KR102145531B1

KR102145531B1 - Julgi 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 식물 영양 저장 조직의 영양 저장능력을 높이기 위한 조성물

Info

Publication number: KR102145531B1
Application number: KR1020180148550A
Authority: KR
Inventors: 황일두; 조현우; 남호영; 조현섭
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2018-03-28
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2020-08-19
Also published as: KR20190113513A; US20210115458A1

Abstract

본 발명은 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질의, 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 식물 영양 저장 조직의 영양 저장능력을 높이기 위한 조성물, 상기 조성물을 이용해 식물의 영양 저장능력을 증가시키는 방법, 및 상기 방법을 통해 영양 저장능력이 증가된 식물체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질의, 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 조성물을 식물체에 처리함으로써, 식물에서 광합성 산물이 이동해 최종적으로 저장기관에 전분 및 당 형태로 저장되는데 있어 가장 중요한 역할을 수행하는 기관인 체관 발달을 증진시킬 수 있고, 이를 통해 식물 저장기관의 저장능력을 증가시킴으로써 JULGI가 보존적으로 발현되는 관다발식물을 포함하는 다양한 농작물의 생산성을 증대시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 식물의 영양 저장능력 증가 방법은 종래 방법들과 달리 외래 유전자 도입 없이 GMO 문제로부터 자유로운 고부가 가치의 작물 생산방법이라는 점에서 종래 한계점을 극복할 수 있는 장점이 있다.

Description

JULGI 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 식물 영양 저장 조직의 영양 저장능력을 높이기 위한 조성물{Composition for increasing sink strength of sink tissues comprising expression or activity inhibitor of JULGI protein}

본 발명은 JULGI 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 식물 영양 저장 조직의 영양 저장능력을 높이기 위한 조성물, 상기 조성물을 이용해 식물의 영양 저장능력을 증가시키는 방법, 및 상기 방법을 통해 영양 저장능력이 증가된 식물체에 관한 것이다.

대기 중 이산화탄소 농도의 증가로 인한 범지구적 이상 기후에 의한 피해가 증가하고 있으며, 이에 따른 2015년 195개 국가가 참여한 이산화탄소 배출 규제를 위한 파리협약은 대기 중 이산화탄소 농도 조절이 인류의 생존을 위해 얼마나 중요한 문제인지를 보여준다. 광합성을 통한 이산화탄소의 탄소 화합물로의 전환 과정은 지구 탄소 순환계를 구성하는 핵심 기작이며, 지구 생태계에서 태양으로부터 얻는 빛에너지를 유기에너지로 전환시키는 1차 생산과정이다. 더욱이, 독립 영양 생물인 식물의 발달과 성장의 근본 원리를 이해하고 응용하는 것은 인간 개개인의 생존이 아닌 인류의 지속적 생존을 위해 필수적인 부분이다. 이에, 종래에는 탄소 동화 효율 및 작물 생산성 증대를 위한 전략으로 광합성에 관여하는 효소의 활성을 증가시키거나 광합성 산물의 운반체 단백질의 발현을 증대시키는 방법들이 시도되어왔다. 이러한 방법들에 더하여 광합성 산물의 이동 억제 요소가 되는 체관의 수송 용량을 증대 시키는 방법 역시 중요한 전략이 될 수 있다.

체관부(Phloem)는 관다발식물(vascular plants)에서 살아있는 도관으로, 광합성 산물, 호르몬, mRNA, 단백질과 같은 거대분자의 이동통로로써 식물의 발달에서 중요한 기능을 하며, 특히 광합성 산물을 저장하고 이용하는 저장 기관의 발달 및 조절에 주요하게 작용한다. 체관부의 분화는 (전)형성층이라고 불리는 분열세포로부터의 비가역적인 세포 리프로그래밍을 수반하며, 이러한 변화에서 핵을 포함한 세포내 소기관의 선택적 제거, 세포벽 재구성 및 세포질 희석이 전사적 케스케이드를 위한 신호의 조절을 통해 일어난다. 체관부 세포의 운명이 결정된 후, 체관부 초기 세포는 체요소로 발달하기 위해 핵이 제거되고 이들이 결합되어 체관을 형성한다. 세포가 전사 능력을 잃어 감에 따라 식물에서 체관부 네트워크를 구축하기 위해서는 전사 후 조절 과정이 필요할 수 있다. 그러나 체관부 분화의 근원이 되는 전사 후 조절 기작은 알려져 있지 않으며, 공급-수용 관계를 형성하는데 미치는 영향은 명확히 규명되어 있지 않다.

이에 따라 국내외에서 체관 분화에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있고, 체관 분화 조절기작에 대한 지식도 점차적으로 확대되고 있다. 보다 구체적으로, 2003년 체관 발달 조절 유전자인 ALTERED PHLOEM DEVELOPMENT(APL)의 발견을 통해 체관 분화 기작에 관한 연구가 시작되었고(Bonke et al., 2003 Nature), 근래에는 APL의 하위 조절유전자로 하위 전사 인자인 NAC45/86과 체관 분화 중 발생하는 핵 제거에 관여하는 NEN1-4가 동정되었다. 이와 더불어 OCTOPUS와 BIN2, CVP2와 CVL1, BRX, BAM3, CLE45 등의 주요 체관 발달 조절 인자들이 동정되었다. 그러나 이전까지 인류가 체관 발달을 인위적으로 조절하기에 적합한 유전자는 발견 되지 않았다. 이에, 본 발명은 체관 발달을 조절할 수 있는 유전자를 이용함으로써 식물의 영양 저장 조직의 영양 저장능력을 증가시켜 궁극적으로 작물의 생산성을 높이는 방법을 제시하고자 한다.

본 발명에서는 3개의 Ranbp2-type zinc finger 도메인을 갖는 RNA 결합단백질인 JULGI가 SMXL4/5(SUPPRESSOR OF MAX2 1-LIKE4/5) 5’UTR에 결합하여 G-quadruplex 형성을 유도함으로써 SMXL4/5의 발현을 저하시키고, 이에 따라 체관부 분화를 저해하는 음성적 조절 기작을 규명하였으며, 이에 따라 JULGI의 발현 또는 활성을 억제함으로써 체관부 발달을 증진시키고 종자 및 열매와 같은 식물의 저장조직의 영양 저장능력을 증가시킬 수 있음을 확인하였는바, 이에 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질의, 발현 또는 활성 억제제를 포함하는, 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장능력(sink strength)을 높이기 위한 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 식물체에 처리하는 단계를 포함하는, 식물의 영양 저장 조직의 영양 저장능력을 증가시키는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 식물의 영양 저장 조직의 영양 저장능력(sink strength)이 증가된, 식물체를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질의, 발현 또는 활성 억제제를 포함하는, 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장능력(sink strength)을 높이기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 영양 저장 조직은 종자, 열매, 꽃, 뿌리, 또는 괴경일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 JULGI 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 JULGI 단백질은 SMXL4/5(SUPPRESSOR OF MAX2 1-LIKE4/5) mRNA의 5’UTR(Untranslated region)에 결합하여 상기 SMXL4/5의 발현을 저하시키는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 SMXL4/5의 발현 저하는 JULGI 단백질이 SMXL4/5 mRNA의 5’UTR에 결합하여 RNA G-quadruplex 형성을 유도함으로써 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 억제제는 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 억제제는 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 RNAi용 벡터일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 억제제는 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 편집하는 CRISPR/Cas9 벡터일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 JULGI 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 식물체에 처리하는 단계를 포함하는, 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장능력(sink strength)을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장능력(sink strength)이 증가된, 식물체를 제공한다.

본 발명에서는 JULGI 단백질이 SMXL4/5 5’UTR에 결합하여 G-quadruplex 형성을 유도함으로써 SMXL5의 발현을 억제하여 식물체의 체관 발달을 음성적으로 조절한다는 기능을 규명하였고, 이에 따라 JULGI의 발현 또는 활성을 억제시키는 경우 체관 발달이 증진되고, 이에 따라 종자, 과실 등의 저장기관의 영양 저장능력이 높아지는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 JULGI 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 조성물을 식물체에 처리함으로써, 식물에서 광합성 산물이 이동해 최종적으로 저장기관에 전분 및 당 형태로 저장되는데 있어 가장 중요한 역할을 수행하는 기관인 체관 발달을 증진시킬 수 있고, 이를 통해 식물 저장기관의 저장능력을 증가시킴으로써 JULGI가 보존적으로 발현되는 관다발식물을 포함하는 다양한 농작물의 생산성을 증대시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 식물의 영양 저장능력 증가 방법은 종래 방법들과 달리 외래 유전자 도입 없이 GMO 문제로부터 자유로운 고부가 가치의 작물 생산방법이라는 점에서 종래 한계점을 극복할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 체관부 분화의 음성 조절자인 JULGI를 발굴한 결과로서, 도 1a는 포플러(Populus tremula)와 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 체관부/형성층 부위, 및 애기장대의 수크로오스 조절 유전자들의 전사체를 비교분석한 결과이고, 도 1b는 3개의 RanBP2-type ZnF 도메인을 갖는 담배 유전자인 Niben101Scf0620g02009(At3g15680 ortholog)의 발현을 억제(TRV-NbJUL)한 후 체관부 분화정도 및, 각각 체관부, 형성층, 물관부 마커 유전자(각각 APL, WOX4, XCP2)의 발현수준 변화를 측정한 결과이고, 도 1c는 계통발생 분석을 통해 각기 다른 23종의 식물에서 담배 JUL의 상동체를 조사한 결과이고, 도 1d는 애기장대에서 JUL1 및 JUL2의 발현 억제(JUL1/2 RNAi) 또는 JUL1 단백질 과발현(JUL1 OX)에 따른 체관부 분화정도, 및 APL, WOX4, XCP2 마커 유전자의 발현수준을 측정한 결과이며, 도 1e는 관다발 세포 유도 배양 시스템을 이용하여 관다발 계통 확립에 대한 JUL의 역할을 평가하기 위해 JUL1/2 RNAi 또는 JUL1 OX의 경우 유도 기간에 따른 체관부, 형성층, 및 물관부 마커 유전자(SEOR1, TDR, IRX3)의 발현수준을 측정한 결과이다.
도 2는 JUL 단백질의 표적으로 SMXL4/5의 5’UTR에서 독점적으로 보존되는 G-quadruplex 모티프를 규명한 결과로서, 도 2a는 JUL1 단백질 내 3개의 RanBP2-type ZnF 도메인 및 RNA 결합에 필요한 보존된 아르기닌 잔기를 도시한 것이고, 상기 아르기닌 잔기를 알라닌으로 치환한 각 JUL1 변이체의 과발현에 따른 체관부 분화 정도를 관찰한 결과이며, 도 2b는 랜덤 펜타프로브(PP) ssRNA 라이브러리를 이용하여 상기 JUL 유전자가 일반적인 RNA 결합 능력 또는 서열 특이성을 지니고 있는지 분석한 결과이고, 도 2c는 JUL1의 in vivo mRNA 표적을 확인하기 위해 RNA G quadruplex 형성 모티프를 갖는 것으로 추정되는 67개의 체관부 특이적 유전자 세트를 분석한 결과이며, 도 2d는 애기장대에서 체관부 분화의 중요한 양성 조절 인자로 공지된 SMXL family의 계통분석을 실시한 결과이고, 도 2e는 계통분석 결과 관다발식물에서만 독점적으로 보존된 SMXL5에 대하여 담배에서 발현을 억제(TRV-NbSMXL5)시킨 후 체관부 분화정도를 관찰한 결과이며, 도 2f 내지 도 2h는 smxl4/5 애기장대 돌연변이체에서 체관부 조직 관찰, 및 체관부, 형성층, 물관부 마커 유전자(각각 APL 및 SEOR1 / TDR 및 HB8 / IRX3 및 XCP1)들의 발현수준을 측정한 결과이다.
도 3은 JUL이 SMXL5 5’UTR의 RNA G-quadruplex 형성 모티프에 직접적으로 결합하여 G-quadruplex 형성을 유도함을 확인한 결과로서, 도 3a는 칼륨의 유무 조건하에 GST-JUL1을 이용해 EMSA를 실시한 결과이고, 도 3b는 칼륨의 유무 조건에 따른 JUL1과 SMXL5 5’UTR의 결합 해리상수를 측정한 결과이며, 도 3c는 표면 결합 시스템을 이용해 SMXL5 5’UTR G-quadruplex와 JUL1 단백질 사이의 상호 작용을 시각화하여 분석한 결과이고, 도 3d는 SMXL5 5’UTR RNA G-quadruplex 구조에 대한 reverse transcriptase 정지 분석을 실시한 결과이며, 도 3e는 SMXL5에서 G-quadruplex 형성 모티프의 원편광이색성(CD) 흡수율을 측정한 결과이고, 도 3f는 원형질체에서 RNA 면역침전 분석을 통해 in vivo에서 SMXL5 5’UTR과 JUL1의 결합을 검증한 결과이다.
도 4는 체관부와 형성층에서 세포질 JUL 및 SMXL4/5가 체관부 발달을 조절함을 확인한 결과로서, 도 4a는 각각 JUL1 및 SMXL5 프로모터의 조절 하에 β-글루쿠로니다아제(glucuronidase; GUS) 및 YFP가 발현되는 시스템을 이용해 개화 줄기의 관다발조직에서 JUL 및 SMXL5의 발현양상을 관찰한 결과이고, 도 4b는 MS2 헤어핀/MS2 외피 단백질 기반 RNA 모니터링 시스템을 사용하여 JUL1 및 SMXL5 5’UTR의 세포 내 발현양상을 형광으로 시각화하여 분석한 결과이며, 도 4c는 핵위치 서열(NLS) 또는 핵방출 서열(NES)과 융합된 JUL1을 과발현하는 형질전환 계통에서 체관부 분화 정도와 관련 마커 유전자의 발현수준을 측정한 결과이다.
도 5는 JUL 매개 G-quadruplex 형성에 의한 SMXL5의 번역 억제를 확인한 결과로서, 도 5a는 JUL1 존재여부에 따른 SMXL5의 리보솜 결합여부를 관찰한 결과이고, 도 5b는 SMXL5 5’UTR 조절하에 발현되는 GFP 리포터를 이용해 JUL1의 처리농도에 따른 GFP 발현수준 변화를 관찰하여 JUL1에 의한 SMXL5의 번역억제 여부를 분석한 결과이며, 도 5c는 SMXL5 5’UTR 또는 변이체 SMXL5 5’UTR-융합 루시퍼라제(LUC) 리포터 분석을 통해 JUL1 야생형 또는 변이체(JUL(RA))의 처리농도에 따른 SMXL5의 번역 억제를 분석한 결과이고, 도 5d 및 도 5e는 JUL1의 존재 시 SMXL5 5’UTR의 G-quadruplex 형성 여부에 따른 SMXL5의 번역 억제 정도를 각각 GFP 리포터 및 루시퍼라제(LUC) 리포터 분석을 통해 실시한 결과이다.
도 6은 체관부 분화 과정에서 JUL 매개 SMXL5 5’UTR의 G-quadruplex 형성이 미치는 영향을 확인한 결과로서, 도 6a는 JUL1/2의 발현이 억제된 뿌리에서 SMXL5의 발현양상을 관찰한 결과이고, 도 6b는 JUL1/2의 발현 억제된 경우 SMXL5와 폴리좀 결합여부를 분석한 결과이며, 도 6c 및 도 6d는 각각 애기장대 및 담배에서 JUL의 발현이 억제된 경우 SMXL4/5 돌연변이 여부에 따른 체관 분화정도를 관찰한 결과이다.
도 7은 JUL의 발현억제에 따른 체관 세포 수 증가 및 이에 따른 식물체 저장기관의 강도 증가를 확인한 결과로서, 도 7a는 체관부 symplasmic 추적자인 CFDA를 식물체에 처리하여 이의 이동을 모니터링하기 위한 실험을 도시한 것이고, 도 7b는 JUL1/2의 발현이 억제된 경우 하배측에서의 체관부 세포 수, CFDA의 축적 정도를 확인한 결과이며, 도 7c는 담배에서 NbJUL의 발현 억제(TRV-NbJUL #1, TRV-NbJUL #2)에 따른 종자의 크기 및 무게를 측정한 결과이고, 도 7d는 애기장대에서 JUL1/2의 발현 억제 시(JUL1/2 RNAi) 발현 억제 정도와 종자의 크기 및 무게를 측정한 결과이며, 도 7e는 토마토에서 JUL의 발현 억제에 따른 토마토 과육 총 생산량 및 당도를 측정한 결과이다.
도 8은 유전자 편집법을 이용한 JUL의 발현억제에 따른 체관 세포 수 증가 및 이에 따른 식물체 저장기관의 강도 증가를 확인한 결과로서, 도 8a는 JUL1 유전자를 넉아웃시키기 위해 상기 유전자의 5’인접 염기서열에 단일 염기 삽입을 유도한 것을 보여주는 그림이고, 도 8b는 대조군(Control(jul2))에 비하여 JUL1 유전자를 넉아웃시킨 군(jul ^CRISPR/Cas9 jul2)의 체관부가 크게 증가된 것을 보여주는 결과이며, 도 8c는 JUL1 유전자를 넉아웃시킨 군에서 종자의 크기와 무게가 증가함을 보여주는 결과이다.
도 9는 결론적으로 JULGI의 발현 조절에 따른 SMXL4/5의 번역증가 및 이에 따른 체관부 발달 증가와 저장기관의 강도 증가가 직접적 연관이 있음을 그림으로 도시한 것이다.

본 발명에서는 JULGI에 의한 체관부 분화의 음성 조절 기작을 규명하고, JULGI 발현 조절을 통한 체관 발달 조절 및 나아가 작물의 생산성 조절이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 JULGI 단백질 또는 상동성 분석을 통해 제시한 상동체 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질의, 발현 또는 활성 억제제를 포함하는, 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장능력(sink strength)을 높이기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 JUL1 단백질 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 JUL2 단백질, 및 상기 단백질들의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체에서 체관 형성에 대한 활성을 의미한다.

상기 상동성 분석을 통해 제시한 JULGI의 상동체 단백질은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 JULGI의 체관부 분화에 대한 음성적 조절 기작을 규명하였고, JULGI의 발현 조절에 따른 체관부 발달 및 저장기관의 영양 저장능력을 증가시키는 것을 확인하였다.

본 발명의 일실시예에서는, 담배에서 3개의 RanBP2-type ZnF 도메인을 갖는 NbJULGI(NbJUL) 유전자를 확인하였고, 여러 식물 종에서 상기 유전자의 상동체를 조사한 결과 다양한 관다발식물에서 상기 유전자가 보존적으로 존재하는 것을 관찰하였다. 또한, JUL 유전자의 발현 조절을 통해 체관부 형성에 대한 영향을 분석한 결과, JUL이 체관부 분화의 음성 조절자로 기능한다는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, JUL 단백질의 표적을 조사한 결과 JUL 단백질 내에 RNA 결합 아르기닌 잔기가 포함된 ZnF 도메인, 즉 상기 단백질의 RNA 결합 활성이 체관부 발달 억제에 필수적임을 확인하였고, 랜덤 펜타프로브 ssRNA 라이브러리를 이용한 실험을 통해 JUL이 표적 RNA에 대한 서열 특이성을 가짐을 알 수 있었다. 나아가 SELEX 분석 및 이에 따라 발굴된 SMXL family에 대한 계통분석을 통해 관다발식물에서만 독점적으로 보존된 SMXL4/5 5’UTR의 G-quadruplex 형성 모티프가 JUL의 특이적 기질임을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 다양한 방법으로 JUL과 SMXL5 5’UTR의 RNA G-quadruplex 모티프 간의 직접적 결합을 통한 G-quadruplex 형성 여부를 분석한 결과, SMXL5 5’UTR의 G-quadruplex에서 JUL의 RanBP2-type ZnF와 직접적으로 결합하고, 이러한 결합에 의해 SMXL5의 5’UTR에서 RNA G-quadruplex 형성이 유도되며, in vivo에서도 JUL과 SMXL5 5’UTR의 G-quadruplex 모티프와 결합하는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, SMXL5 mRNA에 대한 JUL의 작용을 구체적으로 규명하기 위해, 원형질체에서 SMXL5의 리보솜 결합을 모니터링한 결과, JUL이 5’UTR G-quadruplex 인식을 통해 번역을 위해 활성화된 리보솜에 대한 SMXL5 전사체의 결합을 억제하는 것을 확인하였고, 실질적으로 JUL1의 용량에 의존적으로 SMXL5 5’UTR의 조절 하에 있는 GFP 단백질의 발현이 감소하며, JUL1이 존재하는 경우에도 G-quadruplex 형성이 일어나지 않는 SMXL5 5’UTR 돌연변이에서는 GFP 단백질의 발현 감소가 일어나지 않는 등의 결과를 통해 RNA G-quadruplex 형성 모티프의 직접적인 인식과 SMXL5 5’UTR에서의 G-quadruplex의 안정화가 효율적인 JUL1 매개 번역 억제를 유도함을 확인하였다(실시예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 체관부 분화 과정에서 JUL 매개 SMXL5의 5’UTR G-quadruplex 형성이 미치는 영향을 조사한 결과, JUL1/2의 발현이 억제된 식물체에서 SMXL5의 폴리좀 결합이 증가한 것을 통해 JUL1/2의 발현 억제에 의해 SMXL5의 번역이 증가함을 확인하였고, JUL과 SMXL4/5 사이의 관계를 조사한 결과 JUL이 체관부 발달에서 SMXL4/5의 상류에서 기능한다는 것을 알 수 있었다(실시예 6 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 체관부 세포 수의 증가가 체관부 수송능력과 관련이 있는지 분석한 결과 JUL1/2의 발현이 억제된 식물체에서 체관부 세포 수가 증가하고 체관부 수송능력이 증진된 것을 확인하였고, 담배 및 애기장대에서 저장조직인 종자를 관찰한 결과 JUL의 발현이 억제된 식물체에서 종자의 크기와 무게가 유의하게 증가한 것을 관찰하였으며, 또한 토마토 과실의 총 생산량 및 당도가 유의하게 증가한 것을 확인하였다. 더욱이, 유전자 편집법을 이용해 JUL1 유전자를 넉아웃시킨 경우에도 대조군에 비해 체관부가 크게 증가하며 종자의 크기와 무게가 증가한 것을 확인하였다. 이를 통해 JUL의 발현 억제에 따른 체관부 분화 향상과 저장조직의 저장능력 증가 간에 양의 상관관계가 있음을 알 수 있었다(실시예 7 및 8 참조).

본 발명에 있어서, 상기 식물의 영양 저장 조직은 종자, 열매, 꽃, 뿌리, 또는 괴경일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 억제제는 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터, RNAi용 벡터, 또는 CRISPR/Cas9 벡터일 수 있고, 더욱이 ZFN, TALLEN과 같은 유전자 편집 기법을 이용할 수 있으나, 상기 JULGI 단백질의 발현 또는 활성을 저해시킬 수 있는 것이라면 그 종류가 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 JUL1 유전자 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 JUL2 유전자일 수 있다. 서열번호 3의 염기서열은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 서열이며, 서열번호 4의 염기서열은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 서열이다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

상기 VIGS는 바이러스에 의해 유도되는 유전자 침묵 현상으로 다양한 식물과 진균, 곤충류, 선충류, 어류, 쥐 등에서 잘 알려진 전사 후 유전자 침묵 현상의 일종으로, 바이러스가 식물체에 침입하여 복제하는 과정에서 감염 식물체에 바이러스 유전체와 상동성인 있는 내생유전자가 발현될 때 내생유전자와 바이러스 유전체의 발현과 복제가 함께 억제되는 현상이라고 할 수 있다. 즉, 바이러스 게놈의 cDNA에 기주에서 유래된 특정 유전자의 일부 혹은 전체를 삽입하고 감염성 RNA로 제작하여 식물체에 감염시키면, 상응하는 기주의 RNA가 목표가 되어, 감염된 기주 식물체에서는 목적 유전자의 발현이 억제되거나 소실된다. 그 결과 목적 유전자의 기능을 간접적으로 추정할 수 있다. 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS) 기작은 바이러스에 대항하여 RNA가 매개하는 식물 방어기작의 일종이라고 알려져 있으며, 1) 전사후 유전자 침묵 2) RNA 전환 3) 뉴클레오티드 서열 특이성이라는 특징을 가진다.

본 발명에서 사용되는 용어 “재조합”은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적절하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 상기 벡터는 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로 부터의 DNA 업스트림 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.

본 발명에 있어서, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 식물체에 처리하는 단계를 포함하는, 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장능력(sink strength)을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 따라 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장능력(sink strength)이 증가된 식물체를 제공한다.

본 발명에서 상기 “조성물을 식물체에 처리하는 단계”는 보다 바람직하게는 DNA를 식물에 도입시키는 것, 더욱 바람직하게는 형질전환시키는 방법을 의미하는 것으로, 본 발명에서 형질전환은 공지된 방법에 따라 당업자가 적절히 선택하여 이용할 수 있는데, 예컨대 공지된 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌글리콜 방법, 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법, 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법, 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 선택될 수 있다. 그러나 본 발명에서는 보다 바람직하게 아그로박테리움 매개된 DNA 도입방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 포함하는, RNA G-quadruplex 형성에 의한 SMXL4/5의 번역 억제용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 식물 모델의 준비

본 실시예에서 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 col-0과 WS-2 생태형은 각각 야생형 및 형질전환 계통으로 사용하였다. 모든 종자는 1/2 Gamborg B5 salt(Duchefa, Netherlands), 1% 수크로오스 및 0.8% phytoagar(pH 5.7)가 함유된 배지에서 24℃의 장일 조건(16시간 명/8시간 암)하에 발아되도록 하였고 일주일 후, 묘목을 화분으로 옮겨 심고 동일하게 장일 조건에서 성장시켰다. smxl4/5 계통에서 smx15, smx14/5, pSMXL5-YFP, pSMXL5-SMXL5-YFP는 독일 하이델베르크 대학의 Thomas Greb에게 제공받았으며, jul1(FLAG_293A10; 5’UTR 삽입) 및 jul2(GK-268A03-015068; 5’UTR 삽입)는 ABRC로부터 얻었다. 한편, 원형질체는 식물을 단일 조건(10시간 명/14 시간 암)에서 재배하고 3~4주된 식물의 완전히 확장된 잎으로부터 분리하여 사용하였다. 담배(N. benthamiana)는 종자를 뿌리고 26℃의 장일 조건에서 5~6주 동안 재배하였으며, 토마토(Solanum lycopersicum cv. Heinz 1706)는 22℃의 장일 조건에서 5~7주 동안 재배하였다.

1-2. 플라스미드 제작 및 형질전환 식물체 제조

VIGS 분석을 위해, NbJUL, SlJUL 및 NbSMXL5의 cDNA 단편을 TRV2 벡터에 클로닝하였다. RNAi 구조체의 경우에는 AtJUL1(AT3G15680) 및 AtJUL2(AT5G25490)의 일부 서열을 증폭시키고 연결(ligation)한 다음, 연결된 산물을 증폭하고 pCR8/GW/TOPO 벡터(Invitrogen, USA)에 클로닝하였다. 클로닝된 cDNA는 M13 순방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 증폭시킨 후, pK7GWIWG2 (I)로의 게이트웨이 클로닝에 사용하였다. CRISPR/Cas9 구조체의 경우 AtJUL1의 5’말단 인접 부위 염기서열인 GGTGATTGGTACTGCACCG를 sgRNA로 가지는 pHCas9GM-AtU6p 벡터를 클로닝하였다.

또한 AtJUL1 및 AtJUL2를 조직 특이적으로 발현시키기 위해 애기장대 게놈 DNA로부터 번역 시작 부위의 1.5kb 서열 상류부위를 증폭하고 pCXGUS-P에 클로닝하였다.

한편 원형질체 리포터 분석을 위해, SMXL5의 전장 5’UTR 및 JUL1을 GFP, 루시퍼라제(luciferase) 및 HA가 포함된 식물체 발현 벡터에 클로닝하였다. 재조합 단백질은 전장 JUL1 및 JUL2 cDNA를 pGEX5-1(Promega, USA)으로 클로닝한 후 생성 및 정제 하였다. JUL1의 점돌연변이(JUL1^R20A, JUL1^R80A, JUL1^R146A, JUL1^R20/80A, JUL1^R20/146A, JUL1^R80/146A 및 JUL1^R20/80/146A) 및 SMXL5 5’UTR[mSMXL5 5’UTR(1), mSMXL5 5’UTR(2) 또는 Scrambled SMXL5 5’UTR(1-3)]은 QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, USA)를 이용하여 제조하였다. 이후 형질전환 식물체를 제조하기 위해, JUL1, JUL2 및 JUL1 점 돌연변이의 전장 cDNA 서열을 35S 프로모터 및 HA 에피토프 태그가 포함된 pCB302ES 벡터에 클로닝한 후 상기 구조체들을 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101에 형질전환 시키고, 상기 형질전환된 A. tumefaciens를 이용하여 floral dipping 방법을 통해 애기장대 식물을 형질전환 시켰다.

1-3. 애기장대 원형질체에서 일시적 발현

엽육(Mesophyll) 원형질체와 플라스미드 DNA를 준비한 다음, 2x10⁴개 원형질체에 20 μg의 플라스미드 DNA를 형질감염시키고 실온에서 6시간 동안 배양하였다. 또한 리포터 분석을 위해, 2x10⁴개의 원형질체에 다른 리포터[SMXL5 5’UTR-LUC, mSMXL5 5’UTR(1)-LUC, mSMXL5 5’UTR(2)-LUC, SMXL4 5’UTR-LUC SMXL5 5’UTR-GFP, mSMXL5 5’UTR(1)-GFP, mSMXL5 5’UTR(2)-GFP, 또는 Scrambled SMXL5 5’UTR-GFP(1-3)], 효과기(JUL1-HA 또는 JUL1^R20/80/146A-HA) 및 p35S-Rennila 조합으로 구성된 총 플라스미드 DNA 20 μg을 형질감염시켰다.

RNA 면역 침전을 위해서는, SMXL5 5’UTR-GFP 또는 mSMXL5 5’UTR(1)-GFP로 구성된 플라스미드 DNA 40 μg으로 형질감염된 원형질체를 JUL1-HA가 있거나 없는 원형질체로 공동 형질감염시켰다. 모든 분석은 최소 3회 수행되었으며 모든 실험에서 유사한 결과가 얻어졌다.

1-4. VIGS(Virus-induced gene silencing)

pTRV2 유래 벡터를 A. tumefaciens 균주 GV2260으로 형질전환 시킨 다음, pTRV1 또는 pTRV2 구조체를 포함하는 A. tumefaciens를 28℃에서 밤새 배양하고 회수한 후 10 mM MgCl₂ 및 10 mM MES에 재현탁시켰다. 병원성은 200 μM 아세토시린곤(acetosyringone)을 첨가하고 실온에서 2~4 시간 동안 배양함으로써 유도되었다. 다음으로, pTRV1 또는 pTRV2를 포함하는 A. tumefaciens 세포를 1:1의 비율로 혼합하고, 3주된 담배 식물의 잎에 침투시켰다. 토마토에서 VIGS를 위해서는, pTRV2-SlJUL 구조체로 A. tumefaciens 균주 GV3101를 형질전환시킨 다음, pTRV1 및 pTRV2를 함유하는 상기 균주 혼합물을 2주된 토마토 식물의 자엽에 침투시켰다. 대략 침투 3~4주 후 해당 식물을 실험에 사용하였다.

1-5. 계통발생 분석(Phylogenetic analysis)

녹색식물군(Viridiplantae)에서 JULs와 SMXL의 상동체를 조사하기 위해, 공개 데이터베이스(EnsemblPlants release 36, Phytozome ver.12, Solgenomics ver.3.1, Klebsormidium nitens v1.1)에서 관련된 게놈 서열을 가진 23종의 공지된 분류군을 분석하였다. 애기장대에서 2개의 JUL 단백질과 8개의 SMXL 단백질 군 각각의 단백질 서열을 tBLASTn 검색을 위한 질의로 사용하였고, e-value ≤10¹⁰의 상위 히트 10개 내 상동체의 서열은 계통 유전학적 파이프라인(phylogenomic pipeline)에 이용하였으며, 애기장대 입력 서열은 TAIR에서 얻었다. 각각의 쿼리로부터 tBLASTn 히트(e-value로 정렬)의 상위 10개에 대하여 상동성 후보를 만들기 위해 수동으로 각 분류군으로 분석하였다. 각각 기본 설정 하에서 JUL의 서열 정렬은 ClustalO를 이용하고 SMXL의 경우에는 MAFFT를 이용하였다.

더욱 정확한 서열 정렬을 위해 단백질 서열 정렬은 trimAl를 이용하였다. JTT 행렬 기반 모델에 근거하여 ML(maximum likelihood) 트리를 구축하였고, 분지 서포트는 IQ-TREE를 사용하여 1000 부트 스트랩 복사본(-bb 1000)으로 초고속 부트 스트랩 근사 접근법을 사용하여 추정하였다. 각 정렬에 대한 최상의 아미노산 치환 모델은 Nearest-Neighbor-Interchange ML 계층적 방법을 선택하였다.

1-6. 황금고사리에서 SMXL 확인

특정 게놈 스캐 폴드 영역(GL377574 : 2177376-2180294)을 AtSMXL5 상동체 (SmSMXL)의 추정되는 ORF로 지정하였다. 상기 서열을 바탕으로, 황금고사리(S. moellendorffii)(http://www.xplant.co.kr, Seoul에서 구입)에서 추출한 총 cDNA에 대하여 PCR을 실시하여 상기 SmSMXL ORF를 클로닝 하였다. SmSMXL의 CDS는 유전자 특이적 프라이머로 서열분석하여 확인하였다. 또한 상기 서열을 황금고사리의 공지된 게놈과 정렬하여 SNP를 정정하였다. 이후 BLAST 분석을 위해 상기 수정된 SmSMXL의 CDS를 단백질 서열로 번역하였다. SmSMXL의 위치는 GL377569 : 293451-296918 (EnsemblPlant)이다.

1-7. 조직학적 분석

광학 현미경 관찰을 위해, 6주령 줄기 샘플을 0.1 M 인산나트륨 완충액(pH 7.2)에 희석한 3% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)에서 3시간 동안 고정시킨 다음, 순차적으로 아세톤을 이용한 탈수를 진행하기 전에 0.1 M 인산나트륨 완충액으로 2회 헹구었다. 이후 조직절편을 침투시키고 Spurr 수지(Electron Microscopy Sciences, USA)에 65℃에서 48 시간 동안 임베딩하였다. 다음으로, RM2265 마이크로톰(Leica, Germany)을 사용하여 2 μm 두께의 조직절편을 만들고 0.025% 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색한 후 Axioplan 2 현미경(Carl Zeiss, Germany)으로 관찰하였다. 네이티브 염색의 경우, 면도날을 이용해 샘플을 직접 절단하고 절편을 만든 후 0.05 % 톨루이딘 블루로 1분 동안 염색하고, 30초 동안 증류수로 헹군 다음 50% 글리세롤로 마운팅한 후 Axioplan 2 현미경으로 관찰하였다. 투과 전자 현미경 관찰을 위해서는 고정된 조직을 탈수시키기 전에 OsO₄에 처리하였다.

1-8. Quantitative RT-PCR

6주된 식물의 화서 줄기에서 TRIzol 시약(Invitrogen)을 이용하여 총 RNA를 분리한 후, 상기 분리한 RNA 1 ㎍, oligo(dT) 프라이머 및 ImProm-II 역전사 효소(Promega)를 사용하여 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 실시하였다. qRT-PCR은 SYBR Premix ExTaq 시스템(Takara Bio, Japan)을 이용하여 LightCycler 2.0(Roche Life Science, USA)에 제공된 지침에 따라 수행하였으며, 본 실험에 사용된 PCR 프라이머 서열은 하기 표 2에 나타내었다.

유전자	방향	서열(5’-3’)	서열번호
SEOR1(AT3G01680)	Forward	TCTCACGGCCTTGGTTCATC	5
SEOR1(AT3G01680)	Reverse	ATCGACCCCAACCAAGTTCC	6
NEN4(AT4G39810)	Forward	CGGTAGGATTTGGGCAGGTC	7
NEN4(AT4G39810)	Reverse	CCAAGACCAAAATAGGCAGCC	8
HB8(AT4G32880)	Forward	GCTCGCTGGATCTCTCACTC	9
HB8(AT4G32880)	Reverse	TCTTGAAGTGCCACCAACGT	10
TDR(AT5G61480)	Forward	TCTCGTCGGAAAACCTTGCA	11
TDR(AT5G61480)	Reverse	ACCACCGTCGACTCTGTTTC	12
IRX3(AT5G17420)	Forward	CAAAGGGTCCTAAACGTCCA	13
IRX3(AT5G17420)	Reverse	ATGGATGATTGCCCAAATGT	14
XCP1(AT4G35350)	Forward	TGGAGAAAGAAAGGCGCTGT	15
XCP1(AT4G35350)	Reverse	ATGAGACCTCCATTGCAGCC	16
TUB4(AT5G44340)	Forward	GCTAATCCTACCTTTGGTGATC	17
TUB4(AT5G44340)	Reverse	CAGCTTTCCACGGAACACAG	18
GFP	Forward	AGCAAGGGCGAGGAGCTG	19
GFP	Reverse	GCACGCCGTAGGTGAAGG	20
YFP	Forward	GCAAGGGCGAGGAGCTG	21
YFP	Reverse	GCACTGCAGGCCGTAGC	22

1-9. 재조합 단백질 정제

GST가 융합된 재조합 단백질들을 정제하기 위해, GST-fused JUL1, JUL2, JUL1^R20A, JUL1^R80A, JUL1^R146A, JUL1^R20/80A, JUL1^R80/146A, JUL1^R20/146A 또는 JUL1^R20/80/146A를 Escherichia coli BL21에서 발현시켰고, 상기 박테리아 세포를 200 mL Luria broth 배지에서 37℃의 조건으로 600 nm에서 광학밀도가 0.8에 도달할 때까지 배양하였다. 다음으로, 0.5 mM 이소프로필-β-d-1-티오갈락토피라노이드(isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoide; IPTG)를 처리한 후 3시간 동안 추가배양하였다. 이후 GST가 융합된 재조합 단백질은 제조사의 프로토콜(GE Healthcare, USA)에 따라 정제하였다.

1-10. SELEX 분석

압타머(aptamer) 선별을 위해, 시험관 내 전사 및 증폭을 위한 2개의 프라이머 영역 (5'-GATAATACGACTCACTATAGGGTTACCTAGGTGTAGATGCT- (N) 30-AAGTGACGTCTGAACTGCTTCGAA-3; T7 promoter underlined)(PMID: 25689224)에 인접한 무작위 서열의 30-뉴클레오티드로 구성된 합성 ssDNA의 라이브러리를 설계하였다; T7 프로모터 밑줄 친) (PMID : 25689224). 모든 DNA 올리고는 Cosmo Genetech (한국)에서 합성하였다. ssDNA 라이브러리는 i-pfu, 정방향 프라이머 (5'-GATAATACGACTCACTATAGGGTTACCTAGGTGTAGATGCT-3') 및 역방향 프라이머 (5'-TTCGAAGCAGTTCAGACGTCACTT-3')를 사용하여 증폭시켰다. 증폭 사이클은 겔 분석을 통해 최적화하였고, 증폭된 dsDNA 라이브러리는 PCR 정제 키트(Qiagen, Germany)를 사용하여 정제하였다. 이후 AmpliScribe™ T7 High Yield Transcription Kit(Epicenter, USA)를 사용하여 37℃에서 2시간 동안 상기 dsDNA 라이브러리를 전사시킨 후 DNase I로 DNA를 분해하였다. RNA 라이브러리는 페놀-클로로포름-이소아밀알코올 추출법을 이용하여 정제 한 다음, 에탄올 침전시키고 NanoDrop 2000(Thermo Scientific, USA)으로 농도를 측정하였다. 라이브러리를 표적 단백질과 함께 배양하기 전에, RNA 풀을 80℃에서 5분 동안 가열하고 실온에서 서서히 냉각시킴으로써 결합 완충액(20 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM KCl 및 5 mM MgCl₂)으로 리폴딩되도록 하였다. GST와 융합된 표적 단백질을 평형 완충액(125 mM Tris-HCl, 150 mM KCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA [pH 7.4]) 중 Pierce Glutathione 자기 아가로오스 비드(Thermo Scientific) 상에 고정시켰다. 결합 완충액으로 여러 번 세척한 후, RNA 라이브러리를 비드에 고정된 표적 단백질과 함께 실온에서 1시간 동안 서서히 교반하면서 배양하였다.

한편 RNA 라이브러리의 결합 비율을 결정하기 위해, 비결합 RNA의 양을 NanoDrop으로 정량화하였다. 비드를 100 ㎕의 완충액으로 2회 세척하고, 결합된 RNA 라이브러리를 95℃에서 10분 동안 가열함으로써 8 M 우레아에 용출시켰다. 용출된 RNA 풀은 에탄올 침전을 통해 회수한 다음 GoScript™ Reverse Transcription System (Promega)을 사용하여 역전사시켰고, 생성된 올리고는 SELEX의 다음 라운드에 사용하였으며, 각 라운드는 상기와 동일한 과정으로 반복 수행하였다. 세 번째 라운드를 진행한 후, 음성 선택을 위해 RNA 풀을 자기 아가로오스 비드 상에 고정화하지 않은 표적 단백질과 함께 배양하였다. 선별과정 동안, 몇 가지 매개 변수를 변형 및 엄격하게 제어하는데, 구체적으로 단백질에 대한 RNA의 비율은 0.5에서 2.5로 증가; 배양 시간은 1시간에서 30분으로 감소; 세척 부피는 100 ㎕에서 200 ㎕로 증가, 및 세척 횟수는 2회에서 4회로 증가시켰다. 분리된 SELEX는 JUL1 자체 단백질에 대해 15번째 라운드까지 수행되었고, 선택된 RNA 풀을 상기 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시킨 다음 pENTR/TOPO 벡터에 클로닝 하였으며, 상기 벡터로 Escherichia coli TOP10 세포(TOPO-TA Cloning Kit, Thermo Fisher Scientific)를 형질전환 시켰다. ssDNA를 함유하는 클론을 Miniprep Kit(GeneAll, Korea)를 사용하여 정제하고 서열분석(Cosmo Genetech) 하였으며, 선택된 RNAs의 구조적 유사성을 분석하기 위해 QGRS 프로그램(http://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/index.php)을 사용하여 이차 구조를 조사하였다.

1-11. EMSA(Electrophoretic mobility shift assay)

PP 라이브러리의 RNA-EMSA를 수행하기 위해, pcDNA3.1 플라스미드를 ApaI로 선형화하고 DNA 중합 효소 I(Klenow) 단편(New England Biolabs, USA)으로 3'오버행을 채움으로써 단일 가닥 RNA PP를 제조하였다. 다음으로, [α-³²P] UTP(10mCi·mL^-1)의 존재 하에 RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7(Promega)을 사용하여 전사를 수행하였고, RNA 프로브는 6% 우레아-TBE 겔을 이용한 겔 전기영동을 통해 변성시켜 겔 정제하였다. SMXL5 5’UTR로 RNA-EMSA를 실시하기 위해, SMXL5 5’UTR G-quadruplex 형성 영역 및 SELEX 프로브의 ssRNA 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. ssRNA 프로브는 37℃에서 30분 동안 T4 폴리뉴클레오타이드 인산화효소(New England Biolabs)와 함께 배양함으로써 [γ-³²P] ATP (10mCi·mL^-1)로 표지하였고, 비표지된 방사성 뉴클레오티드는 Illustra MicroSpin G-25 컬럼(Amersham, USA)을 사용하여 제거하였다. GST, GST-JUL1, GST-JUL2, GST-JUL1^R20A, GST-JUL1^R80A, GST-JUL1^R146A, GST-JUL1^R20/80A, GST-JUL1^R80/146A, GST-JUL1^R20/146A또는 GST-JUL1^R20/80/146A 단백질을 20,000 cpm의 ssRNA 프로브를 갖는 결합 완충액(10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 2.5% 글리세롤, 0.5 mM DTT, 50 μg·mL-1 BSA, 100 mM KCl, 250 μM EDTA 및 1 μg 헤파린)과 실온에서 20분 동안 배양하였다. 이후 반응 혼합을 0.5X TBE 완충액으로 희석한 6% 폴리아크릴아마이드 겔상에서 분리하였고, 겔을 Typhoon FLA 9000 PhosphorImager(GE Healthcare)를 사용하여 Phosphor 스크린상에 시각화하였다.

1-12. 원평광이색성 분석(Circular dichroism assay)

모든 CD 스펙트럼은 경로 길이가 2.0 mm인 수정 큐벳을 사용하여 25℃에서 J-815 Spectropolarimeter(Jasco, USA)에서 얻었다. 각각의 스펙트럼은 50 nm·min^-1스캔 속도로 220 nm 내지 320 nm의 파장 범위에서 기록되었고, 최종 스펙트럼은 동일한 샘플의 5회 스캔 결과의 평균값으로 하였다. 합성된 RNA 올리고뉴클레오티드(5 μM)를 결합 완충액(10 mM Tris-HCl [pH 8.0] 및 1 mM MgCl₂, 100 mM KCl 존재 또는 미존재)에서 95℃에서 실온으로 천천히 냉각시킴으로써 G-quadruplex를 형성하도록 하였고, CD 측정 전에 평형에 도달하도록 하였다. 100 mM KCl을 함유하는 재생된 SMXL5 5’UTR을 2.5 μM JUL1 단백질과 혼합하고 CD 측정 전에 30분 동안 항온 배양하여 SMXL5:JUL1 복합체에서 RNA의 G-quadruplex 구조를 관찰하였다. 또한 단백질 및 완충액의 영향을 제거하기 위해, JUL1 단백질을 함유하는 스펙트럼을 완충액 중의 2.5 μM JUL1을 기준으로 보정하였다. 이에 더하여, JUL1이 RNA G-quadruplex의 스펙트럼에 큰 영향을 미치지 않음을 입증하기 위해 2.5 μM JUL1 단독의 스펙트럼을 기록하였다.

1-13. RNA 면역침전

SMXL5 5’UTR과 JUL1 사이의 상호작용을 검증하기 위해, SMXL5 5’UTR-GFP를 JUL1-HA가 있거나 없는 원형질체에 공동 형질감염 시켰다. 이후 IP 완충액(100 mM KCl, 2.5 mM MgCl₂, 10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 10% 글리세롤, 0.5% NP-40, 1 mM DTT, 100 U·mL^-1 RNasin RNase 억제제(Promega), 25 mM MG132) 및 식물 세포 추출을 위한 protease 억제제 칵테일[Sigma-Aldrich, USA])을 이용해 원형질체 용해물에서 RNA-단백질 복합체를 추출하였다. 이후 4℃, 13,000 g에서 10분 동안 원심분리하여 불용성 잔해물을 제거한 다음, 300 ㎕ 세포 추출물을 1 ㎍의 HA-항체(Roche)와 얼음에서 2 시간 동안 가끔씩 부드럽게 혼합하면서 배양하였으며, 세포 추출물을 30 μL씩 나누고 이후 실험을 위해 -80℃에 보관하였다. 실험 시, 단백질 G 아가로오스 마그네틱 비드(Bio-Rad Laboratories, USA)를 완충액(100 mM KCl, 2.5 mM MgCl₂, 10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 10% glycerol, 0.5% NP-40 및 100 U·mL^-1 RNasin RNase 억제제)으로 3회 세척한 다음, 항-HA로 표지된 추출물을 10 ㎕ 단백질 G 아가로오스 마그네틱 비드와 함께 지속적으로 교반하면서 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 비드를 1 mL 완충액으로 8회 세척한 후, TRIzol 시약으로 용출시키고 면역 침전된 RNA 및 단백질을 qRT-PCR로 분석하고 HRP가 결합된 고친화성 항-HA 항체를 이용해 검출하였다.

1-14. 표면 상호작용 분석

RNA G-quadruplex 및 JUL1의 상호작용을 가시화하기 위해, 5 μM의 RNA 프로브 20 ㎕를 95℃에서 5분 동안 구조 완충액(10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 100 mM KCl, 100 mM NaCl 또는 100 mM LiCl, 및 1 mM MgCl₂) 하에서 가열한 다음, 25℃에서 1-2시간 동안 서서히 냉각시켰다. 다음으로 글루타티온-세파로오스(Glutathione-sepharose) 4B 비드(GE Healthcare)를 구조 완충액으로 2회 세척하고 4℃에서 1시간 동안 GST-JUL1 및 GST-JUL1^R20/80/146A(1.0-2.5 μM)와 함께 배양했다. 이후 단백질-비드 복합체를 구조 완충액으로 2회 세척하고 부피를 20 ㎕로 증가시킨 다음, 냉각되고 구조화된 RNA 프로브를 단백질-비드 복합체에 첨가하고 가끔씩 혼합하면서 10분 동안 배양하였으며, ThT 또는 NMM을 RNA 프로브-단백질-비드 복합체에 최종 농도가 4 μM가 되도록 첨가하였다. 다음으로 비드 표면에 결합된 G-quadruplex 구조를 시각화하기 위해, 비드 표면상의 ThT 및 NMM의 형광을 각각 CFP 필터 (460-500 nm) 및 RFP 필터 (630-690 nm)를 사용하여 관찰하였다.

1-15. HEK293T 세포에서 일시적 발현

HEK293T 세포는 10% 소태아혈청(FBS)이 함유된 DMEM 배지(Welgene, Korea)에서 37℃ 및 5% CO₂조건으로 배양하였고, 계대배양 시에는 트립신(trypsin)을 이용해 세포를 분리하였다. 플라스미드 형질주입(transfection)은 제조사의 지시에 따라 Metafectene Pro(Biontex Laboratories, Germany)를 사용하여 수행하였다. 보다 구체적으로, 세포에 JUL1 발현 플라스미드(500 ng 또는 1000 ng의 pCMV10-JUL1 또는 pCMV10-JUL1^R20/80/146A 벡터) 및 GFP 리포터(1 ㎍의 pCMV10-SMXL5 5’UTR-GFP 또는 pCMV10-mSMXL5 5’UTR-GFP)를 동시에 형질주입하고 48시간 후 세포를 회수하고 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다.

1-16. 수크로오스 밀도 구배 분석

Polysome 프로파일은 Col-0, JUL1/2 RNAi 모종 및 JUL-HA가 없거나 존재할 때 SMXL5 5’UTR-GFP를 발현하는 애기장대 원형질체로부터 얻었다. 간단하게, 세포에 100 ㎍·mL^-1 시클로헥시미드(cycloheximide)를 30분 동안 처리하고 폴리솜 lysis buffer(200 mM Tris-HCl [pH 8.0], 50 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 0.1 mM DTT, 0.5% NP-40, 및 100 ㎍·mL^-1 시클로헥시미드)를 첨가하여 용해시켰다. 다음으로, 각 샘플에 대해 250 ㎕ 세포 추출물을 폴리솜 완충액(200mM Tris-HCl [pH 8.0], 50mM KCl, 25mM MgCl₂및 0.1mM DTT)에서 SW41Ti 로터로 3시간 동안 30,000rpm의 초원심분리를 진행하여 5-45% 수크로오스 구배 상에 용해시켰다. 이후 0.5 mL·min^-1의 유속에서 60% (w/v) 수크로오스로 상방 변위를 사용하여 구배 밀도 분별기(Brandel, USA)를 통해 0.25 mL의 분획을 수득하였다. 또한 Econo UV 모니터(Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 254 nm의 흡광도에서 지속적인 모니터링을 실시하였다. 각 분획에서 총 RNA는 TRIzol 시약을 사용하여 분리하였고, 이를 이용해 qRT-PCR을 실시한 후 각 분획에서 GFP 또는 TUB4 mRNA 전사 수준을 GFP 또는 TUB4의 전체 투입 mRNA 수준으로 보정하였다.

1-17. 형광 분석을 이용한 해리 상수 측정

평형 해리 상수는 표준 형광 분석법을 이용해 측정하였다. 모든 RNA 샘플은 사용 전에 95℃에서 5분 동안 가열한 후 1시간 동안 실온으로 서서히 냉각시켜 결합 완충액에서 재생시켰다. 플루오레세인(Fluorescein; FAM)-변형된 RNA 샘플을 100 ㎕ 결합 완충액을 이용해 0 nM에서 500 nM까지 다양한 농도로 희석한 다음 JUL1가 고정된 마그네틱 비드와 혼합 하였고, 상기 혼합물을 암실에서 1 시간 동안 실온에서 가볍게 진탕 배양하였다. 이후 결합 버퍼를 사용하여 결합하지 않은 RNA를 2회 세척한 다음, RNA-JUL1 복합체를 500 mM 이미다졸이 보충된 100 ㎕ 결합 완충액으로 용출시켰다. 용출액의 형광 강도는 Synergy™ HT multi-detection microplate reader(BioTek, USA)를 이용해 528/20nm 방출 필터(485/20nm 형광 필터 포함)를 사용하여 측정하였다. Kd 값은 OriginPro 9.0 소프트웨어 (OriginLab, USA)의 ‘exponential decay 1’ 모델인 키네틱 모형에 맞추어 계산하였다.

1-18. 공초점 현미경 분석(Confocal analysis)

MS2 단백질의 co-localization 분석을 위해, MS2 헤어핀-융합된 SMXL5 5’UTR과 JUL1 단백질, GFP 및 mRFP 형광을 공초점 현미경(LSM510, Carl Zeiss) 하에서 관찰하였다. GFP는 488 nm 파장의 아르곤 레이저 라인을 사용하여 들뜨게 하였고, mRFP는 543 nm 파장의 HeNe 레이저 라인을 사용하였다. 500 nm와 520 nm 사이의 방출 파장은 GFP 형광으로 기록되었고, mRFP 형광은 580 nm와 645 nm 사이에서 기록되었다. GFP와 mRFP의 co-localization을 분석하기 위해 재구성된 Z-stack 시리즈는 3D 인터랙티브 그래픽으로 만들었다. JUL1 단백질의 세포질 축적을 분석하기 위해, 샘플에 0.01% NaN₃를 10분 동안 처리하였다. 원형질체에서의 ThT 형광 검출을 위해, 10 μM ThT를 405 nm 파장의 아르곤 레이저로 들뜨기 전에 10분 동안 샘플에 처리하였고, 450 nm 내지 490 nm 사이의 방출 파장을 수집하였다. YFP를 발현하는 뿌리의 이미징은 514 nm의 아르곤 레이저를 사용하였으며 520-540 nm의 파장 범위에서 방출을 검출하였다.

1-19. CFDA 처리 및 측정

1.5 cm 성장 모종(4 일된 모종에서 선발)의 자엽을 절단한 후 5 μM의 CFDA-SE(Thermofisher)를 직접 처리하였다. CFDA 처리 후, 모종을 5% 아가로오스 겔에 놓아 건조되는 것을 방지 하였고, 뿌리 끝의 CFDA 형광은 CFDA 처리 후 0, 2 및 3분에 GFP 필터가 장착된 형광 현미경(Axioplan2)으로 관찰하였으며 형광 강도는 imageJ를 이용해 정량화하였다.

1-20. Reverse transcriptase stalling assay

시험관내 RT 정지 분석(In vitro RT-stop assay)은 공지된 방법을 일부 변형하여 실시하였다. 상기 분석을 위한 RNA 주형은 최소 T7 프로모터를 포함하는 pre-annealed DNA를 사용하여 준비하였다. RiboMAX^TM Large Scale RNA 생산 시스템-T7(Promega)을 사용하여 시험관내 전사를 진행한 후, 생성물을 PCI/CI 정제법으로 정제한 다음 G25 컬럼(GE healthcare)을 사용하여 겔-여과를 실시하였다. 다음으로, LiCl, NaCl, 또는 KCl의 최종농도가 10 mM이 되도록 10 μM의 피리도스타틴(pyridostatin; PDS) 1 ㎕가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 nuclease-free water에 용해된 150-200 ㎍의 주형 RNA를 8 ㎕까지 첨가하고, 5 μM의 방사선이 표지된 프라이머 1 ㎕를 첨가하였다. 이후 혼합물을 25℃에서 20분 동안 예비 배양한 다음, 70℃에서 3분간 가열하고, 4℃에서 10분 동안 배양하여 주형에 대한 프라이머 어닐링을 수행 하였다.

RT 반응은 150 mM의 LiCl, NaCl 또는 KCl 조건에서 수행하였으며, 최종 혼합물을 역전사시키기 위해 25℃에서 10분, 이어서 50℃에서 20분 동안 배양하였다. 이후 RT 반응을 정지시키기 위해, 1N의 NaOH 1 ㎕, 2X 포름아마이드 변성 완충액을 첨가하고, 95℃에서 2분 동안 배양한 다음, 얼음 위에서 냉각시켰다. RT-생성물은 8M UREA denaturing gel상에 분리하고 20% 에탄올, 5% 아세트산으로 고정시킨 후 Typhoon FLA 9000 PhosphorImager(GE Healthcare)를 이용하여 Phosphor screen으로 시각화하였다.

실시예 2. 체관부 분화의 음성 조절자로서 JULGI 확인

2-1. JUL 유전자 확인

본 발명자들은 관다발식물의 진화 과정에서 체관부 형성에 대한 근본적인 메커니즘을 연구하고자 하였으며, 이때, 광합성 산물인 당(sugar)이 체관부 분화를 조절하여 식물체 전체로 탄소 분배를 최적화시킬 것이라는 가설을 세웠다. 상기 가설을 검증하기 위해, 목본 식물인 포플러(Populus tremula)와 초본 식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 체관부/형성층 부위, 및 애기장대의 수크로오스 조절 유전자들의 전사체를 비교 분석하였다. 그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이 흥미롭게도 두 개의 당 조절 유전자인 At3g15680과 At2g28790이 애기장대와 포플러의 체관부/형성층에서도 발현되는 것을 확인하였다.

다음으로, 담배(Nicotiana benthamiana)에서 상기 실시예 1-4의 방법에 따라 바이러스 유도 유전자 발현 억제(virus-induced gene silencing; VIGS) 방법을 통해 상기 2가지 후보 유전자와 더불어 컴퓨터 및 문서 분석을 통해 추정된 관다발 조절인자 및 대조군으로 선별한 24종 유전자의 기능성을 함께 조사하였다. 그 결과, 상기 유전자들 중에서 3개의 RanBP2-type ZnF 도메인을 갖는 식물 특이적 단백질을 암호화하는 담배 유전자인 Niben101Scf0620g02009(At3g15680 ortholog)의 발현을 억제(TRV-NbJUL)한 경우 도 1b에 나타낸 바와 같이 체관부 세포 수와 체관부 마커 유전자인 APL의 발현이 현저히 증가하였고, 형성층(WOX4) 또는 물관부(XYLEM CYSTEINE PEPTIDASE 2, XCP2) 마커 유전자들의 발현은 증가하지 않는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 상기 신규한 조절인자를 ‘plant shoot’ 또는 ‘stream’을 의미하는 NbJULGI(NbJUL)로 명명하였다.

2-2. JUL 유전자의 기능 조사

다음으로 관다발식물의 진화 과정에서 JUL의 역할을 조사하기 위하여, 녹조류(chlorophytes), 차죽조류(charophytes), 선태식물(bryophytes), 석송류(lycophytes), 외떡잎식물(monocots) 및 진정쌍떡잎식물(eudicots)을 포함하는 23종의 다양한 식물 종(species)에서 담배 JUL의 상동체가 존재하는지를 조사하였다. 그 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이 15종의 관다발식물 및 4종의 비-관다발식물에서 상동체가 존재하는 것을 확인하였다. 또한 계통발생 분석 결과 상기 비-관다발식물 4종에서 발견된 상동체는 관다발식물 JUL 상동체의 외부 그룹에서 분지되어 있었으며, 이는 비-관다발식물의 JUL 상동체가 고대 형태의 관다발식물의 JUL 단백질임을 의미하는 것이다. 따라서 JUL 단백질은 관다발식물이 진화함에 따라 다양화되었고, 바위손(Selaginella)과 같은 초기 관다발식물과 개화 식물 모두에서 보다 현대적인 형태로 존재하며, 이는 JUL이 식물의 맥관구조(vasculature), 특히 체관부의 출현에서 중요한 역할을 한다는 것을 제시하는 것이다. 실제로, 토마토(Solanum lycopersicum) 및 쌀(Orzya sativa)에서 JUL1 상동체의 발현을 억제시킨 경우 체관부 세포의 수가 증가하였으며, 이는 상기 유전자의 진화적으로 보존된 역할을 입증하는 것이다.

나아가, 체관부 형성에 있어서 JUL의 기능을 더욱 자세히 알아보기 위해, 애기장대에서 JUL1(At3g15680) 및 JUL2(At5g25490)의 발현을 저해시킨 후 이에 따른 영향을 분석하였다. 그 결과, JUL1 또는 JUL2의 발현을 억제한 경우 체관부 세포 집단에서 약간의 변형이 나타난 반면, JUL1과 JUL2의 발현을 모두 억제한 경우(JUL1/2 RNAi)에는 도 1d에 나타낸 바와 같이 야생형(Col-0)과 비교할 때 체관부 분화 정도 및 체관부 마커 유전자인 APL의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 이에 반해, 물관부 또는 관다발 형성층 발달 관련 마커 유전자(WOX4 및 XCP2)의 발현에는 변화가 없는 것으로 나타났다. 상기와 반대로, JUL1-HA을 과발현 시킨 경우(JUL1 OX)에는 줄기에서 체관부, 물관부 및 형성층 세포 집단에서 심각한 이상이 나타났고 상기 APL, WOX4 및 XCP2 유전자의 발현도 현저하게 감소하였다.

상기 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 분화 효율을 정량화할 수 있도록 Arabidopsis Leaves (VISUAL)를 이용하는 관다발 세포 유도 배양 시스템을 이용하여 관다발조직을 형성하는데 있어서 JUL의 역할을 평가하였다. 그 결과, 도 1e에 나타낸 바와 같이 JUL1과 JUL2의 발현을 모두 억제시킨 경우(JUL1/2 RNAi), VISUAL 유도 첫날에는 체관부 마커 유전자인 SEOR1(SIEVE ELEMENT OCCLUSION-RELATED 1)의 발현이 강하게 유도되었고, 형성층 TDR(TDIF RECEPTOR) 또는 물관부 IRX3(IRREGULAR XYLEM 3) 관련 유전자의 발현에는 유의한 변화가 나타나지 않는 것을 확인하였다. 또한 이와는 대조적으로, JUL1을 과발현시킨 경우(JUL1 OX)에는 3일째에 체관부 마커 유전자인 SEOR1 및 물관부 마커 유전자인 IRX3의 발현 유도가 억제되는 것을 확인하였다. 따라서 상기 결과들을 통해, JUL이 관다발식물에서 진화적으로 보존된 체관부 분화의 음성 조절자로 기능한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 3. JUL의 표적으로써 SMXL4/5 5’UTR의 G-quadruplex 모티프 규명

도 2a에 도시된 바와 같이 JUL1과 JUL2는 3개의 RanBP2-type ZnF 도메인을 가지고 있으며, 상기 도메인 각각은 RNA 결합에 필요한 보존된 아르기닌 잔기(ZnF1, ZnF2 및 ZnF3에 각각 R20, R80 및 R146 존재)를 가지고 있다. 따라서 본 발명자들은 JUL1의 상기 ZnF 도메인이 체관부 분화에 필요한지 여부를 알아보기 위해, 아르기닌을 알라닌으로 치환한 4가지 JUL1 변이체인 JUL1^R20A, JUL1^R80A, JUL1^R146A, 및 JUL1^R20/80/146A를 과발현시키고 그 영향을 분석하였다. 그 결과, 도 2a에서 볼 수 있는 바와 같이 상기 JUL1과 JUL2의 발현을 억제시킨 경우(JUL1/JUL2 RNAi)에서의 결과와 유사하게, 상기 변이체를 발현시킨 모든 식물체에서 야생형(Col-0)에 비해 체관부 세포가 현저히 증가된 것을 확인하였다. 이러한 결과는 JUL1의 ZnF 도메인 변이체가 JUL1의 주요 음성적 형태로 작용하여 야생형 JUL과 상호작용하는 단백질과의 결합을 잠재적으로 방해함으로써 나타난 것이며, JUL1의 RNA 결합 활성이 체관부 발달 억제에 필수적임을 입증하는 것이다.

다음으로, 펜타-뉴클레오타이드 다양성을 포함하는 랜덤 펜타프로브(pentaprobe; PP) ssRNA 라이브러리를 이용하여 JUL1이 일반적인 RNA 결합 능력 또는 서열 특이성을 지니고 있는지를 조사하였다. 이를 위해, GST(Glutathione S-transferase)가 융합된 JUL1 및 이의 ZnF 도메인 변이체에 대하여 in vitro 전사된 PP 세트로 상기 실시예 1-11의 방법에 따라 EMSA 분석을 실시하였다. 그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이 PPs 서브세트가 JUL1에만 결합하였고, JUL1 ZnF 도메인 변이체(JUL1^R20/80A, JUL1^R80/146A, JUL1^R20/146A 및 JUL1^R20/80/146A)는 PP의 이동성이 완전히 나타나지 않았으며, 이는 JUL1이 이의 표적 RNA에 대한 서열 특이성을 가질 수 있음을 시사하는 것이다.

다음으로, JUL1이 인식하는 RNA 표적 서열을 알아보기 위해, 랜덤 30-뉴클레오타이드 RNA 라이브러리를 사용하여 상기 실시예 1-10의 방법에 따라 SELEX 분석을 실시하였다. 15라운드까지 JUL1에 결합된 RNA 프로브를 선택적으로 농축하고 염기서열을 확인한 결과, 흥미롭게도 JUL1에 결합된 RNA는 G(구아닌)이 풍부한 서열을 포함하고 있었으며, 대부분이 G-quadruplex를 형성하였고(61개 RNA 중에서 57개에서 G-score가 높음(G-score > 20)), 2차 구조는 Hoogsteen-bonded G-quartet stacks을 형성하였다. 나아가 JUL1의 in vivo mRNA 표적을 확인하기 위해, 본 발명자들은 RNA G-quadruplex 형성 모티프를 갖는 것으로 추정되는 67개의 체관부 특이적 유전자 세트를 분석했다. 그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이 G-tetrads 수와 연결 루프 길이에 근거한 컴퓨터 스코어링 알고리즘(G-score)을 통해 분석한 결과 애기장대에서 체관부 분화의 중요한 양성 조절 인자로 알려져 있는 SMXL5의 5’비번역 영역(5’UTR)이 G-quadruplex 형성 가능성이 가장 높은 것으로 나타났다.

상기 결과를 바탕으로, SMXL family의 계통분석을 실시한 결과 도 2d에서 볼 수 있는 바와 같이 SMXL3/4/5가 관다발식물에서 독점적으로 발견되었으며 모든 식물 종에서 발견되는 다른 SMXL과는 별도로 분류되는 것을 확인하였다. 또한 고대 관다발식물인 황금고사리(S. moellendorffii)의 SMXL5 상동체는 단일계통이지만 SMXL3/4/5 그룹으로 분류되었으며, 이는 SmSMXL이 SMXL3/4/5의 조상이라는 것을 암시한다. 흥미롭게도, G-quadruplex를 형성하는 서열은 24종의 SMXL4/5 상동체와 SmSMXL 중 23종의 5’UTR에서 발견되었지만, 상기 23종의 서열화된 식물종에서 다른 SMXL의 5’UTR에는 G-quadruplex 형성 모티프가 거의 없는 것을 확인하였다. 따라서 관다발식물에서만 독점적으로 보존된 SMXL4/5 5’UTR의 G-quadruplex 형성 모티프가 체관부 발달을 위한 JUL 단백질의 특이적 기질일 것으로 생각되었다.

이에, 본 발명자들은 담배와 애기장대에서 smxl4/5 기능 상실 돌연변이체의 표현형을 분석하였다. 그 결과, 도 2e에 나타낸 바와 같이 담배에서 SMXL5의 발현을 억제시킨 경우(TRV-NbSMXL5), 체관부 분화가 현저하게 감소하는 것으로 나타났다. 또한 흥미롭게도 야생형 맥관구조의 완전히 분화된 체관부와 비교할 때, 도 2f 내지 도 2h에서 볼 수 있는 바와 같이 smxl4/5 애기장대 돌연변이체는 여전히 핵과 엽록체를 함유하고 있는 더 크지만 미분화된 체요소를 가지고 있으며, 체관부 마커 유전자(APL 및 SEOR1)의 발현이 현저히 감소된 것을 확인하였다. 종합적으로 상기 결과들은 육상 식물의 진화 과정에서 SMXL4/5 5’UTRs이 체관부 형성을 위한 보존된 표적임을 입증하는 것이다.

실시예 4. JUL과 SMXL5 5’UTR의 RNA G-quadruplex 모티프 간의 직접적 결합을 통한 G-quadruplex 형성 확인

4-1. EMSA 분석

상기 실시예 3의 결과를 바탕으로, JUL 단백질이 SMXL5의 단일 가닥 mRNA 또는 RNA G-quadruplex에 직접적으로 결합하는지 여부를 알아보기 위해, G-quadruplex 형성에 필요한 칼륨이 존재하거나 또는 존재하지 않는 조건에서 GST-JUL1 및 GST-JUL2 단백질을 이용하여 EMSA를 수행하였다. 그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이 JUL1이 양성 대조군으로 사용된 SMXL5 5’UTR 프로브에서 G-quadruplex 형성 모티프의 이동이 지연된 것을 확인하였다. 그러나 G-quadruplex 형성 모티프가 없는 mSMXL5 5’UTR(1), mSMXL5 5’UTR(3)의 경우에는 상기와 같은 결과가 나타나지 않았다. 반면에 G-quartet의 두 개 층을 생성하는 변이체인 mSMXL5 5’UTR (2)의 경우에는 SMXL5 5’UTR 보다는 덜 효율적으로 JUL 단백질에 결합하였다. 또한, 상기 JUL1과 SMXL5 5’UTR 결합의 해리 상수(Kd)를 측정한 결과 도 3b에서 볼 수 있는 바와 같이 칼륨의 존재하지 않을 때에는 130 nM, 칼륨의 존재 시에는 230 nM로 추정되었으며, 이는 JUL1이 우선적으로 1차 SMXL5 5’UTR 서열에 결합한다는 것을 의미하는 것이다.

4-2. 표면 상호작용 분석

다음으로, 상기 실시예 1-14의 방법에 따라 단백질이 코팅된 비드 표면의 액체-고체 계면에서 RNA 프로브에 대해 G-quadruplex를 강하게 안정화시키는 칼륨, 약하게 안정화시키는 나트륨, 또는 G-quadruplex를 안정화시키지 않는 리튬과 응축시킨 표면 결합 시스템을 이용하여 SMXL5 5’UTR G-quadruplex와 JUL1 단백질 사이의 상호 작용을 시각화하였다. 이를 위해, 구체적으로 도 3c에 도시된 바와 같이 Cy5로 표지된 RNA 프로브인 SMXL5 5’UTR을 GST-JUL1으로 코팅된 글루타티온-세파로오스(glutathione-sepharose) 비드에 처리하고, 결과적으로 비드 표면상에 형성된 G-quadruplex를 Cy5 및 G-quadruplex 센서인 Thioflavin T(ThT)를 사용하여 동시에 시각화하였다.

그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이 ThT에 의해 방출된 형광 신호는 칼륨 존재(+KCl) 하에 JUL1이 코팅된 비드 표면과 완전히 중첩되어 나타났으나, 나트륨(+NaCl) 또는 리튬(+LiCl)의 존재 시에는 형광 신호가 감소하였고, 반면에 비드 표면과 중첩되는 Cy5 형광은 나트륨 또는 리튬 존재 시 증가하였다. 이러한 결과는 SMXL5 5’UTR의 G-quadruplex에서 JUL1의 RanBP2-type ZnF와 직접적인 결합이 일어난다는 것을 의미한다. 또한, JUL1은 G-quadruplex를 포함하는 전체 길이의 SMXL5 5’UTR 및 5’UTR 단편 모두에 결합하는 것으로 나타났다.

4-3. 역전사 효소 스톨링 분석

상기 결과에 더하여, RNA G-quadruplex의 형성에 대하여 보다 자세히 확인하기 위해, 상기 실시예 1-20의 방법에 따라 U-rich 영역을 포함하는 68 염기의 SMXL5 5’UTR의 구조를 조사하였다. 그 결과, 도 3d에 나타낸 바와 같이 강력한 G-quadruplex 안정화 리간드인 칼륨(+KCl) 또는 피리도스타틴(pyridostatin; PDS)의 존재 하에 SMXL5 5’UTR에서는 역전사 효소 스톨링(stalling)이 발생하였으나, mSMXL5 5’UTR(1)에서는 일어나지 않았다. 이러한 스톨링은 칼륨의 존재 하에서만 관찰되었고 리튬(+LiCl) 존재 하에서는 관찰되지 않았으며, PDS는 리튬 존재 하에서도 스톨링을 강하게 증가시켰다. 이러한 결과는 RNA G-quadruplex가 G/U 쌍을 이루는 헤어핀 구조보다는 SMXL5의 5’UTR에서 형성된다는 것을 의미하는 것이다.

4-4. 원편광이색성(CD) 흡수율 측정

다음으로, 상기 실시예 1-12의 방법에 따라 SMXL5에서 G-quadruplex 형성 모티프의 원편광이색성(CD) 흡수율을 측정하였다. 그 결과, 도 3e에 나타낸 바와 같이 G-rich 모티프의 몰 타원율은 RNA G-quadruplex의 시그니쳐 스펙트럼인 240 nm에서 음성 피크와 264 nm에서 양성 피크를 나타내었다. 흥미롭게도, JUL1과 구조화되지 않은 SMXL5 5’UTR을 배양한 경우(SMXL5 5’UTR +KCl +JUL1)에는 264 nm에서의 피크를 증가시켰고, 이는 JUL1이 SMXL5 5’UTR에 직접 결합하여 G-quadruplex의 접힘을 유도한다는 것을 시사한다. 더욱이, JUL1과 접힌 SMXL5 5’UTR을 함께 배양한 경우(SMXL5 5’UTR +KCl +JUL1)에도 264 nm에서 피크가 증가하였고, 이는 JUL1의 결합이 접힌 SMXL5 5’UTR의 형성을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 따라서 상기 결과들을 통해 JUL1이 주로 단일 가닥의 G-quadruplex 형성 모티프를 인식하고 잠재적으로 RNA G-quadruplex 형성의 유도 인자로 기능한다는 것을 알 수 있었다.

4-5. RNA 면역침전

나아가 본 발명자들은 상기 실시예 1-13의 방법에 따라 원형질체에서 RNA 면역침전법을 실시하여 in vivo에서 SMXL5 5’UTR과 JUL1의 결합을 검증하였다. 그 결과 도 3f에 나타낸 바와 같이 mSMXL5 5’UTR(1)이 아닌 SMXL5 5’UTR의 경우에만 HA(haemagglutinin)가 태그된 JUL1과 함께 면역침전 되었음을 확인하였다.

종합적으로, 이러한 결과는 JUL이 SMXL5의 5’UTR과 직접적인 상호작용을 하며, 특히 SMXL5의 5’UTR에서 G-quadruplex 접힘에 작용한다는 것을 보여준다.

4-6. SMXL5에 대한 JUL의 작용 분석

SMXL5에 대한 JUL의 작용을 조사하기 위해, 각각 JUL1 프로모터 및 SMXL5 프로모터의 조절 하에 β-글루쿠로니다아제(glucuronidase; GUS) 및 YFP(yellow fluorescence protein)를 사용하여 개화 줄기의 관다발조직에서 JUL 및 SMXL5이 발현되는 위치를 조사하였다. 그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 JUL1(pJUL1-GUS)과 SMXL5(pSMXL-YFP) 모두 애기장대 줄기의 체관부와 형성층 부위에서 특이적으로 발현되었으며, 이는 JUL1이 체관부 발달 동안 SMXL5와 함께 기능한다는 개념을 뒷받침하는 것이다. 흥미롭게도, JUL1은 또한 꽃가루, 뿌리, 자엽 및 주병(funicle)의 관다발에서도 발현되었다.

다음으로, JUL이 SMXL5 5’UTR 내의 G-quadruplex와 결합하는지 여부를 알아보기 위해, 애기장대 원형질체에서 MS2 헤어핀/MS2 외피 단백질 기반 RNA 모니터링 시스템을 사용하여 JUL1 및 SMXL5 5’UTR의 세포 내 분포를 추적하였다. 구체적으로 24x MS2 결합 헤어핀 구조에 접합된 SMXL5 5’UTR이 GFP가 태그된 MS2 외피 단백질에 의해 직접 가시화되도록 하였다. 실험 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이 SMXL5 5’UTR 전사체는 애기장대 원형질체에서 JUL1과 공존하는 것으로 나타났지만, mSMXL5 5’UTR과 JUL1 RA는 각각 JUL1 및 SMXL5 5’UTR과 공존하지 않는 것으로 나타났으며, 이는 JUL1이 in vivo에서 SMXL5 5’UTR의 G-quadruplex 모티프와 결합한다는 것을 나타낸다.

이에 더하여, 체관부 분화 과정에서 JUL1의 기능을 검증하기 위해, 핵위치 서열(nuclear localization sequence; NLS) 또는 핵방출 서열(nuclear export sequence; NES)과 융합된 JUL1을 과발현하는 형질전환 계통의 표현형을 관찰하였다. 그 결과, JUL1-NES을 과발현한 경우(JUL1-NES OX)에는 야생형 JUL1의 과발현 표현형과 유사하게 나타났고, 체관부 마커 유전자의 발현이 감소된 반면, JUL1-NLS를 과발현한 경우(JUL1-NLS OX)에는 상기 실시예 2-2 및 3에서의 JUL1/2 RNAi 및 JUL1 ZnF 도메인 변이체의 경우와 유사하게 체관부 분화 및 관련 마커 유전자(APL 및 NEN4)의 발현이 증가된 것을 확인하였다.

실시예 5. JUL 매개 G-quadruplex의 형성을 통한 SMXL5의 번역 억제 확인

5’UTR은 세포질에서 번역을 조절하고, G-quadruplex는 5’UTR 상에 전형적으로 번역 억제 요소를 부여한다. 따라서 본 발명자들은 세포질 JUL1이 5’UTR G-quadruplex-매개 번역 조절을 통해 이의 특이적 표적인 SMXL5의 발현을 조절한다고 가정하였다. 이에, SMXL5 mRNA에 대한 JUL1 작용을 구체적으로 규명하기 위해, 원형질체에서 SMXL5의 리보솜 결합을 모니터링 하였다. 그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 JUL1이 함께 존재하는 경우(SMXL5 5’UTR-GFP + JUL1), SMXL5 5’UTR이 융합된 GFP mRNA의 폴리좀 연관이 현저히 감소한 반면 대조군으로 사용된 TUB4 mRNA의 경우에는 감소하지 않은 것을 확인하였다. 또한 mSMXL5 5’UTR (1) 돌연변이체의 경우에는 JUL1이 GFP mRNA의 폴리솜 결합을 감소시키지 않는 것으로 나타난 것을 통해 JUL1이 5’UTR G-quadruplex 인식을 통해 번역을 위해 활성화된 리보솜에 대한 SMXL5 전사체의 결합을 억제한다는 것을 시사한다.

다음으로, 5’UTR G-quadruplex에 결합하는 JUL1이 SMXL5의 번역에 실질적으로 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, SMXL5 5’UTR 또는 돌연변이 5’UTRs [mSMXL5 5’UTR (1)]의 제어 하에 GFP 리포터 분석을 실시하였다. 그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이 원형질체에서 SMXL5 5’UTR의 조절 하에 있는 GFP 신호 및 단백질 발현수준이 JUL1의 용량에 의존적으로 감소한 반면, mSMXL5 5’UTR (1)의 경우에는 GFP 신호 및 단백질 발현수준에 변화가 없는 것을 통해 JUL1의 억제 효과가 나타나지 않는 것을 확인하였다. 또한, 이러한 경우 JUL1의 처리용량에 관계없이 GFP mRNA의 발현에는 변화가 없는 것을 확인하였다. 이러한 결과와 일치하게, SMXL4 또는 SMXL5 5’UTR-융합 루시퍼라제(LUC)를 이용한 리포터 분석을 실시한 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이 JUL1 농도에 의존적으로 리포터 활성이 감소되었으나, SMXL5 5’UTR [mSMXL5 5’UTR(1)] 또는 JUL1 RA의 발현 시에는 번역 억제가 나타나지 않는 것으로 나타났다. 이에 더하여, 동일한 구아닌 염기 수를 가지지만 G-quadruplex 형성이 일어나지 않는 SMXL5 5’UTR 돌연변이(Scrambled SMXL5 5‘UTR-GFP (1) / Scrambled SMXL5 5‘UTR-GFP (2))에서 관찰한 결과 도 5d에서 볼 수 있는 바와 같이 JUL1이 존재(+JUL1)하는 경우에도 GFP 형광 단백질의 발현이 감소하지 않는 것을 통해 JUL1에 의존적인 번역 억제가 유도되지 않는 것을 확인하였다. 또한, JUL1의 존재 하에, G-쿼텟의 2개의 층을 갖는 SMXL5 5’UTR 돌연변이체(mSMXL5 5’UTR (2))는 SMXL5 5’UTR에서 보다 리포터 활성에 대한 억제 효과가 적었지만, 이의 효과는 단일 가닥 SMXL5 5’UTR 돌연변이체(mSMXL5 5’UTR(1)) 보다는 높게 나타났다. 이러한 결과는 RNA G-quadruplex 형성 모티프의 직접적인 인식과 SMXL5 5’UTR에서의 G-quadruplex의 안정화가 효율적인 JUL1 매개 억제를 유도한다는 것을 시사한다. 주목할 만하게, 도 5e에서 볼 수 있는 바와 같이 SMXL5 5’UTR 및 이의 돌연변이체는 JUL1의 부재시에 리포터 활성에 어떠한 차이도 나타내지 않았다. 상기 결과들은 JUL1이 SMXL5 5’UTR에서 G-quadruplex의 형성을 유도하며, G-quadruplex를 안정화시킴을 의미하는 것이다.

실시예 6. JUL 매개 SMXL5의 음성적 조절을 통한 체관부 발달 조절 확인

체관부 분화 과정에서 JUL 매개 SMXL5의 5’UTR G-quadruplex 형성이 미치는 영향을 조사하기 위해, JUL1/2의 발현이 억제된 뿌리에서 SMXL5 프로모터의 조절 하에 SMXL5의 발현양상을 관찰하였다. 그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이 JUL1 프로모터의 활성은 뿌리의 신장과 성숙 영역으로 제한되는 반면, SMXL5는 기저 분열조직의 체관부 초기 세포에서만 검출되었다. 그러나 JUL1/2의 발현이 억제된 경우(JUL1/2 RNAi), 기저 분열조직의 원위부로 SMXL5의 검출이 증가 및 확장되는 것으로 나타났다. 또한, 도 6b에서 볼 수 있는 바와 같이 JUL1/2의 발현이 억제된 경우에는 식물체에서 SMXL5의 폴리좀 결합이 증가하였으며, 이는 JUL1/2의 발현 억제에 의해 SMXL5의 번역이 증가함을 의미하는 것이다.

나아가 체관부 분화에서 JUL과 SMXL4/5 사이의 관계를 조사하기 위해, JUL의 발현이 억제된 식물에서 결함 있는 SMXL4/5의 영향을 관찰하였다. 그 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이 smxl4/5 돌연변이의 경우 체관부 마커 유전자인 APL의 발현이 감소하였으며, 야생형으로 JUL1/2 RNAi 라인의 표현형을 부분적으로 회복시켰다. 또한, 도 6d에 나타낸 바와 같이 VIGS를 이용해 NbSMXL5의 발현을 억제한 경우(TRV-NbJUL NbSMXL5), 담배에서 체관부 세포 수가 감소하였고, NbJUL의 발현이 억제된 표현형이 부분적으로 회복되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 JUL이 체관부 발달에서 SMXL4/5의 상류에서 기능한다는 것을 뒷받침하는 것이다.

실시예 7. JUL 매개 관다발식물의 저장기관 강도 조절 확인

본 발명자들은 체관부 세포 수의 증가가 체관부 수송 능력과 관련이 있는지를 알아보고자 하였다. 이에 체관부 흐름을 추적하기 위해, 도 7a에 도시한 바와 같이 자엽에서 뿌리 끝까지 체관부 symplasmic 추적자인 5, 6 카복시플루오레신 디아세테이트(5, 6 carboxyfluorescein?diacetate; CFDA)의 이동을 모니터링하였다. 실험 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이 JUL1/2의 발현이 억제된 경우(JUL1/2 RNAi), 하배측에서 체관부 세포 수가 증가하였고, 야생형(Col-0) 대조군과 비교하여 뿌리 선단에서의 CFDA 축적이 유의적으로 증가하였으며, 이는 JUL1/2 RNAi 계통에서 체관부 수송능력이 증진된다는 것을 의미한다.

다음으로, 담배와 애기장대에서 종자와 같은 싱크 조직에 대하여 JUL의 결핍에 따른 표현형을 조사하고자 하였다. 그 결과, 도 7c에 나타낸 바와 같이 담배에서 NbJUL의 발현이 억제된 경우(TRV-NbJUL #1, TRV-NbJUL #2), 대조군(TRV-GFP #1, TRV-GFP #2)과 비교해 종자의 크기와 무게가 약 26-29% 증가한 것을 관찰하였다. 또한, 도 7d에 나타낸 바와 같이 JUL이 결핍된 담배에서와 유사하게 JUL1/2 RNAi 애기장대에서 야생형(Col-0)에 비해 총 종자 생산량은 변하지 않았으나 종자의 크기와 무게가 각각 37%와 22% 증가한 것을 확인하였다. 더욱이 종자의 크기와 중량 증가 정도는 각 RNAi 계통에서 JUL1의 발현 억제 정도와 관련이 있는 것으로 나타났으며, 이는 체관부 세포 수의 증가와 종자 당 향상된 저장 강도 간에 양의 상관관계가 있음을 의미하는 것이다. 이에 더하여, VIGS를 이용해 토마토에서 JULGI의 발현을 억제한 결과 도 7e에 나타낸 바와 같이 토마토 과육의 총 생산량이 현저히 증가하였으며, 당도 또한 유의하게 증가한 것을 확인하였다.

실시예 8. 유전자 편집법을 이용한 JUL 매개 관다발식물의 저장기관 강도 조절 확인

상기 실시예 7의 결과에 더하여 유전자 편집법의 일종인 CRISPR/Cas9 system을 이용하여 도 8a에서 볼 수 있는바와 같이 JUL1 유전자의 5’인접 염기서열에 단일 염기 삽입(single nucleotide insertion)을 유도하여 애기장대 JUL1 유전자를 넉아웃(knock-out) 시켰다. 그 결과 도 8b에 나타낸 바와 같이 대조군(Control(jul2))에 비하여 JUL1 유전자를 넉아웃시킨 군(jul ^CRISPR/Cas9 jul2)의 체관부가 크게 증가된 것을 확인하였으며, 도 8c에 나타낸 바와 같이 역시 종자의 크기와 무게가 약 40% 증가한 것을 관찰하였다. 이는 본 발명이 유전자 편집법과 함께 효율적으로 이용될 수 있음을 보여줌을 의미한다.

종합적으로, 도 9에 도시한 바와 같이 JUL 결핍의 결과로 체관부 발달이 향상되는 것과 저장기관의 싱크 강도(sink strength)가 증가한 것 사이의 연관성은 체관부 처리 능력이 싱크 활성과 직접적으로 연관된다는 개념을 지지하는 것이다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Composition for increasing sink strength of sink tissues comprising expression or activity inhibitor of JULGI protein <130> PD18-038-P1 <150> KR 10-2018-0035534 <151> 2018-03-28 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 164 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana_JUL1 protein <400> 1 Met Ser Arg Pro Gly Asp Trp Asn Cys Arg Ser Cys Ser His Leu Asn 1 5 10 15 Phe Gln Arg Arg Asp Ser Cys Gln Arg Cys Gly Asp Ser Arg Ser Gly 20 25 30 Pro Gly Gly Val Gly Gly Leu Asp Phe Gly Asn Phe Gly Gly Arg Ala 35 40 45 Met Ser Ala Phe Gly Phe Thr Thr Gly Ser Asp Val Arg Pro Gly Asp 50 55 60 Trp Tyr Cys Thr Val Gly Asn Cys Gly Thr His Asn Phe Ala Ser Arg 65 70 75 80 Ser Thr Cys Phe Lys Cys Gly Thr Phe Lys Asp Glu Thr Gly Ala Gly 85 90 95 Gly Gly Gly Gly Gly Ile Gly Gly Pro Ala Met Phe Asp Ala Asp Ile 100 105 110 Met Arg Ser Arg Val Pro Gly Asn Gly Gly Arg Ser Ser Trp Lys Ser 115 120 125 Gly Asp Trp Ile Cys Thr Arg Ile Gly Cys Asn Glu His Asn Phe Ala 130 135 140 Ser Arg Met Glu Cys Phe Arg Cys Asn Ala Pro Arg Asp Phe Ser Asn 145 150 155 160 Arg Thr Ser Phe <210> 2 <211> 170 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana_JUL2 protein <400> 2 Met Asn Arg Pro Gly Asp Trp Asn Cys Arg Leu Cys Ser His Leu Asn 1 5 10 15 Phe Gln Arg Arg Asp Ser Cys Gln Arg Cys Arg Glu Pro Arg Pro Gly 20 25 30 Gly Ile Ser Thr Asp Leu Leu Ser Gly Phe Gly Gly Arg Pro Val Ser 35 40 45 Ser Ser Phe Gly Phe Asn Thr Gly Pro Asp Val Arg Pro Gly Asp Trp 50 55 60 Tyr Cys Asn Leu Gly Asp Cys Gly Thr His Asn Phe Ala Asn Arg Ser 65 70 75 80 Ser Cys Phe Lys Cys Gly Ala Ala Lys Asp Glu Phe Ser Cys Ser Ser 85 90 95 Ala Ala Ala Thr Thr Gly Phe Met Asp Met Asn Val Gly Pro Arg Arg 100 105 110 Gly Leu Phe Gly Phe Gly Gly Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly 115 120 125 Arg Ser Pro Trp Lys Ser Gly Asp Trp Ile Cys Pro Arg Ser Gly Cys 130 135 140 Asn Glu His Asn Phe Ala Ser Arg Ser Glu Cys Phe Arg Cys Asn Ala 145 150 155 160 Pro Lys Glu Leu Ala Thr Glu Pro Pro Tyr 165 170 <210> 3 <211> 495 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana_JUL1 cDNA <400> 3 atgagcagac ccggagattg gaactgcagg tcatgcagcc atctcaactt ccagcgccgt 60 gactcttgcc agcgatgcgg tgactctcgt tccggccccg gtggagttgg tggcttagac 120 tttggtaatt tcggtggcag agccatgtct gctttcggat tcaccaccgg ctccgacgtt 180 cgtcccggtg attggtactg caccgtggga aactgcggga cacacaactt cgccagtcgc 240 tccacctgct tcaaatgcgg cactttcaag gacgagaccg gcgctggagg cggaggtggt 300 ggcatcggcg gtccggccat gtttgacgcc gacattatgc ggtctagagt ccccggtaac 360 ggtggtcgct ctagctggaa atccggcgac tggatttgca ctaggattgg ttgcaatgag 420 cataactttg caagcagaat ggaatgcttc aggtgcaatg caccaaggga cttcagcaac 480 agaacctctt tctaa 495 <210> 4 <211> 513 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana_JUL2 cDNA <400> 4 atgaataggc cgggagattg gaactgcaga ttgtgtagcc acctcaactt ccagaggagg 60 gattcatgcc aacgttgtag agagcctaga ccgggcggga tcagtaccga tttactcagc 120 ggttttggtg gccgtccggt tagtagctcc ttcggtttca acaccgggcc cgatgtgcga 180 cccggggatt ggtattgcaa ccttggggat tgtgggacac ataattttgc caataggtcc 240 agttgtttca agtgtggtgc cgcaaaagat gagttttcat gctcaagtgc tgctgcaaca 300 accgggttta tggacatgaa tgttggtccg agacgtggcc tttttggttt tggcggcagc 360 agtagtggtg gtggtggtac gggccgttct ccttggaaat ctggagattg gatttgccca 420 aggtcaggct gtaacgaaca taacttcgca agcaggtcag agtgtttcag gtgtaacgca 480 ccaaaggaac ttgccaccga accaccctat tag 513 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SEOR1(AT3G01680)_Forward <400> 5 tctcacggcc ttggttcatc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SEOR1(AT3G01680)_Reverse <400> 6 atcgacccca accaagttcc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NEN4(AT4G39810)_Forward <400> 7 cggtaggatt tgggcaggtc 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NEN4(AT4G39810)_Reverse <400> 8 ccaagaccaa aataggcagc c 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HB8(AT4G32880)_Forward <400> 9 gctcgctgga tctctcactc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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TUB4(AT5G44340)_Reverse <400> 18 cagctttcca cggaacacag 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP_Forward <400> 19 agcaagggcg aggagctg 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP_Reverse <400> 20 gcacgccgta ggtgaagg 18 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YFP_Forward <400> 21 gcaagggcga ggagctg 17 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YFP_Reverse <400> 22 gcactgcagg ccgtagc 17

Claims

서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 JULGI 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는, 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장능력(sink strength)을 높이기 위한 조성물로서,
상기 억제제는 JULGI 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터, RNAi용 벡터, 및 상기 단백질 또는 유전자를 편집하는 CRISPR/Cas9 벡터로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이며,
상기 영양 저장 조직은 종자, 열매, 꽃, 뿌리, 또는 괴경인 것을 특징으로 하는, 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 JULGI 단백질은 SMXL4/5(SUPPRESSOR OF MAX2 1-LIKE4/5) mRNA의 5’UTR(Untranslated region)에 결합하여 상기 SMXL4/5의 발현을 저하시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제4항에 있어서,
상기 SMXL4/5의 발현 저하는 JULGI 단백질이 SMXL4/5 mRNA의 5’UTR에 결합하여 RNA G-quadruplex 형성을 유도함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
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제1항에 있어서,
상기 JULGI 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항의 조성물을 식물체에 처리하는 단계를 포함하는, 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장능력(sink strength)을 증가시키는 방법.
제11항의 방법에 따라 식물의 영양 저장 조직(sink tissue)의 영양 저장능력(sink strength)이 증가된, 식물체.
제12항에 있어서,
상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 식물체.