ES2931248A1 - Plantas resistentes a la infección por el virus del mosaico del pepino dulce - Google Patents
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Abstract
Plantas resistentes a la infección por el virus del mosaico del pepino dulce. La presente invención se refiere a plantas que comprenden en su genoma un gen inactivado haciendo que la planta sea resistente a la infección por el virus del mosaico del pepino dulce (PepMV). La presente invención también se refiere a la inactivación del gen requerido para la infección por PepMV. La invención abarca partes de estas plantas y su progenie que muestran dicha inactivación génica y como consecuencia un fenotipo mejorado de resistencia a la infección por PepMV. Los métodos para obtener plantas, partes de plantas o semillas con resistencia a infección por PepMV forman parte de esta invención. La presente invención se refiere al gen y las secuencias unidas a él como marcadores para seleccionar plantas resistentes a la infección por PepMV. Por lo tanto, la presente invención pertenece al campo de la agricultura.
Description
DESCRIPCIÓN
PLANTAS RESISTENTES A LA INFECCIÓN POR EL VIRUS DEL MOSAICO DEL
PEPINO DULCE
La presente invención se refiere a plantas que comprenden en su genoma un gen que ha sido inactivado haciendo que la planta sea resistente a la infección por el virus del mosaico del pepino dulce (PepMV). La presente invención también se refiere a la inactivación del gen requerido para la infección por PepMV. La invención abarca partes de estas plantas y su progenie que comprenden dicha inactivación génica y, como consecuencia, un fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV. Los métodos para obtener plantas, partes de plantas o semillas con resistencia a la infección por PepMV también forman parte de esta invención. La presente invención se refiere además al gen y las secuencias unidas a él como marcadores para seleccionar plantas resistentes a la infección por PepMV. Por lo tanto, la presente invención pertenece al campo de la agricultura.
ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA
Los virus, en particular los virus de plantas, tienen genomas pequeños que codifican repertorios de proteínas muy pequeños; con estas pocas herramientas, los virus deben completar sus ciclos, incluida la replicación, el tráfico dentro del huésped, contrarrestar las defensas del huésped y la transmisión entre huéspedes, solo por citar las funciones principales. Para conseguir esto, los virus secuestran y subvierten la maquinaria celular vegetal, interactuando con factores del huésped que tienen funciones provirales (Hyodo y Okuno, 2020, Advances in Virus Research, vol. 107. Academic Press, Cambridge, págs. 37-86); los factores provirales del huésped a menudo se denominan factores de susceptibilidad del huésped, porque en su ausencia (o en presencia de una isoforma no funcional para el virus), el huésped no es susceptible o no es completamente susceptible. Atendiendo al fenotipo de la interacción planta-virus, la pérdida de susceptibilidad equivale a la resistencia de la planta (Kourelis y van der Hoorn, 2018, Plant Cell 30, 285-299) y, por lo tanto, tiene un interés primordial en mejora vegetal. Los mejoradores de plantas han usado genes de resistencia recesivos para obtener cultivares resistentes a los virus a lo largo de los años; en los casos estudiados con suficiente profundidad, todos los genes recesivos de resistencia a virus se ajustan a la hipótesis de codificar un factor proviral (Nicaise, 2014, Front Plant Sci 5, 1-18). Los genes recesivos de resistencia a virus caracterizados hasta la fecha dentro de la diversidad natural de especies cultivadas parecen pertenecer a una sola clase, que
codifica factores de inicio de la traducción eucariota (elF, por sus siglas en inglés) de las familias 4E y 4G (Truniger y Aranda, 2009, Advances in Virus Research, vol. 75. Academic Press, Cambridge, págs. 119-159). Un panorama diferente surge cuando se criban colecciones de mutantes de especies modelo para determinar la pérdida de susceptibilidad a los virus; en este caso, se han descrito factores del huésped diferentes a elF4E o 4G (Makiinen, 2020, Ann Appl Biol 176, 122-129). Sin embargo, su uso en mejora de variedades de cultivos resistentes a virus es todavía una posibilidad poco explorada.
El virus del mosaico del pepino dulce (PepMV) es un virus de ARN monocatenario de sentido positivo que pertenece al género Potexvirus (familia Alphaflexiviridae) y es epidémico en cultivos de tomate de todo el mundo; de hecho, PepMV está provocando pérdidas económicas muy importantes en cultivos intensivos de tomate en todo el mundo. La especie virus del mosaico del pepino dulce es bastante diversa, con al menos cinco cepas descritas hasta la fecha. Dado su impacto económico, se han realizado cribados para identificar fuentes de resistencia a PepMV en colecciones de accesiones de Solanum spp. (Soler et al., 2011, J. Plant Dis Prot 118, 149-155.), pero con éxito limitado; las resistencias identificadas son parciales y/o específicas de la cepa, lo que, junto con la distancia genética de la fuente de resistencia al tomate cultivado, las hace de interés limitado para la mejora. También se han identificado factores del huésped que interactúan con factores de PepMV; este es el caso de las isoformas de la proteína de choque térmico 70 (Hsc70) que interactúan con la proteína de la cápsida (CP) de PepMV (Mathioudakis et al., 2014, Mol Plant-Microbe Interact 27, 135.6-1369). Hsc70 parece tener una función proviral para PepMV, pero su silenciamiento induce un fenotipo grave en las plantas (Mathioudakis et al., 2014, Mol Plant-Microbe Interact 27, 135.6 1369), lo que lo hace inutilizable en mejora. Se han identificado algunos otros factores provirales para los potexvirus, pero sus funciones no se han ensayado para PepMV, o no se ha previsto su uso en el cultivo de variedades de tomate resistentes a PepMV.
Por lo tanto, se requieren nuevos mecanismos que reduzcan la susceptibilidad de las plantas a la infección por PepMV, donde dichos mecanismos funcionen para varias o todas las cepas de PepMV, y sean mecanismos estables que resistan la adaptación y evasión del virus, para que puedan utilizarse en mejora de plantas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Con el fin de abordar la mencionada falta de resistencia útil a PepMV en plantas, los autores seleccionaron una colección de plantas mutantes de tomate para identificar
mutaciones que mostrasen asociación con una susceptibilidad reducida a PepMV. El cribado dio como resultado el descubrimiento de plantas mutantes con cargas virales reducidas y ausencia de los síntomas típicos de la infección por PepMV. Para determinar la fuente de la resistencia de las plantas a la infección por PepMV, el genoma de tales mutantes se caracterizó por un análisis de bloques segregantes acoplado a una secuenciación de alto rendimiento. Finalmente se determinó que la fuente era la inactivación de un gen particular que codificaba una proteína. Mediante retrocruzamiento con la planta silvestre y el análisis de progenies, se pudo establecer que la resistencia tiene una naturaleza recesiva (véanse los ejemplos) ya que las frecuencias génicas se ajustan casi a la perfección a la segregación esperada en un modelo en el que la resistencia es monogénica y recesiva. Las plantas mutantes no tienen un fenotipo obvio aparte de la resistencia mejorada a PepMV o una susceptibilidad reducida a PepMV (véanse los ejemplos).
Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a una planta (de aquí en adelante la planta de la invención) o parte de la misma, un material vegetal de reproducción o propagación, incluyendo semillas, (de aquí en adelante el material vegetal de reproducción o propagación de la invención) o una célula vegetal (de aquí en adelante la célula vegetal de la invención) caracterizados por que comprenden un gen (de aquí en adelante el gen de la invención) que codifica una proteína, donde dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 %, 62 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y dicho gen ha sido inactivado. En una realización preferida, la planta de la invención, o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación de la invención, o la célula vegetal de la invención, no se obtienen exclusivamente mediante un proceso esencialmente biológico.
Como se ha indicado, los inventores han identificado plantas mutantes con resistencia a la infección por PepMV. El término "planta", como se usa en el presente documento, incluye plantas enteras, cualquier "material de reproducción o propagación" para una planta, progenie de las plantas y partes de plantas, incluyendo semillas, silicuas, frutos, hojas, flores, brotes, tallos, tubérculos, raíces, células vegetales aisladas, callos, tejidos y órganos. Las referencias a una planta también pueden incluir células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejidos vegetales, callos de plantas, grupos de plantas y células vegetales que están intactas en plantas o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, cereales, espigas, mazorcas, cáscaras, tallos, raíces, puntas de raíces y similares. La descendencia,
variantes y mutantes de cualquiera de las plantas descritas en el presente documento están dentro del alcance de la presente invención. También se incluyen las semillas de cualquiera de dichas plantas. Como se usa en el presente documento, la expresión "partes de una planta" incluye cualquier parte o partes de una planta, incluidas las semillas, silicuas, frutos, hojas, flores, brotes, tallos y/o raíces.
Como entiende el experto en la materia, la presente invención también se puede llevar a cabo en células vegetales. La expresión "célula vegetal", como se usa en el presente documento, incluye células vegetales obtenidas y/o aisladas de tejido celular vegetal o de cultivo de células vegetales.
La invención descrita en el presente documento se refiere a plantas con resistencia mejorada a la infección por PepMV o un fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV. En otra realización preferida, la planta de la invención, o parte de la misma, o el material vegetal de reproducción o propagación de la invención, o la célula vegetal de la invención, se caracterizan por tener una resistencia mejorada o una susceptibilidad reducida a la infección por PepMV o un fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV en comparación con las plantas control de tipo silvestre.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "resistencia a la infección por PepMV" y "susceptibilidad reducida a la infección por PepMV" se refieren a una reducción del título viral o la ausencia del virus en la planta de la invención, o en el material vegetal de reproducción o propagación de la invención, o en la célula vegetal de la invención en comparación con plantas, materiales o células vegetales control de tipo silvestre. En una realización preferida, la reducción del título viral es de al menos el 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o el 100 % en comparación con una planta de tipo silvestre. Además, las expresiones "resistencia a la infección por PepMV" y "fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV" se refieren a una reducción o ausencia de los síntomas provocados por la infección. En una realización preferida, la resistencia a la infección por PepMV o el fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV conduce a la reducción de los síntomas de acuerdo con el test de escala de la enfermedad (véanse los ejemplos) con una puntuación en tal prueba mejor que las plantas de tipo silvestre, es decir, en una escala 0-2 (donde 0 es ausencia de síntomas, 1 son manchas de color amarillo brillante esporádicas en las hojas recién emergidas, y 2 es un mosaico de color amarillo brillante que afecta a todas las hojas recién emergidas) una reducción de 2 a 1 o una puntuación de 0.
Los inventores de la presente invención determinaron que la resistencia a la infección por PepMV o el fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV se debe a la inactivación del gen de la invención. En una realización preferida, la planta de la invención o parte de la misma, o el material vegetal de reproducción o propagación de la invención, o la célula vegetal de la invención, se caracterizan por que el gen inactivado codifica una proteína donde dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 %, 62 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91%, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 1. En otra realización preferida, la planta de la invención, o el material vegetal de reproducción o propagación de la invención, o la célula vegetal de la invención se caracterizan por que el gen inactivado codifica una proteína, donde dicha secuencia de aminoácidos de la proteína consiste en la SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 1
M I £ S S FEA D S P SM A fiN ST F S P P PAAGDGDFNY D V A W Y G N IQ Y L L N ISA IG A L T C A L I F I F GKIiR S DHPEMP GPT A I V S KALAAWHATGVE IA R H C G A D A A Q Y A A IEG G S S A L A A F IA A A S LAVMAPANI YAGEAPMADQ F S K T T IN H IE K G S PLLW IH F I F W I V W I V H Y G I 3 E I GARA K IT R A R A G Y G N P SN SG 'T N V SA A FSIM V Q G V P K T A G FD K T P LV E Y FQ H K Y P G K V Y R V W P M
D LCALD D IiA T ELV K V R E DI S KAV S R I EARG YANEGE E DE YNND 3 VUGAGLL ERAC F L í í RK AKDTWYH W D Q L G F S D E E R L R K L Q E L RAD AEMAMAS Y K EG R A R G A G V A FW FK D V FT A N K A V £D A R K 3K R R R Y G R F F S V I E L Q LQ RNQ W KVERA PLA TD IYPÍNH LGSTK F S L K A R R V L VTJ T C L L L M L L FC 3 B P L A V I S A I Q SA G R 11 MAEAMDHAQMWLKWVQG 3 SÍÍIiA T I I F Q F L PFTVL I E V SM Y I W P S V L S Y L S K F E Q H L T V S GZQRAELLKM VC F F L W L I A L R A L V E 3 T L E G A LL SM G R C Y A D G ED CA R IE Q Y K TA B F L T R T C L 3 S A A F L I T S S F L G I S F D L A A P I P íí I KKKAQK FRANDML S L V P E R 3 E E Y PLE N Q D I D S L Z R P L I H E R S S T V IA D NTÍGFLH D A 3 P N E ID F P G Q
DA S E Y P P V S RT S PV P K P K E D FA Q Y Y A F N A T IF A A T L I YC 3 F A P A W P VGAV Y FG YR Y A VD KYN F A FV YR VRG F PAGNDGRLMDT V L S IM R FC V D A FLA SM LL F F 3 VRG D 3 T K L Q A IF T AG LA V '/Y R A A P 3D R D 3 FQ P A A A Q G IQ T ID N IV E G P T D Y E V F3Q P T F D W D T Y N S
El término "inactivado", como se usa en el presente documento, se refiere a la disminución, reducción o inhibición total o parcial de la expresión del gen diana o alelo diana en al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85% al 100 % en comparación con su expresión normal en una planta de tipo silvestre. Además, el término "inactivado" también se usa en el presente documento como sinónimo de "silenciado" y como sinónimo de "desactivado", lo cual se refiere a la modificación de la secuencia de nucleótidos del gen de manera que produzca un ARN mensajero no funcional o una función reducida o proteína no funcional. En una realización más
preferida, la planta de la invención, o el material vegetal de reproducción o propagación de la invención, o la célula vegetal de la invención, se caracterizan por que el gen inactivado codifica una proteína donde dicha proteína comprende la SEQ ID NO: 2, preferentemente consiste en la SEQ ID NO: 2. La SEQ ID NO: 2 es resultado de una mutación en la SEQ ID NO: 1 en la posición 554 donde el aminoácido Usina se ha reemplazado por el codón de terminación. En otra realización preferida, la planta de la invención, o el material vegetal de reproducción o propagación de la invención, o la célula vegetal de la invención, se caracterizan por que el gen inactivado codifica una proteína donde dicha proteína comprende la SEQ ID NO: 3, preferentemente consiste en la SEQ ID NO: 3. La SEQ ID NO: 3 es resultado de la deleción de los aminoácidos 11a 408 de laSEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 2
M IG S S F SA D 3 P SM A A N STF S P P PAAGDGEFH Y DVAWYGNI Q Y L L N IS A IG A X T C L L IF IF G K L R 3 DHRRMPG PTA I V S FT.TRRWH ATfTVF IA R H C G A D A A Q Y LLIEG G S 3 A E L L F L A L L SIiA V M L PLN I'YAGKAPMADQFS K T T IN H IE KG 3 P L L Í Í I H F I F Y V IV W L V H Y G I S E I Q ER LK .I TR LR EG Y G N P S K SG T N V SA IF SIM V Q G V P K T I iG F D K T P I jVEYFQHKY p g k v y rv w p m e l c al e d l a t e l v k v r E D I 3 K L V S R I E LR G Y LN EG EE DZYNND 3 V N G R G LLEK LC FLW RKAKDT W YHW EOL GF S DE E RL RKIjQ EL RADLEM ZtíAS YEEGRARGA jG V A FW E tKD^VFTANKAV 2D LR N E K R R R Y G R F FS V IE I iC L QRWQWKVERAPIiAT D IY ÍÍN H LG ST K FSL K D R R V L V N T C LLLM LL FC 3 S P L A V IS A IQ S A G R IIN AEAMDHAQMWIiHWV QG3 SWIiñlT 11 F Q F L P K V A IF V SM Y IT V P 3 VAS YA SK EE Q H LT V 3G EQ RA E LLRMVC F F L V T IL IL L R A L VE 3TLEG A LLSM G R C YLDGEDC R
SEQ ID NO: 3
M IQ SSFSA D SQ K FSLK IiR RV LV N TCLIiIiM LLFC SSPIiA V ISA IQ SA G R IIN A EA M D H A Q M W IiN W VQGS SWIiAT 11 F Q F L P N V L IF V SM Y I W P S V I S Y LSK FEQ H IiT V S GEQRAEAIjKM VCFFLVNIi I L IiR A LV E STLEGA LLSM GRCYI,D GED CKK.I EQYMTAS F L T R T C L S S L A F L I T S S F L G I S F D L LA PIPW IK K K D Q K FR K N D M LQ LV PE R SE EY PLEN Q E ID SLE R PLIH E R SSTV IA D N N G FTiH D A SPN E ID F P G Q D L SE Y P P V SR T SP V P K P K F D F A Q Y Y A FN IiT IFA IiT L IY C SFA P L W P V G A V Y F G Y R Y LV D K Y W FLFV Y R V R G FPA G N D G R IiM D TV LSIM R FC V D LFLLSM LLFFSV R G D STK LQ A IFTLG L L W Y E U j P S D K D 3E Q PA LLQ G IQ TI D H IV EG PT E YE V F SQ P T FDWDT YUS
En la presente invención, la inactivación se refiere al gen de la invención. Como se usa en la presente descripción, el término "gen" se refiere a cualquier segmento de ADN asociado con una función biológica. Por lo tanto, los genes incluyen secuencias codificantes y/o secuencias reguladoras necesarias para su expresión. Los genes también incluyen segmentos de ADN no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas. Los genes pueden obtenerse de
una diversidad de orígenes, incluida la clonación a partir de una fuente de interés o la síntesis a partir de información de una secuencia conocida o predicha, y pueden incluir secuencias diseñadas para que tengan los parámetros deseados. La expresión "codifica una proteína", como se usa en el presente documento, se refiere al hecho de que el gen de la invención comprende las secuencias de nucleótidos necesarias que permiten que se transcriba en un ARN mensajero que posteriormente se traduce en una secuencia de aminoácidos que se plegará en una proteína funcional. En una realización preferida, el gen de la invención comprende la secuencia de ADN genómico SEQ ID NO: 4. En otra realización preferida, el gen de la invención está inactivado y comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6. En otra realización preferida, el gen de la invención está inactivado y consiste en la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.
Como se ha mencionado anteriormente, una planta con resistencia a la infección por PepMV o con fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV, se refiere a una planta con un título viral más bajo o síntomas de infección reducidos en comparación con una planta de tipo silvestre. Asimismo, la inactivación del gen de la invención también comprende una reducción del nivel de expresión del gen, una reducción del nivel disponible de ARNm transcritos de dicho gen, una reducción de la cantidad de proteína funcional codificada por dicho gen, así como la supresión completa del gen y/o de la proteína funcional. En los casos en que hay una reducción, dicha reducción se determina en comparación con una planta de tipo silvestre. La expresión "tipo silvestre" (también escrito "de tipo silvestre" o TS), como se usa en el presente documento, se refiere a una forma típica de una planta o de un gen, como planta control que no comprende el gen inactivado de la invención; la mejor versión de la planta control serían las líneas isogénicas. Una "planta de tipo silvestre" se refiere a una planta con el fenotipo correspondiente a una planta que no comprende el gen inactivado de la invención en la población natural.
A pesar de haber sido identificado como la fuente de la susceptibilidad reducida a la infección por PepMV en plantas de tomate o del fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV, el gen de la invención y la proteína codificada por el mismo tienen ortólogos con proteínas de similares características estructurales, como se demuestra por los inventores (véanse los ejemplos). Para identificar los homólogos de proteínas, los expertos en la materia suelen usar la identidad de la secuencia de aminoácidos entre dos proteínas. El término "identidad", como se usa en el presente documento, se refiere a la proporción de aminoácidos o nucleótidos idénticos entre dos péptidos/proteínas o secuencias de nucleótidos, respectivamente, comparadas a lo
largo de la longitud completa de su secuencia. Los métodos para comparar secuencias se conocen en el estado de la técnica e incluyen, pero sin limitarse a, los programas BLASTP o BLASTN, EMBOSS Needle, ClustalW y FASTA. Se puede considerar que los péptidos, proteínas o secuencias de nucleótidos con identidades porcentuales de al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % mantendrán las mismas propiedades que la secuencia con la que se están comparando.
La identificación de homólogos del gen de la invención indica que la inactivación de dichos homólogos puede usarse para crear plantas resistentes a la infección por PepMV o con fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV. Por lo tanto, en otra realización preferida, la planta de la invención o parte de la misma, o el material vegetal de reproducción o propagación de la invención, o la célula vegetal de la invención, pertenecen a la familia Solanaceae. En otra realización preferida, la planta de la invención o parte de la misma, o el material vegetal de reproducción o propagación de la invención, o la célula vegetal de la invención, pertenecen a los géneros Solanum sp, Capsicum sp, Nicotiana sp o Physalis sp. En una realización aún más preferida, las especies se seleccionan de la lista que consiste en: S. lycopersicum, S. tuberosum, S. melongena, S. pennellii, S. pimpinellifolium, S. peruvianum, S. cheesmanii, S. galapagense, S. chilense, S. aethiopicum, S. quitoense, S. torvum, S. muricatum, S. betaceum, S. chmielewskii, S. arcanum, S, cornelliomulleri, S. habrochaiti, S. huaylasense, S. neorickii, S. dulcamara, S. Iycopersicoides, S. sitiens, S. juglandifolium, S. ochranthum y S. cheesmaniae. La presente invención también se refiere al sinónimo de estas especies, tales como Lycopersicon esculentum, Lycopersicon esculentum Mili., Lycopersicon esculentum var. esculentum, Solanum esculentum, Solanum esculentum Dunal.
Debe entenderse que una especie también incluye todas las subespecies y variedades o cultivares de la misma. El término "variedad", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de plantas dentro de una especie que comparten caracteres que las diferencian de otras posibles variedades dentro de esa especie. Dicho carácter distintivo o conjunto de caracteres debe ser estable después de la reproducción y suficientemente homogéneo entre sus individuos y su progenie. Para las especies autógamas o autofecundadoras, como en la familia Solanaceae, la mayoría de las variedades comerciales son líneas puras o híbridos F1 entre dos líneas puras. El término "cultivar", como se usa en el presente documento, se refiere a una planta que tiene un estado biológico diferente al estado "silvestre", donde el estado "silvestre" indica el estado original no cultivado o natural de una planta o accesión. El término "cultivar" incluye, pero sin limitación, a cultivares seminaturales, semisilvestres, malezas,
variedades tradicionales, vestigiales, autóctonas o locales, material de mejora, material de investigación, líneas de obtentor, población sintética, híbrido, plantel fundador/población base, línea endogámica o pura (progenitor de cultivar híbrido), población segregante, colección de mutantes/genética y cultivar avanzado/mejorado.
Por lo tanto, en otra realización preferida de la planta de la invención o parte de la misma, o el material vegetal de reproducción o propagación de la invención, o la célula vegetal de la invención, la especie S. lycopersicum comprende las variedades/cultivares Anna Russian, Applause, Aussie, Baladre, Bella Rosa, Black cherry, Black Pear, Black russian, Blondkopfchen, Brandywine, Cabri, Caracas, Carbón, Ceylan, Cherokee purple, Cherry, Comanche, Costoluto genovese, Ditmarcher, Dombito, Estrella, Eros, Gallician, Glacier, Gartenperle, Green sausage, Grushovka, Harzfeuer, Hugh, Jersey devil, Juboline, Kosovo, Krim black, Kumato, Liguria, Limachino, Lime green salad, Manitoba, Marvel stripe, Moneymaker, Marglobe, Meltine, Monserrat, Muchamiel, Nemato, Opalka, Pera de Girona, Piña Hawaiana, Rio grande, RAF, Roma, Siberian, Sprite, Sugary, Sun sugar, Sobeto, Sonatine, Tigerella, Terrades, Vergel, White Queen, Raf Claudia, Roma, Valenciano, Adoration, Alicante, Azoychka, Better Boy, Big Beef, Big Rainbow, Blaby Special, Black Krim, Branywine, Campari, Celebrity, (tomate) Canario, Tomkin, Early Girl, Enchantment, Ferris Wheel, Flamenco, Fourth of July, Garden Peach, Gardener's Delight, Granadero, Great White, Green Zebra, tomate Hanover, Japanese Black Trifele, Jubilee, Juliet, Lillian's Yellow, Matt's Wild Cherry, Micro-Tom, Moneymaker, Monterosa, Mortgage Lifter, Mr. Stripey, Pantano Romanesco, tomate Plum, tomate Raf, Rebellion, Red Currant, Rosa de Barbastro, San Marzano, San Pedro, Sasha Altai, Tiny Tim, Cherry Bambelo, Cherry Nébula, Santorini, Tomaccio, Yellow Pear, White Queen, Corazón de Buey, Angela, Colgar en Rama, Ciruela Negro, Optima, Pata Negra, Copia, Velasco, Montenegro, Vertyco, Ventero, Ramyle, Pitenza, Paladium, Mayoral, Razymo, Motto, Caniles, Byelsa, Royalty, Trujillo, Delizia, Dumas Duratom, Larguero, Torry, Tovistar, Pintón, Grueso, Larga Vida, Marenza, Window box Roma, Ninette, Retinto, Boludo, Anairis, Tobi Star, Myla, Guarapo, Atago, Jawara, Velasco, Manitu, Colbi, Duraton, Patriarca, Danubio, Intense, Pera Fitto, Vernal, Cecilio, Cherry Kumato, Cherry Amarillo, Cherry Redondo, Cherry Ministar, Cherry Guindos, Cherry Marinica y Cherry Angel.
En otra realización preferida de la planta de la invención o parte de la misma, o el material vegetal de reproducción o propagación de la invención, o la célula vegetal de la invención, la especie S. tuberosum comprende las variedades/cultivares Kennebec, Monalisa, Desirée, Bintje, Álava, Palogan, Pedro Muñoz, Roja Riñón, Duquesa, Goya, Olalla, Turia, Víctor, Lora, Gauna, Alda, Belda, Buesa, Iturrieta, Diba, Fénix, Onda,
Arene, Asun, Ayala, Edurne, Gorbea, Idoia, Iker, Inca, Isla, Mayka, Mikel, Montico, Nagore, Nerea, Zadorra, Zarina y Zela.
Para obtener la planta de la invención, el material vegetal de reproducción o propagación, o la célula vegetal de la invención como se menciona en el presente documento, se usaron tanto métodos exclusivamente biológicos como métodos o procedimientos distintos de los exclusivamente biológicos. Como tal, la expresión "no obtenido exclusivamente mediante un proceso esencialmente biológico" se refiere a un organismo huésped tal como una célula vegetal, una semilla, una planta o parte de una planta cuyo genoma o proteoma se ha modificado por métodos distintos de los métodos esencialmente biológicos tales como cruzamiento, intermejoramiento, mejoramiento selectivo, introgresión, autofecundación u otros procesos biológicos que no impliquen una etapa técnica que modifique el genoma o proteoma. Ejemplos de métodos, distintos de los procesos esencialmente biológicos, para obtener una planta donde el gen de la invención está inactivado son, sin limitarse a, hibridación somática, mutagénesis con agentes mutagénicos como, pero sin limitarse a, radiación ionizante tal como rayos X, neutrones rápidos, radiación UV, etc., o agentes químicos tales como, pero sin limitarse a, metanosulfonato de etilo (EMS), sulfato de dietilo (des) etilenimina (ei), propano sultona, N-metil-N-nitrosouretano (mnu), N-nitroso-N-metilurea (NMU), N-etil-N-nitrosourea (enu), azida de sodio, e ingeniería genética. Ejemplos de estos últimos métodos son, sin limitarse a, la inserción de ácidos nucleicos exógenos en el genoma de la planta diana usando vectores microbianos, bombardeo de microproyectiles, electroporación, microinyección, o transposones, o la transformación de los ácidos nucleicos endógenos o técnicas de edición genómica, incluyendo técnicas CRISPR/Cas u otras tales como, sin limitarse a, las basadas en el uso de la nucleasa de dedos de cinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), etc.
Para los fines de la presente invención, la expresión "no obtenido exclusivamente mediante un proceso esencialmente biológico" se refiere a plantas cuyo material genético se ha modificado deliberadamente para alterar el gen que codifica una proteína donde dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 %, 62 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oun100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, o donde dicha secuencia de aminoácidos consiste en la SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, dicha proteína es el canal permeable al calcio dependiente de la hiperosmolalidad 4.1 (OSCA4.1). Específicamente, las plantas de la invención se han modificado por procesos tanto esencialmente biológicos como no esencialmente biológicos, para inactivar la expresión del gen de la invención descrito en el presente documento y/o para modificar su producto
de expresión con el fin de que dicho producto tenga una función reducida o sea no funcional.
La planta de la invención, como todas las demás plantas, está compuesta por células, tejidos y órganos, que están dentro del alcance de la invención. Por lo tanto, en otra realización preferida, el material de reproducción o propagación se selecciona de una célula, un fruto, una semilla, un tubérculo o una progenie. En otra realización más preferida de la planta de la invención, la parte de la planta se selecciona de una lista que consiste en: una hoja, un tallo, una flor, un ovario o un callo. Estos componentes de la planta de la invención, tanto el material de reproducción o propagación como la parte de la planta de la invención, también se caracterizan por comprender un gen que codifica una proteína, donde dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 %, 62 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y dicho gen ha sido inactivado.
Para obtener la planta de la invención, el material vegetal de reproducción o propagación de la invención, la célula vegetal de la invención o cualquiera de los componentes de la planta de la invención, el experto en la materia dispone de varios métodos, siendo el experto el que conocerá la mejor técnica para aplicar el método elegido para obtener una planta con el gen de la invención inactivado. Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para producir la planta de la invención, o el material vegetal de reproducción o propagación de la invención, o la célula vegetal de la invención, o los componentes de la planta de la invención, donde dicha planta o parte de la misma, material vegetal de reproducción o propagación o célula vegetal, muestran resistencia a la infección por PepMV o un fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV, comprendiendo dicho método (de aquí en adelante el método de la invención):
a) someter la planta o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación o la célula vegetal, a mutagénesis, ya sea aleatoria o dirigida, y b) detectar una mutación en un gen que codifica una proteína, donde dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 %, 62 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, en la planta o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación o la célula vegetal, y donde dicha mutación conduce a una inactivación del gen.
En una realización preferida del método de la invención, la planta, o el material vegetal de reproducción o propagación de la invención, o la célula vegetal de la invención, o los componentes de la planta de la invención, pertenecen a la familia Solanaceae. En otra realización más preferida del método de la invención, la planta, o el material vegetal de reproducción o propagación de la invención, o la célula vegetal de la invención, o los componentes de la planta de la invención, pertenecen a los géneros Solanum sp., Capsicum sp., Nicotiana sp. o Physalis sp. En una realización más preferida del método de la invención, la planta, o el material de reproducción o propagación de la invención, o la célula vegetal de la invención, o los componentes de la planta de la invención, pertenecen a una especie seleccionada de la lista que consiste en: Solanum lycopersicum, S. tuberosum, S. pennellii, S. pimpinellifolium, S. peruvianum, S. cheesmanii, S. galapagense, S. chilense, S. melongena, S. aethiopicum, S. quitoense, S. torvum, S. muricatum, S. betaceum. S. chmielewskii, S. arcanum, S, cornelliomulleri, S. habrochaiti, S. huaylasense, S. neorickii, S. dulcamara. S. Iycopersicoides, S. sitiens, S. juglandifolium, S. ochranthum y S. cheesmaniae. Debe entenderse que una especie incluye todas las subespecies y variedades o cultivares de la misma. Los ejemplos de variedades/cultivares para varias especies, sin limitación, se han enumerado anteriormente en la descripción y dichas variedades/cultivares son válidos para el aspecto actual y sus realizaciones.
Los métodos para obtener plantas, material de reproducción o propagación, células vegetales, progenies o partes de plantas, específicamente donde los genes están inactivados, son ampliamente conocidos en la técnica y un experto podría discernir el mejor método a aplicar para obtener la planta deseada. Dichos métodos incluyen estrategias de mutagénesis, tanto dirigida como aleatoria. Las estrategias de mutagénesis aleatoria se basan principalmente, pero sin limitarse a, técnicas que inducen mutaciones en el ADN de las células, tales como el contacto con un agente mutagénico, tal como una sustancia química (tal como metilsulfonato de etilo (EMS), etilnitrosourea (ENU), etc.) o radiación ionizante (neutrones, tal como en mutagénesis de neutrones rápidos, etc.), rayos alfa, rayos gamma (tales como los suministrados por una fuente de Cobalto 60), rayos X, radiación UV, etc., o cualquier combinación de los mismos. Las estrategias de mutagénesis dirigida incluyen, pero sin limitarse a, edición génica dependiente de recombinación homologa, ARN antisentido, inserción dirigida de transposones, silenciamiento génico inducido por virus y técnicas de edición genómica incluyendo, pero sin limitarse a, técnicas CRISPR/Cas.
Como tal, en una realización preferida del método de la invención, el gen de la invención se inactiva mediante mutagénesis con agentes mutagénicos, mutagénesis con agentes
químicos, ingeniería genética o técnicas de edición genómica, incluyendo técnicas CRISPR/Cas.
La planta de la invención es de usos agrícolas. Entre dichos usos, el más extendido es el crecimiento de la planta para la obtención o generación de productos alimenticios o consumibles. Así, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de la planta de la invención, el material vegetal de reproducción o propagación de la invención, la célula vegetal de la invención o los componentes de la planta de la invención, para producir un producto agroindustrial, donde preferentemente el producto agroindustrial es un alimento o un pienso.
Dicho uso está estrechamente relacionado con los métodos para la producción de dicho producto agroindustrial. Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de producción de productos agroindustriales, donde preferentemente el producto agroindustrial es un alimento o un pienso, que comprende:
a) cultivar la planta de la invención, el material vegetal de reproducción o propagación de la invención, la célula vegetal de la invención o los componentes de la planta de la invención,
b) recolectar el fruto, las semillas, los tubérculos o la parte comestible de la planta para producir el producto agroindustrial, y
c) opcionalmente, preparar el producto agroindustrial para su consumo tanto fresco como transformado.
La invención descrita en la presente descripción y en las reivindicaciones mencionadas más adelante se refiere a plantas donde la inactivación del gen de la invención confiere resistencia a la infección por PepMV o con un fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV. La presente descripción también describe que las plantas con resistencia a la infección por PepMV o con dicho fenotipo mejorado pueden identificarse mediante el cribado de alteraciones en la secuencia de nucleótidos del gen de la invención que pueden afectar al nivel de expresión de dicho gen o el cribado de alteraciones en el nivel de expresión de los productos de dicho gen. Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un gen como biomarcador, de aquí en adelante, el uso del biomarcador de la invención, para seleccionar plantas con resistencia a la infección por PepMV o con fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV, donde dicho gen codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 %, 62 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. En otra realización preferida del biomarcador de la
invención, el gen comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 60 %, 62 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4. Si el gen que se detecta está alterado de manera que cause su inactivación, entonces la planta presenta resistencia a la infección por PepMV. Por lo tanto, en otra realización del uso del biomarcador de la invención, el biomarcador está inactivado. En otra realización preferida del uso del biomarcador de la invención, el biomarcador está inactivado y comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3. En otra realización más preferida del uso del biomarcador de la invención, el biomarcador está inactivado y comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6. El uso del biomarcador de la presente invención en un programa de mejora asistida por marcadores para seleccionar líneas mejoradas, progenies y/o plantas con el carácter de resistencia a PepMV también forma parte de la presente descripción.
Como se usa en el presente documento, el término "biomarcador" comprende cualquier sustancia medible en una planta cuya presencia es indicativa de un estado biológico o una condición de interés. En la presente invención, el biomarcador se refiere a la secuencia de nucleótidos del gen de la invención, los productos de la expresión de dicho gen o secuencias de nucleótidos unidas a él. Por lo tanto, en una realización preferida del uso del biomarcador de la invención, la selección se realiza determinando la secuencia de nucleótidos del gen o fragmentos de dicha secuencia de nucleótidos e identificando alteraciones en la misma. En otra realización preferida, la selección se realiza detectando o cuantificando el producto de expresión del gen de la invención, donde dicho producto se selecciona de una lista que consiste en: ADN complementario o un fragmento del mismo, ARN mensajero o un fragmento del mismo, y una proteína o un fragmento de la misma. En otra realización preferida del biomarcador de la invención, la selección se realiza determinando adicionalmente un locus marcador que segrega conjuntamente con la SEQ ID NO: 4, preferiblemente donde dicho locus marcador se localiza en un rango de 100.000 nucleótidos aguas arriba o aguas abajo del biomarcador de la invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un locus marcador para seleccionar plantas con resistencia a la infección por PepMV o con fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV, donde dicho locus marcador segrega conjuntamente con la SEQ ID NO: 4 y está localizado en un rango de 100.000 nucleótidos aguas arriba o aguas abajo de la SEQ ID NO: 4.
La expresión "locus marcador", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una posición fija específica en un cromosoma donde se encuentra un gen o marcador genético particular, que segrega conjuntamente con la SEQ ID NO: 4. La expresión "segrega conjuntamente", tal como se usa en el presente documento, se refiere a dos o más marcadores genéticos en un cromosoma que se transmiten juntos como resultado de estar en estrecha proximidad física entre sí, es decir, están ligados. El locus marcador puede comprender o consistir en cualquier secuencia de nucleótidos genética o rasgo común, tales como, sin limitarse a, genes, intrones, exones, potenciadores, promotores, polimorfismos de un único nucleótido, inserciones/deleciones de pequeño tamaño, elementos transponibles, microsatélites o simplemente fragmentos de nucleótidos de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más pares de bases de la secuencia de nucleótidos.
Las expresiones "aguas arriba" y "aguas abajo", tal como se usan en el presente documento, se refieren a posiciones nucleotídicas que están en la dirección 5' o la dirección 3' del biomarcador de la invención, respectivamente.
Los métodos para detectar un biomarcador son de conocimiento común en el campo técnico del experto en la materia. Por ejemplo, la identificación de alteraciones en la secuencia de nucleótidos del gen de la invención o en fragmentos del mismo se puede realizar, sin limitarse a, mediante análisis de electroforesis o análisis de secuenciación de los productos de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del gen completo o un fragmento del mismo. Dichas "alteraciones en la secuencia de nucleótidos", como se usan en el presente documento, se refieren a mutaciones en la secuencia de nucleótidos, ya sean sustituciones, inserciones o deleciones de nucleótidos, que cuando están presentes en la región codificante de proteínas del gen de la invención pueden dar como resultado mutaciones de sentido alterado, donde un aminoácido se reemplaza por otro, o a mutaciones interruptoras donde se forma un codón terminador temprano. Es más probable que dichos tipos de alteraciones conduzcan a productos de expresión funcionalmente reducidos o no funcionales del gen de la invención y, como tal, a una inactivación del gen o un silenciamiento más fuerte del gen de la invención. La expresión "alteraciones en la secuencia de nucleótidos", tal como se usa en el presente documento, también abarca las alteraciones que se producen en el gen de la invención fuera de la región codificante de la proteína, tales como, sin limitarse a, la región promotora y/o potenciadora, o en secuencias unidas al gen de la invención, tales como, y sin limitarse a, potenciadores, que pueden afectar al nivel de expresión de los productos del gen de la invención.
Las alteraciones en la secuencia de nucleótidos del biomarcador, como sabe el experto en la técnica, pueden detectarse en un pequeño fragmento, o fragmentos, de la secuencia completa, si dicho fragmento puede identificarse claramente y mapearse en la secuencia nativa o de tipo silvestre con el fin de identificar dichas alteraciones y poder determinar su potencial para inactivar el biomarcador. Dicho fragmento puede variar desde 10 pares de bases hasta la longitud completa del biomarcador. Por lo tanto, en una realización preferida, el biomarcador comprende un fragmento de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o100 pares de bases de la secuencia del gen.
La detección de los productos de expresión del gen de la invención se puede realizar detectando o cuantificando el nivel de ARN mensajero (ARNm) obtenido de la transcripción del gen, o un fragmento del mismo, donde se puede realizar el análisis del nivel de ARNm, por ejemplo, y sin limitarse a, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR), reacción en cadena de la ligasa en combinación con transcriptasa reversa (RT-LCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; micromatrices de ADN producidas usando oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; micromatrices de ADN realizadas a partir de oligonucleótidos sintetizados in situ por fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ usando sondas específicas marcadas mediante cualquier método de mareaje; por geles de electroforesis; por transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; por resonancia magnética nuclear o cualquier otra técnica de imagen usando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con sondas de ADN/ARN, por anticuerpos o por cualquier otro medio.
La expresión "fragmento de ARNm", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la secuencia de nucleótidos obtenida por transcripción del gen de la invención, donde a dicha secuencia le faltan uno o más nucleótidos de la región 5 prima y/o la región 3 prima o cualquier región del mismo en comparación con la secuencia de nucleótidos completa obtenida a partir de la transcripción del gen de la invención.
Además de detectar el ARNm, la detección del biomarcador de la invención también puede realizarse detectando y/o cuantificando el producto proteico del biomarcador de la invención, o un fragmento del mismo. Como anteriormente, dichos métodos se conocen bien en la técnica e incluyen, sin limitarse a, Western blot, array de proteínas, ELISA, inmunohistoquímica o inmunoprecipitación.
La expresión "fragmento de proteína", tal como se usa en el presente documento, se
refiere a una proteína a la que le faltan uno o más aminoácidos del extremo N-terminal y/o C-terminal o cualquier parte de la proteína, en comparación con la proteína normal de longitud completa, donde dicho fragmento no conserva la función original de la proteína de longitud completa. En la presente invención, la proteína es la proteína OSCA4.1 obtenida mediante la traducción del gen de la invención.
Una de las formas más habituales de detectar proteínas o fragmentos de proteínas es mediante el uso de anticuerpos y técnicas que usan dichos anticuerpos. El término "anticuerpos", como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunoactivos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión de un antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con una proteína. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: inmunoglobulina M (IgM), inmunoglobulina D (IgD), inmunoglobulina G (IgG), inmunoglobulina A (IgA) e inmunoglobulina E (IgE).
En relación con el uso descrito en el presente documento, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para seleccionar plantas con resistencia a la infección por PepMV o con fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV en comparación con el tipo silvestre (TS), de aquí en adelante el método de selección de la invención, que comprende las etapas de:
a) detectar un gen que codifica una proteína donde dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 %, 62 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, y
b) determinar si dicho gen de la etapa a) está inactivado,
donde un gen inactivado es indicativo de resistencia a la infección por PepMV o un fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV en comparación con el TS.
En una realización preferida del método de selección de la invención, la detección en la etapa (a) se realiza determinando la secuencia de nucleótidos del gen o un fragmento del mismo. En otra realización preferida del método de selección de la invención, la detección en la etapa (a) se realiza detectando o cualificando el producto de expresión del gen de la invención, donde dichos productos se seleccionan de la lista que consiste en: ADN complementario o un fragmento del mismo, ARN mensajero o un fragmento del mismo y una proteína o un fragmento de la misma.
Los términos y expresiones "plantas", "resistencia a la infección por PepMV", "gen", "proteína", "secuencias de aminoácidos", "identidad", "inactivado", "silenciado",
"fragmento de un gen", "fragmento de una proteína", "ARN mensajero", "fragmento de ARNm", "ADN complementario", fragmento de ADNc" se han definido previamente en relación con aspectos anteriores de la presente invención y dichas definiciones son igualmente válidas para el presente aspecto y sus realizaciones preferidas.
Se han descrito previamente métodos para detectar un gen, ya sea determinando su secuencia de nucleótidos o un fragmento de la misma, o sus productos de expresión como el ARNm, ADNc o proteína o fragmentos de los mismos, en relación con el uso del biomarcador de la invención con respecto a métodos y técnicas para detectar alteraciones en la secuencia de nucleótidos del biomarcador o detectar alteraciones en los productos de expresión del biomarcador. Dichos métodos y técnicas son igualmente válidos para el presente aspecto y sus realizaciones.
Otros usos y métodos para generar la planta de la invención o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación de la invención o la célula vegetal de la invención son métodos basados en una intervención humana sustancial basada en procesos biológicos que aprovechan el uso del biomarcador de la invención para obtener el resultado deseado. Por lo tanto, otro aspecto de la presente descripción es el uso del biomarcador de la invención en un programa de mejora asistida para seleccionar plantas con resistencia a la infección por PepMV o con fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV en comparación con el tipo silvestre. Otro aspecto más de la presente invención se refiere al uso del biomarcador de la invención para el cribado de una población de plantas para detectar la presencia de un alelo inactivado del gen de la invención, donde dicha presencia es indicativa de una mayor resistencia a la infección por PepMV o un fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV en comparación con el tipo silvestre.
La expresión "programa de mejora asistida", también conocido como "selección asistida por marcadores", tal como se usa en el presente documento, se refiere al proceso de selección donde se selecciona un carácter de interés basándose en algún marcador que esté ligado a dicho carácter, en lugar del carácter en sí. En la presente invención, el marcador es el biomarcador de la invención y el carácter es la resistencia a la infección por PepMV o el fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para producir un híbrido de la planta de la invención o parte de la misma, un híbrido del material vegetal de reproducción o propagación de la invención, o un híbrido de la célula vegetal de la invención, donde dicha planta híbrida o parte de la misma, material vegetal de
reproducción o propagación híbrido o célula vegetal híbrida, muestran resistencia a la infección por PepMV o un fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV, de aquí en adelante el método híbrido de la invención, que comprende: a) Cruzar la planta de la invención o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación de la invención o la célula vegetal de la invención, con una segunda planta; y
b) Recolectar la progenie híbrida de dicho cruce.
Como se usa en el presente documento, los términos "híbrido", "planta híbrida" o "progenie híbrida" se refieren a un individuo producido a partir de progenitores genéticamente diferentes (por ejemplo, un individuo genéticamente heterocigoto o en su mayoría heterocigoto). En una realización preferida del método híbrido de la invención, la segunda planta de la etapa a) pertenece a Solanum sp. o Capsicum sp., Nicotiana sp. o Physalis sp. En otra realización preferida, la segunda planta se selecciona de una lista que consiste en: Solanum lycopersicum, S. tuberosum, S. pennellii, S. pimpinellifolium, S. peruvianum, S. cheesmanii, S. galapagense, S. chilense, S. melongena, S. aethiopicum, S. quitoense, S. torvum, S. muricatum, S. betaceum, S. chmielewskii, S. arcanum, S, cornelliomulleri, S. habrochaiti, S. huaylasense, S. neorickii, S. dulcamara, S. Iycopersicoides, S. sitiens, S. juglandifolium, S. ochranthum y S. cheesmania
En otra realización del método híbrido de la invención, la segunda planta de la etapa a) es una línea pura y la progenie híbrida de la etapa b) es un híbrido F1 de un solo cruce. La expresión "línea pura", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una población genéticamente homocigota o casi homocigota. Una línea pura puede, por ejemplo, obtenerse a través de varios ciclos de mejoramiento hermano/hermana, por autofecundación o por producción de dihaploides. Como se usa en el presente documento, la expresión "híbrido F1 de un solo cruce" se refiere a un híbrido de primera generación (o "Filial 1") producido a partir de un cruce entre dos líneas puras. En algunas realizaciones preferidas del método híbrido de la invención, las líneas puras están fijadas (raza pura o “breed true’’ en inglés) para uno o más rasgos fenotípicos de interés. En otra realización preferida adicional del método híbrido de la invención, la línea pura es una línea élite. Como se usa en el presente documento, la expresión "línea elite" se refiere a líneas de plantas que proporcionan un producto de calidad constante. Las líneas elite son el resultado de muchos años de autofecundación y combinan múltiples características superiores tales como alto rendimiento, calidad del fruto y resistencia a plagas, enfermedades o estrés abiótico. El rendimiento promedio de estas líneas élite es generalmente mucho más alto que el de las accesiones silvestres originales
(variedades autóctonas). Las líneas elite se pueden usar directamente como planta de cultivo o se pueden usar para producir híbridos F1 deun solo cruce.
En una realización más preferida del método híbrido de la invención, comprende además una etapa adicional (c) en la que los híbridos recolectados en la etapa (b) muestran una inactivación de un gen que codifica una proteína, donde dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 %, 62 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, se seleccionan mediante intervención humana.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una planta o parte de la misma, un material vegetal de reproducción o propagación o una célula vegetal obtenida mediante el método híbrido de la invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para producir la planta de la invención o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación de la invención, o la célula vegetal de la invención, donde dicha planta o parte de la misma, dicho material de reproducción o propagación, o dicha célula vegetal, presentan resistencia a la infección por PepMV o un fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV en comparación con el tipo silvestre, de aquí en adelante el método de introgresión de la invención, que comprende:
a) cruzar una planta de mejora de la invención o parte de la misma, un material vegetal de reproducción o propagación de mejora de la invención, o una célula vegetal de mejora de la invención con una segunda planta;
b) seleccionar una planta de la progenie resultante del cruce en la etapa a) que tenga una introgresión de la planta de mejora de la invención o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación de mejora de la invención, o la célula vegetal de mejora de la invención asociados con la resistencia a PepMV o fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV;
c) autofecundar y/o retrocruzar dicha planta de progenie seleccionada en la etapa (b) usando como progenitor dicha planta de mejora de la invención o parte de la misma, un material vegetal de reproducción o propagación de mejora de la invención, una célula vegetal de mejora de la línea de la invención o una segunda planta como en (a);
d) seleccionar una planta de la progenie resultante del cruce en la etapa c) que tenga una introgresión de la planta de mejora de la invención o parte de la
misma, el material vegetal de reproducción o propagación de mejora de la invención, o la célula vegetal de mejora de la invención asociados con la resistencia a PepMV o con fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV; y
e) repetir dichas etapas de autofecundación y/o retrocruzamiento y selección de las etapas (c) y (d) para proporcionar una línea de mejora esencialmente homocigota para dicha introgresión, donde al menos una selección, como se realiza en las etapas (b) o (d), se realiza mediante selección asistida por marcadores,
en donde la introgresión comprende una mutación en un gen que codifica una proteína, donde dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 %, 62 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, y donde dicha mutación conduce a una inactivación del gen.
Como se usa en el presente documento, el término "introgresión" pretende referirse a la introducción de un determinante genético en una planta que no porta el determinante genético mediante el cruce y la selección a partir de la primera generación en la que el carácter se vuelve visible o detectable. Para un carácter dominante, la selección puede comenzar tan pronto como la progenie de una F1 de un cruce entre una planta que presenta el carácter y una planta sin el carácter comience a segregar para dicho carácter (por ejemplo, la generación F2 o la primera generación de retrocruzamiento [BC1]). Para un carácter recesivo, esto también es posible a partir de F2. Como alternativa, y especialmente para un carácter poligénico, la selección se puede realizar con marcadores moleculares vinculados al carácter. La selección asistida por marcadores se puede realizar en cualquier generación o población que pueda comprender plantas portadoras del/los marcador/es.
El término "cruzamiento", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la fertilización de plantas femeninas (o gametos) por plantas masculinas (o gametos). El término "gameto" se refiere a la célula reproductora haploide (óvulo o polen) producida en las plantas por mitosis de un gametofito e involucrada en la reproducción sexual, durante la cual dos gametos del sexo opuesto se fusionan para formar un cigoto diploide. El término generalmente incluye referencia a un polen (incluidas las células espermáticas) y un óvulo. Por lo tanto, "cruzamiento" generalmente se refiere a la fertilización de óvulos de un individuo con polen de otro individuo, mientras que "autofecundación" se refiere a la fertilización de óvulos de un individuo con polen del mismo individuo. Al referirse al cruzamiento en el contexto de lograr la introgresión de
una región o segmento genómico, el experto comprenderá que, para lograr la introgresión de solo una parte de un cromosoma de una planta en el cromosoma de otra planta, se requiere que porciones aleatorias de los genomas de ambas líneas parentales se combinen durante el cruzamiento debido a la aparición de eventos de entrecruzamiento en la producción de los gametos en las líneas parentales. Por lo tanto, los genomas de ambos progenitores deben combinarse en una sola célula mediante un cruzamiento, donde, después de la producción de gametos a partir de dicha célula y su fusión en la fecundación, se producirá un evento de introgresión.
El término "retrocruzamiento" se refiere al proceso donde la planta resultante de un cruce entre dos líneas parentales se cruza con una de sus líneas parentales, donde la línea parental usada en el retrocruzamiento se denomina progenitor recurrente. El retrocruzamiento repetido da como resultado que el genoma se vuelva cada vez más homocigoto.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una planta o parte de la misma, un material vegetal de reproducción o propagación, o una célula vegetal obtenida por el método de introgresión de la invención, caracterizada por que comprende un gen que codifica una proteína, donde dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 %, 62 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y dicho gen se ha inactivado.
Todas las definiciones de términos descritos previamente en relación con otros aspectos de la presente invención son igualmente válidas para todos los aspectos y las realizaciones de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 - Síntomas inducidos por PepMV-H30 en hojas de plantas de tomate de tipo silvestre y muíante. Plantas de tipo silvestre (TS) y mutantes 2F531 del cultivar de tomate M82 fueron inoculadas (o no (-) en el caso de los controles sanos) con el aislado agresivo PepMV-H30, que induce mosaicos de color amarillo brillante en los folíolos de las plantas infectadas. La fotografía se tomó 16 días después de la inoculación.
Figura 2 - Resistencia de plantas de tomate del muíante 2F531 a aislados de PepMV de diferentes cepas. La carga viral se midió mediante RT-qPCR usando
cebadores específicos y una curva de calibración de referencia para la cuantificación absoluta del ARN de PepMV. Se observó una fuerte disminución en la acumulación de PepMV en 2F531 con respecto a las plantas TS. Los aislados de PepMV fueron: PepMV-Sp13, -H30 (cepa EU), -PS5y-KLP2 (cepa CH2). Promedio y desviación estándar (D.E.) de 4 réplicas de 3 plantas cada una. Se extrajo el ARN total 16 días después de la inoculación. * indica diferencias significativas (p <0,05, prueba de la T de Student).
Figura 3 - Durabilidad de la resistencia del mutante 2F531. Se realizaron hasta cinco pases de dos aislados de PepMV en plantas TS y mutantes para estimar la probabilidad de ruptura de la resistencia: (A) Esquema del diseño experimental para establecer 6 linajes de PepMV-Sp13 y 6 de PepMV-PS5 en plantas TS y 2F531. (B) Evolución de la carga viral a lo largo del experimento (logio ng de ARN viral/100 ng de ARN total, 16 días después de la inoculación (dpi)), para los aislados PepMV-Sp13 (arriba) y PepMV-PS5 (abajo).
Figura 4 - Mapeo de la mutación que confiere resistencia a PepMV en 2F531. (A) Susceptibilidad de BC1F1 a PepMV-H30, en comparación con TS y 2F531: acumulación de carga viral (ng de ARN viral/100 ng de ARN total), 16 días después de la inoculación; promedios y D.E. de 8 réplicas de 3 plantas cada una. a y b indican niveles de acumulación de PepMV significativamente diferentes (p <0,05, prueba de LSD). (B) Fenotipado de BC1F3 : Histograma de familias BC1F3 con respecto a su % de individuos susceptibles. (C) Diagrama de tipo Manhattan Plot que representa la diferencia en las frecuencias alélicas entre los conjuntos TS y R (eje y), en todas las variantes detectadas a lo largo de los cromosomas del tomate de acuerdo con el genoma de referencia (Heinz 1706, SL2.50). La línea discontinua muestra el umbral de diferencia en frecuencias alélicas superiores a 0,7, indicativo de asociación con resistencia. (D) Mapa genético y análisis de asociación de los SNPs en la región candidata del Cromosoma 2: Mapa de ligamiento de 12 marcadores en la región candidata después del análisis de segregación de 200 individuos BC1F2, distancias genéticas en cM (centro); y gráfica de probabilidad de que la pérdida de susceptibilidad esté asociada con los marcadores, representada como puntuación LOD (escala en la parte superior del gráfico, derecha).
Figura 5 - Número de lecturas emparejadas que mapean con los genes candidatos.
Número de lecturas emparejadas normalizadas después de la RNA-seq. (eje Y) que se mapearon en cada gen candidato, en 3 grupos de seis plantas F2 cada uno, cuya descendencia muestra el fenotipo resistente (R) o susceptible (TS).
Figura 6 - Edición el gen SIOSCA4.1 usando CRISPR/Cas9. (A) Representación
esquemática de la secuencia codificante del gen SIOSCA4.1 de tipo silvestre (TS) que indica las posiciones de los ARNg diseñados para la edición génica mediante CRISPR/Cas9, y el gen editado slosca4.1_2 secuenciado a partir de plantas editadas, con una deleción de 1192 pb con respecto al gen TS. (B) Expresión de síntomas de PepMV en plantas de tomate TS y slosca4.1_2-knockout infectadas (o no para el control sano) con PepMV-H30. (C) Acumulación de PepMV-Sp13 en plantas de tomate TS y mutantes slosca4.1_2-knockout 16 días después de la inoculación. Los datos son medias y la desviación estándar de 6 plantas infectadas. Los asteriscos indican diferencias significativas usando la prueba estadística ANOVA unidireccional (*** p
< 0 ,001).
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Métodos
Cribado de mutantes de tomate
La población muíante consistió en 1.000 familias M2 suministradas después de tratar semillas del tomate cv. M82 con metanosulfonato de etilo (EMS). Se sembraron veinticinco plantas por familia en un vivero (Murcia, España) y 33 días después de la siembra se trasplantaron a invernaderos (Murcia, España) con ventanas y entradas protegidas con malla anti-trips. Se incluyeron plantas de tomate TS cv. M82 como controles susceptibles y para las líneas de los bordes. La densidad de plantas fue de 4 plantas por metro cuadrado. Las plantas se inocularon con el aislado agresivo PepMV-KLP2 (Agüero et al., 2018, Front Plant Sci 9, 1-12.) el mismo día del trasplante. Se usaron plantas de Nicotina benthamiana para propagar el inoculo: 14 días después de la inoculación (dpi), se recogieron hojas sintomáticas por encima de las inoculadas, se mezclaron con tampón fosfato 30 mM a pH 8 a una concentración de 100 g/L y se conservaron a -80°C; para las inoculaciones, esta solución madre se diluyó 5 veces. Las plantas de tomate se pulverizaron a alta presión con una suspensión de polvo de carborundo (0,037 mm de tamaño de partícula; 10 g/L) en la solución de inoculo. Se usó un total de 28 L de solución de inoculo diluida para toda la población muíante de tomate. Se realizó una segunda ronda de inoculación 28 días después, para asegurar la infección. Cada planta M2 se evaluó en cuanto a síntomas 42 días después de la inoculación inicial. Se definió una escala de gravedad de los síntomas de 0-2 de la siguiente manera: 0, sin síntomas; 1, manchas esporádicas de color amarillo brillante en hojas recién emergidas; 2, mosaico de color amarillo brillante que afecta a todas las hojas recién emergidas. Se seleccionaron plantas con puntuación de 0 y 1. Para comprobar la asociación de los síntomas con la infección real, se realizó la detección de
PepMV en10 plantas por familia; se usó hibridación molecular en impresiones tisulares de secciones transversales de pecíolos como en Marco et al. (2003, Phytopathology 93, 844-852). Los cultivos se gestionaron siguiendo prácticas convencionales, salvo que se adoptaron medidas de higiene extremas para el personal que trabajaba en los invernaderos. Una vez evaluados, se recolectaron frutos de plantas con síntomas leves o sin síntomas y se extrajeron las semillas, conservando así más de 600 familias M3.
En una segunda ronda de selección, se evaluaron 10-12 plantas por familia M3; las semillas se desinfectaron con H2O2 al 4 % durante 30 minutos para eliminar el PepMV contaminante; a continuación, se sembraron en bandejas de semillero de 40 alveolos, se inocularon y se cultivaron en un invernadero experimental (CEBAS-CSIC, Murcia, España). El aislado viral usado para las inoculaciones fue PepMV-H30 que, como PepMV-KLP2, induce mosaicos de color amarillo brillante, pero tiene un fenotipo de infección más estable (Agüero et al., 2018, Front Plant Sci 9, 1-12). En este caso, el inoculo se produjo en plantas de tomate (cv. Moneymaker) y las inoculaciones mecánicas se realizaron manualmente como en Agüero et al. (2018, Front Plant Sci 9, 1-12) 21 días después de la siembra. Las plantas se re-inocularon de nuevo 14 días después de la primera inoculación. La visualización de los síntomas se anotó 25 dpi, registrando el porcentaje de plantas sintomáticas por familia. Después de la evaluación, se trasplantaron 3-6 plantas de las familias seleccionadas a sacos de fibra de coco y se cultivaron en invernaderos (Finca "La Matanza", CEBAS-CSIC, Murcia, España) en condiciones de cultivo estándar hasta la maduración del fruto. Se realizaron polinizaciones controladas de las plantas seleccionadas para obtener dos rondas de autofecundación (semilla M4 y M5).
Medición de la carga viral en plantas 2F531
Se ensayaron cuatro aislados de PepMV en plantas TS y 2F531 (semilla M5): PepMV-Sp13 y PepMV-H30 pertenecientes a la cepa EU, y PepMV-PS5 y PepMV-KLP2 de la cepa CH2. PepMV-Sp13 y -PS5 son aislados atenuados que inducen síntomas leves, mientras que PepMV-H30 y -KLP2 son aislados agresivos (Agüero et al., 2018, Front Plant Sci 9, 1-12). Los inóculos se revivieron en plantas de N. benthamiana siguiendo las prácticas estándar. Se inocularon de tres a cuatro réplicas de 3 plantas de tomate por genotipo con cada virus o aislado viral. En todos los casos, las plantas con 2 hojas verdaderas se inocularon mecánicamente como se ha descrito anteriormente (Gómez et al., 2009a, J Virol 83, 12378-12387) y el muestreo se realizó 16 dpi. Las plantas se cultivaron en macetas de 1,1L llenas de una mezcla de turba y fibra de coco (2:1) en un invernadero de cristal (CEBAS-CSIC) con control climático (temperatura diurna ajustada a 24-25°C, temperatura nocturna de 16-18°C, 16 h de luz). La cuantificación del ARN
viral se realizó después de extraer el ARN total. Todas las hojas de las plantas de cada réplica se recolectaron y se homogeneizaron en batidora con 4m L de tampón TNA por g de tejido vegetal (TNA: SDS al 2 %, Tris HCI 100 mM a pH 8, EDTA 10 mM a pH 8); se muestrearon 500 pL de los homogeneizados y se mezclaron con la misma cantidad de TRI-Reagent® (RNA Isolation Reagent, Sigma Chemical Co, EE.UU.); la extracción de ARN se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El precipitado final se disolvió en 50 pL de agua estéril libre de RNasa y el ADN residual se eliminó mediante tratamiento con el kit TURBO DNA-free TM (Invitrogen, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. La cantidad de ARN se estimó en un Nano-Drop® One (Thermo Scientific, EE.UU.). Se usó RT-qPCR para la cuantificación del ARN viral. Se generaron curvas estándar para cada uno de los diferentes virus ensayados, con diluciones seriadas 1:10 de un ARN viral de concentración conocida. Se usó el kit de RT-qPCR KAPA SYBR® FAST Universal One-Step (KAPA Biosystems, EE.UU.), con 2 pL de la dilución de ARN viral purificado o ARN vegetal extraído, en un volumen de reacción de 20 pL, y con cebadores específicos (Gómez et al., 2009a, J Virol 83, 12378 12387). Se analizaron tres réplicas técnicas por réplica biológica usando un termocicladorStepOnePlus (Applied Biosystems, EE.UU.).
Experimento de pases en serie
La estabilidad de la resistencia a PepMV en plantas 2F531 se caracterizó en un experimento de pases en serie. En este experimento se incluyeron dos genotipos de plantas (2F531 y TS) y 2 virus (PepMV-Sp13 y PepMV-PS5). Se usaron semillas Ms para 2F531. Se usaron tres plantas por genotipo y por aislado de PepMV para establecer 12 linajes (Figura 3A). Los inóculos iniciales para ambos aislados se revivieron primero en plantas TS, se cuantificaron como se ha descrito anteriormente y se prepararon para el pase 0 a una concentración de aproximadamente 107 copias de virus/ng de ARN total. Se usaron cincuenta pL de inoculo para inocular mecánicamente cada una de las plantas fundadoras de cada linaje en la etapa de 2 hojas verdaderas, y a continuación se realizaron 5 pases sucesivos; para ello, se tomaron 4 discos de 10,7 mm de la segunda hoja por encima de la inoculada 16 dpi, y se usaron como nueva fuente de inoculo para el siguiente pase de ese linaje (Figura 3A). Otros 4 discos de la misma hoja se mantuvieron congelados a -80°C para cuantificar la carga viral como se ha descrito anteriormente. Todas las plantas se cultivaron en macetas de 1,1L llenas de una mezcla de turba y fibra de coco (2:1) en un invernadero de cristal (CEBAS-CSIC) con control climático (temperatura diurna ajustada a 24-25 °C, temperatura nocturna de 16-18°C, 16 h de luz).
Mapeo de poblaciones v fenotipado
Se realizaron polinizaciones controladas para obtener el retrocruzamiento hacia M82 (BC1F1). BC1F2 se obtuvo mediante la autofecundación controlada de BC1F1. Se cultivaron doscientos cuatro individuos BC1F2 y se usaron como población de mapeo y se autofecundaron para generar 204 progenies BC1F3. En todos los casos, las plantas se cultivaron en sacos de fibra de coco en invernadero de PVC (Finca "La Matanza", CEBAS-CSIC). El valor fenotípico de un BC1F2 dado se determinó analizando la susceptibilidad a PepMV-H30 de 10-12 de sus descendientes BC1F3. La metodología para esta prueba de progenie fue similar a la descrita previamente para la segunda ronda de selección en el cribado masivo, excepto para la reinoculación, que se realizó 7 dpi y la evaluación final 14 dpi.
Análisis de bloques segregantes v genotipado de alto rendimiento
Se generaron dos grupos, el grupo TS con 18 individuos BC1F2 cuyo BC1F3 presentó el 100% de descendencia sintomática, y el grupo R con 18 individuos con el 0% de descendencia sintomática. Se usó tejido foliar de cada individuo BC1F2 para la extracción de ácidos nucleicos. La extracción de ADN automatizada se realizó siguiendo el protocolo Maxwell® CSC (Promega Corp., EE.UU.) para "PureFood GMO and Authentification Kit for Food, Feed and Seed samples". Se usaron modificaciones menores para mejorar el rendimiento; concretamente, 60 mg de tejido molido como material de partida, 600 pL de CTAB, 30 pL de Proteinasa K, una incubación de 2 h a 65°C y un volumen final de 80 pL. El ADN se cuantificó con el kit de ensayo QubitTM dsDNA BR en un fluorímetro Qubit® 2.0 (Life Technologies, EE.UU.), y su calidad se verificó mediante electroforesis en agarosa al 1% y en un Nano-Drop® One. El ADN de los individuos seleccionados se mezcló para que todos estuvieran representados por igual en una muestra por grupo, y Macrogen Inc. (Corea del Sur) realizó una secuenciación de alta cobertura de ambos grupos. Se generaron genotecas TruSeq DNA PCR-Free, con un tamaño de fragmento de 350 pb, y se procesaron en un HORM de alto rendimiento HiSeq®2500 (lllumina Inc., EE.UU.), con lecturas de extremos emparejados, para lograr una profundidad de cobertura de aproximadamente 50X. Los datos brutos se analizaron de la siguiente manera: la calidad de las lecturas se determinó con FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/); el mapeo de las lecturas frente al genoma de referencia del tomate (cv Heinz 1706, versión SL2.50; http://solgenomics.net/organism/Solanum_lycopersicum/genome; Tomato Genome Consortium, 2012) se realizó con el alineador BWA (Li y Durbin, 2009, Bioinformatics 25, 1754-1760); la secuencia de M82 se recuperó de bases de datos públicas (Bolger et al., 2014a, Nat Genet 46, 1034-1038). El programa Freebayes (Garrison y Marth, 2012, ArXiv:1207.3907 [q-bio.GN]) se usó para la identificación de variantes de ambos conjuntos y M82; las frecuencias alélicas se calcularon en los dos
grupos y en M82 después del filtrado (criterios: datos disponibles en ambos grupos, cobertura igual o superior a 20 por muestra, calidad de variante de al menos 25 y frecuencia total de un alelo inferior a 0,9). Finalmente, se calculó la diferencia de frecuencias alélicas entre conjuntos y se representó como un diagrama de tipo Manhattan Plot usando el software R. Se estimó que, para una mutación mendeliana recesiva asociada con la pérdida de función observada, dicha diferencia no sería inferior a 0,7.
RNA-Seq
Los mismos 18 individuos BC1F2 de cada grupo se subdividieron en 3 réplicas de 6 plantas. Se usaron cantidades equivalentes de tejido de hoja de cada una de las 6 plantas por réplica para extraer el ARN como se ha descrito anteriormente, excepto que las preparaciones de ARN finales se obtuvieron usando el kit Nucleo-Spin® RNA plant (Macherey-Nagel GmbH, Alemania). Las preparaciones de ARN resultantes se evaluaron usando un Nano-Drop® One y el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, EE.UU.). Todas las muestras mostraron valores de integridad de ARN superiores a 7,4. Los seis conjuntos se secuenciaron (Macrogen Inc.) después de la construcción de las genotecas con el kit TruSeq Stranded mRNA LT (lllumina Inc.), en la plataforma NovaSeqTM 6000 (lllumina Inc.), con lecturas de extremos emparejados de 151 pb. Las secuencias en bruto se recortaron (adaptadores y 10 nucleótidos del extremo 5') con el programa Trimmomatic (Bolger et al., 2014b) y se filtraron por calidad (un control de calidad mínimo de 30 y una longitud de al menos 70 pb) con FastQC. Las lecturas se emparejaron con BBMap (www.sourceforege.net/projects/bbmap) y a continuación se mapearon frente al genoma de referencia usando el algoritmo MEM de BWA (Li y Durbin, 2009, Bioinformatics 25,1754-1760), verificando la calidad del mapeo con Qualimap (bampc). La identificación de variantes y el cálculo de las frecuencias alélicas se realizaron como se ha descrito para la resecuenciación del ADN. El número de lecturas que se mapearon con respecto a genes anotados se calculó con la función featureCounts de SubRead, su calidad con DESeq2 y su normalización con rlog. DESeq2 permitió también estudiar la expresión diferencial entre las muestras R y TS, considerando dos factores, el genotipo y la replicación. Se usó Goseq para el análisis de enriquecimiento GO. Finalmente, se predijo el impacto biológico de las variantes con SnpEff (Cingolani et al., 2012, SnpEff. Fly 5, 29-30).
Edición CRISPR/Cas9
Se diseñaron tres ARNg complementarios a la secuencia codificante de SIOSCA4.1 usando la herramienta bioinformática BreakingCas (Oliveros et al., 2016). Las secuencias diana en SIOSCA4.1 fueron 5'-ACTTCAATTACGACGTCGCT-3'(SEQ ID
NO: 7), 5'-CAGAGCT GCCGCCCTCAAT A-3' (SEQ ID NO: 8) y 5'-ATAAGGCTGTCCAGGACCTC-3' (SEQ ID NO: 9). Oligonucleótidos con sentido y antisentido (Integrated DNA Technologies, Inc.) se hibridaron y se clonaron en el plásmido binario pDIRECT_22C (Addgene ref. N.°91135) siguiendo el protocolo descrito en Cermák et al. (The Plantcell, 201729(6), 1196-1217). El plásmido resultante se usó para transformar la cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101, que a su vez se usó para transformar explantos de tomate cv. Micro-Tom siguiendo el protocolo descrito en Van Eck et al. (Methods in molecular biology, 2006, 343, 459-473). Las plantas enraizadas en medio selectivo se transfirieron a sustrato y se aclimataron en cámaras de crecimiento. Para comprobar si la edición de SIOSCA4.1 había tenido lugar en las plantas T0, la región diana dentro del gen se amplificó mediante POR directa de tejido usando el kit Phire Tissue direct POR (Thermo Scientific) siguiendo las especificaciones del fabricante y se secuenció por Sanger. Las plantas editadas se autofecundaron para obtener la semilla T1. Se genotiparon plantas T1 cultivadas en sustrato, seleccionando aquellas que presentaban la mutación en homocigosis.
Ejemplo 1: Pérdida de susceptibilidad a PepMV en una colección de mutantes de tomate
Se realizó un cribado en una población de 25.000 mutantes de tomate de 1.000 familias M2. Las plantas mutantes se inocularon con un aislado de PepMV agresivo que induce obvios mosaicos de color amarillo brillante. La gravedad de los síntomas se puntuó para cada planta de acuerdo con una escala de 0 -2 , donde 0 es ausencia de síntomas, 1 es manchas esporádicas de color amarillo brillante en las hojas recién emergidas y 2 es un mosaico de color amarillo brillante que afecta a todas las hojas recién emergidas (figura 1). Los síntomas agresivos (puntuación 2) aparecieron en el 97,5% de las plantas, las cuales se registraron como susceptibles. Hubo plantas que puntuaron 0 o 1 en 379 familias. Se ensayó una subpoblación de plantas sintomáticas y asintomáticas para detectar la infección por PepMV, lo que reveló una correlación perfecta entre la infección y la presentación de síntomas. Se seleccionaron y autofecundaron de 1 a 4 plantas con una puntuación de 0 o 1 por familia, dando lugar a más de 600 familias M3. De estas, se inocularon de 10 a 12 individuos de cada una de las 453 familias M3 con PepMV y se evaluaron de nuevo los síntomas. La familia 2F531 mostró el 100% de plantas asintomáticas, lo que apunta a una mutación homocigótica que causa pérdida de susceptibilidad a PepMV; las plantas de esta familia se autofecundaron para generar semillas M4 y se retrocruzaron con la accesión de tipo silvestre M82 para obtener BC1F1. De ahora en adelante, se hará referencia al fenotipo de pérdida de susceptibilidad de estas plantas como resistencia.
Las plantas de tomate que portan el gen inactivado de la invención no muestran diferencias fenotípicas con respecto al tipo silvestre, aparte de la resistencia a la infección por PepMV o el fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV. Ni las plántulas (figura 6B) ni las plantas completamente desarrolladas de los mutantes 2F531 o slosca4.1_2-knockout pudieron distinguirse de las plantas TS en ausencia de infección por PepMV: tienen similares el hábito de crecimiento determinado, el tamaño, color y forma de las hojas, así como del aspecto, número o cuajado de los frutos y la producción de semillas (rendimiento y capacidad geminativa), lo que indica que la mutación no altera la aptitud de las plantas de tomate.
Alcance y durabilidad de la resistencia en el mutante 2F531
La acumulación de PepMV en plantas de tipo silvestre (TS) y 2F531 se comparó después de la inoculación con PepMV-Sp13, PepMV-H30 (ambos pertenecientes a la cepa EU), PepMV-PS5 o PepMV-KLP2 (pertenecientes a la cepa CH2). Hubo una fuerte y significativa disminución de la carga viral en el mutante con respecto a las plantas TS para los cuatro aislados (figura 2), que fue más pronunciada para los aislados de EU (de 9 a 10 veces) que para los aislados de CH2 (de 3 a 5 veces), y también más pronunciada para los aislados agresivos (PepMV-H30 y -KLP2) que para los leves (PepMV-Sp13 y -PS5).
La durabilidad de la resistencia es clave para implementar estrategias sostenibles de control de patógenos en el campo. Para probar si PepMV podía superar fácilmente la resistencia de 2F531, se realizó un experimento de pases. Después de la inoculación inicial con PepMV-Sp13 o PepMV-PS5, se establecieron tres linajes virales en plantas de cada genotipo M82 o 2F531 y se realizaron 5 pases sucesivos (Figura 3A). Se midió la carga viral en cada pase. Para los pases de PepMV-PS5, la carga viral fluctuó, pero siempre fue menor (casi un orden de magnitud en la mayoría de los casos) en 2F531 que en las plantas TS (Figura 3B). Para PepMV-Sp13, las fluctuaciones de la carga viral con los pases fueron más pronunciadas y, de hecho, en el 3er, 4o y 5o pases, las poblaciones virales en cada uno de los linajes 2F531, respectivamente, casi se extinguieron (Figura 3B).
Mapeo por secuenciación de la mutación asociada a la pérdida de susceptibilidad a PepMV
Las plantas BC1F1 mostraron una acumulación y síntomas de PepMV similares a los de las plantas TS (Figura 4A), lo que indica que la resistencia de 2F531 tiene una naturaleza
recesiva. Se autofecundaron plantas BC1F1 para obtener más de 200 plantas BC1F2, que se cultivaron, se autofecundaron para obtener sus progenies BC1F3 y se muestrearon individualmente para realizar extracciones de ADN y ARN. Se fenotiparon doscientas cuatro familias BC1F3 inoculando 12 plantas por familia con PepMV. En 50 y 54 familias BC1F3, respectivamente, todos los individuos fueron resistentes o susceptibles, mientras que se observó segregación dentro de la familia en 1 00 casos (Figura 4B). Estas frecuencias se ajustan casi a la perfección con la segregación genética esperada en un modelo en el que la resistencia es monogénica y recesiva (estadístico x 2 , 2 d f = 0,23; a >0,001).
Se adoptó el análisis de bloques segregantes (BSA, por sus siglas en inglés) acoplado a una secuenciación de alto rendimiento (HTS, por sus siglas en inglés) para mapear la mutación asociada con la resistencia a PepMV. Se construyeron dos grupos, con 18 individuos BC1F2 en el grupo R (es decir, 0% de plantas susceptibles en BC1F3) y otros 18 individuos BC1F2 en el grupo TS (es decir, 100% de plantas susceptibles en BC1F3). Los grupos de ADN se secuenciaron a una profundidad de 50X. Después del filtrado de calidad y la alineación frente el genoma de referencia (Heinz 1706, SL2.50), se pudo mapear el 99% de las lecturas, teniendo el 78% de ellas una puntuación de calidad MAPQ mayor a 57. La identificación de variantes frente al genoma de referencia detectó 1.285.278 variantes después de filtrar por baja cobertura. La mayoría de las variantes han podido atribuirse a polimorfismos naturales entre M82 y Heinz 1706, y solo 6.302 (0,49%) a la mutagénesis inducida por EMS; esto indica una tasa aproximada de 1 mutación cada 150 Kbp en el muíante 2F531. Se calcularon las frecuencias alélicas de cada variante en cada grupo. La diferencia en las frecuencias alélicas fue mayor de 0,7 en 10 SNP y 1 inserción/deleción, todas ubicadas en el extremo distal del cromosoma 2, lo que indica una asociación entre los alelos de las variantes y el tipo de grupo (Figura 4C). Estas 11 variantes abarcan una región de 2,02 Mb, desde la posición 45.135.056 a 47.155.034; cinco de las mutaciones se encuentran en genes anotados. Esta región incluye otras 448 variantes de baja cobertura y abarca 145 genes anotados.
Para refinar el mapeo del gen, se realizó un análisis de recombinación. Se seleccionaron y se analizaron veinticuatro SNP identificados dentro o adyacentes a la región genómica de interés en 200 individuos BC1F2; solo 12 de los marcadores segregaron en la población. Se construyó un mapa de ligamiento para estos marcadores y se realizó un análisis de asociación para correlacionar los genotipos de los marcadores y la susceptibilidad. La Figura 4D muestra el mapa genético y la densidad de probabilidad a lo largo de este, e ilustra la fuerte asociación de la resistencia con los marcadores C18 y C19. Un análisis de recombinantes indica además que la pérdida de susceptibilidad a
PepMV solo se muestra en individuos homocigotos para el alelo alternativo en la región enmarcada por C16 y C20, que abarca 734.632 pb. Dentro de esta región, el análisis BSA-HTS identificó 4 variantes; el efecto funcional predicho de estas variaciones fue de bajo a moderado excepto para la sustitución de A porT en el nucleótido 1803 dentro del único exón del gen Solyc02g083430, que corresponde a la posición 1660 dentro del marco de lectura abierto principal de Solyc02g083430. La proteína codificada por Solyc02g083430 tiene 831 aminoácidos, y la mutación afecta a la lisina en la posición 554, introduciendo en su lugar un codón de terminación prematuro.
Para validar y complementar los datos anteriores, se realizó un análisis de RNA-Seq usando ARNs mezclados de los grupos R o TS. Se secuenciaron los transcritos, se mapearon frente al genoma de referencia y se filtraron, se identificaron variantes y se compararon las frecuencias alélicas entre grupos. De nuevo, los únicos locus donde las frecuencias alélicas diferían en más de 0,7 se ubicaron en la misma región genómica que se encontró previamente, y las variantes se detectaron específicamente en tres locus, Solyc02g081200, Solyc02g082660 y Solyc02g083430. Se pudieron identificar algunos SNP nuevos en el área, pero con coberturas bajas. Al comparar el número de lecturas del RNA-Seq que mapearon sobre cada uno de los tres candidatos en el grupo R respecto al grupo TS (Figura 5), se observaron diferencias para Solyc02g083430; aunque estas no fueron estadísticamente significativas, las lecturas de Solyc02g083430 parecen ser menos en el grupo resistente que en el susceptible, de acuerdo con la naturaleza de la mutación observada en este gen. Por otro lado, un análisis de enriquecimiento de ontología genética (GO, por sus siglas en inglés) identificó 27 términos GO sobrerrepresentados. Casi el 9% de los genes desregulados están relacionados con complejos de ATPasa dentro de la categoría de componente celular. Dentro de la categoría de función molecular, las más enriquecidas fueron la unión a ATP (GO: 0005524), la actividad endopeptidasa de tipo aspártico (GO: 0004190) y la actividad oxidorreductasa (GO: 0016491). Finalmente, dentro de la categoría de función biológica, solo se identificaron dos procesos biológicos enriquecidos: respuesta a las heridas (GO: 0009611) y proceso metabólico del alcohol (GO: 0006066).
Solyc02g083430 codifica SIOSCA4.1, una proteína involucrada en el tráfico vacuolar y miembro de la familia del canal 1 permeable al calcio dependiente de la hiperosmolalidad (OSCA)
La proteína codificada por Solyc02g083430 (secuencia genómica SEQ ID NO: 4), SEQ ID NO: 1, tiene 3 dominios conservados: un dominio transmembrana que forma parte de un canal 1 de intercambio catiónico permeable al calcio (Csc1_N) activado por señales
físicas tales como es estrés osmótico; un dominio transportador de fosfato, predicho como citosólico (PHM7_cyt); y una región de 7 dominios transmembrana que forman parte de un transportador de fosfato putativo (RSN1_7TM) (Zhu et al., 2008, Nat Genet 40, 854-861). La introducción prematura del codón de terminación en el aminoácido 554 da como resultado la pérdida de gran parte del dominio transmembrana RSN1_7TM, lo que podría causar la pérdida total o parcial de la función de la proteína, dando como resultado el fenotipo muíante. Su ortólogo más cercano en Arabidopsis codifica AtOSCA4.1, que pertenece a la familia de canales permeables al calcio dependientes de la hiperosmolalidad/activados mecánicamente (OSCA) (Yuan et al., 2014, Nature 514, 367-371) y con el que comparte el 69% de identidad de aminoácidos. Como en Arabidopsis, OSCA4.1 de tomate (SIOSCA4.1) pertenece a una pequeña familia compuesta por 12 miembros organizados filogenéticamente en los mismos cuatro ciados que en Arabidopsis. El AtOSCA4.1 se ha identificado claramente como un factor de triaje vacuolar en dos artículos independientes (Fuji et al., 2007, Plant Cell 19, 597 609; Delgadillo et al., 2020, PNAS 117, 9884-9895). Una búsqueda adicional de ortólogos de la proteína codificada por el gen Solyc02g083430 en especies agrícolas importantes, con una organización estructural similar, dio como resultado dos conjuntos de proteínas: uno extremadamente conservado dentro de las Solanaceae con una identidad mínima del 91,29 % en toda la proteína (Tabla 1); y un segundo altamente conservado fuera de las Solanaceae (Tabla 2) con una identidad mínima del 62,77 % en toda la proteína. La similitud estructural y la distribución de dominios de ambos conjuntos de proteínas indicaron que las proteínas deben tener una función conservada con respecto a la proteína codificada por Solyc02g083430.
La edición de SIOSCA4.1 en el cultivar de tomate Micro-Tom confirma su función proviral para PepMV
Para confirmar la implicación de SIOSCA4.1 en la susceptibilidad a PepMV, se usó la tecnología de edición genómica CRISPR/Cas9 para producir mutantes de tomate del cv. Micro-Tom en el locus Solyc02g083430. Se diseñaron ARN guía dirigidos a la secuencia inicial del único exón de Solyc02g083430. Se identificaron mutaciones en homocigosis en algunas plantas de la generación T1 (Figura 6A), las cuales se inocularon con PepMV. Se observó un fenotipo de infección similar al de las plantas mutantes 2F531: no se observaron síntomas de enfermedad en las plantas editadas (Figura 6B) y la acumulación de PepMV se redujo significativamente en las plantas mutantes en comparación con las plantas TS (Figura 6C), validando así la hipótesis de partida.
Tabla 1: Ortólogos de SEQ ID NO:1 en especies de Solanaceae
Especie (Solanaceae)____________% de id.
Nicotiana_benthamiana_1 91,29 Nicotiana_benthamiana_2 92,27 Capsicum_annuum_cv 93,98 Capsicum_annuum_glabriusculum 94,26 Capsicum_annuum_zunla 94,38 Solanum_melongena 93,98 Solanum_lycopersicum 100,00 Solanum_pimpinellifolium 100,00 Solanum_pennellii 98,32 Solanum_tuberosum 97,56
Tabla 2: Ortólogos de SEQ ID NO:1 en especies no Solanaceae
Especie (No Solanaceae)_________% de id.
Musa_acuminata 65,04
Zea_mays 62,96 Oryza_sativa_Indica 62,77 Triticum_aestivum 63,12 Brassica_rapa 69,33 Brassica_rapa_2 62,90 Daucus_carota 75,55 Actinida_chinensis 76,78 Sesamum_indicum 79,34 Olea_europaea 78,16 Solanum_lycopersicum 100,00 Coffea_canephora 80,37 Phaseolus_ vulgaris 71,73 Glycine_max 70,85 Malus_domestica 72,29 Manihot_esculenta 73,79 Cucumis_sativus 71,11
Claims (21)
1. Una planta o parte de la misma, material vegetal de reproducción o propagación, o una célula vegetal, caracterizada por que comprende un gen que codifica una proteína, donde dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o un 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y dicho gen se ha inactivado, con la condición de que la planta o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación, o la célula vegetal, no se obtenga exclusivamente por medio de un proceso esencialmente biológico.
2. La planta o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación, o la célula vegetal, de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho gen está inactivado y codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2.
3. La planta o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación, o la célula vegetal, de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde dicho gen está inactivado y codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.
4. La planta o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación, o la célula vegetal, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, pertenecientes a la familia Solanaceae.
5. La planta o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación, o la célula vegetal, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, pertenecientes a Solanum sp., Capsicum sp., Nicotiana sp. o Physalis sp.
6. La planta o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación, o la célula vegetal, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, pertenecientes a una especie que se selecciona de la lista que consiste en: Solanum lycopersicum, S. tuberosum, S. pennellii, S. pimpinellifolium, S. peruvianum, S. cheesmanii, S. galapagense, S. chilense, S. melongena, S. aethiopicum, S. quitoense, S. torvum, S. muricatum, S. betaceum, S. chmielewskii, S. arcanum, S, cornelliomulleri, S. habrochaiti, S. huaylasense, S. neorickii, S. dulcamara, S. Iycopersicoides, S. sitiens, S. juglandifolium, S. ochranthum y S. cheesmaniae.
7. La planta o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación, o la célula vegetal, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la parte de la planta se selecciona de la lista que consiste en: una hoja, un tallo, una flor,
un ovario o un callo.
8. La planta o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación, o la célula vegetal, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el material vegetal de reproducción o propagación se selecciona de un fruto, una semilla, un tubérculo o una progenie.
9. Un método para producir una planta o parte de la misma, un material vegetal de reproducción o propagación, o una célula vegetal, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde dicha planta o parte de la misma, material vegetal de reproducción o propagación, o célula vegetal, muestra resistencia a la infección por el virus del mosaico del pepino dulce (PepMV) o un fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV, que comprende:
a) Someter a la planta o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación, o la célula vegetal, a mutagénesis, ya sea aleatoria o dirigida, y b) detectar una mutación en un gen que codifica una proteína, donde dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 %, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, en la planta o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación, o la célula vegetal, y donde dicha mutación conduce a una inactivación del gen.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la mutagénesis aleatoria se logra poniendo en contacto la planta o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación, o la célula vegetal, con un agente mutagénico, preferiblemente que se selecciona de la lista que consiste en: una sustancia química, radiación ionizante, rayos alfa, rayos gamma, rayos X, radiación UV o cualquier combinación de los mismos.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 9, donde la mutagénesis dirigida se logra mediante edición génica dependiente de recombinación homologa, ARN antisentido, inserción dirigida de transposones, silenciamiento génico inducido por virus o técnicas de edición genómica, donde preferiblemente la técnica de edición genómica es la técnica CRISPR/Cas.
12. Uso de la planta o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación, o la célula vegetal, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para producir un producto agroindustrial, donde preferiblemente el producto
agroindustrial es un alimento o un pienso.
13. Un método de producción de productos agroindustriales, donde preferiblemente el producto agroindustrial es un alimento o un pienso, que comprende:
a) cultivar la planta o parte de la misma, el material vegetal de reproducción o propagación, o la célula vegetal, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1a8,
b) recolectar el fruto, las semillas, los tubérculos o la parte comestible de la planta para producir el producto agroindustrial, y
c) opcionalmente, preparar el producto agroindustrial para su consumo tanto fresco como transformado.
14. Uso de un gen como biomarcador para seleccionar plantas con resistencia a la infección por PepMV o con fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV, donde dicho gen codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o un 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1.
15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, donde la selección se realiza determinando la secuencia de nucleótidos del gen.
16. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, donde la selección se realiza detectando o cuantificando el producto de expresión del gen, donde dichos productos se seleccionan de la lista que consiste en: ADN complementario o un fragmento del mismo, ARN mensajero o un fragmento del mismo, y una proteína o un fragmento de la misma.
17. Uso de un locus marcador para seleccionar plantas con resistencia a la infección por PepMV, donde dicho locus marcador segrega conjuntamente con la SEQ ID NO: 4 y está localizado en un rango de 100.000 nucleótidos aguas arriba o aguas abajo de la SEQ ID NO: 4.
18. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, donde la selección se realiza determinando además un locus marcador de acuerdo con la reivindicación 17.
19. Un método para seleccionar plantas con resistencia a la infección por PepMV o con fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV en comparación con el tipo silvestre que comprende las etapas de:
a) Detectar un gen que codifica una proteína donde dicha proteína comprende
una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o un 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, y
b) Determinar si dicho gen de la etapa a) está inactivado,
donde un gen inactivado es indicativo de resistencia a la infección por PepMV o un fenotipo mejorado en términos de resistencia a la infección por PepMV en comparación con el tipo silvestre.
20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, donde la detección en la etapa a) se realiza determinando la secuencia de nucleótidos del gen o un fragmento del mismo.
21. El método de acuerdo con la reivindicación 19, donde la detección en la etapa a) se realiza detectando o cualificando el producto de expresión del gen, donde dichos productos se seleccionan de la lista que consiste en: ADN complementario o un fragmento del mismo, ARN mensajero o un fragmento del mismo y una proteína o un fragmento de la misma.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA2A | Patent application published |
Ref document number: 2931248 Country of ref document: ES Kind code of ref document: A1 Effective date: 20221227 |
|
| FA2A | Application withdrawn |
Effective date: 20230411 |