KR101434218B1 - 오이 모자이크 바이러스에 대하여 저항성을 가지는 siRNA 를 코딩하는 뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터, 및 이에 의하여 형질 전환된 오이 모자이크 바이러스에 대하여 저항성을 가지는 식물 - Google Patents

오이 모자이크 바이러스에 대하여 저항성을 가지는 siRNA 를 코딩하는 뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터, 및 이에 의하여 형질 전환된 오이 모자이크 바이러스에 대하여 저항성을 가지는 식물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 오이 모자이크 바이러스에 대하여 저항성을 가지는 siRNA 를 코딩하는 뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터, 및 이에 의하여 형질 전환된 오이 모자이크 바이러스에 대하여 저항성을 가지는 식물에 관한 것이다.
본 발명에 의한 오이 모자이크 바이러스에 대하여 RNA 간섭을 유도하는 siRNA 는 가장 넓은 범위를 갖는 오이 모자이크 바이러스를 타겟으로 하기 때문에 높은 바이러스 저항성 효율을 기대할 수 있으며, 오이 모자이크 바이러스가 감염시킬 수 있는 모든 작물의 형질 전환 식물체 제작에 활용 가능하다.

Description

오이 모자이크 바이러스에 대하여 저항성을 가지는 siRNA 를 코딩하는 뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터, 및 이에 의하여 형질 전환된 오이 모자이크 바이러스에 대하여 저항성을 가지는 식물{NUCLEOTIDE CODING siRNA HAVING CMV VIRUS RESISTANCE, RECOMBINANT VECTOR COMPRISING THE SAME, AND TRANSFORMED PLANT WITH SAME}
본 발명은 오이 모자이크 바이러스에 대하여 저항성을 가지는 siRNA 를 코딩하는 뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터, 및 이에 의하여 형질 전환된 오이 모자이크 바이러스에 대하여 저항성을 가지는 식물에 관한 것이다.
오이모자이크 바이러스(cucumber mosaic virus; CMV)는 식물 바이러스 중에서도 기주 범위가 가장 넓은 식물병원성 바이러스로서, 직경이 약 30nm되는 구형바이러스 (Icosahedral virus) 이며, 브로모비리다에(Bromoｖiridae)과 쿠쿠모비루스(Cucumo virus)속의 대표적인 종으로 지구의 온대, 아열대 및 열대의 지역에서 많은 중요한 농산물에 감염시켜 경제적으로 큰 피해를 초래하고 있다. 식물이 CMV에 감염되면 잎, 줄기 및 과실에 모자이크 증상이 나타나며, 특히 병에 걸린 잎은 작아지고 쪼글쪼글해지며 잎맥을 따라 괴리가 생기게 되고, 과실에는 녹색농담의 모자이크가 나타나며 울퉁불퉁해져 상품가치가 떨어지게 된다.
이 바이러스는 아마 바이러스 중에 가장 많은 기주 식물종 (host plant species)을 감염시킬 수 있는 것으로 알려져 있으며, 한 연구 결과에 의하면 85속 800종이 넘는 식물에 감염한다. 이 바이러스는 중국 동부, 크로아티아, 프랑스, 이집트, 그리스, 이스라엘, 이탈리아, 일본, 폴란드, 포르투갈, 스웨덴, 그리고 미합중국 북부 등의 많은 나라들에서, 바나나, 호박, 셀러리, 콩류, 양상추, 고추, 토마토 및 담배 등의 작물에 감염하여, 모자이크, 실엽, 황화, 왜화, 회저 등의 병해를 생기게 함과 동시에 과실이나 잎의 품질을 저하시키고 또 수확량도 저하시키고 있는 것으로 알려졌다. 예를 들면 토마토 소비량이 많은 지중해 연안에 있어서 통조림용 토마토의 CMV의 발생은 지금까지 경제적으로 몹시 심각한 문제였다. 1972년 프랑스의 아르자스 지방에서 발생한 토마토 과실의 괴사병에 이어, 다시 1987년 이탈리아와 스페인의 토마토 주요 산지에서 CMV가 돌연 대발생하여 모든 토마토 작물에 피해를 미치고 궤멸 상태가 되었다(The American Phytopathological Society편, Plant Virus Disease Control, p.507을 참조).
이와 같이 많은 지역에서 다종 다양한 작물에 감염하여 대단한 경제적 피해를 미치는 오이모자이크 바이러스 등 식물병 바이러스로부터 식물의 감염을 방지하기 위한 방법들이 개발된 바 있는데, 이와 관련된 종래기술들을 살펴보면, 대한민국 특허등록 제293,567호에서는 국내에서 분리한 CMV 외피 단백질 유전자를 토마토에 형질 전환시켜 CMV에 대한 저항성 계통을 개발하는 방법을 개시하고 있고, 대한민국 특허출원 제1993-0029605호에는 작물에 병을 일으키는 CMV에 대하여 저항성을 갖는 형질전환 작물을 제조하기 위해 CMV 외피 단백질 유전자의 RNA를 공격하는 망치머리형 라이보자임이 개시된 바 있다. 그러나 상기 종래기술들에 의한 병 저항성 품종들의 개발 방법은 병 저항성 인자들을 갖는 다른 품종으로부터 계속적인 역교배를 통해 그 인자를 도입하여야 하며, 도입 단계마다 저항성 시험을 거쳐 선발해야 하는 등 복잡한 방법으로 인한 많은 시간이 소요되는 문제점이 있다.
오이 모자이크 바이러스를 포함하는 식물 바이러스의 치료는 현재까지는 불가능한 상태이며, 바이러스 저항성 식물의 육성이 유효한 대안으로 제시되고 있다. 바이러스에 저항성을 갖는 내성 변종식물을 생산하는 방법에는 최근 RNA간섭현상(RNA interference, RNAi)를 이용한 식물형질전환 방법에 대한 연구가 각광받고 있다.
RNAi(RNA interference)는 표적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA와 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중사슬 RNA(double strand RNA)를 세포 등에 도입하여 선택적으로 표적유전자의 mRNA의 분해를 유도하고 표적유전자의 발현을 억제할 수 있는 현상이다. 이와 같이 RNAi는 선택적으로 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 종래의 비효율적인 상동 재조합에 의한 유전자 파괴 방법을 대신하는 간단한 유전자 넉다운(knock down) 방법으로서 상당한 관심을 모으고 있다.
siRNA(small interfering RNA)는 RNAi를 유도하는 물질로서, 19개에서 23개 정도의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 RNA 이중나선 가닥을 말한다. siRNA(small interfering RNA)는 포유류 세포내로 주입시켜 특정 타깃 mRNA를 일시적으로 저해(silencing)시킴으로서 유전자의 기능을 알아내는데 응용되기도 한다. siRNA를 이용하여 동물 세포내의 특정 유전자의 발현을 억제하는 방법으로 생체외 (in vitro)에서 siRNA를 합성한 뒤 세포 내로 도입시키는 방법 (in vitro preparation of siRNA)이 많이 이용되었는데, siRNA를 생합성하는 가격이 고가이고, 또한 세포 내로 합성된 siRNA를 주입하는 방법인 세포 형질감염의 효율이 매우 낮기 때문에 siRNA에 의한 유전자 발현 억제가 충분히 일어나지 않고 RNAi 효과가 2-3일간만 유지되는 단점들이 부각되었다.
이를 극복하기 위해서, siRNA를 세포내에서 발현시킬 수 있는 siRNA 발현 벡터(plasmid vector)를 세포내로 도입시키는 방법이 개발되었다. 특히, RNA 중합효소 Ш의 프로모터로부터 siRNA 타깃 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5-9개의 염기로 구성된 루프를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 RNA (short hairpin RNA: shRNA)를 발현하는 siRNA 발현 벡터의 경우에는, 세포내로 도입된 후 발현된 shRNA가 세포내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소 (Dicer 또는 RNase Ш로 구성된 RISC complex)에 의해 siRNA로 전환되어 특정 유전자의 발현을 선택적으로 억제할 수 있는 특징이 있다.
그러나, 식물, 특히 식물의 오이 모자이크 바이러스에 대해서는 siRNA 를 이용한 유전자 저해(gene silencing)는 아직 활발하게 연구되거나 활용되지 못하고 있다.
대한민국 특허등록 제293,567호 대한민국 특허출원 제1993-0029605호
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 오이 모자이크 바이러스에 대해 RNA 간섭을 유도하는 siRNA 를 코딩하는 뉴클레오타이드 및 이에 의하여 형질 전환된 오이 모자이크 바이러스에 대해 저항성을 나타내는 형질전환 식물체를 공급하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여
(a) 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오타이드 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드;
(b) 상기 (a)의 뉴클레오타이드의 역위 반복 서열로 이루어진 뉴클레오타이드; 및
(c) 상기 (a)의 뉴클레오타이드와 상기 (b)의 뉴클레오타이드 사이에 위치하는 루프 서열로 이루어진 뉴클레오타이드;를 포함하는 오이 모자이크 바이러스에 대하여 RNA 간섭을 유도하는 siRNA 를 코딩하는 뉴클레오타이드를 제공한다.
본 명세서에서 용어 “RNA 간섭”이란 세포내에 주입된 이중가닥의 RNA(double-strand RNA)가 절단되어 이에 상보되는 세포내 RNA를 분해하여 궁극적으로 유전자의 발현을 저해하게 되는 현상을 말한다.
본 발명에 따르면, 상기 (a)로 표시되는 오이 모자이크 바이러스 유전자의 3`말단의 비번역 부위에 대한 서열과 상기 (b)로 표시되는 동일서열에 대한 역위반복서열(inverted repeat sequence) 및 이들 서열 사이에 위치하는 루프(loop)서열의 결합에 의해 헤어핀(hair pin) 구조가 만들어진다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1은 gtctgaagtcactaaacacattgtgtggtgaacgggttgtccatccagctaacggctaaaatggtcagtcgtggagaaatccacgccagtagacttacaagtctctgaggcacctttgaaaccatctcctaggtttcttcggaaggacttcggtccgtgtac 로 표시되며, 서열번호 1 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 서열은 CMV의 분절 게놈 내 3'말단의 비번역부위 280 내지 310bp 내에 포함되는 상동성이 높은 서열로서, 100-200 bp의 길이이며, 바람직하게는 140-180 bp의 길이이고, 보다 바람직하게는 약 160 bp의 길이이다.
본 발명의 오이 모자이크 바이러스에 대하여 RNA 간섭을 유도하는 siRNA 를 코딩하는 뉴클레오타이드는 (a)상기 서열번호 1 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 서열, 및 (b)이에 대하여 역위반복서열로 상보하는 서열을 포함한다. 상기 역위반복서열은 서열번호 1과 상보적으로 결합하여, 이들 서열 사이에 위치하는 루프(loop)서열에 의해 헤어핀(hair pin)구조를 형성한다.
이러한 헤어핀 구조에 의해 부분적으로 이중가닥 RNA가 만들어진 후 세포질 내에 이중가닥 RNA를 절단하는 효소(dicer)에 의해 21-23 bp 의 siRNA가 만들어진다. 이러한 siRNA는 서열 특이적으로 세포내 RNA를 분해함으로서 RNA 간섭현상을 일으키게 된다.
본 발명에 있어서, "루프(loop) 서열”이란 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 이의 역위반복서열 사이에 위치하며 전사체를 형성하는 경우 전체적으로 헤어핀 구조를 형성하도록 유도하는 서열로서 헤어핀 구조에서 루프에 해당하는 부위의 서열을 의미한다. 본 발명의 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에서, 루프서열로 이용될 수 있는 서열은 당업계에 공지된 다양한 서열을 포함하며, 바람직하게는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열인 catagtgactggatatgttgtgttttacagtattatgtagtctgttttttatgcaaaatctaatttaatatattgatatttatatcattttacgtttctcgttcagctttcttgtacaaagtggtgatatcactagtgcggccgcctgcaggtcgaccatatggtcgacctgcaggcggccgcactagtgatgctgttatgttcagtgtcaagctgacctgcaaacacgttaaatgctaagaagttagaatatatgagacacgttaactggtatatgaataagctgtaaataaccgagtataaactcattaactaatatcacctctagagtataatataatcaaattcgacaatttgactttcaagagtaggctaatgtaaaatctttatatatttctacaatgttcaaagaaacagttgcatctaaacccctatggccatcaaattcaatgaacgctaagcttaatatgactctcaataaagtctcataccaacaagtgccaccttattcaaccatcaagaaaaaagccaaaatttatgctactctaaggaaaacttcactaaagaagacgatttagagtgttttaccaagaatttctgtcatcttactaaacaactaaagatcggtgtgatacaaaacctaatctcattaaagtttatgctaaaataagcataattttacccactaagcgtgaccagataaacataactcagcacaccagagcatatatattggtggctcaaatcatagaaacttacagtgaagacacagaaagccgtaagaagaggcaagagtatgaaaccttacctcatcatttccatgaggttgcttctgatcccgcgggatatcaccactttgtacaagaaagctgaacgagaaacgtaaaatgatataaatatcaatatattaaattagattttgcataaaaaacagactacataatactgtaaaacacaacatatccagtcactatg로 표시되며, pCNCR 바이너리 벡터의 애기장대(Arabidopsis thaliana )의 인트론 염기서열 (At5g27430; www.arabidopsis.org)에 해당되는 약 644bp일 수 있다.
본 발명은 또한, 오이 모자이크 바이러스로부터 상기 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오타이드 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 표적 서열을 증폭하기 위한 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머 세트를 제공한다.
상기 서열번호 2 및 서열번호 3는 게이트웨이 서열로서, 서열번호 2는 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGG로 표시되며, 서열번호 3은 GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT로 표시된다. 업스트림용 프라이머는 5’- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGG GTCTGAAGTCACTAAACACA -3’ 일 수 있고, 다운스트림용 프라이머는 5’- GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT GTACACGGACCGAAGTCCTTCC -3’일 수 있다.
본 발명은 또한,
(a) 제 1 항에 의한 오이 모자이크 바이러스에 대하여 RNA 간섭을 유도하는 siRNA 를 코팅하는 뉴클레오타이드; 및
(b) 상기 뉴클레오타이드에 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있고 식물 세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 "작동적으로 결합(operatively linked)"라 함은, 핵산 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 되는 것을 말한다.
본 발명에 있어서, 상기 벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터인 것을 특징으로 한다. 본 발명에 있어서, 상기 "바이너리 벡터"라 함은, Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분은 LB(left border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타켓 튜클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드 두개로 나누어 놓은 벡터를 말한다. 본 발명에 있어서 아그로벡테리움은 본 발명의 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 특히 본 발명에 있어서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 아그로박테리움 튜메파씨엔스(Agrobacterium tumefacience ) LBA4404가 바람직하다.
벡터에는 필요에 따라서 벡터가 도입된 세포를 선택할 수 있는 선택 마커 등을 추가로 보유시킬 수 있다. 선택 마커로서는, 네오마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자와 같은 약제 내성 마커, 갈락토시다아제 등의 효소 활성을 지표로 선택할 수 있는 마커, 혹은, GFP 등의 형광 발광등을 지표로 선택할 수 있는 마커 등을 들 수 있다. 또, EGF 리셉터, B7-2 등의 표면 항원을 지표로 선택할 수 있는 선택 마커 등을 이용하여도 좋다.
본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들면 입자 충격법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method) 및 열충격법(heat shock) 등이 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 식물 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 식물체를 제공한다.
본 발명의 DNA 또는 당해 DNA를 포함한 벡터를 세포에 도입하여 당해 세포에 있어서의 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 본 발명에 의한 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 식물 세포는 당업자가 사용하는 일반적인 방법에 의하여 생산될 수 있으며, 본 발명의 DNA 또는 당해 DNA를 포함한 벡터를 세포에 도입하는 공정, 및 상기 벡터가 도입된 세포를 선택하는 공정을 포함한다.
본 발명에 의한 오이 모자이크 바이러스에 대하여 RNA 간섭을 유도하는 siRNA 는 가장 넓은 기주 범위를 갖는 오이 모자이크 바이러스를 타겟으로 하기 때문에 높은 바이러스 저항성 효율을 기대할 수 있으며, 오이 모자이크 바이러스가 감염시킬 수 있는 모든 작물의 형질 전환 식물체 제작에 활용가능하다.
도 1은 바이러스 분주들간의 3' 말단 비번역부위(3'-noncoding region, 3'NCR)를 비교한 결과를 나타낸다.
도 2, 도 3은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 벡터를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 상엽에서 병징이 관찰되는지 여부를 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에서 오이 모자이크 바이러스 가 검출되는지 여부를 PCR로 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에서 siRNA의 존재 유무를 노던 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이하의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<재료> 바이러스 원
오이 모자이크 바이러스의 대표 strain인 Fny-CMV는 서울여자대학교 Plant Virus GenBank (PVGB accession no. PV-0001)에서 분양 받아 Nicotiana tabacum cv. SamsunNN 담배에 바이러스를 접종하여 7일후 오이 모자이크 바이러스 병징을 확인하였으며 이렇게 증식된 오이 모자이크 바이러스는 본 연구의 바이러스 원(source)으로 사용하였다.
< 프라이머 설계>
오이 모자이크 바이러스는 분절 게놈 RNA1, RNA2, RNA3 를 갖는데 특히 바이러스 분리주들간에 3` 말단 비번역부위(3`-noncoding region, 3`NCR)가 염기 서열간 상동성이 매우 높다는 것이 이미 알려져 있다. 또한 3`NCR에 tRNA-like structure (TLS)가 존재하는데 이는 바이러스 복제시 복제효소 및 기주단백질들과의 상호작용하는 부위이며 음성가닥(minus-strand) 합성시 프로모터(promoter)의 역할을 하는 중요 부위라는 것이 알려져 있다.
프라이머 설계를 위해 이미 보고된 오이 모자이크 바이러스의 RNA1, RNA2, RNA 3 의 염기서열을 참고로 3`말단비번역부위의 염기들을 비교하였다(도 1). 도 1에서 가장 상동성이 높은 부위를 증폭하기 위하여 RNA1 3`NCR 부위의 3125-3144 nt 까지 업스트림 프라이머 attCMVNCR-F (5`- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGG GTCTGAAGTCACTAAACACA-3` 밑줄친 부분은 게이트웨이 서열(gateway sequence)이다)를 디자인하였으며, 다운스트림 프라이머 attCMVNCR-R (5`- GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT GTACACGGACCGAAGTCCTTCC-3` 밑줄친 부분은 게이트웨이 서열(gateway sequence)이다)로는 분리 균주의 RNA1 5`비번역부위의 3125 뉴클레오타이드부터 3286 뉴클레오타이드까지 포함되면서 162 bp 크기의 유전자가 증폭될 수 있도록 프라이머를 디자인하였다.
< 역전사효소 연쇄반응( RT - PCR )>
CMV 의 3`NCR 부위를 역전사 효소 연쇄반응법으로 증폭하였다. 즉, Fny-CMV가 감염된 N. tabacum cv. SamsunNN 담배잎 1g 으로부터 트리졸 시약(Trizol reagent, invitrogen, USA)를 이용해 전체 RNA를 추출하여 RT-PCR 의 주형으로 사용하였다. 역전사 과정으로서 SuperScriptTM III 역전사효소(reverse transcriptase, Invitrogen, USA) 및 디자인된 다운스트림 프라이머와 함께 42 ℃에서 1시간 반응시켜 1st cDNA를 합성하였고 2nd PCR을 위해 10pM 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머, 0.2mM dNTP 믹스(mix), 1μ Ex-Taq 중합효소(polymerase) 및 제공된 버퍼(buffer)를 넣고, 반응은 95 ℃에서 2분간 변성(denaturation)을 진행한 다음, 95 ℃ 20초, 55 ℃ 20초, 68 ℃ 1분을 30 사이클 수행한 것을 68℃ 에서 10분간 신장(extension)을 시켜 반응을 종료하여 RT-PCR을 완성하였다. 약 220bp의 PCR product가 증폭되었으며 이를 좀 더 검증하기 위해 염기서열분석을 수행하였다. 그 결과 약 220bp의 게이트웨이 서열(gateway sequence)이 포함된 CMV의 염기서열이 확인되었다. 상기 서열은 CMV 특이적 162bp와 게이트웨이 서열 쌍에 해당하는 것이다.
< 클로닝 및 벡터 제작 >
클로닝을 위해 일단 상기에서 서열이 확정된 CMV-3`NCR 유전자를 AscI 및 SwaI 제한 효소로 처리하여 게이트웨이 시스템(Gateway system, Invitrogen Co.)으로 pDONR207 바이너리벡터에 클로닝하여 엔트리 벡터(entry vector)를 만들고 확인한 다음, 동일한 염기 서열을 가진 두번째 cDNA를 BamHI 와 XbaI 로 처리하여 두번째 클로닝을 실시하여 목적 벡터(destination vector)인 pK7GWIWG2(I),0 벡터에 동시에 삽입시켜서 역위 반복 서열 구조의 RNAi 벡터를 제작하고 이를 pCNCR 이라고 명명하였다. 이와 같이 제조된 본 발명에 의하여 제작된 벡터를 도 2 및 도 3 에 나타내었다.
< 실시예 > 형질 전환 담배 제작
pCNCR 벡터를 아그로박테리움 튜메파쎄엔스(Agrobacterium tumefacience ) `LBA4404`에 형질전환(transformation)하였으며 N. tabacum `SamsunNN`의 잎조직과 함께 공생배양(co-culture)하여 타켓 유전자를 식물체내로 삽입시켰다. 이후 공생배양(co-culture)된 식물조직을 카나마이신(Kanamycin) 100ug/ml, 세포탁심(Cefotaxime) 250ug/ml, NAA 0.1mg/l 및 6BAP 1mg/l이 포함된 MS 배지에서 캘러스(callus)를 수득하고 슈팅(shooting)을 유도시켰으며 발근(Rooting)용 MS배지 (0.00875mg/l의 IAA, 0.03mg/l의 키네틴(kinetin), 0.001mg/l의 엽산(folic acid), 250ug/ml의 세포탁심(cefotaxime), 100ug/ml의 카나마이신(Kanamycin))에 치상하여 뿌리 발달을 유도하였다. 각각의 형질전환체를 기내 밖으로 꺼내어 26℃가 유지되는 온실에서 유지하였으며 T1 종자를 채종하였다.
< 실시예 > 저항성 평가
본 실험에서는 상기 채종된 T1 주들을 이용하여 CMV에 대한 저항성 평가를 수행하였다.
카나마이신(Kanamycin)이 포함된 MS 배지에서 형질전환 담배 T1 주 8종을 선발하였으며 CMV를 접종한 다음 약 4주간 관찰하여 저항성 평가를 한 결과를 표 1에 나타내었다. 표 1에서 #11, #15, #18 담배에서 CMV에 대해 저항성을 보이는 것으로 나타났다.
Figure 112012102706227-pat00001
외관상 바이러스 병징을 관찰한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 wt-담배 (N. tabacum cv. SamsunNN)에서는 오이 모자이크 바이러스 접종 7일부터 상엽에서 병징이 관찰되었으며, 이후 상엽으로 심각한 오이 모자이크 바이러스 병징을 보였다. 그러나, 형질전환 담배 T1 주 (#11, #15, #18)에서는 접종 후 4주 이후에도 오이 모자이크 바이러스에 의한 뚜렷한 병징이 관찰되지 않았다.
< 실험예 > RT - PCR
진공침윤시킨 후 바이러스가 접종된 접종잎 1 g 으로부터 트리졸 시약 (Invitrogen, USA)으로 전체 RNA를 추출하고 프라이머 CMCP5(5`-ATGGACAAATCTGAATCAACCAG-3`) 및 프라이머 CMCP3(5`-GACTGGGAGCACTCCAGATGTG-3`)를 이용하여 RT-PCR 을 수행하고 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 형질전환체에서는 오이 모자이크 바이러스가 검출되지 않았으나, 비교예에서는 감염에 의한 CMV 밴드가 관찰되었다.
< 실험예 > 노던 블롯팅( Northern blotting )>
진공침윤시킨 후 바이러스가 접종된 접종잎 1 g 으로부터 트리졸 시약 (Invitrogen, USA)으로 전체 RNA를 추출하고 동량의 10% PEG 8000 및 1M 염화나트륨을 첨가하여 siRNA(small-interfering RNA)만을 분리 정제하였다.
이렇게 확보된 siRNA들을 7 M의 요소(Urea)가 포함된 15% 페이지(PAGE)에서 1X TBE(Tris-Borate-EDTA)와 함께 전기영동을 실시하였으며, 이후 겔에서 siRNA들을 나일론 막으로 이동시켰다. 막에 siRNA들을 고정시키기 위해 UV-크로스 링크을 실시하였고 예열된 교잡 완충액(hybridization buffer)(Ambion, USA) 10 mL 와 함께, 45℃에서 1시간 동안 막을 방치 후 CMV 특이적 프로브를 넣어 프라이머 EF1a-F(5`-GGATCCTCTTGACCAGATTAATGAGCCCA-3`) 및 EF1a-R(5`-AAGCTTACTCTTGATGACACCAACAGCA-3`)을 이용하여 밤새 교잡(hybridization)시켰다. 막 세척 후 말레산 완충액으로 막을 처리한 뒤, DIG(Dig0xigenln)-라벨링 시스템을 이용하여 DIG 특이적 항체와 실온에서 방치 및 세척 과정을 거친 후 CSPD(Disodium 3-(4-methoxyspiro 1,2-dioxetne-3,2'-(5'-chloro) tricyclo [3,3,1,13,7]decan -4-yl) phenyl phosphate) 용액(Roche, USA)과 반응시키고 엑스레이 필름에서 감광 후 RNA의 존재 유무를 확인하고 그 결과를 도 6 에 나타내었다.
도 6 에서 본 발명에 의한 실시예의 경우 pCNCR 에 의한 CMV 의 RNA의 분해의 과학적 증거가 되는 약 21 내지 24 bp정도의 siRNA가 검출되는데 비해, CMV 만 접종한 식물체나 완충액만을 접종한 식물체에서는 siRNA가 검출되지 않았다. 이로부터 본 발명에 의하여 헤어핀(hair-pin)에 의한 서열특이적 침묵 현상이 유도되어 RNA 간섭 현상에 따라 CMV RNA 의 분해(degradation) 가 일어난 것으로 추정할 수 있다.
<110> Sahmyook University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> NUCLEOTIDE CODING siRNA HAVING CMV VIRUS RESISTANCE, RECOMBINANT VECTOR COMPRISING THE SAME, AND TRANSFORMED PLANT WITH SAME <130> DPP-2012-0234 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 162 <212> DNA <213> Cucumber mosaic virus <400> 1 gtctgaagtc actaaacaca ttgtgtggtg aacgggttgt ccatccagct aacggctaaa 60 atggtcagtc gtggagaaat ccacgccagt agacttacaa gtctctgagg cacctttgaa 120 accatctcct aggtttcttc ggaaggactt cggtccgtgt ac 162 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg g 31 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gggaccactt tgtacaagaa agctgggt 28 <210> 4 <211> 975 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana hybrida <400> 4 catagtgact ggatatgttg tgttttacag tattatgtag tctgtttttt atgcaaaatc 60 taatttaata tattgatatt tatatcattt tacgtttctc gttcagcttt cttgtacaaa 120 gtggtgatat cactagtgcg gccgcctgca ggtcgaccat atggtcgacc tgcaggcggc 180 cgcactagtg atgctgttat gttcagtgtc aagctgacct gcaaacacgt taaatgctaa 240 gaagttagaa tatatgagac acgttaactg gtatatgaat aagctgtaaa taaccgagta 300 taaactcatt aactaatatc acctctagag tataatataa tcaaattcga caatttgact 360 ttcaagagta ggctaatgta aaatctttat atatttctac aatgttcaaa gaaacagttg 420 catctaaacc cctatggcca tcaaattcaa tgaacgctaa gcttaatatg actctcaata 480 aagtctcata ccaacaagtg ccaccttatt caaccatcaa gaaaaaagcc aaaatttatg 540 ctactctaag gaaaacttca ctaaagaaga cgatttagag tgttttacca agaatttctg 600 tcatcttact aaacaactaa agatcggtgt gatacaaaac ctaatctcat taaagtttat 660 gctaaaataa gcataatttt acccactaag cgtgaccaga taaacataac tcagcacacc 720 agagcatata tattggtggc tcaaatcata gaaacttaca gtgaagacac agaaagccgt 780 aagaagaggc aagagtatga aaccttacct catcatttcc atgaggttgc ttctgatccc 840 gcgggatatc accactttgt acaagaaagc tgaacgagaa acgtaaaatg atataaatat 900 caatatatta aattagattt tgcataaaaa acagactaca taatactgta aaacacaaca 960 tatccagtca ctatg 975

Claims (7)

  1. (a) 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오타이드;
    (b) 상기 (a)의 뉴클레오타이드의 역위 반복 서열로 이루어진 뉴클레오타이드; 및
    (c) 상기 (a)의 뉴클레오타이드와 상기 (b)의 뉴클레오타이드 사이에 위치하고, 서열번호 4의 193-836의 루프 서열로 이루어진 뉴클레오타이드;를 포함하는 오이 모자이크 바이러스에 대하여 RNA 간섭을 유도하는 siRNA 를 코딩하는 뉴클레오타이드.
  2. (a) 제 1 항에 의한 오이 모자이크 바이러스에 대하여 RNA 간섭을 유도하는 siRNA 를 코팅하는 뉴클레오타이드; 및
    (b) 상기 뉴클레오타이드에 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있고 식물 세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 를 포함하는 재조합 벡터.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 프로모터는 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  5. 제2항에 의한 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 식물 세포.
  6. 제2항에 의한 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 식물체.
  7. 제 1 항에 의한 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오타이드를 증폭하기 위한 서열번호 2 및 서열번호 3 으로 표시되는 프라이머 세트.
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Hu et al. Virology Journal 2011, 8:41 *
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