CN104582473B - 抗tswv的辣椒属植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及椒类育种领域。提供了抵抗TSWV的Tsw抗性突破性致病型的植物。还提供了其植物部分、种子、细胞和果实以及产生这类植物的方法。

Description

抗TSWV的辣椒属植物
发明领域
本发明涉及植物育种和植物改良，特别地涉及抵抗Tsw抗性突破性毒株Ve427RB的长辣椒(Capsicum annuum L)植物物种。
发明背景
长辣椒植物是茄科(Solanaceae)草本植物。该植物达到约0.5–1.5米(20–60英寸)。单一白花携带未成熟时为绿色的椒类果实，所述椒类果实主要变成红色，虽然一些品种可以成熟呈棕色或紫色。尽管该物种可以耐受大多数气候，它们在温暖和干燥的气候下特别多产。长辣椒物种的栽培椒类植物包括不同类型的椒，如铃状椒(bell pepper)、卡伊恩椒(cayenne pepper)、帕布莉卡椒(paprika)和加拉佩诺椒
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番茄斑萎病毒属病毒(Tospoviruses)是许多植物物种的重要致病威胁，在世界范围造成相当大的破坏和产量损失(German等人,1992,Ann Rev Phytopath V30:315-348)。因此植物育种者持续地搜寻赋予或增强番茄斑萎病毒抗性的基因，以便开发抗性栽培品种。将Sw-5基因从秘鲁番茄(Lycopersicon peruvianum)转移至栽培番茄，赋予针对番茄斑萎病毒属病毒血清组I(例如TSWV，番茄斑萎病毒)和血清组II(例如GRSV和TCSV，分别是落花生环斑病毒和番茄褪绿斑病毒)的抗性。
商业化的甜椒和朝天椒(hot pepper)的栽培品种目前通常含有显性抗性基因Tsw，其赋予针对TSWV(但是不赋予针对其他番茄斑萎病毒属病毒，如不赋予针对GRSV或TCSV)的超敏感抗性。已经从物种黄灯笼椒(Capsicum chinense)的品系PI152225、PI159236渐渗了Tsw基因(Black等人,1991,Plant Disease 75:863；Boiteux等人,1995,Theor.Appl.Genet.90:146-149；Costa等人,1995,First Int.Symposium on Solanaceaefor the Fresh Market,March 28-311995,Malaga,Spain,Acta Hortic.412:523-532)。也已经开发用于鉴定和/或选择Tsw的分子标志物(Moury等人,2000,Genome 43:137-142)和Jahn等人(2000，MPMI第13卷:673-682)已经将Tsw基因绘图至长辣椒中的10号染色体。
一个缺点是Tsw基因赋予的TSWV抗性受高温破坏并还取决于植物年龄(幼植株更敏感)。科学证据似乎表明Tsw抗性基因可以通过破坏TSWV的长距离运输发挥作用(见Rogero等人，Thrips and Tospoviruses:Proceedings of the 7th Int Symposium onThysanoptera,第105–110页)。
Tsw基因的额外问题是已经报道了TSWV的Tsw抗性突破性毒株。Tsw抗性突破性毒株能够全身性感染携带显性Tsw抗性基因的植物。突破黄灯笼椒抗性的抗性突破性毒株的首次报道是在1993年(Boiteaux等人,Plant Disease 77:210)。Later Moury等人(1997，Euphytica1994：45-52)还找到了克服Tsw抗性的毒株，不过未将所述病毒分离株分型以评估它们是否确实是TSWV分离株，而非GRSV或TCSV分离株。
Roggero等人(1999，Plant Disease第83卷:第965页)在意大利找到两个TSWV田地分离株，它们在携带来自PI15225的Tsw基因的椒杂种中克服Tsw抗性。血清学测试证实病毒分离株是由蓟马媒介西花蓟马(Frankliniella occidentalis)可传播的TSWV毒株。在2002年，Roggero等人还报道了意大利的Tsw抗性突破性毒株(Plant Disease第86卷:950-954)。测试的全部商业上的椒栽培品种均可以在实验条件下由这些突破抗性的TSWV毒株全身感染。但是，携带Sw-5基因的TSWV抗性栽培品种不易感于来自椒的Tsw抗性突破性毒株，表明Sw-5和Tsw具有不同的特征(Roggero等人,2002，上文)。这还由Jahn等人(2000，上文)证实。
在2004年，Margaria等人(Plant Pathology第53卷:第794页)报道在西班牙(阿尔梅里亚)田地中鉴定到Tsw抗性突破性毒株。
Margaria等人,2007(MPMI第20卷:547-558)研究了携带显性Tsw抗性基因的椒类植物和多种天然TSWV毒株、野生型毒株及能够突破Tsw抗性的毒株之间的相互作用。在他们的研究中，Tsw抗性突破性TSWV毒株由上标‘RB’命名。这些抗性突破性毒株之一是2003年从西班牙阿尔梅里亚的椒田分离的Ve427RB。与仅在携带Tsw基因的植株的接种椒叶上造成局部损伤的野生型TSWV毒株相反，突破抗性的TSWV毒株造成全身性感染，导致例如遍及感染植株的叶褪绿和黄斑。通过使用具有野生型(毒株Br01wt)和RB毒株基因组之间重配的毒株，Margaria等人(2007，MPMI第20卷:547-558)能够显示，Tsw抗性突破性毒株的无毒力决定因子是小RNA(S RNA)上存在的NSs蛋白(非结构蛋白)。在这项研究的抗性突破性毒株中，相对于野生型NSs蛋白，这些NSs蛋白含有一个或两个突变或缺失。
虽然显性Tsw基因仍可用于在世界许多地方向椒品种提供针对TSWV的抗性，但是仍急切需要TSWV抗性的新来源，以使新TSWV毒株造成的、尤其Tsw抗性突破性毒株造成的损害最小化。
本发明的一个目的是提供包含与Tsw基因不同的新抗性基因的椒类植物，所述新抗性基因赋予针对Tsw抗性突破性毒株(如在NSs蛋白中包含突变和/或缺失的毒株)的抗性。在一个实施方案中，新抗性基因赋予至少针对Tsw抗性突破性毒株Ve427RB的抗性。本发明的又一个目的是提供包含新抗性基因和Tsw基因的椒类植物，即这样的植株，其抵抗野生型TSWV毒株(致病型P0)并抵抗Tsw抗性突破性毒株(致病型P1)，至少抵抗Ve427RB，但是优选地还抵抗其他Tsw抗性突破性毒株(如在NSs蛋白中具有一个或多个缺失和/或突变的毒株和/或能够全身性感染携带Tsw基因的椒类植物的毒株)。
发明详述
如本文所用，术语“包含”及该动词的变化形式以其非限制性含义使用以意指包括跟随该词之后的对象，但是不排除未具体提到的对象。然而，技术人员将理解术语“包含”还涵盖术语“组成”。因此，在本发明的实施方案中，包含子要素的要素，例如QTL，还可以由所述子要素组成。此外，谈及某个要素述及“一个”或“一种”时不排除存在多于一种该要素的可能性，除非上下文清楚地要求应当存在一个且仅一个所述要素。因此，“一个”或“一种”通常意指“至少一个”或“一个或多个”，例如，“一个细胞”还指处于细胞培养物、组织、整个生物等形式的几种细胞。类似地，“一个植株”还指多个植株。
“表型”是植物的可观察外观和/或生理表观，作为其基因型与其环境之间相互作用的结果。它包括可观察的形态特征和/或生理特征。
“基因型”是植物的可遗传遗传信息的总体，部分受环境因素影响，其以表型表现。
如本文所用，“椒类植物(pepper plant)”或“椒类(pepper)”是辣椒属(Capsicum)的植物或其部分(例如果实)。椒类包括全部椒种类，如朝天椒/辛辣椒和非辛辣椒(甜椒)。本术语涵盖野生种质和驯化椒类。
“驯化椒”指物种长辣椒(Capsicum annuum L.)、黄灯笼椒(Capsicum chinenseJacq.)、小米椒(Capsicum frutescens L.)、风铃椒(Capsicum baccatum L.)和茸毛椒(Capsicum pubescens Ruiz & Pav.)。
术语“栽培品种”(或“栽培”植物)在本文中用来指具有除“野生型”状态之外的生物学状态的植物，所述“野生型”状态指植物或种质的原始未栽培、未驯化或天然状态，并且术语“栽培”不包括这类野生或杂草性植物。术语“栽培品种”包括具有良好农艺学特征的材料，如育种材料、研究材料、繁育系、原种繁育系、合成种群、杂种、建立者原种(founderstock)/基础群、近交系、栽培品种(开放授粉的杂交栽培品种)、分离群、突变体/遗传群和高级/改良栽培品种。在一个实施方案中，术语栽培品种还包括地方品种，即由人类在本地选择和栽培许多年并适应于特定地理环境并且分享共同基因池的椒类植物(或种群)。通常而言，“栽培椒”指由人类在田间或在防护的环境(例如温室或隧道)为产生果实而栽培的驯化椒的繁育系和品种。与野生型种质相比较，栽培品种具有良好农艺学特性，如高产率、更大的果实尺寸、更高的能育性、更高的植株和/或果实均匀度等。栽培品种的例子包括属于物种长辣椒、黄灯笼椒、小米椒(Capsicum frutescens)、风铃椒(Capsicum baccatum)和茸毛椒(Capsicum pubescens)的栽培品种。
如本文所用，术语“植物”包括完整植物或任何部分或其衍生物，如植物器官(例如，收获或未收获的果实、叶、种子、花等)、植物细胞、植物原生质体、可以再生出完整植株的植物细胞培养物或组织培养物、植物愈伤组织、植物细胞团块和在植物或植物部分中完整的植物细胞，如胚、花粉、胚珠、子房、果实(例如，收获的组织或器官，如收获的椒类果实或其部分)、花、叶、种子、克隆繁殖的植株、根、砧木、茎、根尖等。还包括任何发育阶段，如不成熟和成熟的籽苗等。
如本文所用的术语“果实”指在赋予针对Tsw抗性突破性毒株如毒株Ve427RB的抗性的椒类植物上正在生长的椒类果实。在一个实施方案中，果实是收获的果实。在一个实施方案中，这种果实是无籽的，即，它根本不含有种子，或它含有无活力的种子，或它在其发育的全部阶段(包括成熟阶段)不含有成熟种子，即，它们不适于通过种子繁殖。
术语椒类果实的“果肉”、“荚”或“肉”指不是种子的果实部分。通常而言，果肉包括种子，即，果肉和种子形成本发明含义下的果实。
“植物品种”是相同植物分类单位内部具有已知最低等级的一组植物，其(无论认可植物育种学家权利的条件是否满足)可以基于表现因某种基因型或基因型组合所致的特征而定义，可以通过表现这些特征中至少一者区别于任何其他植物群，并且可以视为实体，因为它可以在没有任何变化的情况下繁殖。因此，术语“植物品种”不能用来指这样的一组植物，即便它们属于相同种类，如果这些植物均以存在一个基因座或基因(或因这个单基因座或基因所致的一系列表型特征)为特征，但就其他基因座或基因而言可以彼此极为不同。
“植物品系”或“繁育系”指一种植物和其子代。如本文所用，术语“近交系”指已经反复自交的植物品系。
“F1、F2等”指两个亲本植株或亲本系间杂交后的连续相关世代。从两个植株或品系杂交产生的种子中培育的植物称作F1代。自交F1植株产生F2代等。“F1杂交”植物(或F1杂交种子)是从两个近交亲本系杂交获得的世代。
“杂种”或“杂交植物”是通过至少两个不同植株或不同亲本系的植株互交(杂交受精)所产生的植物。可以理解，本文中涵盖这种杂交的种子(杂交种子)，以及从衍生自那些长成植株的那些种子和植物部分培育的杂交植株。
术语“性状”指例如通过杂交和选择从一个植株可转移另一个植株的可遗传特征，如TSWV抗性。
“TSWV”、“TSWV毒株”或“TSWV分离株”或“TSWV致病型”指可以按血清学方式(使用例如针对TSWV核衣壳或糖蛋白产生的抗体，见Roggero和Masenga，2002，Plant Dis.第86卷，950-953)或通过序列比较(例如通过将某毒株与已经测定其全基因组序列的巴西分离株Br01wt(GenBank登录号NC_002050、NC_002051和NC_002052))确定的番茄斑萎病毒毒株。
“野生型(WT)TSWV毒株”或“致病型P0”指从本领域已知的显性Tsw抗性基因对其赋予抗性的TSWV毒株。例如，在感染后或人工接种后，具有Tsw抗性基因的抗性植株在上端未接种的叶上基本上不显示全身症状如黄色斑驳，例如，如可以使用如本文所述的致病型P0的抗性测定法实施。WT TSWV毒株的例子例如是p105WT或Ve430WT，二者均在Margaria等人(2007，MPMI第20卷:547-558)中描述。两个毒株可以通过以登录号DQ376178和DQ376184在GenBank分别保藏的S区段序列鉴定。
“TSWV抗性基因”或“TSWV抗性等位基因”是包含所述基因或等位基因的基因或等位基因或DNA区域，其中与缺少该基因或等位基因或DNA区域的植物相比较，在植物基因组中存在时，所述基因或等位基因或DNA区域赋予或增强针对一个或多个TSWV毒株的抗性。
“Tsw基因”或“Tsw抗性基因”指如本领域已知的显性抗性基因，例如，从黄灯笼椒PI152225、PI159236或从包含Tsw基因的商业化的椒类品种如长辣椒栽培品种Explorer(一种商业化的杂交铃状椒品种)可获得。可以使用如实施例中所述的抗性测定法和/或使用现有技术中提供的分子标志物测定法(Moury等人,2000,Genome 43:137-142和Jahn等人，2000，MPMI第13卷:673-682)确定Tsw基因的存在或不存在。
“Tsw抗性突破性毒株”(RB)或“致病型P1”指能够在包含发挥功能的Tsw抗性基因的植株上例如在黄灯笼椒PI152225、PI159236或长辣椒栽培品种“Explorer”的植株上造成全身性疾病症状(上端未接种的叶上的黄色斑驳)的TSWV毒株。在一个实施方案中，局部坏死性损害在接种的叶上形成。在一个实施方案中，Tsw抗性突破性毒株在非结构蛋白(NSs)中包含一个或多个突变和/或缺失(见Margaria等人(2007，MPMI第20卷:547-558)和deHaan等人(1990，J.Gen.Virol.71:1001-1007))。
“Ve427RB”指如Margaria等人(2004，2007，上文)中所述并且其代表性样品已经以DSM 24829登录号在DSZM保藏的从西班牙(阿尔梅里亚)田间分离的RB毒株。
具有或包含“Ve427RB抗性”或呈“Ve427RB抗性”的椒类植物指用Ve427RB接种或感染后不形成全身症状的椒类植物。这可以使用多种方法测试，一个例子是使用人工接种测定法，例如本文所述的Ve427RB抗性测定法，其中例如将具有5至6片充分发育叶的椒类植物的两片最幼叶用Ve427RB接种，并且上端未接种的叶在接种后约28日不显示黄色斑驳症状。在一个实施方案中，如果一个植物品系或品种显示基本上无全身症状，意指感染或接种植株的至少60％，优选地至少70％、75％、80％、85％、90％或更多(例如92％、93％、94％、95％、98％、99％或100％)显示无全身症状(即在上端未接种的叶上无黄色斑驳)，则称该植物品系或品种抵抗Ve427RB。
“包含赋予Ve427RB抗性的QTL或其赋予Ve427RB抗性的部分的遗传元件或“赋予Ve427RB抗性的QTL”指在椒类植物中赋予或增强针对Tsw抗性突破性毒株Ve427RB的抗性的遗传元件，例如，核酸(如基因组DNA)。在一个实施方案中，所述遗传元件可衍生自/可获自野生种质PA2638的椒类植物。因此，在一个实施方案中，遗传元件可以通过将具有种质PA2638的植株与另一个辣椒果实植物杂交获得(可获得)。如本文所用的“野生种质PA2638”指从意大利的市场获得的野生种质。PA2638的种子的代表性样品已经由纽内姆公司(Nunhems B.V.)在2012年2月23日在登录号NCIMB 41936下保藏。在一个实施方案中，可以使用抗性测定法例如本文作为“Ve427RB抗性测定法”描述的测定法和/或分子标志物测定法确定包含赋予Ve427RB抗性的QTL的遗传元件在植物中的存在或不存在。在一个实施方案中，包含赋予Ve427RB抗性的QTL的遗传元件获自、可获自、衍生自、可衍生自、存在于以登录号NCIMB 41817、NCIMB 41818或NCIMB 41936保藏的种子和从这些种子培育的植物和/或其子代。因此，在一个实施方案中，包含赋予Ve427RB抗性的QTL的遗传元件源自、获自、可获自、衍生自、可衍生自其种子以登录号NCIMB 41817、NCIMB 41818或NCIMB41936保藏的植物与另一个椒类植物杂交。
“Ve427RB抗性测定法”是一种测定法，它适合确定椒类植物对Tsw抗性突破性毒株的抗性和/或包含赋予Ve427RB抗性的QTL的遗传元件的存在。下文进一步示例性描述该测定法。使用这种测定法，可以将植物、植物品系或品种划归为“抵抗”Tsw抗性突破性毒株，如Ve427RB。
“抗性”指相对于缺少有效(或有功能的)抗性基因的植株，在包含有效(或有功能的)抗性基因的植株统计学显著地限制特定病原体(例如一个或多个TSWV毒株)的增长和/或发育和/或以特定病原体(例如一个或多个TSWV毒株)感染后统计学显著地减少疾病症状。抗性可以定性确定(将特定品系或品种的植株划分为‘抗性’或‘易感’)和/或抗性可以定量，例如在抗性测定法中，通过例如测量为病毒毒株感染后存活(存活％)或如果仅植株的一部分感染时显示基本上无全身症状的特定品系或品种植株的百分数。在一个实施方案中，如果根据Tsw抗性突破性毒株感染或接种后不形成症状，特别地是不形成全身症状(可以在TSWV抗性测定法中检验)，将某个植物品系或品种定性为‘抗性’，例如，如本文所述，将该植物品系或品种称为抵抗Tsw抗性突破性毒株。在一个实施方案中，如果一个植物品系或品种显示基本上无全身症状，即如果用Tsw抗性突破性毒株感染或接种后，植物的至少60％、优选地至少70％、75％、80％、85％、90％或更多(例如92％、93％、94％、95％、98％、99％或100％)显示无全身症状(即在上端未接种的叶上无黄色斑驳)，则称该植物品系或品种抵抗Tsw抗性突破性毒株。技术人员将理解应当在相同测试条件下测试每个品系或品种至少10个植株，12、15或20个或甚至更多植株以评价某品系或品种是否具有抗性并且应当包括合适的对照植物。
术语“等位基因”意指在特定基因座处某基因的一种或多种替代形式的任一个，全部等位基因均涉及特定基因座处的一个性状或特征。在生物的二倍体细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的特定位置或基因座(locus)(复数形式：基因座(loci))处。一个等位基因存在于成对同源染色体的每条染色体上。二倍体植物物种如椒可以在特定的基因座处包含众多不同的等位基因。这些等位基因可以是基因的相同等位基因(纯合)或两个不同的等位基因(杂合)。
“种植”或“栽种”指将籽苗(小植物)通过机器或手工播种(直接播种)或移栽至田地中。
“营养繁殖”指植物从营养组织繁殖，例如通过体外繁殖法。体外繁殖法涉及体外细胞培养或组织培养和从体外培养物再生完整植株。因此可以通过体外培养和再生方法产生原始植株的克隆(即遗传上相同的营养繁殖)。
术语“基因座(locus)”(复数形式：基因座(loci))意指染色体上其中存在例如基因或QTL或分子标志物的一个特定位置或多个位置或一个位点或区域。相同染色体上基因座之间的距离由交换的频率度量。两个基因座相隔越远，它们之间更有可能交换。相反，如果两个基因座靠近在一起，则交换在它们之间较不可能出现。通常，1厘摩(cM)等于基因座(例如标志物)之间的1％重组。
术语“QTL”和“数量性状基因座”在本文中以本领域认可的意思使用。这些术语指位于辣椒属特定染色体上与编码Ve427RB抗性的至少一个基因(或等位基因)相关的区域或至少一个调节区，即控制参与Ve427RB抗性的一个或多个基因表达的染色体区域。可以例如将该基因的表型表现观察为病毒复制速率降低和/或观察为病毒穿过植物运动的速率降低和/或其表型效应(例如基本上无全身症状形成)。QTL可以例如包含一个或多个其产物赋予遗传抗性的基因。备选地，QTL可以例如包含其产物影响植物基因组中其他基因座上基因的表达，因而赋予Ve427RB抗性的调节基因或序列。
术语“天然遗传背景”在本文中用来指QTL的原始遗传背景，即其中最初发现QTL的基因组和染色体。因此，PA2638(登录号NCIMB 41963)的基因组代表了包含本发明赋予Ve427RB抗性的QTL的遗传元件的天然遗传背景。相反，涉及将包含QTL的DNA区域(或渐渗片段(introgression fragment))或其抗性赋予部分从PA2638的原始遗传背景转移(或渐渗)至另一个辣椒属植物或物种的另一个遗传背景(例如转移到另一个基因组的染色体上)的方法将导致该QTL或其所述抗性赋予部分不处于其天然遗传背景中。如本文所用，术语“连锁群”与染色体(物理实体)同义。
术语“分子标志物”、“遗传标志物”或“DNA标志物”在本文中指通过各种方法检测到以可视化核酸序列差异的多态性核酸序列。这类方法的例子是定义特定遗传位置和染色体位置的限制性片段长度多态性(RFLP)标志物、扩增片段长度多态性(AFLP)标志物、单核苷酸多态性(SNP)、插入、突变、微卫星标志物(SSR)、序列表征的扩增区域(SCAR)、切割的扩增多态性序列(CAPS)标志物或同工酶标志物或所述标志物的组合。“与QTL或者基因或基因座连锁的分子标志物”因此指与包含QTL、基因或基因座的基因组DNA区域物理连接并与包含QTL、基因或基因座的DNA区域共分离的标志物。标志物因此还可以定义渐渗区域。
“重组事件”指减数分裂的交换事件。
术语“渐渗区域”或“渐渗的DNA区域”、“渐渗的性状”或“渐渗的基因”或“渐渗的片段”指已通过育种方法如回交从一个植物基因组转移至另一个植物的基因组的染色体区段。
“渐渗”在本文中指赋予特定性状或表型(例如针对TSWV毒株VE427RB的抗性)的DNA区域(渐渗区域)从一个植物基因组通过种间杂交转移至相同物种或密切相关物种的另一个植物基因组。具体而言，指这个DNA区域从非栽培植物或从野生植物(缺少良好农艺学特性)转移至栽培植物(具有良好农艺学特性)的基因组中。因此，在一个实施方案中，所产生的椒类植物包含已经向其基因组中渐渗来自另一个植物基因组、特别地来自PA2638的渐渗片段的栽培椒类植物的基因组。渐渗通常涉及多个育种步骤如一个或多个杂交、自交和/或回交，但是还可以涉及标记物辅助选择、表型选择(例如抗性测定法)、双单倍体产生、胚拯救等。
“回交”指将两个亲本之间杂交而产生的植株与亲本之一杂(回)交的育种方法。回交中使用的亲本称作回归亲本。反复回交导致基因组变得越来越纯合，越来越相似于回归亲本。回交可以用来将源自供体植物(例如野生种质)的性状引入另一个植物(例如栽培植物或繁育系)中。
术语“自交”指个体以自身花粉授粉或受精的自我受精过程。植物已经重复“自交”(自我受精)。
术语“蛋白质”指具有作用模式、大小、三维结构或来源的多肽。“野生型”蛋白是有完全功能的蛋白质，如同以野生型中那样存在，例如野生型TSWV病毒毒株。“突变蛋白”在本文中是一种蛋白质，与野生型蛋白相比较，所述蛋白质在编码该蛋白质的核酸序列中包含导致一个或多个氨基酸置换、缺失或插入的一个或多个突变。因此可以将蛋白质的“片段”或“部分”仍称作“蛋白质”。“分离的蛋白质”用来指不再处于其天然环境下的蛋白质。
TSWV的“野生型NSs蛋白”或“野生型非结构蛋白”是存在于野生型毒株中的NSs蛋白，例如具有登录号Genbank ABD38700.1的毒株VE430WT的NSs蛋白(图1a)，而Tsw抗性突破性毒株VE427RB的NSs蛋白具有GenBank登录号ABD38702.1的序列(图1b)，仅与野生型蛋白差异1个氨基酸(即，一个“突变NSs蛋白”)并与野生型蛋白具有99％序列同一性。
编码蛋白质的核酸分子中的“突变”是例如因替换、缺失或插入一个或多个核苷酸而与野生型序列相比的一个或多个核苷酸变化。“点突变”是单核苷酸的置换，或单核苷酸的插入或缺失。“无义”突变是在编码蛋白质的核酸序列中密码子变成终止密码子的(点)突变。截短的蛋白质可以具有减少的功能或功能丧失。“错义”突变是在编码蛋白质的核酸序列中密码子变成编码一种不同氨基酸的(点)突变。所产生的蛋白质可以具有减少的功能或改变的功能。
“序列同一性”和“序列相似性”可以通过使用总体或局部比对算法比对两个肽或两个核苷酸序列来确定。当序列(通过例如程序GAP或BESTFIT或Emboss程序“Needle”最佳比对时(使用默认参数，见下文))共有至少某个最小序列同一性百分数(如下文进一步限定)时，则可以将它们称作“基本上相同”或“基本上相似”。这些程序使用Needleman和Wunsch总体比对算法在它们的整个长度范围内比对两个序列，使匹配的数目最大化并使空位的数目最小化。通常，使用默认参数，缺口生成罚分＝10和空位延伸罚分＝0.5(二者均用于核苷酸比对和蛋白质比对)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是nwsgapdna，并且对于蛋白质，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff和Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。可以例如使用计算机程序，如从Accelrys Inc.,9685 Scranton Road,San Diego,CA 92121-3752USA或EMBOSS(http://www.ebi.ac.uk/Tools/webservices/services/emboss)可获得的10.3版GCG Wisconsin软件包确定序列比对和序列同一性百分数评分。备选地，可以通过针对数据库检索如FASTA，BLAST等确定相似性或同一性百分数，但是应当取回命中结果并成对比对以比较序列同一性。
“平均数”在本文中指算术平均数。
“辣椒碱”是红辣椒(chili pepper)的活性组分，红辣椒是属于辣椒属的植物。它是哺乳动物(包括人类)的刺激物，并产生烧灼感。辣椒碱的量在不同的辣椒属品种(包括长辣椒在内)之间明显变动：
Figure BDA0000596407490000121
“史高维尔指标”是椒的热辣(或辣味/辛辣)的量度。史高维尔热辣单位(SHU)的数目表示存在的辣椒碱的量：将来自测定量的干燥椒中的辣椒碱油的醇提取物增加地添加至糖在水中的溶液直至“热辣感”由一组试味员(通常5位)刚可察觉；稀释程度给出其在史高维尔指标上的量值。备选地，可以通过使用高效液相色谱(HPLC)测量热辣。这种方法产生美洲香料贸易协会(ASTA)辛辣单位的结果。HPLC法是本领域熟知的。见，例如，DIONEX的描述。等强度分析性系统由泵、自动进样器、恒温室、四通道
Figure BDA0000596407490000122
检测器和置于该阵列之前的UV/vis检测器组成。LC条件：柱：MD-150(3x150mm；3μm)，流动相：50mM乙酸铵，pH4.4，连同乙酸；45％乙腈，流速：0.8mL/分钟，温度：环境温度，注射体积：20μl，检测器和条件：电化学检测器：型号5600A，CoulArray，带5010型分析室，施加的电位：+150，+450mV vs.Pd，UV检测器：标准UV检测器，波长：235nm和280nm。每百万分之一份辣椒碱的量值对应于约15个史高维尔单位。但是，当确定椒的辣味/辛辣时，优选史高维尔法。
技术人员理解，与数值组合的术语“约”值优选地指确切值。然而，通常，术语“约”还涵盖因测量技术范围内或生物分布范围内公认和接受的测量不精确性所致的值变异。通常而言，取决于测量技术，这种不精确性低于10％、低于8％、低于6％、低于4％、低于2％、低于1％、低于0.1％、低于0.01％。基于其常识，技术人员将在没有过多负担情况下确定在已知测量技术或生物学过程范围内可接受的不精确性，如使用孟德尔定律确定子代分布时。
附图描述
图1a：毒株VE430WT的NSs蛋白。
图1b：Tsw抗性突破性毒株VE427RB的NSs蛋白。
图2：PA2638(NCIMB 41936)的果实。5枚绿色果实(右)和5枚红色/成熟果实(左)。
发明详述
在其它毒株当中，发现Tsw抗性突破性毒株Ve427RB能够克服携带Tsw抗性基因的椒类植物的抗性(Margario等人,2004，2007上文)。使用分离自西班牙田间的这个毒株人工接种，出人意料地发现了命名为PA2638的一种野生的辣椒属种质，其具有Ve427RB抗性，即当人工接种PA2638植株时基本上看不到全身症状。Ve427RB是能够在包含Tsw基因的椒类植物中造成全身性感染的毒株。令人惊讶地，这个新抗性源PA2638不抵抗野生型TSWV毒株，表明这个新抗性源应当理想地与其他抗性基因如显性Tsw基因堆叠。
通过PCR分析证实该野生的椒种质缺少已知的Tsw抗性基因。
通过反复回交选择的Ve427RB抗性F2植株，将包含赋予Ve427RB抗性的QTL的新遗传元件从PA2638渐渗入栽培的椒中。PA2638是一种朝天椒植物，即，PA2638的果实产生/含有辣椒碱。换句话说，PA2638的成熟果实含有至少600个SHU或至少40个ASTA辛辣单位。
植物品系
本发明的一个方面涉及辣椒属的椒类植物，优选地栽培的椒类植物，所述植物抵抗命名为Ve427RB的番茄斑萎病毒(TSWV)Tsw抗性突破性毒株，所述Ve427RB的代表性样品已经以登录号DSM 24829保藏，并且所述椒类植物包含不处于其天然遗传背景下的遗传元件，所述遗传元件包含赋予Ve427RB抗性的QTL或其赋予Ve427RB抗性的部分。例如，如果所述遗传元件的天然遗传背景是PA2638，则本发明的植物不是PA2638植物。因此，本发明的植物包含具有栽培椒基因组的椒类植物，所述基因组包含来自非栽培椒植物(例如来自PA2638)的赋予Ve427RB抗性的渐渗片段。
本发明的另一个方面涉及提供辣椒属的椒类植物，所述椒类植物在其基因组中包含衍生自/可获自/获自PA2638植株的遗传元件，所述遗传元件包含赋予抵抗Tsw抗性突破性TSWV的QTL或其赋予抵抗Tsw抗性突破性TSWV的部分，条件是该辣椒属植物不是PA2638。
本发明的一个方面涉及提供辣椒属的椒类植物，所述椒类植物在其基因组中包含赋予针对Tsw抗性突破性TSWV毒株抗性的QTL，所述TSWV毒株能够在包含Tsw基因的椒类植物中造成全身性感染。
在一个方面，本发明提供辣椒属的椒类植物，所述椒类植物在其基因组中包含遗传元件，所述遗传元件包含赋予抵抗Tsw抗性突破性TSWV的QTL或其赋予抵抗Tsw抗性突破性TSWV的部分，其中所述遗传元件或其抗性赋予部分不处于其天然遗传背景下。优选地这种抗性衍生自/获自/可获自PA2638，即，PA2638是所述遗传元件的天然遗传背景。
“衍生自”、“获自”和“可获自”在本文中指通过杂交其种子以一个或多个登录号保藏的植物获得/可获得的性状(和包含该性状的植物)。这可以涉及第一杂交，随后几次自交和/或(回)杂交。因此，可以将赋予该性状的遗传元件渐渗或转移至另一个遗传背景中。
本发明的一个方面涉及辣椒属的椒类植物，所述椒类植物在其基因组中包含遗传元件，所述遗传元件包含赋予抵抗Tsw抗性突破性TSWV的QTL或其赋予抵抗Tsw抗性突破性TSWV的部分，产生在其最大宽度处具有至少2cm宽度的成熟果实，即，成熟果实具有至少约2cm或更大cm的宽度，如至少约3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm、10cm、11cm或更多，和/或具有至少5cm、6cm、7cm、8cm、9cm、10cm、11cm、12cm、13cm、14cm、15cm、16cm、17cm、18cm、19cm或更大的果实长度。例如，这种植物产生铃型或辣姆优型果实。
在一个实施方案中，所述Tsw抗性突破性TSWV毒株以突变NSs蛋白为特征，其中所述Tsw抗性突破性毒株的NSs蛋白修饰选自一个、两个，三个或更多个修饰，所述修饰选自与分离所述Tsw抗性突破性毒株的区域中的相关WT毒株的野生型蛋白相比的单个氨基酸交换、氨基酸缺失，使得所述Tsw抗性突破性毒株能够克服显性Tsw基因赋予的抗性。在一个实施方案中，野生型毒株的NSs蛋白的序列是如Margaria等人(2007，MPMI第20卷:547-558)的图3中公开的p170wt、如Margaria等人(2007，MPMI第20卷:547-558)的图3中公开的p105wt或具有登录号ABD38700.1的Ve430WT的NSs蛋白的序列。在一个优选的实施方案中，TSWV的野生型毒株是p105WT或Ve430WT，它们可以通过其以登录号DQ376178和DQ376184在GenBank分别保藏的S区段序列鉴定。在一个实施方案中，与野生型NSs蛋白序列(例如具有GenBank登录号ABD38700.1的野生型毒株的NSs蛋白和在第85位置处具有氨基酸交换的Tsw抗性突破性毒株的NSs蛋白序列)相比较，TSWV的Tsw抗性突破性毒株在其NSs蛋白序列中包含或含有选自氨基酸交换和氨基酸缺失的一个或两个突变。在一个实施方案中，Tsw抗性突破性毒株的NSs蛋白具有GenBank登录号ABD38702.1的序列(称作Ve427RB)。在一个实施方案中，野生型毒株的NSs蛋白具有GenBank登录号ABD38700.1(见图1)。在另一个实施方案中，野生型毒株的NSs蛋白是p105WT的NSs蛋白(见登录号DQ376178)。
优选地，Tsw抗性突破性TSWV毒株是Ve427RB，Ve427RB的代表性样品已经以登录号DSM 24829保藏。技术人员知晓的是，针对Ve427RB的抗性当然不排除针对其他Tsw抗性突破性毒株的抗性。但是，如本文所用的针对Ve427RB的抗性不包括针对TSWV野生型毒株(即Tsw基因针对其赋予抗性的毒株)的抗性。
在一个实施方案中，本发明的椒类植物是抵抗Tsw抗性突破性毒株Ve427RB的椒类植物，其中所述椒类植物不是PA2638(NCIMB 41936)。
在一个实施方案中，具有长/宽比最多为3、优选地最多为2并且在其最广宽度处宽度为2cm或更大的成熟果实的椒类植物包含遗传元件，所述遗传元件包含赋予Ve427RB抗性的QTL或其赋予Ve427RB抗性的部分，所述QTL衍生自/获自/可衍生自/可获自野生种质，其代表性种子以登录号NCIMB 41936保藏。
本发明的椒类植物优选地是栽培的椒类植物(栽培品种)。另外，本发明的栽培的椒类植物可以选自以下的物种：长辣椒(C.annuum)、黄灯笼椒(C.chinese)、风铃椒(C.baccatum)、小米辣(C.frutescens)、绒毛椒(C.pubescens)，优选地长辣椒。在一个实施方案中，本发明的椒类植物是近交系。在一个具体实施方案中，本发明的椒类植物是杂种，特别地F1杂种。包含赋予Ve427RB抗性的QTL的渐渗片段可以在椒类植物，近交系或F1杂种中处于杂合或纯合形式。
在一个实施方案中，本发明的椒类植物是甜椒植物。本发明的“甜椒”是其果实在史高维尔指标上具有0SHU和500SHU之间、优选地0SHU和200SHU之间、更优选0SHU和50SHU之间平均评分的椒类植物。在一个优选的实施方案中，甜椒的辛辣度约0个SHU。在另一个实施方案中，椒类果实的辣椒碱的量在0个和约30个ASTA辛辣单位之间，优选地在0个和13个ASTA辛辣单位之间，或甚至在0个和2个ASTA辛辣单位之间。在不同的实施方案中，本发明椒类植物的果实具有0和100之间、或0和500之间、或00和500之间、或500和1000之间、或1000和2000之间、或2500和5000之间或更大的SHU。在其他实施方案中，本发明椒类植物的果实评分在约5.000SHU和约20.000SHU之间或大于约25.000SHU，如在30.000和50.000SHU之间，或在50.000和100.000SHU之间，或在100.000和200.000SHU之间，或在100.000和350.000SHU之间或高于350.000SHU。
在又一个实施方案中，本发明的椒类植物是铃型椒类植物。通常，铃状椒是其成熟果实具有约1.5至约0.7的长/宽比和至少约7.5cm、8cm、9cm、10cm或更大例如在约7.5cm和约17.5cm之间平均果实长度的植物。优选地，成熟果实具有约1.3至约0.9的长/宽比和至少约7.5cm、8cm、9cm、10cm或更大的平均果实长度，例如在约7.5cm和约15cm之间的长度。果实颜色可以例如是绿色、红色、黄色、橙色、白色、彩虹状(在成熟的诸阶段之间)和紫色。北美洲铃状椒指约10cm长和约10cm宽的果实，而在欧洲，铃状椒可以在形状上呈较少块状并更修长。铃状椒是辣椒属内部的一个组并且属于长辣椒物种。在一个实施方案，铃形椒不产生辣椒碱或仅产生至多500个SHU或30个ASTA辛辣单位的辣椒碱。在一个优选的实施方案中，铃状椒不产生辣椒碱。在又一个实施方案中，铃形果实的形状与如“Capsicum PepperVarieties and Classification(新墨西哥州立大学,Circular 530,农业和家庭经济学学院(College of Agriculture and Home Economics),http://www.reocities.com/wstarron/circ530.pdf)”中所述的铃状椒的形状基本上相同。
在又一个实施方案中，本发明植物的成熟椒类果实的长/宽比是最多约4、最多约3.0、最多约2.5、最多约2.0、最多约1.5。
在又一个实施方案中，本发明植物的成熟椒类果实的宽度是在其最广宽度处至少约1.5cm、至少约2.0cm、至少约3.0cm、至少约4.0cm、至少约6cm、至少约7cm、至少约8cm、至少约9cm、至少约10cm或更多。
在又一个实施方案中，本发明植物的成熟椒类果实的宽度是在其最广宽度处至少4.0cm，如6.0cm或更大，7cm或更大，或8cm或更大cm，并且长/宽比是最多3，优选地最多2.5，优选地最多2.0，或最多1.5。
在又一个实施方案中，本发明的椒类植物是其种子的代表性样品已经在登录号NCIMB 41817或NCIMB 41818下保藏的椒类植物；或衍生自/可衍生自/获自/可获自种子保藏物NCIMB 41817或NCIMB 41818的椒类植物，例如其衍生的并保留VE427RB抗性的F1杂种。因此，在一个方面，包含VE427RB抗性的本发明辣椒属植物通过其种子以登录号NCIMB 41817或NCIMB 41818保藏的植物与另一个椒类植物杂交可获得/获得。
在一个优选实施方案中，提供针对VE427RB的抗性的渐渗片段可以是比NCIMB41817和/或NCIMB 41818中存在的片段更短的片段，所述更短片段仍赋予Tsw抗性突破性TSWV毒株抗性如Ve427RB抗性。包含较短渐渗片段的椒类植物可以通过与NCIMB 41817或NCIMB 41818繁育并选择保留Ve427RB抗性的重组子代来产生。例如NCIMB 41817或NCIMB41818可以与缺少渐渗片段的椒类植物杂交以产生F1植物，使F1自交以产生F2代(或任何进一步的世代)并例如使用本文所述的抗性测定法对F2代筛选具有Ve427RB抗性的植株。随后可以使用标准方法，例如分子标志物或FISH(荧光原位杂交)鉴定包含较短渐渗片段的重组植株。
本发明的又一个方面涉及本发明椒类植物的果实或这种椒类果实的果肉，即，果实的非繁殖部分。在一个实施方案中，本发明椒类植物的椒类果实具有有活力的种子，而在在另一个实施方案中，该果实仅包含无活力的种子或无种子(单性果实)。
本发明的一个实施方案涉及已收获果实的甚至在细胞组织培养条件下不适于增殖的组织或植物细胞。本发明植物的椒类果实可以选自本领域已知的广泛不同类型。例如，椒类果实可以具有以下类型：铃型(块状型)、卡伊恩型、辣姆优型(长块状型)、达尔西意大利型、圆锥型、卡皮阿型、甜查尔斯顿型、都玛型、樱桃型、加拉佩诺椒型、沙奎拉型、铅笔型或热辣查尔斯顿型、希维尔型(例如Demre希维尔型或Kazanli希维尔型)、匈牙利蜡型、卡皮亚/弗洛里纳型、香蕉型、弗雷斯诺型、塞拉诺型、安寇椒型、阿纳海姆型、帕西拉型、圣塔非型、苏格兰帽型、哈瓦那型。不同类型椒的一些示例性但非限制性图片在Bosland等人(1996)中公开。果实也可以具有任何颜色。
本发明的又一个方面涉及如本文所述的VE427RB抗性植株的种子或可以从中培育出如本文所述的VE427RB抗性植株的种子。
又一个实施方案涉及本发明的辣椒属植物作为亲本在与另一个辣椒属植物杂交中的用途。还提供一种产生包含VE427RB抗性的其他辣椒属植物的方法，即，将赋予VE427RB抗性的渐渗片段从本发明的植株(例如从本文中所保藏的种子或其子代)转移至其他辣椒属植物中或通过将包含赋予VE427RB抗性的QTL的基因组DNA片段从PA2638转移至栽培的辣椒属植物中。
又一个方面涉及包含遗传元件的本发明植物的植物细胞，其中所述遗传元件包含赋予VE427RB抗性的QTL或其赋予VE427RB抗性的部分。在一个实施方案中，这类植物细胞是可再生细胞，即可以将它们再生成具有VE427RB抗性的完整椒类植物。在另一个实施方案中这类细胞是不可再生的。在又一个方面，提供包含本发明植物的细胞或由其组成的体外细胞培养物或体外组织培养物。细胞和组织可以是包含赋予VE427RB抗性的遗传元件的花粉、子房、胚、叶、茎、下胚轴、子叶、果实部分、分生组织或其他细胞/组织。还提供再生的植株。
可以通过各种方法，如本文中公开的VE427RB抗性测定法测试植株抵抗Tsw抗性突破性毒株如VE427RB的抗性。本文描述的VE427RB抗性测定法适于确定针对野生型(WT；P0)和抗性突破性(RB)致病型(P1)的抗性，同样地，即它不限于确定针对VE427RB的抗性并且可以用来鉴定其他Tsw抗性突破性毒株和鉴定针对其他P1致病型的新抗性源。在本文所述的不同实施方案中，VE427RB可以因此替换为在包含Tsw基因的辣椒属植物上的确造成全身症状的其他Tsw抗性突破性毒株。可以理解，这类实施方案同等地是本发明的实施方案。
抗性测定法
为了鉴定和/或选择包含赋予VE427RB抗性的渐渗片段的本发明辣椒属植物，可以使用以下抗性测定法或备选的测定法。以下描述在实施例中使用的测定法和可以确定植物品系或品种是否包含赋予VE427RB抗性的本发明遗传元件的测定法。技术人员可以同等地调整已公开的测定法或例如基于P1致病型(优选地VE427RB)田间感染、基于传播P1的伤害性昆虫或基于不同人工接种测定法，开发不同的测定法。使用的测定法应当优选地能够通过例如在感染或接种例如下端叶后(基本上)不存在全身症状(或无病毒粒子的全身性存在)鉴定包含赋予抗性的遗传元件(例如渐渗片段)的辣椒属植物，同时易感对照植物形成全身症状。当然，不同测定法可以利用确定植株是否抵抗或易感的不同方式，但是无论测定法是什么，如果在本文所述的VE427RB抗性测定法中植株(再)测试并且根据本发明测定法确定它们包含VE427RB抗性，则它们的确包含赋予VE427RB抗性的本发明遗传元件。
致病型接种物的制备
致病型如P0或P1可以作为感染的本生烟草(N.benthamiana)叶或叶汁长期贮存在液氮中。
在将它用于椒品系的人工接种试验之前，不携带任何TSWV抗性基因的易感植物(如本生烟草或辣椒属植物)可以用该致病型感染以检验所述致病型的活性(例如可以感染5个或更多个植株)。作为阴性对照，也可以任选地感染抗性植株(例如用于P1的保藏物NCIMB 41817和NCIMB 41818和NCIMB 41936的长辣椒植物和用于P0的具有Tsw基因的辣椒属植物)。
如果易感植物形成全身症状，则证实接种物的活性。这些植株的出现症状的叶(由叶上的黄色斑驳鉴定)可以用于接种待测试的椒品系。电子显微术可以用来排除其他病毒的存在。
本发明的TSWV抗性测定法
在本发明的TSWV抗性测定法(如VE427RB抗性或P0抗性测定法或另一种P1抗性测定法)中，待测试一个或多个TSWV致病型抗性的植物品系或品种的许多植株在与许多对照相同的条件下播种并栽培。致病型例如是P1(VE427RB，其代表性样品已经以登录号DSM 24829保藏在DSZM)或P0(野生型TSWV毒株，例如，具有Tsw基因的植物如黄灯笼椒PI152225抵抗的TSWV毒株；这种野生型毒株例如是可以通过其S-区段序列(GenBank登录号：DQ376178)鉴定的p105WT。通常，播种每种致病型至少5个或更多个、至少10个或更多个、至少12个或更多个、至少15个或更多个、至少20个或更多个植株(测试植株)并栽培直至它们具有两片子叶和5至6片真叶。生长条件例如是在供水充足在26℃/18℃昼/夜伴以约14小时光期间的温室中。光源例如是Philips SON-T400钠灯，光合活性辐射120μmol*秒-1*m-2μ[PAR]。生长培养基例如是土壤如一半草坪草一半坑(half turf and half pit)。在实施例中的VE427RB抗性测定法期间使用相同条件。技术人员充分知晓椒类植物的生长条件。使用相同的生长条件，还栽培对照植物。通常而言，对照植物可以分成两类：植株抵抗特定致病型，如抵抗致病型P0或P1的植株，和已知易感所述特定致病型的植株。技术人员将理解两个类型的对照植物均应当优选地是抗性测定法的部分。在每种测定法中，部分对照植物将用缓冲液和目的致病型的混合物处理并且部分对照植物将仅用缓冲液处理。仅用缓冲液接种的对照植物应当在测定法结束时保持无症状，即这些植物应当既不显示病毒感染的局部症状，也不显示全身症状。
通常而言，首次以机械方式接种具有两片子叶和5至6片真叶的植株的两片最年幼但充分发育的叶(例如通过将接种物即缓冲液和致病型的混合物喷洒到叶片上)。在例如5日后，进行接种叶的第二次机械接种。
为了接种待测试植株的两片最年幼叶，将感染的本生烟草叶在液氮中冷冻，研磨成粉末并例如将1g叶粉与5ml保罗缓冲液(磷酸盐缓冲液0.05M pH7，DIECA(二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物)0.005M，EDTA-Na20.001M，巯基乙酸钠0.005M)混合。任选地，该缓冲液可以含有着色剂如活性碳粉以标记经接种的叶，与未接种的叶相比较，由活性碳残余物引起经接种叶的更深颜色。可以将混合物例如喷洒在待接种的叶上。
作为阴性对照，通常而言，可以仅用缓冲液机械地接种具有两片子叶和5至6片真叶的对照植物的两片最年幼但充分发育的叶。
如果植株的上端未接种叶在用特定病毒毒株第一次接种后28日基本上无病毒诱导症状(黄色斑驳)的迹象，即这些植物基本上不显示全身症状，则认为该植株具有抗性。可以在例如5日、6日或7日后对每个植株评估接种叶上症状的首次观察和试验植株和对照植物的上端未接种叶的全身症状的首次观察。可以在例如12日、13日或14日评估第二次观察。可以在例如28日、29日或30日评估第三次观察。应当指出上端未接种的叶仅在比第一次接种的时间点更晚的阶段由植株充分发育形成。
在一个实施方案中，与抗性测定法中试验植株的量相比较，每种分类下对照植物的数目(例如用致病型处理或仅用缓冲液处理的易感对照植物和/或用致病型处理或仅用缓冲液处理的抗性对照植物)占至少5％、10％、25％、50％，然而，抗性测定法中对照植物的每种分类下植株的数目是至少1，优选地至少5，或至少10；或对照植物的数目等于抗性测定法中试验植株的数量。在一个实施方案中，每个试验进行至少两个或更多个重复。在一个实施方案中，相同品系/品种的测试植株的量是每个分类至少5、6、10、12、15或20个试验植株(用致病型处理或仅用缓冲液处理的试验植物)。
分析
在VE427RB抗性测定法中，使用VE427RB作为致病型。同样地，在P0抗性测定法中，使用P0如p105WT或Ve430WT作为致病型。
例如在本文所述的测试条件或等同测试条件下，如果(在分别用VE427RB或P0接种叶后)在上端未接种的叶上基本上无全身症状出现，而在易感对照植物中全身症状出现在上端未接种的叶上，则试验植株可以分别归类为“抵抗VE427RB”或“抵抗P0”。
“全身症状”指在未用TSWV接种的叶上、优选在上端叶上形成的TSWV症状，尤其是黄色斑驳。
“局部症状”指在用TSWV接种(和任选地用例如碳粉标记)的叶上形成的TSWV症状，特别地坏死性损害。
在如本文所述的测定法中的植物品系或品种“基本上无全身症状”意指植物品系或植物品种的大部分测试植株，即至少60％在上端未接种的叶上不显示(病毒引起的)全身性黄色斑驳(褪绿)的任何迹象，而全部易感对照植物显示全身症状。在一个实施方案中，至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％或甚至100％的测试植株在上端未接种的叶上不显示(病毒引起的)全身性黄色斑驳(褪绿)的任何迹象。
“黄色斑驳”是技术人员已知的椒上TSWV全身性感染的典型症状。“黄色斑驳”指黄色斑驳/点/面积的区域。
如本文所用的“坏死性损害”是坏死在接种叶处出现的深色小区域。
因此，在一个实施方案中，与仅用缓冲液接种的对照植物相比较，显示基本上无全身症状(即在未接种的上端叶上无黄色斑驳)的测试植株在接种叶上基本上显示坏死性损害。这是抗性植株对抗致病型的局部反应。“基本上显示/形成局部坏死性损害”的植株指例如在人工接种后约28日，至少60％、优选地至少70％、80％、更优选地至少90％、92％、93％、95％、98％、99％或100％在接种的叶上显示坏死性损害。
然而，技术人员是知晓，还可以或备选地通过使用例如基于病毒NSs蛋白在作为VE427RB抗性主体的植株的上端未接种叶中存在或不存在的ELISA(酶联免疫吸附测定)或如本文所述的P0抗性测定法，确定在本文中所述的抗性测试条件下(与仅用缓冲液接种或是已知对抗特定致病型(例如，Ve427RB)的对照植物相比)病毒在上端未接种叶中的存在/不存在。因此，评估全身症状存在/不存在(和抗性存在/不存在)的备选的或额外方式是测试TSWV病毒粒子是否可能存在于上端未接种的叶中。
Ve427RB抗性辣椒属植物的产生
可以通过许多方法产生包含来自野生辣椒属植物的渐渗片段所赋予(例如获自PA2638或其他Ve427RB抗性的野生辣椒属植物)的Ve427RB抗性的辣椒属植物，特别地是栽培的辣椒属植物。在一个优选实施方案中，通过非转基因方法产生，优选地通过育种方法产生辣椒属植物，包括选自杂交、自交、回交、双单倍体产生、胚拯救、标志物辅助育种、原生质体融合等或其组合的一个或多个方法。
本发明还涉及一种产生Ve427RB抗性辣椒属植物的方法，所述方法包括步骤：执行用于检测赋予Ve427RB抗性的定量性抗性基因座(QTL)在如上文所述的本发明供体椒类植物中存在的方法，和将包含至少一个QTL或其赋予Ve427RB抗性的部分的遗传元件/核酸序列从所述供体植物转移至Ve427RB易感受体辣椒属植物中。所述核酸序列的转移可以通过本文前述的任何方法进行。
在一个实施方案中，用于鉴定Ve427RB抗性辣椒属植物的方法包括：
a)通过例如进行如本文所述的Ve427RB抗性测定法，筛选抗Ve427RB的辣椒属植物或品系或品种，
b)鉴定在Ve427RB感染后不形成全身症状的辣椒属植物或品系或品种。
鉴定的植物品系或品种随后可以进一步用于例如回交方案或其他常规育种方案中，以产生Ve427RB抗性辣椒属植物(优选地长辣椒)，优选地具有良好农艺学特性并包含Ve427RB抗性QTL的栽培种或品种。
在一个实施方案中，用于产生Ve427RB抗性辣椒属植物的方法包括：
a)通过例如进行如本文所述的Ve427RB抗性测定法，筛选抗Ve427RB的辣椒属植物或品系或品种，
b)鉴定在Ve427RB感染后不形成全身症状的辣椒属植物或品系或品种，
c)将所述鉴定的植物或品系或品种与另一个辣椒属植物(例如，缺少Ve427RB抗性的植物)杂交以产生F1植物，
d)将F1植株自交和/或杂交(例如回交)一次或多次以产生包含Ve427RB抗性的子代辣椒属植物。
在步骤a)中，辣椒属植物品系或品种可以在一个实施方案中是野生辣椒属植物，或它可以是栽培的辣椒属植物。在一个实施方案中，步骤a)中的植株是选自以NCIMB41817、NCIMB 41818和NCIMB 41936保藏的植株或其子代，其中子代植株包含Ve427RB抗性。
在步骤b)中，如果至少60％、优选地至少70％、80％、更优选地至少90％、92％、93％、95％、98％、99％或100％的Ve427RB感染植株不形成全身症状，则可以将植株确定为包含Ve427RB抗性。在步骤c)，向其中引入Ve427RB抗性的植株优选地是栽培的辣椒属植物，优选地是缺少Ve427RB抗性的原种繁育系或品种。任选地，这种植株包含Tsw抗性，从而在步骤d)中形成的子代植物包含显性Tsw抗性基因和赋予Ve427RB抗性的遗传元件。可以通过例如分子标志物分析和/或在如本文所述的抗性测定法或任何其他测定法中鉴定包含Tsw抗性的植株，其中辣椒属植物抵抗(即例如在如实施例中所述的TSWV抗性测定法中不形成全身症状)野生型TSWV毒株(致病型P0)，如p105WT，或其他毒株。
在步骤d)中，可以通过多种方法(如Ve427RB抗性测定法或相似测定法，在其中存在Ve427RB毒株的区域内田间试验等)证实赋予Ve427RB抗性的遗传元件在子代植物中的存在。任选地，还可以通过标志物和/或TSWV抗性测定法证实Tsw基因的存在。
另一个实施方案提供一种将Ve427RB抗性从一个辣椒属植物转移至缺少Ve427RB抗性的另一个辣椒属植物中的方法。该方法包括通过杂交Ve427RB抗性供体辣椒属植物，将来自Ve427RB抗性供体辣椒属植物的渐渗片段转移至Ve427RB易感受体辣椒属植物中。这种转移可以因此通过使用传统育种技术适当地完成。通过使用标志物辅助选择(MAS)，将包含赋予Ve427RB抗性的QTL的渐渗片段优选地渐渗至商业化的辣椒属品系或品种中。标志物辅助育种或标志物辅助选择涉及使用一个或多个分子标志物鉴定并选择含有一个或多个编码所需性状的基因的那些后代植株。在这种情况下，这种鉴定和选择基于选择本发明的QTL或与之相关的标志物或与渐渗片段相关的标志物(即对渐渗片段特异的标志物)。
MAS也可以用来形成携带目的QTL的近等基因系(NIL)，允许更详细地研究每种QTL效应，并且还是一种用于形成回交近交系(BIL)群体的有效方法。根据这个实施方案形成的辣椒属植物可以有利地从受体植物衍生它们的大部分性状并从供体植物衍生Ve427RB抗性。如上简短讨论，传统育种技术可以用来将编码Ve427RB抗性的核酸序列渐渗入Ve427RB易感的受体辣椒属植物中。在一种称作系谱育种的方法中，显示抵抗Ve427RB并包含编码Ve427RB抗性的核酸序列的供体辣椒属植物与优选显示商业上希望有的特征(如，但不限于抗病性、昆虫抗性、有价值的果实特征等)的Ve427RB易感性受体辣椒属植物杂交。所产生的植物种群(代表F1杂种)随后自我授粉并结出种子(F2种子)。随后筛查从F2种子培育的F2植株对Ve427RB的抗性。备选地或额外地，可以对一个或多个进一步的世代如F3、F4或BC1或BC2世代筛选Ve427RB抗性。可以例如根据本文所述的抗性测定法筛选种群或可以例如使用替代性抗性测定法和/或标志物辅助选择以证实从抗性测定法获得的结果，并且因此，几种方法也可以组合使用。
可以使用技术轮回选择和回交、自交和/或双单倍体或用来产生亲本系的任何其他技术，形成近交Ve427RB抗性辣椒属植物品系。在轮回选择和回交法中，可以通过回归亲本与不同于回归亲本并在本文中称作“非回归亲本”的第一供体植物杂交，将Ve427RB抗性渐渗入靶受体植物(回归亲本)中。回归亲本是无抗性或具有低水平Ve427RB抗性(例如，在Ve427RB接种后，在本发明测定法的至少10个植物中至少约60％、至少约70％、至少约80％显示全身症状)并拥有商业上希望有的特征(如，但是不限于(额外的)抗病性、昆虫抗性、有价值的果实特征等)的植物。非回归亲本可以是与回归亲本杂交可育的任何植物品种或近交系。将回归亲本和非回归亲本之间杂交产生的子代与回归亲本回交。随后对所产生的植物种群筛选所需的特征，这种筛选可以按众多不同的方式进行。例如，可以使用表型病理学筛选如本文所述的抗性测定法，如本领域已知采用Ve427RB的定量性生物测定法和/或标志物辅助选择(MAS)，筛选该种群。
应当牢记，例如当渐渗隐性基因座时，由该基因座赋予的表型将仅在其中形成对该基因座纯合的植株的条件下在后代植株中表达。
通常而言，一种将所需性状如Ve427RB抗性引入杂种辣椒属品种中的方法包括步骤：
(a)将近交辣椒属亲本与包含一个或多个所需性状的另一个辣椒属植物杂交以产生Fl子代植株，其中一个所需性状是Ve427RB抗性，并且使Fl子代植株自交一次或多次以产生F2、或F3或进一步的世代；
(c)例如使用如本文定义的TSWV抗性测定法，从所述F2或F3或其他代的子代植株选出具有所需性状的那些植株；
(d)任选地，使选择的子代植株与所述近交辣椒属亲本植株回交以产生回交子代植株；
(e)任选地，选择具有所述近交辣椒属亲本植株的所需性状和形态特征和生理学特征的回交子代植株，其中所述选择例如包括如本文所述的抗性测定法；
(f)任选地连续重复步骤(d)和(e)两次或更多次以产生选择的第三或更高级的回交子代植株；
(g)任选地使选择的回交子代自交以鉴定纯合植株；
(h)任选地使至少一个所述回交子代或杂交植株与另一个近交辣椒属亲本植物杂交，以产生在相同环境条件下生长时具有所需性状和杂交辣椒属品种的全部形态特征和生理学特征的杂交辣椒属品种。
如所述，终末回交世代可以自交以提供包含处于纯合形式的Ve427RB抗性的纯繁育(近交)子代。因此，轮回选择、回交和自交的结果是产生这些品系，所述品系对与Ve427RB抗性相关的基因以及与商业目的性状相关的其他基因是遗传同源的。
所产生的F1杂交辣椒属植物可以包含赋予处于纯合形式或处于杂合形式的Ve427RB抗性的遗传元件。因此，在一个实施方案中，提供两个近交亲本系，各自具有良好农艺学特征并且各自包含赋予处于纯合形式的Ve427RB抗性的遗传元件，从而F1杂种包含赋予处于纯合形式的Ve427RB抗性的遗传元件。在另一个实施方案中，提供两个近交亲本系，各自具有良好农艺学特征，但仅一个近交亲本系包含赋予处于纯合形式的Ve427RB抗性的遗传元件，而另一个缺少赋予Ve427RB抗性的遗传元件，从而F1杂种包含赋予处于杂合形式的Ve427RB抗性的遗传元件。优选地，近交亲本系(和F1杂种)属于物种长辣椒并产生良好质量的椒类果实。在一个实施方案中，椒类果实是铃状椒，但是可以提供任何其他果实形状/类型和任何颜色。
因此，使用辣椒属植物，优选地长辣椒植物，作为F1杂交辣椒生产中的亲本，其中所述F1杂交亲本包含赋予Ve427RB抗性的遗传元件。在一个实施方案中，遗传元件可获自选自NCIMB 41817、NCIMB 41818和NCIMB 41936的登录号所保藏的种子或其子代，由此子代植株包含Ve427RB抗性。
还提供本文所述的任何植物的种子，特别是可以从其生长出上文所述的F1杂种的种子和/或可以从其生长出包含Ve427RB抗性的近交长辣椒的种子，其中该抗性是如存在于以登录号NCIMB 41817、NCIMB 41818和/或NCIMB 41936保藏的种子中的抗性；即其中Ve427RB抗性可获自/能获自所述种子。
植物育种的目的是在单个品种中组合多个有利的性状。对于商业作物，这些性状可以包括疾病和昆虫抗性、耐热性和耐旱性、缩减作物成熟时间、更大的产量和更好的农艺学品质、果实均匀度等。植物特征如萌发和植物群丛建立(stand establishment)、生长速率、成熟和植株高度的均匀度也可以是重要的。
通过利用植物授粉方法的技术繁育商业作物。如果来自一朵花的花粉转移至相同植物的同一朵或另一朵花，则该植物自我授粉。当相同家族或品系内部的个体用于授粉时，植物进行同胞授粉。如果花粉来自源于不同家族或品系的不同植株上的花，则植物杂交授粉。已经自我授粉并且就类型而选择许多世代的植株在几乎全部基因座处变得纯合并且产生均匀的纯合子代种群。两个不同纯合系之间的杂交产生可以相对于许多基因座而言杂合的均匀杂交植株种群。各自在许多基因座处杂合的两个植株的杂交将产生在遗传上不同并且将不均一的异质性植物种群。
在辣椒属植物育种计划中形成杂交椒类品种涉及三个步骤：(1)从多种种质池选择植物用于初始育种杂交；(2)从育种杂交选择的植物自交几个世代以产生一系列的近交系，所述近交系各自纯育并且是高度均一的；和(3)将选择的近交系与非相关近交系杂交以产生杂交子代(F1)。在足够量的近交后，连续的子代将仅发挥以下作用：增加已形成近交植物的种子。优选地，近交系应当在其约95％或更多的基因座处包含纯合等位基因。
近交系的纯合性和均匀性的重要后果在于通过一对限定的近交种杂交所产生的杂种将总是相同的。一旦已经鉴定到产生优越杂种的近交种，可以利用这些近交亲本产生杂交种子的持续供应并且随后可以从这种杂交种子供应产生杂交辣椒属植物。
本发明的一个方面涉及通过本发明方法可获得的Ve427RB抗性椒类植物或其部分。本发明的另一个方面涉及包含赋予Ve427RB抗性的QTL的Ve427RB抗性辣椒属植物或其部分，其中所述QTL不处于其天然遗传背景下。本发明的Ve427RB抗性椒类植物可以属于任何遗传类型，如近交、杂交、单倍体、双单倍体或转基因的。另外，本发明的植物可以对Ve427RB抗性性状杂合或纯合，优选地对其纯合。虽然本发明的QTL及其赋予抗性的部分可以转移至任何辣椒属植物以提供Ve427RB抗性辣椒属植物，但是本发明的方法和植物优选地与物种长辣椒的植物相关。本文所述的Ve427RB抗性近交辣椒属植物系可以用于额外杂交以产生Ve427RB抗性杂交植物。例如，本发明的第一Ve427RB抗性近交辣椒属植物可以与拥有商业所希望的性状(如，但是不限于抗病性、昆虫抗性、有利果实特征、所需的果实形状和果实大小等)的第二近交辣椒属植物杂交。这种第二近交辣椒属植物系可以具有或可以不具有Ve427RB抗性。优选地，这种第二近交辣椒属植物系具有Ve427RB抗性。
本发明的另一个方面涉及一种产生可以生长成Ve427RB抗性椒类植物的种子的方法。在一个实施方案中，该方法包括步骤：提供本发明的Ve427RB抗性辣椒属植物，使所述Ve427RB抗性植物与另一个辣椒属植物杂交，并收集因所述杂交产生的种子，当栽种时，所述种子产生Ve427RB抗性辣椒属植物。备选地，该方法包括步骤：提供本发明的Ve427RB抗性辣椒属植物并使植株自交，并收集因所述自交产生的种子。
在另一个实施方案中，该方法包括步骤：提供本发明的Ve427RB抗性辣椒属植物，使所述Ve427RB抗性植物与一个辣椒属植物杂交，收集因所述杂交产生的种子，将所述种子生长成植株，通过本文所述的任何方法选择Ve427RB抗性植株，使选择的植株自我授粉足够的世代数以获得就植株中赋予Ve427RB抗性的等位基因而言固定的植株，使如此产生的植株与具有所希望表型性状的辣椒属植物回交足够的世代数以获得具有Ve427RB抗性并具有所希望表型性状的辣椒属植物，并且收集来自最末回交产生的植株所产生的种子，当栽种时，所述种子产生具有Ve427RB抗性的辣椒属植物。
在一个用于产生Ve427RB抗性辣椒属植物的备选实施方案中，原生质体融合可以用于将核酸从供体辣椒属植物转移至受体植物。原生质体融合是两个或更多个原生质体(通过酶处理移除了细胞壁的细胞)之间诱导或自发的联合，如体细胞杂交，以产生单一的双核细胞或多核细胞。将融合的细胞(其甚至可以用自然界中不杂种繁殖的植物物种获得)体外培养并再生成显示所希望的性状组合的杂交植物。更具体地，第一原生质体可以从显示抵抗Ve427RB感染的辣椒属植物或其他植物品系获得。第二原生质体可以获自包含有商业价值的特征(如，但是不限于抗病性、昆虫抗性、有价值的果实特征等)的第二辣椒属植物或其他植物品系，优选地辣椒属植物系。随后使用本领域已知的传统原生质体融合方法融合原生质体。
备选地，胚拯救可以用于包含本发明QTL或其赋予Ve427RB抗性的部分的核酸从供体植物向受体植物的转移中。胚拯救可以用作从植物不能产生有活力种子的杂交中分离胚的方法。在这个方法中，将植物的受精子房或不成熟种子体外培养并再生以产生新植物。
另外，提供在每个细胞中包含赋予Ve427RB抗性的遗传元件的分离细胞、体外细胞培养物和组织培养物、原生质体培养物、植物部分、收获的材料(例如收获的椒类果实)、花粉、子房、花、种子、雄蕊、花部分等。因此，将所述细胞或组织再生或生长成完整辣椒属植物时，该植物包含Ve427RB抗性。
因此，还提供本发明植物的细胞或组织的体外细胞培养物和/或组织培养物。细胞或组织培养物可以用生芽和/或生根培养基处理以再生辣椒属植物。
本文还涵盖本发明植物的营养繁殖或无性繁殖。存在许多不同的营养繁殖技术。插枝(结节、茎尖、茎等)例如可以用于如上文所述的体外培养。还存在并且可以使用其他营养繁殖技术，如嫁接或空中压条。在空中压条中，允许一段茎发育成根，同时它仍与亲本植株连接，并且一旦足够的根已经形成，则将克隆植株与亲本分离。
因此，在一个方面，提供了一种方法，包括：
a)获得本发明植物的部分(例如细胞或组织，例如插枝)，
b)营养繁殖所述植物部分以从该植物部分产生相同植物。
因此，本发明植物的营养性植物部分用于无性/营养繁殖的用途也是本发明的一个实施方案。
也提供多种包含赋予Ve427RB抗性的遗传元件的收获椒类果实，还提供包含这类椒类果实的部分的食物或饲料产品。
在一个方面，果实是无种子果实。
保藏信息：
Tsw抗性突破性TSWV毒株Ve427RB的代表性样品由纽内姆公司于2011年4月19日在登录号DSM 24829下保藏在DSMZ(德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，茵霍芬街(Inhoffenstr.)7B，38124布劳恩斯切魏格(Braunschweig)，德国)。
包含Ve427RB抗性基因渐渗的长辣椒种子的代表性样品由纽内姆公司于2011年3月14日以登录号NCIMB 41817和NCIMB 41818保藏在NCIMB(NCIMB公司，弗格森大厦(FergusonBuilding)，克莱伯斯通庄园(Craibstone Estate)，巴克斯本(Bucksburn)，阿伯丁，AB219YA苏格兰，UK)。
PA2638的代表性样品由纽内姆公司于2012年2月23日以登录号NCIMB41936保藏在NCIMB(NCIMB公司，弗格森大厦，克莱伯斯通庄园，巴克斯本，阿伯丁，AB219YA苏格兰，UK)。
申请人要求生物材料和从其衍生的任何材料的样品仅应当根据EPC第32(1)条或具有相似条款和规章的国家或条约的相关法规让渡给指定专家，直至提出授予专利，或如果申请被拒绝、撤回或被视为撤回则从提交日起持续20年。
在本申请待决期间，在请求时由美国专利局局长确定有资格的人可获得保藏物。根据37C.F.R.§1.808(b)，当授予专利时，由保藏者强制的关于公众获得保藏材料的全部限制将不可撤销地解除。保藏物将维持30年时间或在最近请求后维持5年，或维持持续本专利的强制期限，按较长时间者计，并且如果在这个时间期间它甚至变得无活力，将予以更换。申请人不放弃根据本专利下关于本申请或根据植物品种保护条例(7 USC 2321等)的任何权利。
以下非限制性实施例阐述了产生本发明的椒类植物、种子和果实。本文中提到的全部参考文献通过引用的方式并入。
实施例
鉴定有效对抗Ve427RB的抗性源
天然感染条件下在西班牙阿尔梅里亚进行抗性筛选，其中突破抗性毒株Ve427RB和其相应野生型Ve430WT最初从此分离(Margaria等人(Plant Pathology 第53卷:第794页)。令人惊讶地，野生种质PA2638显示抵抗抗性突破性毒株Ve427RB。
在意大利都灵通过使用分离的Tsw抗性突破性毒株Ve427RB人工接种证实针对抗性突破性毒株Ve427RB的抗性。
接种方法和抗性评估如上文和下文进一步所述实施。局部症状和全身症状的示例性图片可以例如在Margaria等人(2007，MPMI第20卷:547-558)中找到。
对抗性突破性毒株Ve427RB和野生型(WT)毒株p105WT评价一组宿主物种上的症状发展。将每个基因型12个植株用Ve427RB或用野生型毒株接种。接种后，在7日、15日和28日后在接种的叶中评价局部症状并且在15日和28日后在上端未接种的叶中评价全身症状。
将待测试植株和对照植株在相同的条件下播种并生长直至它们具有两片子叶和5至6片真叶。生长条件是：温室，充足供水，温度：约26℃/18℃昼/夜，具有约14小时的光期间，光强度：约120μmol*秒-1*m-2μ[PAR]，生长培养基：土壤(一半草坪草一半坑(half turfand half pit))。
通过在叶上喷洒含有活性碳粉的缓冲液和Ve427RB的混合物，以机械方式接种具有两片子叶和5至6片真叶的植株的两片最年幼但充分发育的叶。在5日后，进行第二次机械接种。为了接种，将1g受感染的本生烟草叶的叶粉与5ml保罗缓冲液(磷酸盐缓冲液0.05M pH7，DIECA(二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物)0.005M，EDTA-Na20.001M，巯基乙酸钠0.005M)混合。喷洒待接种的叶直至它们在上表面湿润。技术人员将理解缓冲液的量取决于待覆盖的表面。因此，例如，约0.1ml、约0.2ml、约0.5ml、约0.7ml、约1.0ml、约1.5ml、约2.0ml、约2.5ml、约4.0ml缓冲液可以用来润湿叶的上表面。
通过接种易感本生烟草植株的叶证实每种致病型的活性。全部接种的本生烟草植株在28日后显示全身症状。作为阴性对照，通常而言，可以仅用缓冲液机械地接种具有两片子叶和5至6片真叶的植株的两片最年幼但充分发育的叶。在28日后没有检测到全身症状(或局部症状)。
使用携带Tsw基因并抵抗野生型p105WT(并对Ve427RB易感)的对照品种黄灯笼椒PI152225(命名为CV1)和不携带Tsw基因(并因此对p105WT易感并对Ve427RB易感)的对照品种Quadrato D’Asti(市售，见例如，http://www.macro librarsi.it/prodotti/peperone- quadrato-d-asti-5-gr-b525.php)(命名为CV2)作为对照系。但是，还可以使用已知/可以被鉴定为例如抵抗/易感野生型TSWV的其他对照系。下表1中显示结果。致病型P0(p105WT)接种的植株CV2和PA2638在第一次接种后28日显示全身症状，而CV1植株(包含Tsw抗性基因)不显示全身症状并且因此如预期那样抵抗野生型毒株。
相反，致病型P1(Ve427RB)接种的CV1植株显示全身症状，证实Tsw不有效对抗P1。然而，PA2638不显示全身症状。因此，这种野生种质的确抵抗P1并且接种部位处的局部坏死性反应似乎防止全身性病毒扩散。
表1–如上文抗性测定法部分中所述那样接种后28日，人工接种后的表型
Figure BDA0000596407490000321
Figure BDA0000596407490000331
实施例2–将针对P1(Ve427RB)的抗性渐渗入原种椒繁育系
为了有效控制TSWV致病型P0和P1，使用包含显性Tsw基因的原种椒繁育系，启动回交程序，从而PA2638衍生的抗性和Tsw基因赋予的抗性堆叠。
野生种质PA2638与属于块状铃型(长辣椒)并携带衍生自黄灯笼椒PI152225的Tsw基因的亲本系杂交。使F1子代自交至少两次。
使用公开的Tsw分子标志物的标志物分析证实PA2638不含显性Tsw基因，而原种块状型铃状椒(Blocky Bell pepper)繁育系的确含有Tsw基因。
在如实施例1中所述那样进行Ve427RB接种后，测试包含来自PA2638的渐渗片段的子代系的全身症状形成，表2中显示其结果。每个品系测试12个植株。第一次接种后28日评估全身症状(上端未接种的叶上的黄色斑驳)。
表2–第一次接种后28日不同品系的Ve427RB抗性测定结果。
Figure BDA0000596407490000332
选出对Tsw抗性突破性毒株Ve427RB具有基本上相同抗性水平的椒类植物(在其基因组中包含来自野生辣椒属(Capsicum)种质PA2638的赋予抗性的渐渗片段)。这些品系的种子以登录号NCIMB 41817和NCIMB 41818保藏。野生的辣椒属植物PA2638的种子以登录号NCIMB 41936保藏。

Claims (20)

1.用于鉴定抗Ve427RB的辣椒属植物的方法，包括：
a)通过实施Ve427RB抗性测定法，筛选辣椒属植物或品系或品种中的Ve427RB抗性，和
b)鉴定在Ve427RB感染后不形成全身症状的辣椒属植物或品系或品种；
其中所述毒株Ve427RB为其代表性样品已经在登录号DSM 24829下保藏的毒株，并且所述抗Ve427RB的辣椒属植物是选自以NCIMB 41817、NCIMB 41818和NCIMB 41936保藏的植株或其子代，其中子代植株包含Ve427RB抗性。
2.产生抗Ve427RB的辣椒属植物的方法，包括a)筛选辣椒属植物中的Ve427RB抗性，b)鉴定在Ve427RB感染后不形成全身症状的辣椒属植物，c)将所述经鉴定的植物与另一辣椒属植物杂交，以产生F1植物，d)将F1植株自交和/或杂交一次或多次以产生包含Ve427RB抗性的子代辣椒属植物；
其中所述毒株Ve427RB为其代表性样品已经在登录号DSM 24829下保藏的毒株，并且其中在步骤a)中，所述辣椒属植物是选自以NCIMB 41817、NCIMB 41818和NCIMB 41936保藏的植株或其子代，其中子代植株包含Ve427RB抗性。
3.权利要求2所述的方法，其中步骤c)中所述的另一辣椒属植物为缺少Ve427RB抗性的辣椒属植物。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中在步骤a)中，辣椒属植物品系或品种是野生辣椒属植物或栽培的辣椒属植物。
5.将Ve427RB抗性从一个辣椒属植物转移至缺少Ve427RB抗性的另一个辣椒属植物中的方法，所述方法包括通过杂交所述植物，将来自Ve427RB抗性供体辣椒属植物的渐渗片段转移至Ve427RB易感受体辣椒属植物中，其中所述Ve427RB抗性供体辣椒属植物是选自以NCIMB41817、NCIMB 41818和NCIMB 41936保藏的植株或其子代，其中子代植株包含Ve427RB抗性。
6.产生可以生长成Ve427RB抗性椒类植物的种子的方法，所述方法包括步骤：提供Ve427RB抗性辣椒属植物，使所述Ve427RB抗性植物与另一个辣椒属植物杂交，并收集因所述杂交产生的种子，当栽种时，所述种子产生Ve427RB抗性辣椒属植物，其中所提供的Ve427RB抗性辣椒属植物是选自以NCIMB 41817、NCIMB 41818和NCIMB 41936保藏的植株或其子代，其中子代植株包含Ve427RB抗性。
7.产生可以生长成Ve427RB抗性椒类植物的种子的方法，所述方法包括步骤：提供Ve427RB抗性辣椒属植物并使所述Ve427RB抗性植物自交，并收集因所述自交产生的种子，当栽种时，所述种子产生Ve427RB抗性辣椒属植物，其中所提供的Ve427RB抗性辣椒属植物是选自以NCIMB 41817、NCIMB 41818和NCIMB 41936保藏的植株或其子代，其中子代植株包含Ve427RB抗性。
8.包含细胞的椒类植物作为亲本产生椒类植物的用途，其中所述椒类植物是选自以NCIMB 41817、NCIMB 41818和NCIMB 41936保藏的植株或其子代，其中子代植株包含Ve427RB抗性，
其中所述细胞为辣椒属(Capsicum)的椒类植物的非可再生细胞，其抵抗番茄斑萎病毒(TSWV)的命名为Ve427RB的Tsw抗性突破性毒株，所述Ve427RB的代表性样品已经在登录号DSM 24829下保藏并且所述辣椒属的椒类植物包含不处于其天然遗传背景下的遗传元件，所述遗传元件包含赋予Ve427RB抗性的QTL或其赋予Ve427RB抗性的部分。
9.椒类植物的用途，用于制备抵抗番茄斑萎病毒(TSWV)的命名为Ve427RB的Tsw抗性突破性毒株的另一椒类植物，其中所述抗性衍生自在登录号NCIMB 41817、NCIMB 41818和NCIMB 41936下保藏的种子。
10.根据权利要求8所述的用途，其中通过将代表性种子在登录号NCIMB 41936下保藏的野生种质PA2638的植物与另一个椒类植物杂交或通过将种子在登录号NCIMB 41817或NCIMB 41818下保藏的植物与另一个椒类植物杂交可获得所述辣椒属的椒类植物。
11.根据权利要求8或10所述的用途，其中至少60％被Ve427RB感染或用其接种的植株不发展出全身症状。
12.根据权利要求8和10-11中任一项所述的用途，其中所述辣椒属的椒类植物产生选自以下类型的果实：块状铃型(blocky bell type)、卡伊恩型(Cayenne type)、辣姆优型(Lamuyo)、达尔西意大利型(Dulce Italiano)、圆锥型(Conical)、卡皮阿型(Capia)、甜查尔斯顿型(Sweet Charleston)、都玛型(Dolma)、樱桃型(Cherry)、加拉佩诺椒型(Jalapenotype)、沙奎拉型(Shakira)、铅笔型(Pencil)或热辣查尔斯顿型(Hot Charleston)、希维尔型(Sivri)、匈牙利蜡型(Hungarian Wax)、卡皮亚型(Kapya)、香蕉型(banana)、安寇椒型(ancho)、弗雷斯诺型(Fresno)、塞拉诺型(Serrano)、阿纳海姆型(Anaheim)、帕西拉型(Pasilla)、圣塔非型(Santa Fe)、苏格兰帽型(Scotch bonnet)和哈瓦那型(Habanero)。
13.根据权利要求8和10-11中任一项所述的用途，其中所述辣椒属的椒类植物产生的果实是铃型(bell type)或辣姆优型(Lamuyo type)。
14.根据权利要求8和10-13中任一项所述的用途，其中所述辣椒属的椒类植物是近交系或F1杂种。
15.根据权利要求8和10-14中任一项所述的用途，在所述非可再生细胞的基因组中还包含Tsw抗性基因。
16.根据权利要求15所述的用途，其中用野生型TSWV毒株感染或接种后，所述辣椒属的椒类植物不显示全身症状。
17.根据权利要求15所述的用途，其中用选自Br01WT、p105WT、Ve430WT、Br20WT和p170WT的野生型TSWV毒株感染或接种后，所述辣椒属的椒类植物不显示全身症状。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的用途，其中Tsw抗性基因的存在是通过使用DNA标志物可检测的。
19.根据权利要求8和10-18中任一项所述的用途，其中所述辣椒属的椒类植物是长辣椒(Capsicum annuum)物种的经栽培椒类植物，其包含Tsw抗性基因并包含针对Ve427RB的抗性，所述Ve427RB的代表性样品已经在登录号DSM 24829下保藏，其中所述椒类植物属于这样的品系，所述品系在Ve427RB抗性测定法中测试的至少60％植株在第一次用毒株Ve427RB接种约28日后在上部未接种的叶上不显示全身症状。
20.根据权利要求8和10-19中任一项所述的用途，其中通过将种子在登录号NCIMB41817、NCIMB 41818和NCIMB 41936下保藏的植物与另一个椒类植物杂交可获得所述抗性。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160319300A1 (en) * 2013-12-20 2016-11-03 ISI Sementi s.p.a. Isolated nucleotide sequence from solanum lycopersicum for improved resistance to tomato spotted wilt virus, tswv.
US20190100768A1 (en) * 2017-08-28 2019-04-04 Tierra Seed Science Pvt. Ltd. Tospovirus Resistant Plants and Methods Thereof
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EP4082332A4 (en) * 2019-12-24 2024-01-24 Kikkoman Corporation SOLANACEOUS PLANT AND SOLANACEOUS PLANT CELL HAVING RESISTANCE TO TOMATO BLANK DISEASE VIRUS, AND METHOD FOR PRODUCING SOLANACEOUS PLANT
US20230232762A1 (en) * 2020-06-10 2023-07-27 Nunhems B.V. Capsicum annuum plants having improved thrips resistance
CN111903448B (zh) * 2020-08-24 2021-10-12 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 一种辣椒植株培育方法
CN111961753B (zh) * 2020-09-28 2022-07-01 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 一种辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的snp标记及其特异性引物和应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040015044A (ko) 2001-09-10 2004-02-18 독립행정법인농업생물자원연구소 식물 바이러스 이동 단백질에 결합하는 식물 단백질을이용한 바이러스-저항성 부여
US8071862B2 (en) * 2007-08-30 2011-12-06 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Habanero pepper hybrid PX11423486
US8138398B2 (en) * 2008-02-14 2012-03-20 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Sweet pepper hybrid 9942815
KR101112181B1 (ko) * 2009-04-23 2012-02-24 서울여자대학교 산학협력단 잠두시들음 바이러스-2에 대해 저항성을 가지는 형질전환 식물체

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Evidence That the Nonstructural Protein of Tomato spotted wilt virus Is the Avirulence Determinant in the Interaction with Resistant Pepper Carrying the Tsw Gene;P. Margaria etal;《NPMI》;20071231;第20卷(第5期);第547–558页 *
Field isolates of tomato spotted wilt virus overcoming resistance in capsicum in Australia;M.Sharman etal;《Australasian Plant Pathology》;20061231;第35卷;第123-128页 *
抗疫病辣椒杂交组合YC-1的选育;杨新成等;《长江蔬菜（学术版）》;20130131(第2期);第16页左栏第2-3段及右栏第1-4段 *
辣椒品种抗疫病鉴定方法的初步研究;林柏青等;《中国蔬菜》;19941231(第4期);第21-24页 *

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