KR20140131562A - Tswv 저항성 캅시쿰 식물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 페퍼 육종 분야에 관한 것이다. TSWV의 Tsw-저항성 파괴 병원형에 대해 저항성인 식물이 제공된다. 또한, 그의 식물 일부, 종자, 세포 및 과실, 및 이러한 식물을 생산하는 방법이 제공된다.

Description

TSWV 저항성 캅시쿰 식물 {TSWV RESISTANT CAPSICUM PLANTS}

본 발명은 식물 육종 및 식물 개선, 특히 Tsw-저항성 파괴 균주 Ve427^RB에 대해 저항성인 캅시쿰 아눔 엘.(Capsicum annuum L.) 종의 식물에 관한 것이다.

캅시쿰 아눔 엘. 식물은 솔라나세아에(Solanaceae) 과의 초본 식물이다. 식물은 약 0.5-1.5 미터 (20-60 in)에 도달한다. 단일 백색 꽃은, 미숙성시 녹색이고 일부 품종은 갈색 또는 자주색으로 숙성할 수 있지만 원칙적으로는 적색으로 변화하는 페퍼(pepper) 과실을 맺는다. 상기 종은 대부분의 기후를 견딜 수 있지만, 따뜻하고 건조한 기후에서 특히 생산성이 높다. 캅시쿰 아눔 종의 재배 페퍼 식물은 다양한 유형의 페퍼, 예컨대 벨(bell) 페퍼, 카이엔(cayenne) 페퍼, 파프리카 및 할라페뇨를 포함한다.

토스포바이러스는 세계적으로 상당한 손해 및 수확량 손실을 유발하는, 다수의 식물 종에 대한 중요한 병적 위협이다 (문헌 [German et al. 1992, Ann Rev Phytopath V30: 315-348]). 따라서 저항성 재배품종을 개발하기 위해, 식물 육종가는 토스포바이러스 저항성을 부여하거나 또는 증진시키는 유전자를 지속적으로 찾는다. Sw-5 유전자는 리코페르시콘 페루비아눔(Lycopersicon peruvianum)으로부터 재배 토마토 내로 이동되어, 토스포바이러스 혈청군 I (예를 들어, TSWV, 토마토 점무늬 시들음병 바이러스) 및 혈청군 II (예를 들어, GRSV 및 TCSV, 각각 땅콩 원형반점 바이러스 및 토마토 황백화 반점 바이러스)에 대한 저항성을 부여하였다.

최근의 상업적 감미 및 신미 페퍼 재배품종은 TSWV에 대한 과민성 저항성을 부여하는 (그러나 다른 토스포바이러스, 예컨대 GRSV 또는 TCSV에 대해서는 아닌) 우성 저항성 유전자 Tsw를 빈번히 함유한다. Tsw 유전자는 캅시쿰 키넨세(Capsicum chinense) 종의 계통 PI152225, PI159236으로부터 유전자이입되었다 (문헌 [Black et al. 1991, Plant Disease 75: 863; Boiteux et al. 1995, Theor. Appl. Genet. 90: 146-149; Costa et al. 1995, First Int. Symposium on Solanaceae for the Fresh Market, March 28-31 1995, Malaga, Spain, Acta Hortic. 412: 523-532]). Tsw를 확인하고/거나 선택하기 위한 분자 마커도 또한 개발되었고 (문헌 [Moury et al. 2000, Genome 43: 137-142]), 얀(Jahn) 등 (문헌 [2000, MPMI Vol 13: 673-682])은 캅시쿰 아눔의 10번 염색체에 Tsw 유전자를 맵핑하였다.

한 가지 결점은 Tsw 유전자에 의해 부여된 TSWV 저항성은 고온에 의해 파괴되고, 또한 식물 연령에 좌우된다는 것이다 (어린 식물이 더 민감성임). 과학적 증거는 Tsw-저항성 유전자가 TSWV의 장거리 수송을 손상시킴으로써 작용할 수 있음을 시사하는 것으로 보인다 (문헌 [Rogero et al., Thrips and Tospoviruses: Proceedings of the 7^th Int Symposium on Thysanoptera, pp105 - 110] 참조).

Tsw 유전자의 추가의 문제는 TSWV의 Tsw-저항성 파괴 균주가 보고된 바 있다는 것이다. Tsw-저항성 파괴 균주는 우성 Tsw 저항성 유전자를 보유하는 식물을 전체적으로 감염시킬 수 있다. 씨. 키넨세의 저항성을 파괴하는 저항성 파괴 균주의 최초 보고는 1993년에 있었다 (문헌 [Boiteaux et al. Plant Disease 77: 210]). 이후, 모리(Moury) 등 (문헌 [1997, Euphytica 1994: 45-52])은 또한 Tsw 저항성을 극복하는 바이러스 균주를 발견하였지만, 상기 바이러스 분리주는 이들이 GRSV 또는 TCSV 분리주가 아니라 확실히 TSWV 분리주인지를 평가하기 위해 유형분석되지는 않았다.

로게로(Roggero) 등 (문헌 [1999, Plant Disease Vol 83: p965])은 이탈리아에서 PI15225로부터의 Tsw 유전자를 보유하는 페퍼 잡종에서 Tsw-저항성을 극복하는 TSWV의 2종의 야외 분리주를 발견하였다. 혈청학적 검정은 상기 바이러스 분리주가 총채벌레 매개체 프란클리니엘라 옥시덴탈리스(Frankliniella occidentalis)에 의해 전염가능한 TSWV 균주임을 확인시켰다. 2002년에, 로게로 등은 이탈리아에서 추가의 Tsw-저항성 파괴 균주를 보고하였다 (문헌 [Plant Disease Vol 86: 950-954]). 시험된 모든 상업적 페퍼 재배품종은 실험 조건 하에 이들 저항성-파괴 TSWV 균주에 의해 전체적으로 감염될 수 있었다. 그러나, Sw-5 유전자를 보유하는 TSWV 저항성 토마토 재배품종은 페퍼로부터의 Tsw-저항성 파괴 균주에 대해 민감성이 아니었고, 이는 Sw-5 및 Tsw가 상이한 특징을 갖는다는 것을 보여주었다 (상기 문헌 [Roggero et al. 2002]). 이는 또한 얀 등에 의해서도 확인되었다 (상기 문헌 [2000]).

2004년에, 마르가리아(Margaria) 등 (문헌 [Plant Pathology Vol 53: p794])은 스페인 (알메리아)의 밭에서의 Tsw-저항성 파괴 균주의 확인을 보고하였다.

마르가리아 등 (문헌 [MPMI Vol 20: 547-558])은 2007년에 우성 Tsw 저항성 유전자를 보유하는 페퍼 식물과 다양한 천연 TSWV 균주 (야생형 균주 및 Tsw-저항성을 파괴할 수 있는 균주 둘 다) 사이의 상호작용을 연구하였다. Tsw-저항성 파괴 TSWV 균주는 이들의 연구에서 위첨자 'RB'로 표시된다. 이들 저항성 파괴 균주 중 하나는 2003년에 스페인 알메리아의 페퍼밭으로부터 분리된 Ve427^RB이다. Tsw-유전자를 보유하는 식물의 접종된 페퍼 잎에 단지 국부 손상만을 유발한 야생형 TSWV 균주와는 대조적으로, 저항성 파괴 TSWV 균주는, 예를 들어 감염된 식물 전체에 걸친 잎 황백화 및 황색 반점으로 이어지는 전체적 감염을 유발하였다. 야생형 (균주 Br01^wt)과 RB 균주 게놈 사이의 재배열을 갖는 균주를 사용함으로써, 마르가리아 등 (문헌 [2007, MPMI Vol 20: 547-558])은 Tsw-저항성 파괴 균주의 비병원성 결정인자가 소형 RNA (S RNA) 상에서 발견된 NSs 단백질 (비구조 단백질)임을 보여줄 수 있었다. 상기 연구의 저항성-파괴 균주에서, NSs 단백질은 야생형 NSs 단백질에 대해 1 또는 2개의 돌연변이 또는 결실을 함유하였다.

우성 Tsw 유전자는 여전히 전세계의 다수의 지역에서 페퍼 품종에 TSWV에 대한 저항성을 제공하는데 유용하지만, 신규 TSWV 균주, 특히 Tsw-저항성 파괴 균주에 의해 유발되는 손해를 최소화하기 위해 TSWV 저항성의 신규 공급원이 긴급히 필요하다.

본 발명의 목적은 Tsw-저항성 파괴 균주, 예컨대 NSs 단백질 내에 돌연변이 및/또는 결실을 포함하는 균주에 대한 저항성을 부여하는 Tsw-유전자와 상이한 신규 저항성 유전자를 포함하는 페퍼 식물을 제공하는 것이다. 한 실시양태에서, 신규 저항성 유전자는 적어도 Tsw-저항성 파괴 균주 Ve427^RB에 대한 저항성을 부여한다. 본 발명의 추가의 목적은 신규 저항성 유전자 및 Tsw 유전자를 둘 다 포함하는 페퍼 식물, 즉 야생형 TSWV 균주 (병원형 P0) 및 Tsw-저항성 파괴 균주 (병원형 P1), 적어도 Ve427^RB, 바람직하게는 또한 다른 Tsw-저항성 파괴 균주 (예컨대, NSs 단백질 내에 하나 이상의 결실 및/또는 돌연변이를 갖는 균주 및/또는 Tsw-유전자를 보유하는 페퍼 식물의 전체적 감염이 가능한 균주)에 대해 저항성인 식물을 제공하는 것이다.

발명의 상세한 설명

본원에 사용된 용어 "포함한다" 및 그의 활용형은 이 단어에 후속되는 항목이 포함되나 구체적으로 언급되지 않은 항목도 배제되지는 않음을 의미하는 그의 비제한적인 의미로 사용된다. 그럼에도 불구하고, 당업자는 용어 "포함한다"가 용어 "이루어진다"도 또한 포괄하는 것으로 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 실시양태에서, 하위-요소, 예를 들어 QTL을 포함하는 요소는 또한 상기 하위-요소로 이루어질 수 있다. 또한, 한 요소의 단수 표현 언급은, 문맥에서 하나 및 오직 하나의 요소가 있을 것이 명백히 요구되지 않는 한, 하나 초과의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 단수 표현은 통상적으로 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미하는데, 예를 들어 "세포"는 또한 세포 배양물, 조직, 전체 유기체 형태의 여러 세포를 지칭하는 식이다. 유사하게, "식물"은 또한 복수의 식물을 지칭한다.

"표현형"은 그의 유전자형 및 그의 환경 사이의 상호작용의 결과로서의, 식물의 관찰가능한 외부적 및/또는 생리학적 외양이다. 이는 관찰가능한 형태학적 및/또는 생리학적 특징을 포함한다.

"유전자형"은 환경 요인에 의해 부분적으로 영향을 받는 식물의 유전가능한 유전자 정보 전체이고, 이는 표현형으로 발현된다.

본원에 사용된 "페퍼 식물" 또는 "페퍼"는 캅시쿰 속의 식물 또는 그의 일부 (예를 들어, 과실)이다. 페퍼는 모든 종류의 페퍼, 예컨대 신미/매운 맛 페퍼 및 비-매운 맛 페퍼 (감미 페퍼)를 포함한다. 상기 용어는 야생 등록물 및 재배화된 페퍼를 포함한다.

"재배화된 페퍼"는 캅시쿰 아눔 엘., 캅시쿰 키넨세 자크., 캅시쿰 프루테스센스 엘.(Capsicum frutescens L.), 캅시쿰 바카툼 엘.(Capsicum baccatum L.) 및 캅시쿰 푸베스센스 루이스 & 파브.(Capsicum pubescens Ruiz & Pav.) 종을 지칭한다.

용어 "재배품종" (또는 "재배" 식물)은 "야생" 상태 이외의 생물학적 상태를 갖는 식물을 나타내기 위해 본원에 사용되고, 상기 "야생" 상태는 식물 또는 등록물의 본래의 비-재배 상태, 비-재배화 상태 또는 천연 상태를 나타내고, 용어 재배는 이러한 야생 또는 잡초성 식물을 포함하지 않는다. 용어 재배품종은 우수한 작물 특징을 갖는 재료, 예컨대 육종 재료, 연구 재료, 육종 계통, 엘리트 육종 계통, 합성 집단, 잡종, 파운더 스톡/베이스 집단, 근친교배 계통, 재배품종 (방임 수분된 잡종 재배품종), 격리 집단, 돌연변이/유전자 스톡, 및 진보/개선된 재배품종을 포함한다. 한 실시양태에서, 용어 재배품종은 또한 원시품종, 즉 수많은 해에 걸쳐 인간에 의해 지역적으로 선택 및 재배되었고 특정 지리적 환경에 적합화되었으며 공통의 유전자 풀을 공유하는 페퍼 식물 (또는 집단)을 포함한다. 일반적으로, "재배 페퍼"는 과실 생산을 위해 밭 또는 보호된 환경 (예를 들어, 온실 또는 터널)에서 인간에 의해 재배되는 재배화된 페퍼의 육종 계통 및 품종을 지칭한다. 재배품종은 야생 등록물과 비교시 우수한 작물 특성, 예컨대 높은 수확량, 더 큰 과실 크기, 더 높은 생식력, 식물 및/또는 과실의 더 높은 균일성 등을 갖는다. 재배품종의 예는 캅시쿰 아눔, 캅시쿰 키넨세, 캅시쿰 프루테스센스, 캅시쿰 바카툼 및 캅시쿰 푸베스센스 종에 속하는 재배 품종을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "식물"은 전체 식물 또는 그의 임의의 일부 또는 파생물, 예컨대 식물 기관 (예를 들어, 수확되거나 또는 수확되지 않은 과실, 잎, 종자, 꽃 등), 식물 세포, 식물 원형질체, 전체 식물이 재생될 수 있는 식물 세포 또는 조직 배양물, 식물 캘러스, 식물 세포괴, 및 식물 내 온전한 식물 세포, 또는 식물의 일부, 예컨대 배아, 화분, 배주, 씨방, 과실 (예를 들어, 수확된 조직 또는 기관, 예컨대 수확된 페퍼 과실 또는 그의 일부), 꽃, 잎, 종자, 복제 번식된 식물, 뿌리, 근경, 줄기, 근단 등을 포함한다. 또한 임의의 발달 단계, 예컨대 미성숙 및 성숙 묘목 등이 포함된다.

본원에 사용된 용어 "과실"은 Tsw-저항성 파괴 균주, 예컨대 균주 Ve427^RB에 대해 저항성을 부여하는 페퍼 식물에서 성장하고 있던 페퍼 과실을 지칭한다. 한 실시양태에서, 과실은 수확된 과실이다. 한 실시양태에서, 이러한 과실은 무종자인데, 즉 이는 종자를 전혀 포함하지 않거나, 또는 이는 발아가능하지 않은 종자를 함유하거나, 또는 이는 성숙기를 비롯한 그의 모든 발달 시기에 성숙 종자를 함유하지 않는다 (즉, 이들은 종자를 통한 번식에 적합하지 않음).

용어 페퍼 과실의 "펄프", "꼬투리" 또는 "과육"은 종자가 아닌 과실의 일부를 지칭한다. 일반적으로, 과실 펄프는 종자를 캡슐화하는데, 즉 펄프 및 종자는 본 발명의 의미에서 과실을 형성한다.

"식물 품종"은 공지된 가장 낮은 계층의 동일한 식물 분류 내 식물 군이고, 이는 (식물 육종가 권리의 승인을 위한 조건을 충족시키는지 아닌지의 여부에 관계없이) 특정 유전자형 또는 유전자형의 조합으로부터 유래되는 특징의 발현에 기반하여 정의될 수 있고, 그 특징 중 하나 이상의 발현에 의해 식물의 임의의 다른 군으로부터 구별될 수 있고, 어떠한 변화도 없이 증식될 수 있기 때문에 독립체로서 간주될 수 있다. 따라서, 식물의 군이 모두 하나의 유전자좌 또는 유전자의 존재 (또는 이러한 단일 유전자좌 또는 유전자로 인한 일련의 표현형적 특징)를 특징으로 하지만, 달리 다른 유전자좌 또는 유전자와 관련하여 서로 대단히 상이할 수 있는 경우에는, 심지어 이들이 동일한 종류의 것인 경우에도, 용어 "식물 품종"은 이들을 나타내는데 사용될 수 없다.

"식물 계통" 또는 "육종 계통"은 식물 및 그의 자손을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "근친교배 계통"은 반복적으로 자가교배된 식물 계통을 지칭한다.

"F₁, F₂ 등"은 2개의 친 식물 또는 친 계통 사이의 교배에 이어 연속적으로 관련된 세대를 지칭한다. 2개의 식물 또는 계통을 교배시킴으로써 생산된 종자로부터 성장한 식물은 F₁ 세대로 불린다. F₁ 식물의 자가교배는 F₂ 세대를 생성하는 등이다. "F₁ 잡종" 식물 (또는 F₁ 잡종 종자)은 2개의 근친교배 친 계통을 교배시킴으로써 획득된 세대이다.

"잡종" 또는 "잡종 식물"은 2개 이상의 상이한 식물 또는 상이한 친 계통의 식물의 이종교배 (타가-수정)에 의해 생산된 식물이다. 이러한 교배의 종자 (잡종 종자), 뿐만 아니라 그 종자로부터 성장한 잡종 식물 및 그 성장한 식물로부터 유도된 식물 일부는 본원에 포함되는 것으로 이해된다.

용어 "형질"은, 예를 들어 교배 및 선택에 의해 하나의 식물로부터 또 다른 식물로 이동가능한 유전 특징, 예컨대 TSWV 저항성을 지칭한다.

"TSWV", "TSWV 균주" 또는 "TSWV 분리주" 또는 "TSWV 병원형"은 혈청학적으로 (예를 들어, TSWV 뉴클레오캡시드 또는 당단백질에 대해 발생시킨 항체를 사용함, 문헌 [Roggero and Masenga, 2002, Plant Dis. Vol86, 950-953] 참조) 또는 서열 비교에 의해, 예를 들어 균주를 완전한 게놈 서열이 결정된 바 있는 브라질리안(Brazilian) 분리주 Br01^wt (진뱅크(GenBank) 등록 번호 NC_002050, NC_002051 및 NC_002052)와 비교함으로써 결정될 수 있는 토마토 점무늬 시들음병 바이러스의 균주를 지칭한다.

"야생형 (WT) TSWV 균주" 또는 "병원형 P0"은 당업계로부터 공지된 우성 Tsw-저항성 유전자가 저항성을 부여하는 TSWV 균주를 지칭한다. 예를 들어, Tsw-저항성 유전자를 갖는 저항성 식물은 감염 후, 또는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 병원형 P0을 사용한 저항성 검정에서 수행될 수 있는 인위적 접종 후에 상부의 접종되지 않은 잎에서의 전체적 증상, 예컨대 황색 반점형성을 본질적으로 나타내지 않는다. WT TSWV 균주의 예는, 예를 들어 둘 다 문헌 [Margaria et al. (2007, MPMI Vol 20: 547-558)]에 기재되어 있는 p105^WT 또는 Ve430^WT이다. 균주는 둘 다 각각 등록 번호: DQ376178 및 DQ376184 하에 진뱅크에 기탁되어 있는 그의 S 절편 서열에 의해 확인될 수 있다.

"TSWV 저항성 유전자" 또는 "TSWV 저항성 대립유전자"는, 식물 게놈 내에 존재하는 경우에 상기 유전자 또는 대립유전자 또는 DNA 영역이 결여된 식물과 비교하여 TSWV의 하나 이상의 균주에 대한 저항성을 부여하거나 또는 증진시키는 유전자 또는 대립유전자, 또는 상기 유전자 또는 대립유전자를 포함하는 DNA 영역이다.

"Tsw 유전자" 또는 "Tsw 저항성 유전자"는, 예를 들어 씨. 키넨세 PI152225, PI159236, 또는 Tsw 유전자를 포함하는 상업적 페퍼 품종, 예컨대 씨. 아눔 cv. 익스플로러(Explorer) (상업적 잡종 벨 페퍼 품종)로부터 획득가능한 당업계에 공지된 바와 같은 우성 저항성 유전자를 지칭한다. Tsw 유전자의 존재 또는 부재는 실시예에 기재된 바와 같은 저항성 검정을 이용하고/거나 선행 기술에서 제공된 분자 마커 검정 (예를 들어, 문헌 [Moury et al. 2000, Genome 43: 137-142 및 Jahn et al. 2000, MPMI Vol 13: 673-682])을 이용하여 결정될 수 있다.

"Tsw-저항성 파괴 균주" (RB) 또는 "병원형 P1"은 기능적 Tsw-저항성 유전자를 포함하는 식물, 예컨대 예를 들어 씨. 키넨세 PI152225, PI159236 또는 씨. 아눔 재배품종 "익스플로러"의 식물에서 전체적 질환 증상 (상부의 접종되지 않은 잎에서의 황색 반점)을 유발할 수 있는 TSWV 균주를 지칭한다. 한 실시양태에서는, 국부 괴사성 병변이 접종된 잎에 형성된다. 한 실시양태에서, Tsw-저항성 파괴 균주는 비구조 단백질 (NSs) 내에 하나 이상의 돌연변이 및/또는 결실을 포함한다 (문헌 [Margaria et al. (2007, MPMI Vol 20: 547-558) 및 de Haan et al. (1990, J. Gen. Virol. 71: 1001-1007)] 참조).

"Ve427^RB"는, 상기 문헌 [Margaria et al. (2004, 2007)]에 기재된 바와 같이 스페인 (알메리아)의 밭으로부터 분리되었으며 대표적인 샘플이 등록 번호 DSM 24829 하에 DSZM에 기탁되어 있는 RB-균주를 지칭한다.

"Ve427^RB-저항성"을 갖거나 또는 포함하거나, 또는 "Ve427^RB-저항성"인 페퍼 식물은 Ve427^RB로의 접종 또는 감염 후에 전체적 증상을 나타내지 않는 페퍼 식물을 지칭한다. 이는 다양한 방법을 이용하여 시험될 수 있고, 한 예는, 예를 들어 5 내지 6개의 완전히 발달된 잎을 갖는 페퍼 식물의 2개의 가장 어린 잎에 Ve427^RB를 접종하고, 상부의 접종되지 않은 잎이 접종 후 약 28일에 황색 반점 증상을 나타내지 않는 것에 의한, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 Ve427^RB-저항성 검정과 같은 인위적 접종 검정을 이용하는 것이다. 한 실시양태에서, 식물 계통 또는 품종은 전체적 증상을 본질적으로 나타내지 않는 경우에 Ve427^RB에 대해 저항성인 것으로 말해지고, 이는 감염되거나 또는 접종된 식물의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 그 초과 (예를 들어, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99% 또는 100%)가 전체적 증상을 나타내지 않는 것 (즉, 상부의 접종되지 않은 잎에 황색 반점형성이 없음)을 의미한다.

"Ve427^RB-저항성 부여 QTL 또는 그의 Ve427^RB 저항성 부여 부분을 포함하는 유전 요소" 또는 "Ve427^RB 저항성-부여 QTL"은 페퍼 식물에서 Tsw-저항성 파괴 균주 Ve427^RB에 대한 저항성을 부여하거나 또는 증진시키는 유전 요소, 예를 들어 핵산 (예컨대, 게놈 DNA)을 지칭한다. 한 실시양태에서, 상기 유전 요소는 야생 등록물 PA2638의 캅시쿰 식물로부터 유도가능하거나 / 획득가능하다. 따라서, 한 실시양태에서, 유전 요소는 등록물 PA2638의 식물을 또 다른 페퍼 식물과 교배시킴으로써 획득될 수 있다 (획득가능하다). 본원에 사용된 "야생 등록물 PA2638"은 이탈리아의 시장으로부터 입수된 야생 등록물을 지칭한다. PA2638의 종자의 대표적인 샘플은 넌헴스 비.브이.(Nunhems B.V.)에 의해 2012년 2월 23일에 등록 번호 NCIMB 41936 하에 기탁되어 있다. 한 실시양태에서, 식물에서의 Ve427^RB 저항성-부여 QTL을 포함하는 유전 요소의 존재 또는 부재는 저항성 검정, 예를 들어 "Ve427^RB-저항성 검정"으로서 본원에 기재된 검정 및/또는 분자 마커 검정을 이용하여 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, Ve427^RB 저항성 부여 QTL을 포함하는 유전 요소는 등록 번호 NCIMB 41817, NCIMB 41818 또는 NCIMB 41936 하에 기탁된 종자 및 이들 종자 및/또는 그의 자손으로부터 성장한 식물에서 기원하거나, 이로부터 획득되거나, 이로부터 획득가능하거나, 이로부터 유도되거나, 이로부터 유도가능하거나, 이에서 발견된다. 따라서, 한 실시양태에서, Ve427^RB 저항성 부여 QTL을 포함하는 유전 요소는, 종자가 등록 번호 NCIMB 41817, NCIMB 41818 또는 NCIMB 41936 하에 기탁된 식물을 또 다른 페퍼 식물과 교배시키는 것에서 기원하거나, 이로부터 획득되거나, 이로부터 획득가능하거나, 이로부터 유도되거나, 이로부터 유도가능하다.

"Ve427^RB-저항성 검정"은 Tsw-저항성 파괴 균주에 대한 페퍼 식물의 저항성 및/또는 Ve427^RB 저항성 부여 QTL을 포함하는 유전 요소의 존재를 결정하기에 적합한 검정이다. 검정은 하기에 추가로 예시적으로 기재되어 있다. 이러한 검정을 이용하여, 식물, 식물 계통 또는 품종은 Tsw-저항성 파괴 균주, 예컨대 Ve427^RB에 대해 "저항성"인 것으로 분류될 수 있다.

"저항성"은 유효한 (또는 기능적인) 저항성 유전자가 결여된 식물에 비한 유효한 (또는 기능적인) 저항성 유전자를 포함하는 식물에서의 특정 병원체 (예를 들어, 하나 이상의 TSWV 균주)의 성장 및/또는 발달의 통계적으로 유의한 제한 및/또는 특정 병원체 (예를 들어, 하나 이상의 TSWV 균주)로의 감염 후의 질환 증상의 통계적으로 유의한 감소를 지칭한다. 저항성은 정성적으로 결정될 수 있고/거나 (특정한 계통 또는 품종의 식물을 '저항성' 또는 '민감성'으로 분류함), 저항성은 예를 들어 저항성 검정에서, 예를 들어 바이러스 균주로의 감염에서 생존하거나 (생존 %) 또는 식물의 단지 일부만이 감염되는 경우에 전체적 증상을 본질적으로 나타내지 않는 특정한 계통 또는 품종의 식물의 백분율로서 측정함으로써 정량화될 수 있다. 한 실시양태에서, 식물 계통 또는 품종은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 TSWV 저항성 검정에서 시험될 수 있는 Tsw-저항성 파괴 균주로의 감염 또는 접종 후에 나타나지 않는 증상, 특히 전체적 증상에 따라 '저항성'인 것으로 인정되는 경우에, Tsw-저항성 파괴 균주에 대해 저항성인 것으로 말해진다. 한 실시양태에서, 식물 계통 또는 품종은 전체적 증상을 본질적으로 나타내지 않는 경우에, 즉 식물의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 그 초과 (예를 들어, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99% 또는 100%)가 Tsw-저항성 파괴 균주로의 감염 또는 접종 후에 전체적 증상을 나타내지 않는 경우 (즉, 상부의 접종되지 않은 잎에 황색 반점형성이 없음)에 Tsw-저항성 파괴 균주에 대해 저항성인 것으로 말해진다. 당업자는 계통 또는 품종이 저항성인지의 여부를 평가하기 위해 계통 또는 품종당 적어도 10개의 식물, 12, 15 또는 20개 또는 심지어 더 많은 식물이 동일한 시험 조건 하에 시험되어야 한다는 것, 및 적합한 대조 식물이 포함되어야 한다는 것을 이해할 것이다.

용어 "대립유전자(들)"는 특정한 유전자좌에서의 유전자의 임의의 하나 이상의 대안적 형태를 의미하고, 이들 모든 대립유전자는 특정 유전자좌에서의 하나의 형질 또는 특징과 관련이 있다. 유기체의 이배체 세포에서, 주어진 유전자의 대립유전자는 염색체 상의 특정 위치, 또는 유전자좌(들)에 위치한다. 하나의 대립유전자는 상동 염색체 쌍의 각각의 염색체 상에 존재한다. 이배체 식물 종, 예컨대 페퍼는 특정한 유전자좌에서 다수의 상이한 대립유전자를 포함할 수 있다. 이들은 유전자의 동일한 대립유전자 (동형접합) 또는 2개의 상이한 대립유전자 (이형접합)일 수 있다.

"식재" 또는 "식재된"은 기계 또는 수동으로 밭에 파종 (직접 파종)하거나 묘목 (소식물) 이식하는 것을 지칭한다.

"영양 번식"은, 예를 들어 시험관내 번식에 의한 영양 조직으로부터의 식물의 번식을 지칭한다. 시험관내 번식은 시험관내 세포 배양 또는 조직 배양, 및 시험관내 배양물로부터의 전체 식물의 재생을 포함한다. 본래의 식물의 클론 (즉, 유전적으로 동일한 영양 번식물)은 따라서 시험관내 배양 및 재생 방법에 의해 생성될 수 있다.

용어 "유전자좌(들)"는, 예를 들어 유전자 또는 QTL 또는 분자 마커가 발견되는 염색체 상의 특정 장소 또는 장소들 또는 부위 또는 영역을 의미한다. 동일 염색체 상의 유전자좌 사이의 거리는 교차 빈도에 의해 측정된다. 2개의 유전자좌가 더 멀리 떨어져 있을수록, 이들 사이에 교차가 일어날 가능성은 더욱 크다. 반대로, 두 유전자좌가 서로 가까운 경우에는, 이들 사이에 교차가 일어날 가능성이 더 작다. 대체로, 1 센티모르간 (cM)은 유전자좌 (예를 들어, 마커) 사이의 1% 재조합과 동일하다.

용어 "QTL" 및 "정량적 형질 유전자좌"는 그의 당업계-인식되는 의미로 본원에 사용된다. 상기 용어는 Ve427^RB-저항성을 코딩하는 하나 이상의 유전자 (또는 대립유전자) 또는 적어도 조절 영역, 즉 Ve427^RB-저항성에 관여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 제어하는 염색체의 영역과 연관되어 있는 캅시쿰의 특정한 염색체 상에 위치한 영역을 지칭한다. 그 유전자의 표현형적 발현은, 예를 들어 감소된 바이러스 복제 속도 및/또는 식물을 통한 바이러스 이동의 감소된 속도 및/또는 그의 표현형적 효과 (예를 들어, 전체적 증상 발병이 본질적으로 없음)로서 관찰될 수 있다. QTL은, 예를 들어 산물이 유전적 저항성을 부여하는 것인 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 다르게는, QTL은, 예를 들어 산물이 식물의 게놈 내의 다른 유전자좌 상의 유전자의 발현에 영향을 미치고 그로 인해 Ve427^RB-저항성을 부여하는 것인 조절 유전자 또는 서열을 포함할 수 있다.

용어 "천연 유전적 배경"은 QTL의 본래의 유전적 배경, 즉 QTL이 본래 발견되는 게놈 및 염색체를 나타내기 위해 본원에 사용된다. 따라서, PA2638의 게놈 (등록 번호 NCIMB 41963)은 본 발명의 Ve427^RB-저항성 부여 QTL을 포함하는 유전 요소의 천연 유전적 배경을 나타낸다. 반대로, PA2638의 본래의 유전적 배경으로부터 또 다른 캅시쿰 식물 또는 종의 또 다른 유전적 배경 (예를 들어, 또 다른 게놈의 염색체 상)으로의 QTL 또는 그의 저항성-부여 부분을 포함하는 DNA 영역 (또는 유전자이입 단편)의 이동 (또는 유전자이입)을 포함하는 방법은, 그의 천연 유전적 배경에는 없는 그 QTL 또는 그의 상기 저항성-부여 부분을 생성할 것이다. 본원에 사용된 용어 "연관군"은 염색체 (의 물리적 실체)와 동의어이다.

용어 "분자 마커", "유전자 마커" 또는 "DNA 마커"는 본원에서 핵산 서열의 차이를 시각화하는 다양한 방법에 의해 검출되는 다형성 핵산 서열을 지칭한다. 이러한 방법의 예는 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 마커, 증폭된 단편 길이 다형성 (AFLP) 마커, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP), 삽입, 돌연변이, 초위성체 마커 (SSR), 서열-특성화 증폭 영역 (SCAR), 절단된 증폭 다형성 서열 (CAPS) 마커 또는 동종효소 마커, 또는 특정 유전자 및 염색체 위치를 규정하는 마커들의 조합이다. "QTL, 또는 유전자 또는 유전자좌에 연결된 분자 마커"는 따라서, QTL, 유전자 또는 유전자좌를 포함하는 게놈 DNA 영역에 물리적으로 연결되어 있으며 QTL, 유전자 또는 유전자좌를 포함하는 DNA 영역과 공동-분리되는 마커를 지칭한다. 마커는 따라서 유전자이입 영역도 또한 규정할 수 있다.

"재조합 사건"은 감수분열 교차 사건을 지칭한다.

용어 "유전자이입 영역" 또는 "유전자이입 DNA 영역", "유전자이입 형질" 또는 "유전자이입 유전자" 또는 "유전자이입 단편"은 육종 방법, 예컨대 역교배에 의해 하나의 식물 게놈으로부터 또 다른 식물 게놈의 게놈 내로 이동된 염색체 절편을 지칭한다.

"유전자이입"은 본원에서, 하나의 식물 게놈으로부터 동일한 종 또는 밀접하게 관련된 종 (종간 혼성화를 통함)의 또 다른 식물 게놈 내로의, 특정한 형질 또는 표현형 (예를 들어, TSWV 균주 VE427^RB에 대한 저항성)을 부여하는 DNA 영역 (유전자이입 영역)의 이동을 지칭한다. 특히, 비-재배 식물 또는 야생 식물 (우수한 작물 특성이 결여됨)로부터 재배 식물 (우수한 작물 특성을 가짐)의 게놈 내로의 상기 DNA 영역의 이동을 지칭한다. 따라서, 한 실시양태에서, 생성된 페퍼 식물은 또 다른 식물 게놈, 특히 PA2638로부터의 유전자이입 단편이 유전자이입된 재배 페퍼 식물의 게놈을 포함한다. 유전자이입은 일반적으로 육종 단계, 예컨대 1회 이상의 교배, 자가교배 및/또는 역교배를 포함하지만, 마커 보조 선택, 표현형 선택 (예를 들어, 저항성 검정), 이중 반수체 생산, 배아 회생 등도 또한 포함할 수 있다.

"역교배"는 2개의 친 사이의 교배로부터 생성된 식물을 친 중 하나와 (역)교배시키는 육종 방법을 지칭한다. 역교배에 사용된 친은 반복친으로 지칭된다. 반복된 역교배는 점점 더 동형접합이 되고 반복친의 게놈을 점점 더 닮는 게놈을 생성한다. 역교배는 공여자 식물 (예를 들어, 야생 등록물)로부터의 형질을 또 다른 식물 (예를 들어, 재배 식물 또는 육종 계통)에 도입시키는데 사용될 수 있다.

용어 "자가교배"는 개체가 그 자신의 화분으로 수분되거나 또는 수정되는 자가-수정의 과정을 지칭한다. 반복적으로 "자가교배된" (자가-수정된) 식물.

용어 "단백질"은 작용 방식, 크기, 3차원 구조 또는 기원을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. "야생형" 단백질은 야생형, 예를 들어 야생형 TSWV 바이러스 균주에 존재하는 바와 같은 완전히 기능적인 단백질이다. "돌연변이 단백질"은 본원에서, 야생형 단백질과 비교하여 대체, 결실 또는 삽입되는 하나 이상의 아미노산을 유발하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 단백질이다. 단백질의 "단편" 또는 "일부"는 따라서 여전히 "단백질"로 지칭될 수 있다. "단리된 단백질"은 더이상 그의 천연 환경에 있지 않은 단백질을 지칭하는데 사용된다.

TSWV의 "야생형 NSs 단백질" 또는 "야생형 비-구조 단백질"은 야생형 균주에서 발견되는 NSs 단백질이고, 예를 들어 균주 VE430^WT의 NSs 단백질은 등록 번호 진뱅크 ABD38700.1 (도 1 a)을 갖는 반면, Tsw-저항성 파괴 균주 VE427^RB의 NSs 단백질은 야생형 단백질과 단지 1개의 아미노산만이 상이하고 (즉, "돌연변이 NSs 단백질"임) 야생형 단백질에 대해 99% 서열 동일성을 갖는 진뱅크 등록 번호 ABD38702.1 (도 1 b)의 서열을 갖는다.

단백질을 코딩하는 핵산 분자에서의 "돌연변이"는, 예를 들어 하나 이상의 뉴클레오티드의 대체, 결실 또는 삽입에 의한, 야생형 서열과 비교하여 하나 이상의 뉴클레오티드의 변화이다. "점 돌연변이"는 단일 뉴클레오티드의 대체, 또는 단일 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실이다. "무의미" 돌연변이는 코돈이 정지 코돈으로 변화되는 것인, 단백질을 코딩하는 핵산 서열에서의 (점) 돌연변이이다. 말단절단된 단백질은 감소된 기능 또는 기능 상실을 가질 수 있다. "과오" 돌연변이는 코돈이 상이한 아미노산을 코딩하도록 변화되는 것인, 단백질을 코딩하는 핵산 서열에서의 (점) 돌연변이이다. 생성된 단백질은 감소된 기능 또는 기능 상실 또는 변경된 기능을 가질 수 있다.

"서열 동일성" 및 "서열 유사성"은 전체 또는 국부 정렬 알고리즘을 이용한 2개의 펩티드 또는 2개의 뉴클레오티드 서열의 정렬에 의해 결정될 수 있다. 이어서, 서열은 이들이 (예를 들어, 프로그램 갭(GAP) 또는 베스트핏(BESTFIT) 또는 엠보스(Emboss) 프로그램 "니들(Needle)" (디폴트 파라미터 사용, 하기 참조)에 의해 최적으로 정렬되었을 때) 적어도 특정 최소 백분율의 서열 동일성 (하기에 추가로 정의된 바와 같음)을 공유하는 경우에 "실질적으로 동일"하거나 또는 "본질적으로 유사"한 것으로 지칭될 수 있다. 이들 프로그램은 매치의 수를 최대화하고 갭의 수를 최소화하는 니들만(Needleman) 및 운쉬(Wunsch) 전체 정렬 알고리즘을 이용하여, 2개의 서열을 이들의 전체 길이에 걸쳐 정렬시킨다. 일반적으로, 갭 생성 페널티 = 10 및 갭 연장 페널티 = 0.5를 갖는 디폴트 파라미터를 사용한다 (뉴클레오티드 및 단백질 정렬 둘 다에 대해). 뉴클레오티드의 경우에 사용되는 디폴트 점수화 매트릭스는 nwsgapdna이고, 단백질의 경우에 디폴트 점수화 매트릭스는 블로섬62(Blosum62) (문헌 [Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919])이다. 서열 정렬 및 서열 동일성 백분율에 대한 점수는, 예를 들어 엑셀리스 인크.(Accelrys Inc.) (미국 92121-3752 캘리포니아주 샌디에고 스크랜턴 로드 9685)로부터 입수가능한 GCG 위스콘신 패키지 버전 10.3 또는 엠보스(EMBOSS) (http://www.ebi.ac.uk/Tools/webservices/services/ emboss)와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 다르게는, 유사성 또는 동일성 퍼센트는 파스타(FASTA), 블라스트(BLAST) 등과 같은 데이터베이스에 대한 탐색에 의해 결정될 수 있지만, 히트는 서열 동일성을 비교하기 위해 쌍으로 검색 및 정렬되어야 한다.

"평균"은 본원에서 산술 평균을 지칭한다.

"캡사이신"은 캅시쿰 속에 속하는 식물인 칠리 페퍼의 활성 성분이다. 이는 인간을 비롯한 포유동물에 대해 자극성이고, 작열감을 생성한다. 캡사이신의 양은 캅시쿰 아눔을 비롯한 캅시쿰의 다양한 품종 사이에서 유의하게 다양하다:

"스코빌(Scoville) 척도"는 페퍼의 매운 열 (또는 톡 쏘는 맛 / 매운 맛)의 측정치이다. 스코빌 열 단위 (SHU)의 숫자는 존재하는 캡사이신의 양을 나타낸다: 측정된 양의 건조된 페퍼로부터의 캡사이신 오일의 알콜 추출물을 "열"이 (통상적으로 5명의) 테이스터의 패널에 의해 막 검출가능해질 때까지 물 중 당의 용액에 점점 증가시키면서 첨가하고; 희석의 정도는 그의 측정치를 스코빌 척도 상에 제공한다. 다르게는, 매운 열은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용함으로써 측정될 수 있다. 상기 방법은 미국 향신료 무역 협회 (ASTA) 매운 맛 단위로 결과를 생성한다. HPLC 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 디오넥스(DIONEX)의 설명을 참조한다. 등용매 분석 시스템은 펌프, 오토샘플러, 자동온도조절 챔버, 어레이 앞에 위치한 4 채널 코울어레이(CoulArray)® 검출기 및 UV/vis 검출기로 이루어져 있다. LC 조건: 칼럼: MD-150 (3 x 150mm; 3μm), 이동상: 아세트산을 함유하는 50mM 아세트산암모늄, pH 4.4; 45% 아세토니트릴, 유량: 0.8 mL/분, 온도: 주위, 주입 부피: 20 μl, 검출기 및 조건: 전기화학적 검출기: 모델 5600A, 코울어레이, 모델 5010 분석용 셀이 구비됨, 적용 전위: +150, +450mV 대 Pd, UV 검출기: 표준 UV 검출기, 파장: 235 및 280nm. 1 백만분율의 캡사이신의 측정치는 약 15 스코빌 단위에 해당한다. 그러나, 페퍼의 톡 쏘는 맛 / 매운 맛을 결정할 때에는 스코빌 방법이 바람직하다.

당업자는 값과 조합된 용어 "약"이 바람직하게는 정확한 값을 지칭하는 것으로 이해한다. 그러나, 일반적으로, 용어 "약"은 또한 측정 기술 또는 생물학적 분포 내에서 인정 및 허용되는 측정 부정확성으로 인한 값의 다양성을 포함한다. 일반적으로, 이러한 부정확성은 측정 기술에 따라 10% 미만, 8% 미만, 6% 미만, 4% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 0.01% 미만이다. 당업자는 그의 일반적 지식에 기반하여, 공지된 측정 기술 또는 생물학적 과정 내에서 허용되는 부정확성, 예컨대 멘델의 법칙을 적용하는 경우의 자손의 분포를 과도한 부담 없이 확인할 것이다.

도면 범례
도 1 a: 균주 VE430^WT의 NSs 단백질.
도 1 b: Tsw-저항성 파괴 균주 VE427^RB의 NSs 단백질.
도 2: PA2638 (NCIMB41936)의 과실. 5개의 녹색 과실 (우측) 및 5개의 적색/성숙 과실 (좌측).

다른 균주 중에서도 Tsw-저항성 파괴 균주 Ve427^RB는 Tsw-저항성 유전자를 보유하는 페퍼 식물의 저항성을 극복할 수 있는 것으로 밝혀졌다 (상기 문헌 [Margario et al. 2004, 2007]). 스페인의 밭으로부터 분리된 상기 균주로의 인위적 접종을 이용하여, PA2638로 표시되는 야생 캅시쿰 등록물은 PA2638의 식물이 인위적으로 접종된 경우에 놀랍게도 Ve427^RB-저항성인 것으로, 즉 전체적 증상이 본질적으로 보이지 않는 것으로 밝혀졌다. Ve427^RB는 Tsw-유전자를 포함하는 페퍼 식물에서 전체적 감염을 유발할 수 있는 균주이다. 놀랍게도, 이러한 신규 저항성 공급원 PA2638은 야생형 TSWV 균주에 대해 저항성이 아니었는데, 이는 이상적으로는 이러한 신규 저항성 공급원에 다른 저항성 유전자, 예컨대 우성 Tsw 유전자를 채워야 한다는 것을 나타낸다.

야생 페퍼 등록물은 PCR 분석에 의해, 공지된 Tsw-저항성 유전자가 결여된 것으로 확인되었다.

Ve427^RB 저항성 부여 QTL을 포함하는 신규 유전 요소를, 선택된 Ve427^RB-저항성 F₂ 식물의 반복된 역교배에 의해 PA2638로부터 재배 페퍼 내로 유전자이입시켰다. PA2638은 신미 페퍼 식물인데, 즉 PA2638의 과실은 캡사이신을 생산하거나/함유한다. 환언하면, PA2638의 성숙 과실은 적어도 600 SHU 또는 적어도 40 ASTA 매운 맛 단위를 함유한다.

식물 계통

본 발명의 한 측면은, 천연 유전적 배경에는 없는 Ve427^RB-저항성 부여 QTL 또는 그의 Ve427^RB-저항성 부여 부분을 포함하는 유전 요소를 포함하는, 대표적인 샘플이 등록 번호 DSM 24829 하에 기탁되어 있는 Ve427^RB로 표시되는 토마토 점무늬 시들음병 바이러스 (TSWV)의 Tsw-저항성 파괴 균주에 대해 저항성인 캅시쿰 속의 페퍼 식물, 바람직하게는 재배 페퍼 식물을 지칭한다. 예를 들어, 상기 유전 요소의 천연 유전적 배경이 PA2638인 경우에, 본 발명에 따른 식물은 PA2638 식물이 아니다. 따라서, 본 발명에 따른 식물은 비-재배 페퍼 식물, 예를 들어 PA2638로부터의 Ve427^RB-저항성 부여 유전자이입 단편을 포함하는 재배 페퍼의 게놈을 갖는 페퍼 식물을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은, Tsw-저항성-파괴 TSWV-저항성 부여 QTL 또는 그의 Tsw-저항성-파괴 TSWV 저항성 부여 부분을 포함하는, PA2638의 식물로부터 유도되거나 / 이로부터 획득가능하거나 / 이로부터 획득된 유전 요소를 그의 게놈 내에 포함하며, 단 PA2638이 아닌 캅시쿰 속의 페퍼 식물의 제공을 지칭한다.

본 발명의 한 측면은 Tsw-유전자를 포함하는 페퍼 식물에서 전체적 감염을 유발할 수 있는 Tsw-저항성 파괴 TSWV 균주에 대한 저항성 부여 QTL을 그의 게놈 내에 포함하는 캅시쿰 속의 페퍼 식물의 제공을 지칭한다.

한 측면에서, 본 발명은 Tsw-저항성-파괴 TSWV-저항성 부여 QTL 또는 그의 Tsw-저항성 파괴 TSWV-저항성 부여 부분을 포함하는 유전 요소를 그의 게놈 내에 포함하며, 여기서 상기 유전 요소 또는 그의 저항성 부여 부분은 그의 천연 유전적 배경에는 없는 것인 캅시쿰 속의 페퍼 식물을 제공한다. 바람직하게는, 이러한 저항성은 PA2638로부터 유도되거나 / 이로부터 획득되거나 / 이로부터 획득가능한데, 즉 PA2638은 상기 유전 요소의 천연 유전적 배경이다.

"~로부터 유도된", "~로부터 획득된" 및 "~로부터 획득가능한"은 본원에서, 종자가 하나 이상의 등록 번호 하에 기탁된 식물을 교배시킴으로써 획득되거나/획득가능한 형질 (및 상기 형질을 포함하는 식물)을 지칭한다. 이는 최초 교배에 이은 여러 번의 자가교배 및/또는 (역)교배를 포함할 수 있다. 이에 따라, 형질을 부여하는 유전 요소는 또 다른 유전적 배경 내로 유전자이입되거나 또는 이동될 수 있다.

본 발명의 한 측면은, Tsw-저항성-파괴 TSWV-저항성 부여 QTL 또는 그의 Tsw-저항성 파괴 TSWV-저항성 부여 부분을 포함하는 유전 요소를 그의 게놈 내에 포함하며, 그의 가장 넓은 폭에서 적어도 2 cm의 폭을 갖는 성숙 과실을 생산하는, 즉 성숙 과실이 적어도 약 2 cm 이상, 예컨대 적어도 약 3cm, 4 cm, 5cm, 6cm, 7cm, 8cm, 9cm, 10cm, 11cm 또는 그 초과의 폭을 갖고/거나 적어도 5cm, 6cm, 7cm, 8cm, 9cm, 10cm, 11cm, 12cm, 13cm, 14cm, 15cm, 16cm, 17cm, 18cm, 19cm 또는 그 초과의 과실 길이를 갖는 것인 캅시쿰 속의 페퍼 식물을 지칭한다. 예를 들어, 이러한 식물은 벨 유형 또는 라무요(lamuyo) 유형의 과실을 생산한다.

한 실시양태에서, 상기 Tsw-저항성 파괴 TSWV 균주는 돌연변이 NSs 단백질을 특징으로 하고, 여기서 상기 Tsw-저항성 파괴 균주의 NSs 단백질 변형은 상기 Tsw-저항성 파괴 균주가 우성 Tsw-유전자에 의해 부여된 저항성을 극복할 수 있게 하는 상기 Tsw-저항성 파괴 균주가 분리된 지역에서의 관련된 WT 균주의 야생형 단백질과 비교하여 단일 아미노산 교환, 아미노산의 결실로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3개 또는 그 초과의 변형으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 야생형 균주의 NSs-단백질의 서열은 문헌 [Margaria et al. (2007, MPMI Vol 20: 547-558)]의 도 3에 개시된 바와 같은 p170^wt, 문헌 [Margaria et al. (2007, MPMI Vol 20: 547-558)]의 도 3에 개시된 바와 같은 p105^wt, 또는 등록 번호 ABD38700.1을 갖는 Ve430^WT의 NSs-단백질의 서열이다. 한 바람직한 실시양태에서, TSWV의 야생형 균주는 p105^WT 또는 Ve430^WT이고, 이들은 각각 등록 번호: DQ376178 및 DQ376184 하에 진뱅크에 기탁되어 있는 이들의 S 절편 서열에 의해 확인될 수 있다. 한 실시양태에서, TSWV의 Tsw-저항성 파괴 균주는 야생형 NSs 단백질 서열과 비교하여 아미노산의 교환 및 아미노산의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 그의 NSs 단백질 서열에서의 1 또는 2개의 돌연변이를 포함하거나 또는 함유하는데, 예를 들어 진뱅크 등록 번호 ABD38700.1을 갖는 야생형 균주의 NSs 단백질 및 Tsw-저항성 파괴 균주의 NSs 단백질 서열은 위치 85에서의 아미노산 교환을 갖는다. 한 실시양태에서, Tsw-저항성 파괴 균주의 NSs 단백질은 진뱅크 등록 번호 ABD38702.1의 서열을 갖는다 (Ve427^RB를 지칭함). 한 실시양태에서, 야생형 균주의 NSs 단백질은 진뱅크 등록 번호 ABD38700.1을 갖는다 (도 1 참조). 또 다른 실시양태에서, 야생형 균주의 NSs 단백질은 p105^WT의 NSs 단백질이다 (등록 번호 DQ376178 참조).

바람직하게는, Tsw-저항성 파괴 TSWV 균주는 Ve427^RB이고, Ve427^RB의 대표적인 샘플은 등록 번호 DSM 24829 하에 기탁되어 있다. 당업자는 Ve427^RB에 대한 저항성이 물론 다른 Tsw-저항성 파괴 균주에 대한 저항성을 배제하지는 않는다는 것을 인지하고 있다. 그러나, 본원에 사용된 Ve427^RB에 대한 저항성은 TSWV의 야생형 균주 (즉, Tsw-유전자가 저항성을 부여하는 균주)에 대한 저항성을 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 페퍼 식물은 Tsw-저항성 파괴 균주 Ve427^RB에 대해 저항성이며, PA2638 (NCIMB 41936)이 아닌 페퍼 식물이다.

한 실시양태에서, 최대 3, 바람직하게는 최대 2의 길이 대 폭 비, 및 그의 가장 넓은 폭에서 2 cm 이상의 폭을 갖는 성숙 과실을 갖는 페퍼 식물은, 대표적인 종자가 등록 번호 NCIMB 41936 하에 기탁된 야생 등록물로부터 유도되거나/이로부터 획득되거나/이로부터 유도가능하거나/이로부터 획득가능한 Ve427^RB-저항성 부여 QTL 또는 그의 Ve427^RB-저항성 부여 부분을 포함하는 유전 요소를 포함한다.

본 발명에 따른 페퍼 식물은 바람직하게는 재배 페퍼 식물 (재배품종)이다. 추가로, 본 발명에 따른 재배 페퍼 식물은 캅시쿰 아눔 (씨. 아눔), 캅시쿰 차이니즈(Capsicum chinese) (씨. 차이니즈), 캅시쿰 바카툼 (씨. 바카툼), 캅시쿰 프루테스센스 (씨. 프루테스센스), 캅시쿰 푸베스센스 (씨. 푸베스센스)로 이루어진 군으로부터 선택된 종, 바람직하게는 캅시쿰 아눔의 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 페퍼 식물은 근친교배 계통이다. 구체적 실시양태에서, 본 발명에 따른 페퍼 식물은 잡종, 특히 F1 잡종이다. Ve427^RB-저항성 부여 QTL을 포함하는 유전자이입 단편은 근친교배 계통 또는 F1 잡종인 페퍼 식물에서 이형접합 또는 동형접합 형태로 존재할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 페퍼 식물은 감미 페퍼 식물이다. 본 발명에 따른 "감미 페퍼"는 과실이 스코빌 척도 상에서 0 SHU 내지 500 SHU, 바람직하게는 0 SHU 내지 200 SHU, 보다 바람직하게는 0 SHU 내지 50 SHU의 평균 점수를 갖는 페퍼 식물이다. 한 바람직한 실시양태에서, 감미 페퍼의 매운 맛은 약 0 SHU이다. 또 다른 실시양태에서, 페퍼 과실의 캡사이신의 양은 0 내지 약 30 ASTA 매운 맛 단위, 바람직하게는 0 내지 13 ASTA 매운 맛 단위, 또는 심지어 0 내지 2 ASTA 매운 맛 단위이다. 다양한 실시양태에서, 본 발명에 따른 페퍼 식물의 과실은 SHU 0 내지 100, 또는 0 내지 500, 또는 00 내지 500, 또는 500 내지 1000, 또는 1000 내지 2000, 또는 2500 내지 5000 또는 그 초과를 갖는다. 추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 페퍼 식물의 과실은 약 5.000 SHU 내지 약 20.000 SHU, 또는 약 25.000 SHU 초과, 예컨대 30.000 내지 50.000, 또는 50.000 내지 100.000, 또는 100.000 내지 200.000, 또는 100.000 내지 350.000 SHU, 또는 350.000 SHU 초과로 점수화된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 페퍼 식물은 벨 유형의 페퍼 식물이다. 일반적으로, 벨 페퍼는 성숙 과실이 약 1.5 내지 약 0.7의 길이/폭 비, 및 적어도 약 7.5 cm, 8 cm, 9 cm, 10 cm 또는 그 초과, 예를 들어 약 7.5 cm 내지 약 17.5 cm의 평균 과실 길이를 갖는 식물이다. 바람직하게는, 성숙 과실은 약 1.3 내지 약 0.9의 길이/폭 비, 및 적어도 약 7.5 cm, 8 cm, 9 cm, 10 cm 또는 그 초과의 평균 과실 길이, 예를 들어 약 7.5 내지 약 15 cm의 길이를 갖는다. 과실 색상은, 예를 들어 녹색, 적색, 황색, 오렌지색, 백색, 무지개색 (숙성 단계 사이) 및 자주색일 수 있다. 북아메리카 벨 페퍼는 약 10 cm 길이 및 약 10 cm 폭의 과실을 지칭하는 반면, 유럽에서 벨 페퍼는 형상이 덜 뭉툭하고 더 길쭉할 수 있다. 벨 페퍼는 캅시쿰 속 내의 군이고, 캅시쿰 아눔 엘. 종의 것이다. 한 실시양태에서, 벨 유형 페퍼는 캡사이신을 생산하지 않거나, 또는 단지 500 SHU 또는 30 ASTA 매운 맛 단위 이하의 캡사이신만을 생산한다. 한 바람직한 실시양태에서, 벨 페퍼는 캡사이신을 생산하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 벨 유형 과실의 형상은 문헌 ["Capsicum Pepper Varieties and Classification (New Mexico State University, Circular 530, College of Agriculture and Home Economics, http://www.reocities.com/wstarron/circ530.pdf)]에 기재된 바와 같은 벨 페퍼의 형상과 본질적으로 동일하다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 식물의 성숙 페퍼 과실의 길이/폭 비는 최대 약 4, 최대 약 3.0, 최대 약 2.5, 최대 약 2.0, 최대 약 1.5이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 식물의 성숙 페퍼 과실의 폭은 그의 가장 넓은 폭에서 적어도 약 1.5 cm, 적어도 약 2.0 cm, 적어도 약 3.0 cm, 적어도 약 4.0 cm, 적어도 약 6 cm, 적어도 약 7cm, 적어도 약 8 cm, 적어도 약 9 cm, 적어도 약 10 cm, 또는 그 초과이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 식물의 성숙 페퍼 과실의 폭은 그의 가장 넓은 폭에서 적어도 4.0 cm, 예컨대 6.0 cm 이상, 7cm 이상, 또는 8 cm, 또는 그 초과의 cm이고, 길이/폭 비는 최대 3, 바람직하게는 최대 2.5, 바람직하게는 최대 2.0, 또는 최대 1.5이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 페퍼 식물은 종자의 대표적인 샘플이 등록 번호 NCIMB 41817 또는 NCIMB 41818 하에 기탁되어 있는 페퍼 식물; 또는 NCIMB 41817 또는 NCIMB 41818 종자 기탁물로부터 유도되거나/이로부터 유도가능하거나/이로부터 획득되거나/이로부터 획득가능한 페퍼 식물, 예를 들어 VE427^RB-저항성을 유지하는 그의 F₁-잡종 유도체이다. 따라서, 한 측면에서, VE427^RB-저항성을 포함하는 본 발명에 따른 페퍼 식물은 종자가 등록 번호 NCIMB 41817 또는 NCIMB 41818 하에 기탁된 식물을 또 다른 페퍼 식물과 교배시킴으로써 획득가능하거나/획득된다.

바람직한 실시양태에서, VE427^RB에 대한 저항성을 제공하는 유전자이입 단편은, 여전히 Tsw-저항성 파괴 TSWV 균주-저항성, 예컨대 Ve427^RB-저항성을 부여하는 NCIMB 41817 및/또는 NCIMB 41818에서 발견된 단편보다 더 짧은 단편일 수 있다. 더 짧은 유전자이입 단편을 포함하는 페퍼 식물은 NCIMB 41817 또는 NCIMB 41818과 교배시키고 Ve427^RB-저항성을 유지하는 재조합 자손을 선택함으로써 생산될 수 있다. 예를 들어, NCIMB 41817 또는 NCIMB 41818을 유전자이입 단편이 결여된 페퍼 식물과 교배시켜 F1 식물을 생성하고, F1을 자가교배시켜 F2 세대 (또는 임의의 추가 세대)를 생산하고, 예를 들어 본원에 기재된 저항성 검정을 이용하여 Ve427^RB-저항성인 식물에 대해 F2 세대를 스크리닝할 수 있다. 이어서, 더 짧은 유전자이입 단편을 포함하는 재조합 식물을 표준 방법, 예를 들어 분자 마커 또는 FISH (형광 계내 혼성화)를 이용하여 확인할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 페퍼 식물의 과실 또는 이러한 페퍼 과실의 과육, 즉 과실의 비-번식 부분을 지칭한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 페퍼 식물의 페퍼 과실은 발아가능한 종자를 갖는 반면, 또 다른 실시양태에서, 과실은 단지 발아가능하지 않은 종자만을 포함하거나 또는 무종자 (단위결실성)이다.

본 발명의 한 실시양태는, 심지어 세포 조직 배양 조건 하에서도 번식에 적합하지 않은 수확된 과실의 조직 또는 식물 세포를 지칭한다. 본 발명에 따른 식물의 페퍼 과실은 당업계에 공지된 넓은 범위의 다양한 유형으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 페퍼 과실은 하기 유형: 벨 (뭉툭함), 카이엔, 라무요 유형 (길고 뭉툭함), 둘세 이탈리아노(dulce italiano), 코니칼(conical), 카피아(capia), 스위트 찰스턴(sweet charleston), 돌마(dolma), 체리(cherry), 할라페뇨(jalapeno), 샤키라(shakira), 펜슬(pencil) 또는 핫 찰스턴(hot Charleston), 시브리(Sivri) (예를 들어, 데므레(Demre) 시브리 또는 카잔리(Kazanli) 시브리), 헝가리안 왁스(Hungarian wax), 카프야/플로리니스(Kapya/Florinis), 바나나(banana), 프레스노(Fresno), 세라노(Serrano), 앤초(Ancho), 애너하임(Anaheim), 파실라(Pasilla), 산타페(Santa Fe), 스카치 보닛(Scotch bonnet), 하바네로(Habanero)를 가질 수 있다. 다양한 유형의 페퍼의 일부 예시적이지만 비제한적인 묘사는 문헌 [Bosland et al. (1996)]에 개시되었다. 과실은 또한 임의의 색상의 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기재된 바와 같은 VE427^RB-저항성 식물의 종자, 또는 본원에 기재된 바와 같은 VE427^RB-저항성 식물이 성장할 수 있는 종자를 지칭한다.

추가 실시양태는 또 다른 캅시쿰 식물과의 교배에서의 친으로서의 본 발명에 따른 캅시쿰 식물의 용도에 관한 것이다. 또한, VE427^RB-저항성을 포함하는 다른 캅시쿰 식물을 생성하는 방법이 제공되는데, 즉 본 발명에 따른 식물로부터 (예를 들어, 본원에서 기탁된 종자 또는 그의 자손으로부터) 다른 캅시쿰 식물 내로 VE427^RB-저항성을 부여하는 유전자이입 단편을 이동시키거나, 또는 PA2638로부터 재배 캅시쿰 식물 내로 VE427^RB-저항성을 부여하는 QTL을 포함하는 게놈 DNA 단편을 이동시키는 것이다.

또 다른 측면은 VE427^RB-저항성 부여 QTL 또는 그의 VE427^RB-저항성 부여 부분을 포함하는 유전 요소를 포함하는 본 발명에 따른 식물의 식물 세포를 지칭한다. 한 실시양태에서, 이러한 식물 세포는 재생가능한 세포인데, 즉 이들은 VE427^RB-저항성인 전체 페퍼 식물로 재생될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 세포는 재생가능하지 않다. 추가 측면에서, 본 발명의 식물의 세포를 포함하거나 또는 이로 이루어진 시험관내 세포 배양물 또는 시험관내 조직 배양물이 제공된다. 세포 및 조직은 화분, 씨방, 배아, 잎, 줄기, 배축, 자엽, 과실 일부, 분열조직, 또는 VE427^RB-저항성을 부여하는 유전 요소를 포함하는 다른 세포/조직일 수 있다. 또한, 재생된 식물이 제공된다.

Tsw-저항성 파괴 균주, 예컨대 VE427^RB에 대한 식물의 저항성은 다양한 방법, 예컨대 본원에 개시된 VE427^RB-저항성 검정에 의해 시험될 수 있다. 본원에 기재된 VE427^RB-저항성 검정은 야생형 (WT; P0) 및 저항성 파괴 (RB) 병원형 (P1)에 대한 저항성을 결정하기에 마찬가지로 적합한데, 즉 이는 VE427^RB에 대한 저항성을 결정하는 것에 제한되지 않고, 다른 Tsw-저항성 파괴 균주를 확인하고 다른 P1 병원형에 대한 신규 저항성 공급원을 확인하는데 이용될 수 있다. 본원에 기재된 다양한 실시양태에서, VE427^RB는 따라서 Tsw-유전자를 포함하는 캅시쿰 식물에서 전체적 증상을 유발하는 다른 Tsw-저항성 파괴 균주에 의해 대체될 수 있다. 이러한 실시양태는 동등하게 본 발명의 실시양태인 것으로 이해된다.

저항성 검정

본 발명에 따른 VE427^RB 저항성을 부여하는 유전자이입 단편을 포함하는 캅시쿰 식물을 확인하고/거나 선택하기 위해, 하기 저항성 검정 또는 대안적 검정이 이용될 수 있다. 실시예에서 사용된 검정, 및 식물 계통 또는 품종이 본 발명에 따른 VE427^RB 저항성 부여 유전 요소를 포함하는지의 여부를 결정할 수 있는 검정이 하기에 기재되어 있다. 당업자는, 예를 들어 P1 병원형 (바람직하게는, VE427^RB)으로의 밭 감염에 기반하거나, 보독 곤충 전염 P1에 기반하거나, 또는 다양한 인위적 접종 검정에 기반하여 개시된 검정을 동등하게 변형시키거나 또는 다양한 검정을 개발할 수 있다. 이용되는 검정은 바람직하게는, 예를 들어 민감성 대조 식물이 전체적 증상을 나타내는 반면에, 예를 들어 하부 잎의 감염 또는 접종 후의 전체적 증상 (또는 바이러스 입자의 전체적 존재)의 (본질적) 부재를 통해 저항성 부여 유전 요소 (예를 들어, 유전자이입 단편)를 포함하는 캅시쿰 식물을 확인할 수 있어야 한다. 물론, 다양한 검정은 식물이 저항성인지 또는 민감성인지의 여부를 결정하는 다양한 방식을 이용할 수 있지만, 검정이 무엇이든지, 식물이 본원에 기재된 VE427^RB 저항성 검정에서 (재)시험되고 이들이 본 발명의 검정에 따른 VE427^RB 저항성을 포함하는 것으로 결정되는 경우에, 이들은 본 발명에 따른 VE427^RB 저항성 부여 유전 요소를 포함한다.

병원형 접종물의 제조

병원형, 예컨대 P0 또는 P1은 액체 질소 중의 감염된 엔. 벤타미아나(N. benthamiana) 잎 또는 잎 수액으로서 장기간 저장될 수 있거나/저장되었다.

페퍼 계통의 인위적 접종 시험에 사용하기 전에, 어떠한 TSWV 저항성 유전자도 보유하지 않는 민감성 식물, 예컨대 엔. 벤타미아나 또는 캅시쿰 식물을 병원형으로 감염시켜 상기 병원형의 활성을 체크할 수 있거나/체크하였다 (예를 들어, 5개 이상의 식물을 감염시킬 수 있거나/감염시켰음). 음성 대조군으로서, 저항성 식물을 임의로 마찬가지로 감염시킬 수 있다 (예를 들어, P1의 경우에는 NCIMB 41817 및 NCIMB 41818 및 NCIMB 41936 기탁물의 캅시쿰 아눔 식물, 및 P0의 경우에는 Tsw 유전자를 갖는 캅시쿰 식물).

접종물의 활성은 민감성 식물이 전체적 증상을 나타내는 경우에 확인된다. 이들 식물의 증후성 잎 (잎에서의 황색 반점형성에 의해 확인됨)은 시험될 페퍼 계통의 접종에 사용될 수 있거나/사용되었다. 전자 현미경검사를 이용하여 다른 바이러스의 존재를 배제할 수 있거나/배제하였다.

본 발명에 따른 TSWV-저항성 검정

본 발명에 따른 TSWV-저항성 검정 (예컨대, VE427^RB- 또는 P0-저항성 검정, 또는 또 다른 P1 저항성 검정)에서는, 하나 이상의 TSWV 병원형에 대한 저항성에 대해 시험될 식물 계통 또는 품종의 다수의 식물을 다수의 대조 식물과 동일한 조건 하에 파종하고 성장시킨다. 병원형은, 예를 들어 P1 (대표적인 샘플이 등록 번호 DSM24829 하에 DSZM에 기탁되어 있는 VE427^RB) 또는 P0 (야생형 TSWV 균주, 예를 들어 Tsw-유전자를 갖는 식물, 예컨대 씨. 키넨세 PI152225가 저항성인 TSWV 균주; 이러한 야생형 균주는, 예를 들어 그의 S-절편 서열 (진뱅크 등록 번호: DQ376178)에 의해 확인될 수 있는 p105^WT임)이다. 일반적으로, 병원형당 적어도 5개 이상, 적어도 10개 이상, 적어도 12개 이상, 적어도 15개 이상, 적어도 20개 이상의 식물 (시험 식물)을 파종하고, 이들이 2개의 자엽 및 5 내지 6개의 본엽을 가질 때까지 성장시킨다. 성장 조건은, 예를 들어 약 14시간의 광주기로 26℃/18℃ 낮/밤에서 충분한 물 공급을 갖는 온실 내이다. 광원은, 예를 들어 필립스(Philips) SON-T 400 소듐 램프, 광합성적 활성 방사선 120 μmol*초^-1*m^-2 μ[PAR]이다. 성장 배지는, 예를 들어 토양, 예컨대 절반의 잔디 및 절반의 피트이다. 동일한 조건을 실시예에서의 VE427^RB-저항성 검정 동안 이용하였다. 당업자는 페퍼 식물에 대한 성장 조건을 잘 인지하고 있다. 동일한 성장 조건을 이용하여, 대조 식물도 또한 성장시켰다. 일반적으로, 대조 식물은 2개의 카테고리: 특정 병원형에 대해 저항성인 식물, 예컨대 병원형 P0 또는 P1에 대해 저항성인 식물, 및 상기 특정 병원형에 대해 민감성인 것으로 공지되어 있는 식물로 분할될 수 있다. 당업자는, 바람직하게는 대조 식물의 카테고리가 둘 다 저항성 검정의 일부여야 함을 이해할 것이다. 각각의 검정에서, 대조 식물의 일부를 완충제 및 관심 병원형의 혼합물로 처리하고, 대조 식물의 일부를 완충제 단독으로 처리하였다. 완충제 단독으로 접종한 대조 식물은 검정의 종료시 무증상으로 남아 있어야 하는데, 즉 이들 식물은 바이러스 감염의 국부 증상도 또는 전체적 증상도 나타내지 않아야 한다.

일반적으로, 2개의 자엽 및 5 내지 6개의 본엽을 갖는 식물의 2개의 가장 어리지만 완전히 발달한 잎에 최초로 기계적으로 접종하였다 (예를 들어, 엽편 상에 접종물, 즉 완충제 및 병원형의 혼합물을 분무함으로써). 예를 들어 5일 후, 접종된 잎의 제2 기계적 접종을 수행하였다.

시험될 식물의 2개의 가장 어린 잎의 접종을 위해, 감염된 엔. 벤타미아나 잎을 액체 질소 중에서 동결시키고, 분말로 분쇄하고, 예를 들어 잎 분말 1 g을 폴(Paul) 완충제 (포스페이트 완충제 0.05 M pH 7, DIECA (소듐 디에틸디티오카르바메이트 3수화물) 0.005 M, EDTA-Na₂ 0.001 M, 소듐 티오글리콜레이트 0.005 M) 5 ml와 혼합하였다. 임의로, 완충제는 접종되지 않은 잎과 비교하여 접종된 잎을 활성 탄소 잔해에 의해 유발된 그의 더 어두운 색상에 의해 표시하기 위해 착색제, 예컨대 활성 탄소 분말을 함유할 수 있다. 혼합물은, 예를 들어 접종될 잎에 분무할 수 있거나/분무하였다.

음성 대조군으로서, 2개의 자엽 및 5 내지 6개의 본엽을 갖는 대조 식물의 2개의 가장 어리지만 완전히 발달된 잎에 완충제 단독을 기계적으로 접종할 수 있거나/접종하였다.

식물은 식물의 상부의 접종되지 않은 잎이 특정 바이러스 균주로의 최초 접종 28일 후에 바이러스 유발된 증상 (황색 반점형성)의 징후를 본질적으로 갖지 않은 경우에, 즉 이들 식물이 전체적 증상을 본질적으로 나타내지 않는 경우에 저항성으로 간주하였다. 시험 및 대조 식물의 접종된 잎에서의 증상 및 상부의 접종되지 않은 잎에서의 전체적 증상의 최초 관찰은, 예를 들어 5, 6 또는 7일 후에 각각의 식물에 대해 평가할 수 있거나/평가하였다. 제2 관찰은, 예를 들어 12, 13 또는 14일 후에 평가할 수 있다. 제3 관찰은, 예를 들어 28, 29 또는 30일 후에 평가할 수 있다. 상부의 접종되지 않은 잎은 단지 최초 접종의 시점 이후의 단계에서 식물에 의해 완전히 발달된 것임에 주목한다.

한 실시양태에서, 각각의 카테고리 내의 대조 식물 (예를 들어, 병원형으로 처리되거나 또는 완충제 단독으로 처리된 민감성 대조 식물, 및/또는 병원형으로 처리되거나 또는 완충제 단독으로 처리된 저항성 대조 식물)의 수는 저항성 검정에서의 시험 식물의 양과 비교하여 적어도 5%, 10%, 25%, 50%이지만, 저항성 검정에서의 대조 식물의 각각의 카테고리 내의 식물의 수는 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 5개, 또는 적어도 10개이거나; 또는 대조 식물의 수는 저항성 검정에서의 시험 식물의 양과 동일하다. 한 실시양태에서, 시험당 적어도 2벌 이상의 복제를 수행한다. 한 실시양태에서, 동일한 계통/품종의 시험된 식물의 양은 카테고리당 적어도 5, 6, 10, 12, 15 또는 20개의 시험 식물 (병원형으로 처리되거나 또는 완충제 단독으로 처리된 시험 식물)이다.

분석

VE427^RB 저항성 검정에서는, VE427^RB가 병원형으로서 사용되었다. 마찬가지로, P0 저항성 검정에서는, P0, 예컨대 p105^WT 또는 Ve430^WT가 병원형으로서 사용되었다.

시험 식물은, (각각 VE427^RB 또는 P0으로의 잎 접종 후에) 상부의 접종되지 않은 잎에서의 전체적 증상을 본질적으로 나타내지 않는 경우에 각각 "VE427^RB에 대한 저항성" 또는 "P0에 대한 저항성"으로 카테고리화될 수 있는 반면, 민감성 대조 식물(들)에서는, 예를 들어 본원에 기재된 검정 조건 또는 동등한 검정 조건 하에 상부의 접종되지 않은 잎에서의 전체적 증상이 나타난다.

"전체적 증상"은 TSWV로 접종되지 않은 잎, 바람직하게는 상부 잎에서 나타나는 TSWV 증상, 특히 황색 반점형성을 지칭한다.

"국부 증상"은 TSWV로 접종된 (및 임의로는, 예를 들어 탄소 분말에 의해 표시된) 잎에서 나타나는 TSWV 증상, 특히 괴사성 병변을 지칭한다.

본원에 기재된 바와 같은 검정에서 식물 계통 또는 품종의 "전체적 증상이 본질적으로 없음"은, 모든 민감성 대조 식물이 전체적 증상을 나타내는 반면, 식물 계통 또는 식물 품종의 시험된 식물의 대부분, 즉 적어도 60%가 상부의 접종되지 않은 잎에서 (바이러스 유발된) 전체적 황색 반점형성 (황백화)의 어떠한 징후도 나타내지 않는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 시험된 식물의 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98% 또는 심지어 100%는 상부의 접종되지 않은 잎에서 (바이러스 유발된) 전체적 황색 반점형성 (황백화)의 어떠한 징후도 나타내지 않는다.

"황색 반점형성"은 당업자에게 공지되어 있는 페퍼에서의 TSWV의 전체적 감염의 전형적 증상이다. "황색 반점형성"은 황색 반점/점/영역의 영역을 지칭한다.

본원에 사용된 "괴사성 병변"은 접종된 잎에서 괴사가 발생하는 작고 어두운 영역이다.

따라서, 한 실시양태에서, 전체적 증상을 본질적으로 나타내지 않는 (즉, 접종되지 않은 상부 잎에 황색 반점형성이 없는) 시험 식물은 완충제 단독으로 접종한 대조 식물과 비교시 접종된 잎에서 괴사성 병변을 본질적으로 나타낸다. 이는 병원형에 대한 저항성 식물의 국부 반응이다. "국부 괴사성 병변을 본질적으로 보여주거나 / 나타내는" 식물은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 92%, 93%, 95%, 98%, 99% 또는 100%가, 예를 들어 인위적 접종 약 28일 후에 접종된 잎에서 괴사성 병변을 보여주는 것을 지칭한다.

그러나, 당업자는 본원에 기재된 저항성 검정 조건 하에서의 상부의 접종되지 않은 잎에서의 바이러스의 존재/부재 (완충제 단독으로 접종되거나 또는 특정 병원형, 예를 들어 Ve427^RB에 대해 저항성인 것으로 공지되어 있는 대조 식물과 비교시)가, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 VE427^RB-저항성 또는 P0-저항성 검정의 대상체인 식물의 상부의 접종되지 않은 잎에서의 바이러스의 NSs 단백질의 존재 (또는 부재)에 기반한 ELISA (효소 결합 면역-흡착 검정)를 이용함으로써 또한 또는 대안적으로 결정될 수 있음을 인지한다. 따라서, 전체적 증상의 존재/부재 (및 저항성의 존재/부재)를 평가하기 위한 대안적 또는 추가의 방식은 TSWV 바이러스 입자가 상부의 접종되지 않은 잎에서 발견될 수 있는지의 여부를 시험하는 것이다.

Ve427^RB-저항성 캅시쿰 식물의 생산

야생 캅시쿰으로부터의 유전자이입 단편 (예를 들어, PA2638 또는 다른 Ve427^RB-저항성 야생 캅시쿰 식물로부터 획득가능함)에 의해 부여된 Ve427^RB-저항성을 포함하는 캅시쿰 식물은 다수의 방법에 의해 생성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 캅시쿰 식물은 비-트랜스제닉 방법, 바람직하게는 육종 방법, 예컨대 교배, 자가교배, 역교배, 이중 반수체 생산, 배아 회생, 마커 보조 육종, 원형질체 융합 등, 또는 그의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의해 생성된다.

본 발명은 또한, 상기 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 공여자 페퍼 식물에서의 Ve427^RB에 대한 저항성을 부여하는 정량적 저항성 유전자좌 (QTL)의 존재를 검출하는 방법을 수행하는 단계, 및 하나 이상의 QTL 또는 그의 Ve427^RB-저항성 부여 부분을 포함하는 유전 요소 / 핵산 서열을 상기 공여자 식물로부터 Ve427^RB-민감성 수용자 캅시쿰 식물로 이동시키는 단계를 포함하는, Ve427^RB저항성 캅시쿰 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 핵산 서열의 이동은 본원에 앞서 기재된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.

한 실시양태에서, Ve427^RB-저항성 캅시쿰 식물을 확인하는 방법은

a) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 Ve427^RB-저항성 검정을 수행함으로써 캅시쿰 식물 또는 계통 또는 품종을 Ve427^RB-저항성에 대해 스크리닝하고,

b) Ve427^RB 감염 후에 전체적 증상을 나타내지 않는 캅시쿰 식물 또는 계통 또는 품종을 확인하는 것

을 포함한다.

이어서, 확인된 식물 계통 또는 품종은 Ve427^RB-저항성 캅시쿰 식물 (바람직하게는, 씨. 아눔), 바람직하게는 우수한 작물 특성을 갖고 Ve427^RB-저항성 QTL(들)을 포함하는 재배품종 또는 품종을 생성하기 위해, 예를 들어 역교배 기법 또는 따른 전통적 육종 기법에 추가로 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, Ve427^RB-저항성 캅시쿰 식물을 확인하는 방법은

a) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 Ve427^RB-저항성 검정을 수행함으로써 캅시쿰 식물 또는 계통 또는 품종을 Ve427^RB-저항성에 대해 스크리닝하고,

b) Ve427^RB 감염 후에 전체적 증상을 나타내지 않는 캅시쿰 식물 또는 계통 또는 품종을 확인하고,

c) 상기 확인된 식물 또는 계통 또는 품종을 또 다른 캅시쿰 식물, 예를 들어 Ve427^RB-저항성이 결여된 식물과 교배시켜 F1 식물을 생산하고,

d) F1 식물을 1회 이상 자가교배 및/또는 교배 (예를 들어, 역교배)시켜 Ve427^RB-저항성을 포함하는 자손 캅시쿰 식물을 생산하는 것

을 포함한다.

단계 a)에서, 캅시쿰 식물 계통 또는 품종은 한 실시양태에서 야생 캅시쿰 식물일 수 있거나, 또는 이는 재배 캅시쿰 식물일 수 있다. 한 실시양태에서, 단계 a)의 식물은 자손 식물이 Ve427^RB-저항성을 포함하는 NCIMB 41817, NCIMB 41818 및 NCIMB41936 하에 기탁된 식물로부터 선택된 식물 또는 그의 자손이다.

단계 b)에서, 식물은 Ve427^RB 감염된 식물의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 92%, 93%, 95%, 98%, 99% 또는 100%가 전체적 증상을 나타내지 않는 경우에 Ve427^RB-저항성을 포함하는 것으로 확인될 수 있다. 단계 c)에서, Ve427^RB-저항성이 도입되는 식물은 바람직하게는 재배 캅시쿰 식물, 바람직하게는 Ve427^RB-저항성이 결여된 엘리트 육종 계통 또는 품종이다. 임의로는, 상기 식물은 Tsw-저항성을 포함하므로, 단계 d)에서 발생된 자손 식물은 우성 Tsw 저항성 유전자 및 Ve427^RB-저항성을 부여하는 유전 요소를 둘 다 포함한다. Tsw 저항성을 포함하는 식물은, 예를 들어 분자 마커 분석에 의해, 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 저항성 검정 또는 임의의 다른 검정에서 확인될 수 있고, 이에 의해 캅시쿰 식물은 야생형 TSWV 균주 (병원형 P0), 예컨대 p105WT 등에 대해 저항성 (즉, 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같은 TSWV 저항성 검정에서 전체적 증상을 나타내지 않음)이다.

단계 d)에서, 자손 식물에서의 Ve427^RB-저항성을 부여하는 유전 요소의 존재는 다양한 방법 (예컨대, Ve427^RB-저항성 검정 또는 유사한 검정, Ve427^RB 균주가 발견된 지역에서의 현장 시험 등)에 의해 확인될 수 있다. 임의로는 또한 Tsw 유전자의 존재는 마커 및/또는 TSWV 저항성 검정에 의해 확인될 수 있다.

또 다른 실시양태는 하나의 캅시쿰 식물로부터 Ve427^RB-저항성이 결여된 또 다른 캅시쿰 식물 내로 Ve427^RB-저항성을 이동시키는 방법을 제공한다. 방법은 상기 식물을 교배시킴으로써 유전자이입 단편을 Ve427^RB-저항성 공여자 캅시쿰 식물로부터 Ve427^RB-민감성 수용자 캅시쿰 식물 내로 이동시키는 것을 포함한다. 상기 이동은 따라서 전통적 육종 기술을 이용함으로써 적합하게 달성될 수 있다. Ve427^RB-저항성-부여 QTL을 포함하는 유전자이입 단편은 바람직하게는 마커-보조 선택 (MAS)을 이용함으로써 상업적 캅시쿰 계통 또는 품종 내로 유전자이입된다. 마커-보조 육종 또는 마커-보조 선택은 목적하는 형질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 함유하는 자손 식물의 확인 및 선택을 위한 하나 이상의 분자 마커의 사용을 포함한다. 본 발명의 경우에, 이러한 확인 및 선택은 본 발명의 QTL 또는 그와 연관된 마커 또는 유전자이입 단편과 연관된 마커 (즉, 유전자이입 단편에 대해 특이적인 마커)의 선택에 기반한다.

MAS는 또한 각각의 QTL 효과의 보다 상세한 연구를 허용하는 관심 QTL을 보유하는 근동질유전자 계통 (NIL)을 개발하는데 사용될 수 있고, 또한 역교배 근친교배 계통 (BIL) 집단의 개발을 위한 유효한 방법이다. 이러한 실시양태에 따라 개발된 캅시쿰 식물은 수용자 식물로부터 그의 형질의 대부분을 유리하게 유도할 수 있고, 공여자 식물로부터 Ve427^RB-저항성을 유도할 수 있다. 상기 간단히 논의된 바와 같이, 전통적 육종 기법을 이용하여 Ve427^RB저항성을 코딩하는 핵산 서열을 Ve427^RB-민감성 수용자 캅시쿰 식물 내로 유전자이입시킬 수 있다. 계통 육종으로 지칭되는 한 방법에서, Ve427^RB에 대한 저항성을 나타내고 Ve427^RB-저항성을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 공여자 캅시쿰 식물을, 바람직하게는 상업적으로 바람직한 특징, 예컨대 비제한적으로 질환 저항성, 곤충 저항성, 가치 있는 과실 특징 등을 나타내는 Ve427^RB민감성 수용자 캅시쿰 식물과 교배시킨다. 이어서, 생성된 식물 집단 (F₁ 잡종으로 표시)을 자가-수분시키고, 파종한다 (F₂ 종자). 이어서, F₂ 종자로부터 성장한 F₂ 식물을 Ve427^RB에 대한 저항성에 대해 스크리닝한다. 다르게는 또는 추가로, 하나 이상의 추가 세대, 예컨대 F3, F4 또는 BC1 또는 BC2 세대를 Ve427^RB-저항성에 대해 스크리닝할 수 있다. 집단을, 예를 들어 본원에 기재된 저항성 검정 또는 대안적 저항성 검정에 따라 스크리닝할 수 있고/거나, 예를 들어 저항성 검정으로부터 획득된 결과를 확인하기 위해 마커-보조 선택을 이용할 수 있고, 따라서 여러 방법을 또한 조합하여 이용할 수 있다.

근친교배 Ve427^RB-저항성 캅시쿰 식물 계통은 순환 선택 및 역교배, 자가교배 및/또는 이성반수체 또는 친 계통을 만드는데 사용되는 임의의 다른 기술을 이용하여 개발될 수 있다. 순환 선택 및 역교배의 방법에서, 반복친을 반복친과 상이하고 본원에서 "비-반복친"으로 지칭되는 제1 공여자 식물과 교배시킴으로써 Ve427^RB-저항성을 표적 수용자 식물 (반복친) 내로 유전자이입시킬 수 있다. 반복친은 Ve427^RB에 대해 비-저항성이거나 또는 낮은 수준의 저항성을 갖는 (예를 들어, 본 발명에 따른 검정에서 적어도 10개의 식물 중 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%가 Ve427^RB로의 접종 후에 전체적 증상을 나타내는) 식물이고, 상업적으로 바람직한 특징, 예컨대 비제한적으로 (추가의) 질환 저항성, 곤충 저항성, 가치 있는 과실 특징 등을 보유한다. 비-반복친은 반복친과 타가-수정되는 임의의 식물 품종 또는 근친교배 계통일 수 있다. 반복친과 비-반복친 사이의 교배로부터 생성된 자손을 반복친과 역교배시킨다. 이어서, 생성된 식물 집단을 목적하는 특징에 대해 스크리닝하는데, 이 스크리닝은 다수의 다양한 방식으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 표현형적 병리상태 스크리닝, 예컨대 본원에 기재된 저항성 검정, Ve427^RB를 사용한 당업계에 공지된 바와 같은 정량적 생물검정 및/또는 마커-보조 선택 (MAS)을 이용하여 집단을 스크리닝할 수 있다.

예를 들어, 열성 유전자좌를 유전자이입시키는 경우에 그 유전자좌에 의해 부여되는 표현형은 단지 유전자좌에 대해 동형접합인 식물이 형성되는 조건 하의 자손 식물에서만 발현될 것임을 명심하여야 한다.

일반적으로, 목적하는 형질, 예컨대 Ve427^RB-저항성을 잡종 캅시쿰 품종 내로 도입시키는 방법은

(a) 근친교배 캅시쿰 친을 하나 이상의 목적하는 형질을 포함하는 또 다른 캅시쿰 식물과 교배하여 F_l 자손 식물을 생산하고 (여기서, 하나의 목적하는 형질은 Ve427^RB-저항성임), F₁ 자손 식물을 1회 이상 자가교배시켜 F2, 또는 F3, 또는 추가 세대를 생산하는 단계;

(c) 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 TSWV 저항성 검정을 이용하여 목적하는 형질을 갖는 식물을 상기 F₂ 또는 F3 또는 추가 세대 자손 식물로부터 선택하는 단계;

(d) 임의로는, 선택된 자손 식물을 상기 근친교배 캅시쿰 친 식물과 역교배하여 역교배 자손 식물을 생산하는 단계;

(e) 임의로는, 목적하는 형질 및 상기 근친교배 캅시쿰 친 식물의 형태학적 및 생리학적 특징을 갖는 역교배 자손 식물을 선택하는 단계 (여기서, 상기 선택은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 저항성 검정을 포함함);

(f) 임의로는, 단계 (d) 및 (e)를 연속하여 2회 이상 반복함으로써, 선택된 제3 세대 이상의 역교배 자손 식물을 생산하는 단계;

(g) 임의로는, 동형접합 식물을 확인하기 위해, 선택된 역교배 자손을 자가교배시키는 단계;

(h) 임의로는, 상기 역교배 자손 또는 자가교배된 식물 중 적어도 하나를 또 다른 근친교배 캅시쿰 친 식물과 교배시켜, 동일한 환경 조건에서 성장하는 경우에 목적하는 형질 및 잡종 캅시쿰 품종의 형태학적 및 생리학적 특징 모두를 갖는 잡종 캅시쿰 품종을 생성하는 단계

를 포함한다.

나타낸 바와 같이, Ve427^RB-저항성을 포함하는 동형접합 형태의 순계 육종 (근친교배) 자손을 제공하기 위해 마지막 역교배 세대를 자가교배시킬 수 있다. 따라서, 순환 선택, 역교배 및 자가교배의 결과는, Ve427^RB저항성과 연관된 유전자 뿐만 아니라 상업적 관심 형질과 연관된 다른 유전자에 대해 유전적으로 상동성인 계통의 생산이다.

생성된 F1 잡종 캅시쿰 식물은 Ve427^RB-저항성을 부여하는 동형접합 또는 이형접합 형태의 유전 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, F1 잡종이 Ve427^RB-저항성을 부여하는 유전 요소를 동형접합 형태로 포함하도록, 각각 우수한 작물 특징을 갖고 각각 Ve427^RB-저항성을 부여하는 동형접합 형태의 유전 요소를 포함하는 2개의 근친교배 친 계통이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, F1 잡종이 Ve427^RB-저항성을 부여하는 유전 요소를 이형접합 형태로 포함하도록, 각각 우수한 작물 특징을 갖지만 단지 하나의 근친교배 친 계통만이 Ve427^RB-저항성을 부여하는 유전 요소를 동형접합 형태로 포함하는 반면에 다른 하나는 Ve427^RB-저항성을 부여하는 유전 요소가 결여되어 있는 2개의 근친교배 친 계통이 제공된다. 바람직하게는, 근친교배 친 계통 (및 F1 잡종)은 캅시쿰 아눔 엘. 종의 것이고, 우수한 품질의 페퍼 과실을 생산한다. 한 실시양태에서, 페퍼 과실은 벨 페퍼이지만, 임의의 다른 과실 형상/유형 및 임의의 색상이 제공될 수 있다.

따라서, Ve427^RB-저항성을 부여하는 유전 요소를 포함하는 F1 잡종 페퍼 생산에서의 친으로서의 캅시쿰 식물, 바람직하게는 캅시쿰 아눔 식물의 용도가 제공된다. 한 실시양태에서, 유전 요소는 NCIMB 41817, NCIMB 41818 및 NCIMB41936으로부터 선택된 등록 번호 하에 기탁된 종자, 또는 그의 자손으로부터 획득되고, 여기서 자손 식물은 Ve427^RB-저항성을 포함한다.

본원에 기재된 임의의 식물의 종자, 특히 본원에 상기 기재된 F1 잡종이 성장할 수 있는 종자 및/또는 Ve427^RB-저항성을 포함하는 근친교배 씨. 아눔이 성장할 수 있는 종자가 또한 제공되고, 여기서 저항성은 등록 번호 NCIMB 41817, NCIMB 41818 및/또는 NCIMB41936하에 기탁된 종자에서 발견되는 바와 같은 저항성인데; 즉, 여기서 Ve427^RB-저항성은 상기 종자로부터 획득되거나/획득될 수 있다.

식물 육종의 목표는 단일 품종에서 다양한 바람직한 형질을 조합하는 것이다. 상업적 작물의 경우에, 이들 형질은 질환 및 곤충에 대한 저항성, 열 및 가뭄에 대한 허용성, 작물 성숙에 소요되는 시간 단축, 보다 많은 수확량, 및 보다 우수한 작물 품질, 과실 균일성 등을 포함할 수 있다. 발아 및 스탠드 확립, 성장 속도, 성숙도 및 식물 높이와 같은 식물 특징의 균일성도 또한 중요할 수 있다.

상업적 작물은 식물 수분 방법의 이점을 취하는 기술을 통해 육종된다. 한 꽃으로부터의 화분이 동일한 식물의 동일한 꽃 또는 또 다른 꽃으로 이동되는 경우에, 식물은 자가-수분된다. 동일한 가계 또는 계통 내의 개체들이 수분에 사용되는 경우에, 식물은 동계 수분된다. 화분이 상이한 가계 또는 계통으로부터의 상이한 식물의 꽃으로부터 오는 경우에, 식물은 타가-수분된다. 다수의 세대 동안 자가-수분되고 유형에 대해 선택된 식물은 거의 모든 유전자좌에서 동형접합이 되고, 순수 육종 자손의 균일한 집단을 생산한다. 2개의 상이한 동형접합 계통 사이의 교배는 다수의 유전자좌에 대해 이형접합일 수 있는 잡종 식물의 균일한 집단을 생산한다. 각각 다수의 유전자좌에서 이형접합인 2개의 식물의 교배는 유전적으로 상이하고 균일하지 않은 이종 식물의 집단을 생산할 것이다.

캅시쿰 식물 육종 프로그램에서의 잡종 페퍼 품종의 개발은 (1) 초기 육종 교배에 대해 다양한 생식질 풀로부터의 식물을 선택하는 단계; (2) 여러 세대 동안의 육종 교배로부터 선택된 식물을 자가교배시켜 개별적으로 순종을 생성하고 고도로 균일한 일련의 근친교배 계통을 생산하는 단계; (3) 선택된 근친교배 계통을 무관한 근친교배 계통과 교배하여 잡종 자손 (F₁)을 생산하는 단계의 3단계를 포함한다. 충분한 양의 근친교배 후, 연속 후손 세대는 단순히 개발된 근친교배체의 종자를 증가시키는 역할을 할 것이다. 바람직하게는, 근친교배 계통은 그의 유전자좌의 약 95% 이상에서 동형접합 대립유전자를 포함하여야 한다.

근친교배 계통의 동형접합성 및 동질성의 중요한 결과는 규정된 근친교배 쌍을 교배시킴으로써 생성된 잡종이 항상 동일할 것이라는 점이다. 일단 탁월한 잡종을 생성하는 근친교배체가 확인되면, 이들 근친교배 친을 이용하여 잡종 종자의 계속되는 공급이 이루어질 수 있고, 이어서 상기 잡종 종자 공급물로부터 잡종 캅시쿰 식물이 생성될 수 있다.

본 발명의 측면은 본 발명의 방법에 의해 획득가능한 Ve427^RB-저항성 페퍼 식물 또는 그의 일부를 지칭한다. 본 발명의 또 다른 측면은 그의 천연 유전적 배경에는 없는 Ve427^RB-저항성을 부여하는 QTL을 포함하는 Ve427^RB-저항성 캅시쿰 식물 또는 그의 일부에 관한 것이다. 본 발명의 Ve427^RB-저항성 페퍼 식물은 임의의 유전적 유형, 예컨대 근친교배, 잡종, 반수체, 이성반수체 또는 트랜스제닉의 것일 수 있다. 추가로, 본 발명의 식물은 Ve427^RB 저항성 형질에 대해 이형접합 또는 동형접합, 바람직하게는 동형접합일 수 있다. 본 발명의 QTL, 뿐만 아니라 그의 저항성-부여 부분은 Ve427^RB-저항성 캅시쿰 식물을 제공하기 위해 임의의 캅시쿰 식물로 이동될 수 있지만, 본 발명의 방법 및 식물은 바람직하게는 캅시쿰 아눔 종의 식물에 관한 것이다. 본원에 기재된 Ve427^RB-저항성 근친교배 캅시쿰 계통을 추가의 교배에 사용하여 Ve427^RB-저항성 잡종 식물을 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제1 Ve427^RB-저항성 근친교배 캅시쿰 식물은 상업적으로 바람직한 형질, 예컨대 비제한적으로 질환 저항성, 곤충 저항성, 바람직한 과실 특징, 목적하는 과실 형상 및 과실 크기 등을 보유하는 제2 근친교배 캅시쿰 식물과 교배될 수 있다. 상기 제2 근친교배 캅시쿰 계통은 Ve427^RB-저항성일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 바람직하게는, 상기 제2 근친교배 캅시쿰 계통은 Ve427^RB-저항성이다.

본 발명의 또 다른 측면은 Ve427^RB-저항성 페퍼 식물로 성장할 수 있는 종자를 생산하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 방법은 본 발명의 Ve427^RB-저항성 캅시쿰 식물을 제공하고, 상기 Ve427^RB-저항성 식물을 또 다른 캅시쿰 식물과 교배시키고, 식재시 Ve427^RB-저항성 캅시쿰 식물을 생산하는 상기 교배로부터 생성되는 종자를 수집하는 단계를 포함한다. 다르게는, 방법은 본 발명의 Ve427^RB-저항성 캅시쿰 식물을 제공하고, 식물을 자가교배시키고, 상기 자가교배로부터 생성되는 종자를 수집하는 단계를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 방법은 본 발명의 Ve427^RB-저항성 캅시쿰 식물을 제공하고, 상기 Ve427^RB-저항성 식물을 캅시쿰 식물과 교배시키고, 상기 교배로부터 생성되는 종자를 수집하고, 상기 종자를 식물로 성장시키고, 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 Ve427^RB-저항성 식물을 선택하고, 선택된 식물을 충분한 수의 세대 동안 자가-수분시켜 식물에서 Ve427^RB-저항성을 부여하는 대립유전자에 대해 고정된 식물을 획득하고, 이에 따라 생산된 식물을 바람직한 표현형 형질을 갖는 캅시쿰 식물과 충분한 수의 세대 동안 역교배시켜 Ve427^RB-저항성이고 바람직한 표현형 형질을 갖는 캅시쿰 식물을 획득하고, 식재시 Ve427^RB-저항성인 캅시쿰 식물을 생산하는 마지막 역교배로부터 생성된 식물로부터 생산된 종자를 수집하는 단계를 포함한다.

Ve427^RB-저항성 캅시쿰 식물을 생산하기 위한 대안적 실시양태에서, 공여자 캅시쿰 식물로부터 수용자 식물로의 핵산의 이동을 위해 원형질체 융합을 이용할 수 있다. 원형질체 융합은 단일 이핵 세포 또는 다핵 세포를 생산하기 위한, 2개 이상의 원형질체 (세포벽이 효소 처리에 의해 제거된 세포) 사이의 유도된 또는 자발적 연합, 예컨대 체세포 혼성화이다. 자연 상태에서는 이종교배될 수 없는 식물 종에 의해서도 획득될 수 있는 융합 세포는, 시험관내에서 배양되고 바람직한 형질 조합을 나타내는 잡종 식물로 재생된다. 보다 구체적으로, 제1 원형질체는 Ve427^RB에 의한 감염에 대해 저항성을 나타내는 캅시쿰 식물 또는 다른 식물 계통으로부터 획득될 수 있다. 제2 원형질체는 제2의 캅시쿰 또는 다른 식물 계통, 바람직하게는 상업적으로 가치 있는 특징, 예컨대 비제한적으로 질환 저항성, 곤충 저항성, 가치 있는 과실 특징 등을 포함하는 캅시쿰 계통으로부터 획득될 수 있다. 이어서, 원형질체를 당업계에 공지된 전통적 원형질체 융합 절차를 이용하여 융합시킨다.

다르게는, 배아 회생이 공여자 식물로부터 수용자 식물로의 본 발명의 QTL 또는 그의 Ve427^RB-저항성-부여 부분을 포함하는 핵산의 이동에 이용될 수 있다. 배아 회생은 식물이 발아가능한 종자를 생산하는데 실패하는 교배로부터 배아를 단리시키는 절차로서 이용될 수 있다. 상기 과정에서, 식물의 수정된 씨방 또는 미성숙 종자를 시험관내에서 배양하고 재생시켜 새로운 식물을 생성한다.

추가로, 각각의 세포 내에 Ve427^RB-저항성을 부여하는 유전 요소를 포함하는 단리된 세포, 시험관내 세포 배양물 및 조직 배양물, 원형질체 배양물, 식물 일부, 수확된 재료 (예를 들어, 수확된 페퍼 과실), 화분, 씨방, 꽃, 종자, 수술, 꽃 일부 등이 제공된다. 따라서, 상기 세포 또는 조직이 전체 캅시쿰 식물로 재생되거나 또는 성장하는 경우에, 식물은 Ve427^RB-저항성을 포함한다.

따라서, 본 발명의 식물의 세포 또는 조직의 시험관내 세포 배양물 및/또는 조직 배양물도 또한 제공된다. 세포 또는 조직 배양물을 발아 및/또는 발근 배지로 처리하여 캅시쿰 식물을 재생시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 식물의 영양 또는 클론 번식이 본원에 포함된다. 다수의 다양한 영양 번식 기술이 존재한다. 꺾꽂이순 (마디, 경정, 줄기 등)이, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 시험관내 배양에 사용될 수 있다. 또한, 다른 영양 번식 기술, 예컨대 접목 또는 고취법이 존재하고, 이용될 수 있다. 고취법에서는, 한 조각의 줄기를 여전히 친 식물에 부착되어 있는 동안 뿌리를 발생시키도록 하고, 일단 충분한 뿌리가 발생하면 클론 식물을 친으로부터 분리시킨다.

따라서, 한 측면에서,

a) 본 발명의 식물의 일부 (예를 들어, 세포 또는 조직, 예를 들어 꺾꽂이순)를 획득하고,

b) 상기 식물 일부를 영양 번식시켜 식물 일부로부터 동일한 식물을 생성하는 것

을 포함하는 방법이 제공된다.

따라서, 클론/영양 번식을 위한 본 발명의 식물의 영양적 식물 일부의 용도도 또한 본 발명의 한 실시양태이다.

또한, Ve427^RB-저항성을 부여하는 유전 요소를 포함하는 다수의 수확된 페퍼 과실이, 이러한 페퍼 과실의 일부를 포함하는 식품 또는 사료 제품과 마찬가지로 제공된다.

한 측면에서, 과실은 무종자 과실이다.

기탁 정보

Tsw-저항성 파괴 TSWV 균주 Ve427^RB의 대표적인 샘플은 넌헴스 비.브이.에 의해 등록 번호 DSM24829 하에 2011년 4월 19일에 DSMZ (도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), 독일 38124 브라운슈바이크 이노펜슈트라쎄 7베)에 기탁되었다.

Ve427^RB 저항성 유전자 이입을 포함하는 캅시쿰 아눔 종자의 대표적인 샘플은 넌헴스 비.브이.에 의해 등록 번호 NCIMB 41817 및 NCIMB 41818 하에 2011년 3월 14일에 NCIMB (NCIMB 리미티드(NCIMB Limited), 영국 에이비21 9와이에이 스코틀랜드 애버딘 벅스번 크레이브스톤 에스테이트 퍼거슨 빌딩)에 기탁되었다.

PA2638의 대표적인 샘플은 넌헴스 비.브이.에 의해 등록 번호 NCIMB41936 하에 2012년 2월 23일에 NCIMB (NCIMB 리미티드, 영국 에이비21 9와이에이 스코틀랜드 애버딘 벅스번 크레이브스톤 에스테이트 퍼거슨 빌딩)에 기탁되었다.

출원인은 생물학적 물질 및 이로부터 유도된 임의의 물질의 샘플이, 특허의 허여가 언급될 때까지 또는 출원이 거절되거나, 취하되거나 또는 취하된 것으로 간주되는 경우에는 출원일로부터 20년 동안, EPC 제32조 제1항 또는 유사한 규칙 및 규정을 갖는 국가 또는 조약의 관련 제정법에 따라 단지 지정된 전문가에게만 양도될 것을 요구한다.

본 출원이 계류되는 동안 미국 특허청장에 의해 자격이 인정된 사람이 요청시 상기 기탁물에 대한 접근이 가능할 것이다. 37 C.F.R. § 1.808(b)에 따라, 기탁된 물질의 공공의 이용가능성에 대해 기탁자에 의해 부과된 모든 제한은 특허의 허여시 확정적으로 제거될 것이다. 기탁물은 30년 동안, 또는 가장 최근의 요청 후 5년 동안, 또는 본 특허의 유효 기간 동안 중 더 긴 기간 동안 유지될 것이며, 만일 이 기간 동안에 생존하지 않는 경우에 대체될 것이다. 본 출원인은 본 특허 하에서 또는 식물 품종 보호법 (7 USC 2321 이하 참조) 하에서 부여된 어떠한 권리도 포기하지 않는다.

하기 비제한적 예는 본 발명에 따른 페퍼 식물, 종자 및 과실의 생산을 예시한다. 본원에 언급된 모든 참고문헌이 참조로 포함된다.

실시예

Ve427^RB에 대해 유효한 저항성 공급원의 확인

저항성-파괴 균주 Ve427^RB 및 그의 상응하는 야생형 Ve430^WT가 최초로 분리된 스페인 알메리아 (문헌 [Margaria et al. (Plant Pathology Vol 53: p794)])에서 자연 감염 조건 하에 저항성 스크리닝을 수행하였다. 놀랍게도, 야생 등록물 PA2638은 저항성-파괴 균주 Ve427^RB에 대한 저항성을 나타내었다.

이탈리아 투린에서 분리된 Tsw-저항성 파괴 균주 Ve427^RB로의 인위적 접종을 이용하여 저항성-파괴 균주 Ve427^RB에 대한 저항성을 확인하였다.

접종 방법 및 저항성 평가는 상기 및 추가로 하기 기재된 바와 같이 수행하였다. 국부 및 전체적 증상의 예시적인 묘사는, 예를 들어 문헌 [Margaria et al. (2007, MPMI Vol 20: 547-558)]에서 찾아볼 수 있다.

저항성-파괴 균주 Ve427^RB 및 야생형 (WT) 균주 p105^WT를 한 세트의 숙주 종에 대한 증상 발병에 대해 평가하였다. 유전자형당 12개의 식물에 Ve427^RB 또는 야생형 균주를 접종하였다. 접종 후, 국부 증상을 7, 15 및 28일 후에 접종된 잎에서 평가하고, 전체적 증상을 15 및 28일 후에 접종되지 않은 상부 잎에서 평가하였다.

시험될 식물 및 대조 식물을 파종하고, 이들이 2개의 자엽 및 5 내지 6개의 본엽을 가질 때까지 동일한 조건 하에 성장시켰다. 성장 조건은 다음과 같았다: 온실, 충분한 물 공급, 온도: 약 14시간의 광주기로 약 26℃/18℃ 낮/밤, 광 강도: 약 120 μmol*초^-1*m^-2 μ[PAR], 성장 배지: 토양 (절반의 잔디 및 절반의 피트).

2개의 자엽 및 5 내지 6개의 본엽을 갖는 식물의 2개의 가장 어리지만 완전히 발달한 잎을, 활성 탄소 분말 및 Ve427^RB를 함유하는 완충제의 혼합물을 잎에 분무함으로써 기계적으로 접종하였다. 5일 후, 제2 기계적 접종을 수행하였다. 접종을 위해, 감염된 엔. 벤타미아나 잎의 잎 분말 1 g을 폴 완충제 (포스페이트 완충제 0.05 M pH 7, DIECA (소듐 디에틸디티오카르바메이트 3수화물) 0.005 M, EDTA-Na₂ 0.001 M, 소듐 티오글리콜레이트 0.005 M) 5 ml와 혼합하였다. 접종될 잎에, 상부 표면이 습윤 상태가 될 때까지 분무하였다. 당업자는 완충제의 양이 커버될 표면에 좌우됨을 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어 약 0.1 ml, 약 0.2 ml, 약 0.5 ml, 약 0.7 ml, 약 1.0 ml, 약 1.5 ml, 약 2.0 ml, 약 2.5 ml, 약 4.0 ml의 완충제를 잎의 상부 표면을 습윤화시키는데 사용할 수 있다.

각각의 병원형의 활성을 민감성 엔. 벤타미아나 식물의 잎에 접종함으로써 확인하였다. 모든 접종된 엔. 벤타미아나 식물은 28일 후에 전체적 증상을 나타내었다. 음성 대조군으로서, 2개의 자엽 및 5 내지 6개의 본엽을 갖는 식물의 2개의 가장 어리지만 완전히 발달한 잎에 완충제 단독을 기계적으로 접종할 수 있다/접종하였다. 28일 후에 어떠한 전체적 (또는 국부) 증상도 검출되지 않았다.

Tsw 유전자를 보유하고 야생형 p105^WT에 대해 저항성 (및 Ve427^RB에 대해 민감성)인 대조 품종 씨. 키넨시스(C. chinensis) PI152225 (CV1로 표시) 및 Tsw 유전자를 보유하지 않는 (따라서, p105^WT에 대해 민감성이고 Ve427^RB에 대해 민감성인) 대조 품종 쿼드라토 다스티(Quadrato D'Asti) (상업적으로 입수가능함, 예를 들어 http://www.macrolibrarsi.it/prodotti/__peperone-quadrato-d-asti-5-gr-b525.php) (CV2로 표시)를 대조 계통으로서 사용하였다. 그러나, 예를 들어 야생형 TSWV에 대해 저항성/민감성인 것으로 공지되거나/확인될 수 있는 다른 대조 계통도 또한 사용될 수 있다. 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 병원형 P0 (p105^WT) 접종된 식물 CV2 및 PA2638은 최조 접종 28일 후에 전체적 증상을 나타낸 반면, CV1 식물 (Tsw 저항성 유전자를 포함함)은 전체적 증상을 나타내지 않았고, 따라서 예상된 바와 같이 야생형 균주에 대해 저항성이었다.

대조적으로, CV1 중 병원형 P1 (Ve427^RB) 접종된 식물은 전체적 증상을 나타내었고, 이는 Tsw가 P1에 대해 유효하지 않음을 확인시켰다. 그러나, PA2638은 전체적 증상을 나타내지 않았다. 상기 야생 등록물은 따라서 P1에 대해 실제로 저항성이고, 접종 부위에서의 국부 괴사성 반응은 전체적 바이러스 확산을 방지하는 것으로 보인다.

표 1 - 상기 저항성 검정 섹션에 기재된 바와 같은 접종 28일 후의 인위적 접종 후 표현형

실시예 2 - 엘리트 페퍼 육종 계통 내로의 P1 (Ve427^RB)에 대한 저항성의 유전자이입

TSWV 병원형 P0 및 P1을 효과적으로 제어하기 위해, 우성 Tsw 유전자를 포함하는 엘리트 페퍼 육종 계통을 사용하여 역교배 프로그램을 시작함으로써, PA2638 유도된 저항성 및 Tsw-유전자 부여된 저항성을 채웠다.

야생 등록물 PA2638을 뭉툭한 벨 유형 (캅시쿰 아눔 엘.)에 속하고 씨. 키넨세 PI152225로부터 유도된 Tsw 유전자를 보유하는 친 계통과 교배시켰다. F₁ 자손을 2회 이상 자가교배시켰다.

Tsw에 대한 공개된 분자 마커를 사용한 마커 분석은, PA2638은 우성 Tsw 유전자를 함유하지 않는 반면에 엘리트 뭉툭한 벨 페퍼 육종 계통은 Tsw 유전자를 함유한다는 것을 확인시켰다.

PA2638로부터의 유전자이입 단편을 포함하는 자손 계통을, 실시예 1에 기재된 바와 같이 Ve427^RB 접종 후의 전체적 증상 발병에 대해 시험하였다. 계통당 12개의 식물을 시험하였다. 전체적 증상 (상부의 접종되지 않은 잎에서의 황색 반점형성)을 최초 접종 28일 후에 평가하였다.

표 2 - 최초 접종 28일 후의 다양한 계통의 Ve427^RB 저항성 검정 결과.

본질적으로 동일한 수준의 Tsw-저항성 파괴 균주 Ve427^RB (그의 게놈 내에 야생 캅시쿰 등록물 PA2638로부터의 저항성-부여 유전자이입 단편을 포함함)에 대한 저항성을 갖는 페퍼 식물을 선택하였다. 이들 계통의 종자는 등록 번호 NCIMB 41817 및 NCIMB 41818 하에 기탁되었다. 야생 캅시쿰 PA2638의 종자는 등록 번호 NCIMB 41936 하에 기탁되었다.

NCIMB NCIMB41817 20110314 NCIMB NCIMB41818 20110314 NCIMB NCIMB41936 20120223 DSMZ DSM24829 20110419

Claims (18)

1. 천연 유전적 배경에는 없는 Ve427^RB-저항성 부여 QTL 또는 그의 Ve427^RB-저항성 부여 부분을 포함하는 유전 요소를 포함하는, 대표적인 샘플이 등록 번호 DSM 24829 하에 기탁되어 있는 Ve427^RB로 표시되는 토마토 점무늬 시들음병 바이러스(Tomato Spotted Wilt Virus; TSWV)의 Tsw-저항성 파괴 균주에 대해 저항성인 캅시쿰(Capsicum) 속의 페퍼(pepper) 식물.
2. 제1항에 있어서, 대표적인 종자가 등록 번호 NCIMB 41931 하에 기탁되어 있는 야생 등록물 PA2638의 식물을 또 다른 페퍼 식물과 교배시키거나 또는 종자가 등록 번호 NCIMB 41817 또는 NCIMB 41818 하에 기탁된 식물을 또 다른 페퍼 식물과 교배시킴으로써 획득가능한 페퍼 식물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Ve427^RB로 감염시키거나 또는 접종한 식물의 적어도 60%가 전체적 증상을 나타내지 않는 것인 페퍼 식물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 유형: 뭉툭한 벨(bell) 유형, 카이엔(Cayenne) 유형, 라무요(Lamuyo), 둘세 이탈리아노(Dulce Italiano), 코니칼(Conical), 카피아(Capia), 스위트 찰스턴(Sweet Charleston), 돌마(Dolma), 체리(Cherry), 할라페뇨(Jalapeno) 유형, 샤키라(Shakira), 펜슬(Pencil) 또는 핫 찰스턴(Hot Charleston), 시브리(Sivri), 헝가리안 왁스(Hungarian Wax), 카프야(Kapya), 바나나(banana), 앤초(ancho), 프레스노(Fresno), 세라노(Serrano), 애너하임(Anaheim), 파실라(Pasilla), 산타페(Santa Fe), 스카치 보닛(Scotch bonnet), 하바네로(Habanero)로부터 선택된 과실을 생산하며, 바람직하게는 생산된 과실이 벨 유형 또는 라무요 유형의 것인 페퍼 식물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 근친교배 계통 또는 F₁ 잡종인 페퍼 식물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈 내에 Tsw 저항성 유전자를 추가로 포함하는 페퍼 식물.
7. 제6항에 있어서, 야생형 TSWV 균주, 예컨대 Br01^WT, p105^WT, Ve430^WT, Br20^WT 및 p170^WT로부터 선택된 균주로 감염시키거나 또는 접종한 후에 전체적 증상을 나타내지 않는 페퍼 식물.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, Tsw-저항성 유전자의 존재가 DNA 마커를 사용함으로써 검출가능한 것인 페퍼 식물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, Tsw-저항성 유전자를 포함하고 대표적인 샘플이 등록 번호 DSM 24829 하에 기탁되어 있는 Ve427^RB에 대한 저항성을 포함하는 캅시쿰 아눔(Capsicum annuum) 종의 재배 페퍼 식물이고, 본원에 기재된 바와 같은 Ve427^RB-저항성 검정에서 시험된 식물의 적어도 60%가 균주 Ve427^RB로의 최초 접종 약 28일 후에 상부의 접종되지 않은 잎에서의 전체적 증상을 나타내지 않는 계통의 것인 페퍼 식물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 저항성이, 종자가 등록 번호 NCIMB 41817, NCIMB 41818 및 NCIMB 41931 하에 기탁된 식물을 또 다른 페퍼 식물과 교배시킴으로써 획득가능한 것인 페퍼 식물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 페퍼 식물을 성장시킬 수 있는 종자.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 페퍼 식물의 과실 또는 그의 일부, 예컨대 과육.
13. 제12항에 있어서, 적어도 7 cm 길이 및/또는 적어도 2 cm 폭인 과실.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 감미 페퍼 과실인 과실.
15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 페퍼 식물의 시험관내 세포 또는 조직 배양물.
16. a) Ve427^RB-저항성 검정을 수행함으로써 캅시쿰 식물 또는 계통 또는 품종을 Ve427^RB-저항성에 대해 스크리닝하고,
    b) Ve427^RB 감염 후에 전체적 증상을 나타내지 않는 캅시쿰 식물 또는 계통 또는 품종을 확인하는 것
    을 포함하는, Ve427^RB-저항성 캅시쿰 식물을 확인하는 방법.
17. 제16항의 방법에 의해 획득된 페퍼 식물을 또 다른 페퍼 식물과 교배시킴으로써 획득되는, Ve427^RB로 표시되는 토마토 점무늬 시들음병 바이러스 (TSWV)의 Tsw-저항성 파괴 균주에 대해 저항성인 캅시쿰 속의 페퍼 식물.
18. 제17항에 있어서, Ve427^RB로 감염시키거나 또는 접종한 식물의 적어도 60%가 전체적 증상을 나타내지 않는 것인 페퍼 식물.

Images