEQ ID NO:)

Gemini 1 (SEQ ID NO: 1): MON1 (SEQ ID NO: 155) Gemini1/MON1 (SEQ ID NO: 156)

Gemini 4 (SEQ ID NO: 19): MON5 (SEQ ID NO: 157) Gemini4/MON5 (SEQ ID NO: 158)

Gemini 7 (SEQ ID NO: 37): MON13 (SEQ ID NO: 159) Gemini7/MON13 (SEQ ID NO: 160)

PepMV5 (SEQ ID NO: 127): MON18 (SEQ ID NO: 161) PepMV5/MON18 (SEQ ID NO: 162)

Gemini 6 (SEQ ID NO: 31): miR159a (SEQ ID NO: 163) Gemini6/miR159a (SEQ ID NO: 164)

PepMV6 (SEQ ID NO: 141): miR167g (SEQ ID NO: 165) PepMV6/miR167g (SEQ ID NO: 166)

Gemini 2 (SEQ ID NO: 7): MON13 (SEQ ID NO: 159) Gemini2/MON13 (SEQ ID NO: 367)

Gemini 3 (SEQ ID NO: 13): MON1 (SEQ ID NO: 155) Gemini3/MON1 (SEQ ID NO: 368)

Gemini 5 (SEQ ID NO: 25): miR159a (SEQ ID NO: 163) Gemini5/MiR159a (SEQ ID NO: 369)

PepMV1 (SEQ ID NO: 71): miR159a (SEQ ID NO: 163) PepMV1/miR159a (SEQ ID NO: 363)

PepMV2 (SEQ ID NO: 85): MON5 (SEQ ID NO: 157) PepMV2/MON5 (SEQ ID NO: 364)

PepMV3 (SEQ ID NO: 99): MON13 (SEQ ID NO: 159) PepMV3/MON13 (SEQ ID NO: 365)

PepMV4 (SEQ ID NO: 113): MON1 (SEQ ID NO: 155) PepMV4/MON1 (SEQ ID NO: 366)

TospoL1-1 (SEQ ID NO: 43): miR167g (SEQ ID NO: 165) TospoL1-1/miR167g SEQ ID NO: 370)

TospoL1-2 (SEQ ID NO: 47): MON1 (SEQ ID NO: 155) TospoL1-2/MON1 (SEQ ID NO: 371)

TospoM2 (SEQ ID NO: 55): MON1 (SEQ ID NO: 155) TospoM2/MON1 (SEQ ID NO: 372)

TospoM3 (SEQ ID NO: 59): MON13 (SEQ ID NO: 159) TospoM3/MON13 (SEQ ID NO: 373)

TospoS2 (SEQ ID NO: 63): MON5 (SEQ ID NO: 157) TospoS2/MON5 (SEQ ID NO: 374)

TospoS3 (SEQ ID NO: 67): MON13 (SEQ ID NO: 159) TospoS3/MON13 (SEQ ID NO: 375)

15 Pueden utilizarse otras secuencias generadoras de miARN seleccionadas, por ejemplo, entre cualquiera de las SEQ ID NO: 1-154 o de las SEQ ID NO: 169-362 o partes de las mismas, con secuencias estructurales MIR, por ejemplo, MON1 de soja, MON5 de soja, MON13 de arroz, MON18 de mafz, miR159a de mafz o mi167g de mafz (SeQ ID NO: 155, 157, 159, 161, 163 o 165) para crear construcciones generadoras de miARN eficaces adicionales. Adicionalmente, las secuencias estructurales MIR pueden modificarse, por ejemplo, remplazando la parte de la 20 secuencia de la secuencia estructural derivada de plantas que especifica un miARN con una secuencia derivada de virus o artificial (por ejemplo, consenso) seleccionada, y/o puede acortarse, por ejemplo, puede hacerse una eliminacion en el extremo 3' y/o 5', por ejemplo, como se refleja en las secuencias generadoras de miARN y las partes estructurales MIR de las SEQ ID NO: 158, 160, 162, 164, 166, 363, 364, 365, 367, 369, 370, 373, 374 y 375, descritas a continuacion.

25 Se ensayaron individualmente oligomeros de 21 unidades identificados de las SEQ ID NO: 169-362, por ejemplo, entre o de las SEQ ID NO: 1-154, o dos o mas de una vez mientras estan presentes en un casete de expresion, para la eficacia en plantas de tomate transgenicas contra virus apropiados tales como TYLCV y TSWV. Se expresan multiples oligomeros de 21 unidades eficaces en un casete transgenico usando una estructura de ARNip policistronica o de fase (por ejemplo, figura 8). Los resultados de los ensayos de resistencia a virus de dichos 30 ensayos de oligomeros de 21 unidades se proporcionan en el ejemplo 7.

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55

Una vez identificados los miARN antivmcos eficaces, se desplegaron multiples miARN como un unico rasgo transgenico, para conseguir resistencia a multiples virus en plantas transgenicas. Esto se consigue fusionando uno o mas genes MIR modificados por ingeniena descritos anteriormente juntos (por ejemplo, para crear las SEQ ID NO: 156, 158, 160, 162, 164, 166, 363-375), o usando un ta-ARNip o una estructura genica de ARNip progresivo que puede aportar multiples secuencias antivmcas de ~21 nt (por ejemplo, figura 8). Las ultimas estrategias se consiguen mediante una nueva ronda de smtesis genica para remplazar los ARNip de tipo silvestre con las secuencias antivmcas de 21 nt eficaces en la estructura de ta-ARNip o ARNip progresivo.

Ejemplo 6

Complementacion de resistencia basada en ARN

La estrategia de resistencia mediada por ARN utilizando ARNbc o miARN puede complementarse colocando secuencias antivmcas, por ejemplo, las que codifican una protema en el bucle de una secuencia codificante de ARNbc, o insertando una secuencia que codifica un ARNbc o miARN eficaz en un intron de un casete de expresion de polipeptido (ARNbc intronico/miARN; Frizzi y col., 2008) (por ejemplo, figura 9). Por ejemplo, puede expresarse una o mas protemas vmcas tales como la protema de la cubierta y/o la replicasa en una planta transgenica que tambien expresa un ARNbc, miARN o ARNip eficaz, sin el uso de un casete transgenico adicional, insertando la secuencia codificante de protema en el bucle de una ARNbc. Tambien puede emplearse una secuencia que codifica un aptamero peptfdico que interfiere con la replicacion del geminivirus (por ejemplo, Lopez-Ochoa y col., 2006).

Por tanto, pueden expresarse secuencias artificiales junto con el ARNbc, miARN o ARNip para aumentar el fenotipo resistente a virus. Por ejemplo, puede usarse un bucle de nucleotidos artificial modificado por ingeniena del genoma de tospovirus. El genoma de tospovirus (ARNmc) comprende una estructura de "franja" debido a la presencia de repeticiones terminales conservadas de 8-11 nt en ambos extremos de cada componente del genoma. Estas repeticiones terminales de cada componente del genoma (SEQ ID NO: 167-168), por ejemplo, de GBNV (virus de la necrosis de las yemas del cacahuete) o CaCV (virus de la clorosis de Capsicum), pueden fusionarse y usarse como parte de una secuencia formadora de bucle en una construccion de transformacion de plantas. Dicha secuencia artificial puede comprender, por ejemplo, las SEQ ID NO: 376-378 o la SEQ ID NO: 455, y puede servir como sustrato artificial que compite por la transcriptasa inversa, puede impedir la circularizacion apropiada de los componentes del genoma vmco de replicacion, pueden generar por sf mismos segmentos de nucleotidos eficaces mediante iARN, o uno o mas de los anteriores, impidiendo de esta manera el ensamblaje de virion.

La figura 16 demuestra que la inclusion de secuencias terminales de tospovirus en una construccion para generar ARNbc provoca resistencia medible a un virus tal como CaCV. En la construccion ensayada, las SEQ ID NO: 376-378, que comprenden por sf mismas la SEQ ID NO: 168, se fusionaron para crear la SEQ ID NO: 455 (es decir, las pb 1-217 de la SEQ iD NO: 455 comprenden la SEQ ID NO: 376; las pb 248-303 comprenden la SEQ ID NO: 377 y las pb 304-369 comprenden la SEQ ID NO: 378). La construccion se ensayo tanto en la orientacion sentido como en la orientacion anti-sentido, y se comparo el nivel de resistencia a virus con el demostrado por una planta de tomate de control, no transgenica, pero por lo demas isogenica.

Las secuencias que codifican, por ejemplo, la protema de la cubierta o la replicasa, asf como secuencias artificiales descritas anteriormente, pueden incluirse dentro de una secuencia intronica tambien. Por tanto, pueden destacarse multiples modos de accion modificando por ingeniena un casete de expresion individual (por ejemplo, figura 9) o mas de un casete de expresion.

Ejemplo 7

Resultados de ensayos de resistencia a virus ejemplares usando miARN modificados por ingeniena

Se ensayaron las construcciones productoras de miARN modificadas por ingeniena enumeradas en la tabla 7 para la eficacia. Los resultados de bioensayo para los ensayos de geminivirus y potexvirus se muestran en las tablas 8-9. Se observo resistencia a virus debido a la expresion de miARN, y correlacion con la expresion y el apropiado procesamiento de un transcrito transgenico dado. Por ejemplo, para la SEQ ID NO: 166, no se observo procesamiento apropiado de PepMV6/mir167g, ni se observo resistencia a virus para esta construccion, que se correlaciona por tanto con la produccion de miARN que correlaciona por tanto la produccion de miARN con la resistencia a virus en plantas R1 transgenicas. Respecto a los experimentos con tospovirus, se observo expresion y procesamiento apropiado de los transcritos de las SEQ ID NO: 370, 371, 373 y 375, dirigidas, respectivamente, a los genes RdRP, RdRP, NsM, y N. Las plantas R1 CP4 positivas presentaban smtomas reducidos cuando se infectaban con TSWV. Para las SEQ ID NO: 372 y 374, dirigidas, respetivamente, a los genes NsM y N, no se observo procesamiento apropiado de miARN, y no se observo reduccion en los smtomas.

Los miARN sinteticos fueron mas eficaces contra PepMV, y proporcionaron smtomas de infeccion por virus retardados o reducidos contra geminivirus y tospovirus. Las construcciones pueden combinarse en casetes de miARN apilados para inhibir de forma sinergica los virus diana. Como pueden expresarse multiples miARN a partir de un unico casete de expresion, pueden quererse construcciones que expresan, por ejemplo, 8 o 10 miARN antivmcos (como se muestra en la figura 10A-10B). Como estrategia adicional, pueden insertarse casetes de expresion de miARN antivmcos como la secuencia de "bucle" (por ejemplo, la figura 9) de un casete de expresion de

5

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30

ARNbc, para combinar los mecanismos de ARNbc y miARN para el control de virus (vease la figura 10C).

Tabla 8: Resultados de los ensayos de resistencia a geminivirus utilizando secuencias modificadas por __________________ ingenieria incorporadas en estructuras genicas MIR______________________

Construccion incorporada (SEQ ID NO): miARN Expresiona % de resistencia a virusb Region diana

TYLCV: ToLCNDV PepGMV PHYW

SEQ ID NO: 156: Gemini1/MON 1 sf 16 ± 16 % 31 ± 17 37 ± 13 29 ±16 Rep

SEQ ID NO: 367: Gemini 2/ MON13 sf 34 ± 27 27 ±14 29 ±4 32 ± 16 CP

SEQ ID NO: 368: Gemini3/MON 1 si 13 ±8 23 ±7 34 ±11 14 ± 19 CP

SEQ ID NO: 158: Gemini4/MON 5 no - - - - CP

SEQ ID NO: 369: Gemini5/miR1 59a si 14 ± 19 30 ± 20 51 ± 16 28 ± 37 C2/C3

SEQ ID NO: 164: Gemini6/miR1 59a si 20 ± 13 23 ±12 36 ±10 23 ± 19 Rep

SEQ ID NO: 160: Gemini7-1/M ON13 si 7 28 40 11 CP

a procesamiento apropiado de miARN detectado en plantas transgenicas

b porcentaje promedio ± d.t. de segregantes R1 CP4-positivos para resistencia al virus del rizado foliar amarillo del tomate (TYLCV), el virus New Delhi del rizado foliar del tomate (ToLCNDV), el virus del mosaico dorado del pimiento (PePGMV) o el virus de las vena amarillas del pimiento huasteco (PHYVV).__________________

Tabla 9: Resultados de los ensayos de resistencia al virus del mosaico delpepino (PepMV) utilizando _________secuencias modificadas por ingenieria incorporadas en estructuras genicas MIR_________

363: PepMV1/miR159a si No ensayado RdRP

364: PepMV2/ MON5 si (debil) 10 ± 14 RdRP

365: PepMV3/ MON13 si 100 ± 0 RdRP

366: PepMV4/ MON1 si (debil) 44 ± 52 TGBp1

162: PepMV5/ MON18 si 99 ± 3 TGBp2

166: PepMV6/ miR167g no - TGBp3

a procesamiento apropiado de miARN detectado en plantas transgenicas b porcentaje promedio ± d.t. de segregantes R1 CP4-positivos para resistencia a PepMV

Referencias

Las referencias enumeradas a continuacion complementan, explican, proporcionan metodologfa, tecnicas y/o composiciones empleadas en el presente documento.

antecedentes o muestran

Patentes de Estados Unidos 4.536.475; 4.693.977; 4.886.937; 4.940.838; 4.959.317;

5.015.580;

5.501.967

5.759.829

6.399.861

5.107.065

5.508.184

5.780.708

6.403.865

5.110.732; 5.231.020; 5.262.316; 5.283.184; 5.302.523; 5.384.253; 5.464.763; 5.464.765 5.527.695; 5.459.252; 5.538.880; 5.550.318; 5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.633.435 5.824.877; 5.837.848; 5.850.019; 5.981.840; 6.118.047; 6.160.208; 6.229.067; 6.384.301 6.852.907.

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Claims

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REIVINDICACIONES

1. Una planta transgenica de tomate o una semilla transgenica de tomate, o una celula vegetal transgenica de tomate que comprende resistencia a especies de virus de plantas de al menos dos de las familias Geminiviridae, Bunyaviridae y Flexiviridae, en la que la resistencia se proporciona por al menos dos modos diferentes de accion seleccionados de (a) expresion de una construccion de acido nucleico que produce ARNbc interferente con la expresion de un gen de la protema de la envuelta del virus, un gen de la protema del movimiento del virus o un gen de la replicacion del virus; (b) expresion de una construccion de acido nucleico que produce miARN interferente con la expresion de un gen de la protema de la cubierta del virus, un gen de la protema del movimiento del virus o un gen de la replicacion del virus; y (c) expresion de una secuencia terminal del segmento genomico de tospovirus que inhibe el ensamblaje del virion, en el que la resistencia proporcionada contra al menos una de las especies de virus de plantas se proporciona por la expresion de una secuencia de repeticion terminal del segmento genomico de tospovirus que inhibe el ensamblaje del virion de tospovirus, en el que ademas la secuencia de repeticion terminal genomica de tospovirus se selecciona de una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 167, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 168, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 376, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 377, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 378 y una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 455.
2. La planta, semilla o celula vegetal transgenica de tomate de la reivindicacion 1, en la que

(i) la resistencia se proporciona por al menos tres modos diferentes de accion; o

(ii) la resistencia comprende resistencia contra un begomovirus, tospovirus o potexvirus; o

(iii) la resistencia proporcionada contra al menos una de las especies de virus de plantas se proporciona por la expresion de una construccion de fusion de ARNbc; o

(iv) la construccion de acido nucleico que produce ARNbc comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 379-455; o

(v) la resistencia contra un begomovirus o tospovirus se proporciona por una secuencia codificada por un casete de expresion de miARN apilado; o

(vi) el miARN comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 85, 99, 113, 127 y 141; o

(vii) la planta comprende ademas una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 156, 160, 162, 164, 363-371, 373 y 375; o

(viii) la planta comprende ademas una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 85, 99, 113, 127, 141 y 379-454.
3. La planta, semilla o celula vegetal transgenica de tomate de la reivindicacion 1, en la que

(a) la resistencia contra un begomovirus se proporciona por la expresion de ARNbc que interfiere con la expresion de un gen de la replicacion de begomovirus;

(b) la resistencia contra un tospovirus o un potexvirus se proporciona por la expresion de un ARNbc que interfiere con la expresion de un gen de la protema de la cubierta del virus o un gen de la protema del movimiento del virus;

(c) la resistencia contra un potexvirus se proporciona por la expresion de una construccion de acido nucleico que produce miARN; o

(d) la resistencia contra un begomovirus o un tospovirus se proporciona por una secuencia codificada por un casete de expresion de miARN apilado.
4. La planta, semilla o celula vegetal transgenica de tomate de la reivindicacion 1, en la que la resistencia proporcionada contra al menos una de las especies de virus de plantas se proporciona inhibiendo el ensamblaje del virion, en la que el ensamblaje del virion se inhibe por una secuencia comprendida dentro de una construccion de acido nucleico que comprende un primer segmento de acido nucleico y un segundo segmento de acido nucleico, en la que el primer y el segundo segmento son repeticiones sustancialmente invertidas entre sf y estan unidos juntas por un tercer segmento de acido nucleico, y en la que el tercer segmento comprende al menos una secuencia terminal de un segmento genomico de tospovirus que inhibe el ensamblaje del virion.
5. La planta, semilla o celula vegetal transgenica de tomate de la reivindicacion 4, en la que

(i) el tercer acido nucleico comprende una secuencia terminal genomica de tospovirus seleccionada de: una secuencia terminal de un segmento genomico L de CaCV o de GBNV, una secuencia terminal de un segmento genomico M de CaCV o de GBNV, una secuencia terminal de un segmento genomico S de CaCV o de GBNV, una secuencia de repeticion terminal genomica de tospovirus, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 167, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 168, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 376, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 377, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 378 y una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 455; o

(ii) el tercer acido nucleico comprende una secuencia de repeticion terminal del segmento genomico de tospovirus que comprende la SEQ ID NO: 167 o SEQ ID NO: 168.

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6. La planta, semilla o celula vegetal transgenica de tomate de la reivindicacion 2(ii), en la que

(i) los virus se seleccionan de:

(a) al menos uno de TYLCV, ToSLCV, ToLCNDV, PHYVV, PepGMV,

(b) uno o mas de TSWV, GBNV, CaCV, y

(c) PepMV; o

(ii) el potexvirus es virus del mosaico del pepino; o

(iii) el begomovirus es TYLCV, ToLCNDV, PHYVV, ToSLCV o PepGMV; o

(iv) el tospovirus es CaCV, GBNV o TSWV; o

(v) el begomovirus es TYLCV y el potexvirus es virus del mosaico del pepino; o el tospovirus es TSWV y el potexvirus es virus del mosaico del pepino; o en la que el begomovirus es TYLCV, el potexvirus es virus del mosaico del pepino y el tospovirus es TSWV.
7. La planta, semilla o celula vegetal transgenica de tomate de la reivindicacion 1, que comprende

(a) al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 379-454 y al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 167, 168, 376, 377, 378 y 455;

(b) al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 379-454 y al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 85, 99, 113, 127 y 141; o

(c) al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 85, 99, 113, 127 y 141 y al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 167, 168, 376, 377, 378 y 455.
8. La planta, semilla o celula vegetal transgenica de tomate de la reivindicacion 1, en la que la planta comprende al menos una secuencia de acido nucleico heterologa que confiere resistencia a virus seleccionada de

(a) una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia de ARN que es complementaria a todo o a una parte de un primer gen diana;

(b) una secuencia de acido nucleico que comprende multiples copias de al menos un segmento de ADN anti- sentido que es anti-sentido para al menos un segmento de al menos un primer gen diana;

(c) una secuencia de acido nucleico que comprende un segmento de ADN sentido de al menos un gen diana;

(d) una secuencia de acido nucleico que comprende multiples copias de al menos un segmento de ADN sentido de un gen diana;

(e) una secuencia de acido nucleico que se transcribe en ARN para suprimir un gen diana formando ARN bicatenario y que comprende al menos un segmento que es anti-sentido para todo o una parte del gen diana y al menos un segmento de ADN sentido que comprende un segmento de dicho gen diana;

(f) una secuencia de acido nucleico que se transcribe en ARN para suprimir un gen diana formando un unico ARN bicatenario que comprende multiples segmentos de ADN anti-sentido en serie que son anti-sentido para al menos un segmento del gen diana y multiples segmentos de ADN sentido en serie que comprenden al menos un segmento de dicho gen diana;

(g) una secuencia de acido nucleico que se transcribe en ARN para suprimir un gen diana formando multiples hebras dobles de ARN y comprende multiples segmentos que son antisentido para al menos un segmento de dicho gen diana y multiples segmentos de ADN sentido del gen diana, y en la que dichos multiples segmentos de ADN anti-sentido y dichos multiples segmentos de ADN sentido estan dispuestos en una serie de repeticiones invertidas;

(h) una secuencia de acido nucleico que comprende nucleotidos derivados de un miARN de plantas; y

(i) una secuencia de acido nucleico que codifica al menos una secuencia terminal de tospovirus que interfiere con el ensamblaje del virion.
9. La planta, semilla o celula vegetal transgenica de tomate de la reivindicacion 7, en la que

(i) la planta comprende ademas un rasgo de resistencia a virus de plantas no transgenicas; o

(ii) la expresion de al menos una secuencia de acido nucleico heterologa provoca resistencia a dos o mas virus seleccionados de: tospovirus, begomovirus y potexvirus.
10. Un procedimiento para conferir resistencia en una planta de tomate a especies de virus de plantas de al menos dos de las familias Geminiviridae, Bunyaviridae y Flexiviridae, comprendiendo el procedimiento transformar la planta con y expresar en la planta al menos dos secuencias de acido nucleico que proporcionan de forma colectiva resistencia a dichas al menos dos especies de virus de plantas, en el que se utilizan al menos dos modos diferentes de accion para proporcionar dicha resistencia, que comprende (a) expresion de una construccion de acido nucleico que produce ARNbc interferente con la expresion de un gen de la protema de la cubierta del virus, un gen de la protema del movimiento del virus y un gen de la replicacion del virus; (b) expresion de una construccion de acido nucleico que produce miARN interferente con la expresion de un gen de la protema de la cubierta del virus, un gen de la protema del movimiento del virus o un gen de la replicacion del virus; y (c) expresion de una secuencia terminal del segmento genomico de tospovirus que inhibe el ensamblaje del virion, en el que la resistencia proporcionada contra al menos una de las especies de virus de plantas se proporciona por la expresion de una secuencia de

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repeticion terminal del segmento genomico de tospovirus que inhibe el ensamblaje del virion de tospovirus, en el que ademas la secuencia de repeticion terminal genomica de tospovirus se selecciona de una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 167, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 168, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 376, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 377, una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 378 y una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 455.
11. El procedimiento de la reivindicacion 10, en el que

(i) la resistencia comprende resistencia contra un begomovirus, tospovirus o potexvirus; o

(ii) la resistencia proporcionada contra al menos una de las especies de virus de plantas se proporciona por una construccion de fusion de ARNbc; o

(iii) la construccion de acido nucleico comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 379-455; o

(iv) la resistencia contra un begomovirus o un tospovirus se proporciona por una secuencia codificada por un casete de expresion de miARN apilado; o

(v) el miARN comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 85, 99, 113, 127 y 141; o

(vi) la secuencia de acido nucleico comprende al menos un elemento de supresion genica para suprimir al menos un primer gen diana.
12. El procedimiento de la reivindicacion 10, en el que:

(a) la resistencia contra un begomovirus se proporciona por la expresion de ARNbc que interfiere con la expresion de un gen de la replicacion de begomovirus;

(b) la resistencia contra un tospovirus o un potexvirus se proporciona por la expresion de un ARNbc que interfiere con la expresion de un gen de la protema de la cubierta del virus o un gen de la protema del movimiento del virus;

(c) la resistencia contra un potexvirus se proporciona por la expresion de una construccion de acido nucleico que produce miARN; o

(d) la resistencia contra un begomovirus o un tospovirus se proporciona por una secuencia codificada por un casete de expresion de miARN apilado.
13. El procedimiento de la reivindicacion 10, en el que la resistencia proporcionada contra al menos una de dichas especies de virus de plantas se proporciona inhibiendo el ensamblaje del virion, en el que el ensamblaje del virion se inhibe por una secuencia comprendida dentro de una construccion de acido nucleico que comprende un primer segmento de acido nucleico y un segundo segmento de acido nucleico, en el que el primer y el segundo segmento son repeticiones sustancialmente invertidas entre sf y estan unidos juntos por un tercer segmento de acido nucleico, y en el que el tercer segmento comprende al menos una secuencia terminal de un segmento genomico de tospovirus, cuya expresion inhibe el ensamblaje del virion.
14. El procedimiento de la reivindicacion 13, en el que

(i) el tercer acido nucleico comprende una secuencia terminal genomica de tospovirus seleccionada de: una secuencia terminal de un segmento genomico L de CaCV o de GBNV, una secuencia terminal de un segmento genomico M de CaCV o de GBNV, una secuencia terminal de un segmento S de CaCV o de GBNV y una secuencia de repeticion terminal genomica de tospovirus, o

(ii) la secuencia terminal o la secuencia de repeticion terminal comprende la SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 377 o SEQ ID NO: 378.
15. El procedimiento de la reivindicacion 11(i), en el que los virus se seleccionan de:

(a) uno o mas de TYLCV, ToSLCV, ToLCNDV, PHYVV, PepGMV,

(b) uno o mas de TSWV, GBNV, CaCV, y

(c) PepMV.
16. El procedimiento de la reivindicacion 10, que comprende expresar en la planta:

(a) al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 379-454 y al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 167, 168, 376, 377, 378 y 455,

(b) al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 379-454 y al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 85, 99, 113, 127 y 141, o

(c) al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 85, 99, 113, 127 y 141 y al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 167, 168, 376, 377, 378, y 455.