CN103667322B - 一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体avctc及其制备方法和应用 - Google Patents
一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体avctc及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC及其制备方法和应用。所述多基因嵌合体AVCTC的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示；所述多基因嵌合体AVCTC为番茄TMV病毒复制酶基因片段ORF400-700、番茄CMV病毒复制酶基因片段ORF45-345、番茄TYLCV病毒复制酶基因片段ORF420-720、烟草TMV病毒复制酶基因ORF2964-3264和黄瓜CMV复制酶基因ORF2057-2357的嵌合基因，是利用基因合成方法制备而成。将该多基因嵌合体AVCTC转化番茄，进而提高了转基因番茄的抵抗番茄黄化曲叶病毒的能力，为植物抵抗病毒提供有益的帮助。
Description
技术领域
本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC及其制备方法和应用。
背景技术
长期以来，番茄病毒病一直是生产上的巨大威胁，特别是从六十年代起，随着番茄在全国各地极为普遍地种植，该病迅速传播，广为流行，日益严重。自1909年美国发现第一种番茄病毒-TMV(烟草花叶病毒)以来，世界各地共相继报道了近30种可侵染番茄的病毒。病毒病传播广、危害重，又几乎无药可治，这就使得抗病毒病育种成为消除番茄病毒病威胁的主要策略。然而传统的育种艰苦费时，从而大大限制了育种工作的进展。与之相比，基因工程育种具有明显的优越性：①育种周期短；②适用范围广，尤其适用于传统育种因缺乏抗原而难以进行的抗CMV育种；③在育种过程中不会带入其他不良农艺性状的基因等。因此，基因工程在番茄抗病毒病育种中的应用日益受到人们的重视[孙神敏等，自然杂志，2002,25（3）：136-139]。
番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）属于双生病毒科（Gemini-viridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus），该病毒属于双生病毒亚组Ⅲ，是一类粉虱传播的双生病毒，主要通过烟粉虱或红薯白粉虱传播，可以侵染茄科、豆科等多种植物，超过20种植物易受TYLCV的影响。
针对TYLCV的抗病育种工作开始于20世纪60年代，主要措施是利用杂交将野生番茄中的抗病或耐病基因转育到栽培品种中。1988年，世界上第一个抗TYLCV的商品化品种TY-20出现了，它表现为虽然感染病毒，但症状延迟出现，而且产量还相当好。除TY-20之外，另2个来自野生抗原Lycopersiconperuuianum的杂交F1品种也开发成功。植物基因工程在番茄抗病虫育种材料的创新中取得了重要成果。自从Powell等率先获得烟草花叶病毒（TMV）外壳蛋白基因转化植物以来，在番茄中已有许多类似成功的研究报道。
利用基因工程获得抗番茄黄化曲叶病毒材料的研究目前得到很大进展。通过在寄主中表达病毒衣壳蛋白基因、表达病毒复制蛋白mRNA的反义RNA、均可获得对该病害的不同程度的抗性。RNA沉默机制的发现为抗病毒基因工程提供了新的途径，该方面的研究在国际上已经在广泛进行。早在1994年，以色列农业研究组织遗传系的Kunik等就开展了番茄抗黄花曲叶病毒（TYLCV）的转基因技术研究，他们将TYLCV病毒的外壳蛋白V1基因转化番茄，显著提高了转基因番茄对TYLCV病毒的抗性。2007年，巴基斯坦国家生物技术和遗传工程研究所的Mubin等将TYLCV病毒AV2的反义基因导入烟草，并提高了转基因烟草对TYLCV病毒的抗性。
然而，RNAi技术抗单个植物病毒也有其局限性，Canizares等研究报道，植物病毒存在抑制植物转录后基因沉默的机制，意味着利用RNAi技术抗一种植物病毒存在巨大风险。只要转基因植物发生了另一种病毒危害，则该植物病毒启动的转录后基因沉默抑制作用将使转基因植物RNAi抗病毒技术失去了作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC及其制备方法和应用，并将该多基因嵌合体AVCTC转化番茄，进而提高转基因番茄的抵抗番茄黄化曲叶病毒的能力，可以为植物抵抗病毒提供有益的帮助。
本发明利用基因工程技术培育抵抗番茄黄化曲叶病毒的植物，具体是将来自番茄TMV、CMV和TYLCV三种病毒复制酶基因片段，及烟草TMV复制酶和黄瓜CMV复制酶基因的嵌合基因AVCTC（AV1/AV2/AC1/TMVREP/CMVREP）转化到番茄中，从而大大提高番茄对番茄黄化曲叶病毒的抵抗能力。本发明必将更好弥补传统育种方法的不足，促进番茄品种改良事业的进步和发展。
因此，本发明所要解决的技术问题之一，在于提供一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC。
本发明所要解决的技术问题之二，在于提供一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC的制备方法。
本发明所要解决的技术问题之三，在于提供一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC在提高番茄抗番茄黄化曲叶病毒中的应用。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC，其核苷酸序列如SEQIDNo1所示。
所述的抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC是来自番茄TMV病毒复制酶基因片段AV1（ORF400-700）、番茄CMV病毒复制酶基因片段AV2(ORF45-345)、番茄TYLCV病毒复制酶基因片段AC1(ORF420-720)、烟草TMV病毒复制酶基因TMVREP(ORF2964-3264和黄瓜CMV复制酶基因CMVREP(ORF2057-2357)的嵌合基因。
一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC的制备方法，具体是由来自番茄TMV病毒复制酶基因片段AV1（ORF400-700）、番茄CMV病毒复制酶基因片段AV2(ORF45-345)、番茄TYLCV病毒复制酶基因片段AC1(ORF420-720)、烟草TMV病毒复制酶基因TMVREP(ORF2964-3264)和黄瓜CMV病毒复制酶基因CMVREP(ORF2057-2357)通过基因合成法制备而成本发明的多基因嵌合体AVCTC基因，其所用的引物如下：
AVCTC-1
AATGGATCCCAGGTCATGTTCTTCTTGGTTCGTGATAGAAGGCCCTATGGAAACAGCCCA
AVCTC-2
GCTCATTATCGAACATATTAAAAACCTGTCCAAAATCCATTGGGCTGTTTCCATAGGGCC
AVCTC-3
TAATATGTTCGATAATGAGCCCAGTACCGCAACCGTGAAGAATGATTTGCGGGATAGGTT
AVCTC-4
CCCACCAATAACTGTAGCATGAAATTTCCTCATCACTTGAAACCTATCCCGCAAATCATT
AVCTC-5
ATGCTACAGTTATTGGTGGGCCCTCTGGAATGAAGGAACAGGCATTAGTTAAGAGATTTT
AVCTC-6
GCCTCCTGATGATTATAAGTTACGTGACTGTTAATTCTAAAAAATCTCTTAACTAATGCC
AVCTC-7
ACTTATAATCATCAGGAGGCAGCCAAGTATGAGAACCATACTGAAAACGCCTTGTTATTG
AVCTC-8
CTGAAAACGCCTTGTTATTGTATATGGATTTCGTTGCATGTTAGCTATTAAATATTTGCA
AVCTC-9
TTAGCTATTAAATATTTGCAGGCCGTTGAGGAAACTTACGAGCCCAATACATTGGGCCAC
AVCTC-10
CACGGGCCCTTACAACAGATATAAGATCCCTAATTAAATCGTGGCCCAATGTATTGGGCT
AVCTC-11
ATCTGTTGTAAGGGCCCGTGACTATGTCGAAGCGACCAGGCGATATAATCATTTCCACGC
AVCTC-12
GGGCTGTCGAAGTTCAGCCTTCGGCGAACCTTCGAGACGGGCGTGGAAATGATTATATCG
AVCTC-13
AGGCTGAACTTCGACAGCCCATACAGCAGCCGTGCTGCTGTCCCCATTGTCCAAGGCACA
AVCTC-14
TCCGGTACATGGGCCTGTACGTCCATGATCGTCGCTTGTTTGTGCCTTGGACAATGGGGA
AVCTC-15
GTACAGGCCCATGTACCGGAAGCCCAGAATATACAGAATGTATCGAAGAAATCCGAGGCC
AVCTC-16
AAATATAGTCCTTTGGGGCCTTCTCTTTTAATATATTGAGGGCCTCGGATTTCTTCGATA
AVCTC-17
GGCCCCAAAGGACTATATTTTACAATTTCATAATTTAAGTTCAAATTTAGATAGGATTTT
AVCTC-18
AGAAAGAAATGGAGAAACATAAACTTCTAAAGGAGGACTAAAAATCCTATCTAAATTTGA
AVCTC-19
ATGTTTCTCCATTTCTTTCTTCTTCTTTTAATCAAGTTCCAGATGAACTTGAAGAGTGGG
AVCTC-20
CTCCATGGCCGCGCAGCGGAAGATACGACGTTCTCGGCGACCCACTCTTCAAGTTCATCT
AVCTC-21
TCCGCTGCGCGGCCATGGAGACCCATAAGTATTGTCATTGAGGGTGATAGCAGAACAGGC
AVCTC-22
AATAATTATGTGGGCCTAGAGACCTGGCCCACATTGTTTTGCCTGTTCTGCTATCACCCT
AVCTC-23
TCTAGGCCCACATAATTATTTATGTGGACATTCTTCGGTTAAAAAGTCTGTTTCGCAGGA
AVCTC-24
TTTTGAGATCGGATTGATCACGGCGGCTCCGCCGACCATCTCCTGCGAAACAGACTTTTT
AVCTC-25
TGATCAATCCGATCTCAAAACCCTTGCATGGCAAGATCCTGACTTTTACCCAATCGGATA
AVCTC-26
GTGTGAACATCTGAATACCCTCTTGAAAGCAGAGCTTCTTTATCCGATTGGGTAAAAGTC
AVCTC-27
GGGTATTCAGATGTTCACACTGTGCATGAAGTGCAAGGCGAGACATACTCTGATGTTTCA
AVCTC-28
CTGCAATGATGGAGACCGGTGTAGGGGTTAACCTAACTAGTGAAACATCAGAGTATGTCT
AVCTC-29
ACCGGTCTCCATCATTGCAGGAGACAGCCCACATGTTTTGGTCGCATTGTCAAGGCACAC
AVCTC-30
AGCAAACAACATAACAACAGTGTAGTACTTGAGCGAACAGGTGTGCCTTGACAATGCGAC
AVCTC-31
CTGTTGTTATGTTGTTTGCTCACTTCATGCAGTTTGTTGATCGATTGAAGTTTTTGGACC
AVCTC-32
AAGAAGAGTGAAAGTTGATCGATACAAGACTGAGACATTCGGTCCAAAAACTTCAATCGA
AVCTC-33
GATCAACTTTCACTCTTCTTCGAGTTGAAATACAGGAAGTCTGGGGCAGAGGCTGCCTTA
AVCTC-34
ACTGAAAATTAGCGGTGTACTTCTTAAAGGCACCTAGCATTAAGGCAGCCTCTGCCCCAG
AVCTC-35
GTACACCGCTAATTTTCAGTCCTACAAAGAACTCTATTATTCAGATCGTCGTCAGTGCGA
AVCTC-36
CTCAATCCTCAACTCTACACAACTAAACGAATTGATCAATTCGCACTGACGACGATCTGA
AVCTC-37
GTGTAGAGTTGAGGATTGAGCGTTCGAGTTTCATTAAGCAGCGAAAGAAGAAAGATGGAA
AVCTC-38
GCCTACGTTCAATTCCATCTTTCTTCTTTCGCGAGCTC
将本发明合成的多基因嵌合体AVCTC转入番茄，可应用于提高番茄抗番茄黄化曲叶病毒，具体包括如下步骤：
1）干涉载体构建
通过PCR技术获得两端分别带有XbaI和BamHI切点的AVCTC嵌合基因反义片段AVCTC1和两端分别带有KpnI和SacI切点的AVCTC嵌合基因正义片段AVCTC2。随后分别将AVCTC1和AVCTC2的酶切片段插入pYPX145植物RNAi双元载体的相应酶切点间，最终构成AVCTC嵌合基因植物RNAi干涉载体pYPX146（AVCTC），如图1所示。
2）电击法转化农杆菌
将构建好的AVCTC嵌合基因植物RNAi干涉载体pYPX146（AVCTC）质粒经电击法导入根癌农杆菌LBA4404菌株中。
3）农杆菌转化番茄
农杆菌侵染愈伤组织然后转化到番茄中，从获得的转基因番茄植株中取一部分叶子，侵入含有X-GLUC的染色液中，筛选叶片变蓝的转基因植株进行分子检测，提取叶片总DNA，以AVCTC-1和AVCTC-38为引物对转基因植株进行PCR检测。从分子水平上证明目的基因已导入，即得到转入多基因嵌合体AVCTC基因的番茄，进而验证了该转基因番茄对番茄黄化曲叶病毒具有很好的抵抗能力。
本发明的有益效果：
1.本发明利用5基因嵌合RNAi技术将番茄TMV，CMV和TYLCV三种病毒复制酶基因片段，烟草TMV复制酶和黄瓜CMV复制酶基因片段构建了多基因嵌合体AVCTC。
2.本发明合成的抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC（AV1/AV2/AC1/TMVREP/CMVREP）能成功导入植物中，并能够持续在植物中表达，促使植物能够抵抗番茄黄化曲叶病毒，可以为植物抵抗病毒提供有益的帮助。
3.含有本发明的多基因嵌合体AVCTC基因的植物安全稳定，对植物生长没有不良影响。
附图说明
图1为本发明的抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC植物表达载体pYPX146（AVCTC）构建示意图。
图2为本发明实施例3中转基因植株苗期的PCR电泳图，其中，M为DNAmarker，H2O为阴性对照，WT为野生型番茄，TV1-TV7分别为转基因番茄的七个不同株系。
图3为本发明实施例4中转基因番茄抗番茄黄化曲叶病毒的检测结果，其中，前排为野生型番茄，后排为转基因番茄。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案进一步详细描述，但不限制其范围。
实施例1基因合成法制备抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC
通过改良的重叠延伸PCR技术将番茄复制酶基因AV1（ORF400-700）、番茄复制酶基因AV2(ORF45-345)、番茄复制酶基因AC1(ORF420-720)、烟草复制酶基因TMVREP(ORF2964-3264)和黄瓜复制酶CMVREP(ORF2057-2357)5个基因片段进行拼接，构成全长1506bp的嵌合基因片段AVCTC。具体合成过程参考【Xiongetal.，NuclAcidsRes，2004，32:e98】。
合成过程中所用到的引物如下：
AVCTC-1
AATGGATCCCAGGTCATGTTCTTCTTGGTTCGTGATAGAAGGCCCTATGGAAACAGCCCA
AVCTC-2
GCTCATTATCGAACATATTAAAAACCTGTCCAAAATCCATTGGGCTGTTTCCATAGGGCC
AVCTC-3
TAATATGTTCGATAATGAGCCCAGTACCGCAACCGTGAAGAATGATTTGCGGGATAGGTT
AVCTC-4
CCCACCAATAACTGTAGCATGAAATTTCCTCATCACTTGAAACCTATCCCGCAAATCATT
AVCTC-5
ATGCTACAGTTATTGGTGGGCCCTCTGGAATGAAGGAACAGGCATTAGTTAAGAGATTTT
AVCTC-6
GCCTCCTGATGATTATAAGTTACGTGACTGTTAATTCTAAAAAATCTCTTAACTAATGCC
AVCTC-7
ACTTATAATCATCAGGAGGCAGCCAAGTATGAGAACCATACTGAAAACGCCTTGTTATTG
AVCTC-8
CTGAAAACGCCTTGTTATTGTATATGGATTTCGTTGCATGTTAGCTATTAAATATTTGCA
AVCTC-9
TTAGCTATTAAATATTTGCAGGCCGTTGAGGAAACTTACGAGCCCAATACATTGGGCCAC
AVCTC-10
CACGGGCCCTTACAACAGATATAAGATCCCTAATTAAATCGTGGCCCAATGTATTGGGCT
AVCTC-11
ATCTGTTGTAAGGGCCCGTGACTATGTCGAAGCGACCAGGCGATATAATCATTTCCACGC
AVCTC-12
GGGCTGTCGAAGTTCAGCCTTCGGCGAACCTTCGAGACGGGCGTGGAAATGATTATATCG
AVCTC-13
AGGCTGAACTTCGACAGCCCATACAGCAGCCGTGCTGCTGTCCCCATTGTCCAAGGCACA
AVCTC-14
TCCGGTACATGGGCCTGTACGTCCATGATCGTCGCTTGTTTGTGCCTTGGACAATGGGGA
AVCTC-15
GTACAGGCCCATGTACCGGAAGCCCAGAATATACAGAATGTATCGAAGAAATCCGAGGCC
AVCTC-16
AAATATAGTCCTTTGGGGCCTTCTCTTTTAATATATTGAGGGCCTCGGATTTCTTCGATA
AVCTC-17
GGCCCCAAAGGACTATATTTTACAATTTCATAATTTAAGTTCAAATTTAGATAGGATTTT
AVCTC-18
AGAAAGAAATGGAGAAACATAAACTTCTAAAGGAGGACTAAAAATCCTATCTAAATTTGA
AVCTC-19
ATGTTTCTCCATTTCTTTCTTCTTCTTTTAATCAAGTTCCAGATGAACTTGAAGAGTGGG
AVCTC-20
CTCCATGGCCGCGCAGCGGAAGATACGACGTTCTCGGCGACCCACTCTTCAAGTTCATCT
AVCTC-21
TCCGCTGCGCGGCCATGGAGACCCATAAGTATTGTCATTGAGGGTGATAGCAGAACAGGC
AVCTC-22
AATAATTATGTGGGCCTAGAGACCTGGCCCACATTGTTTTGCCTGTTCTGCTATCACCCT
AVCTC-23
TCTAGGCCCACATAATTATTTATGTGGACATTCTTCGGTTAAAAAGTCTGTTTCGCAGGA
AVCTC-24
TTTTGAGATCGGATTGATCACGGCGGCTCCGCCGACCATCTCCTGCGAAACAGACTTTTT
AVCTC-25
TGATCAATCCGATCTCAAAACCCTTGCATGGCAAGATCCTGACTTTTACCCAATCGGATA
AVCTC-26
GTGTGAACATCTGAATACCCTCTTGAAAGCAGAGCTTCTTTATCCGATTGGGTAAAAGTC
AVCTC-27
GGGTATTCAGATGTTCACACTGTGCATGAAGTGCAAGGCGAGACATACTCTGATGTTTCA
AVCTC-28
CTGCAATGATGGAGACCGGTGTAGGGGTTAACCTAACTAGTGAAACATCAGAGTATGTCT
AVCTC-29
ACCGGTCTCCATCATTGCAGGAGACAGCCCACATGTTTTGGTCGCATTGTCAAGGCACAC
AVCTC-30
AGCAAACAACATAACAACAGTGTAGTACTTGAGCGAACAGGTGTGCCTTGACAATGCGAC
AVCTC-31
CTGTTGTTATGTTGTTTGCTCACTTCATGCAGTTTGTTGATCGATTGAAGTTTTTGGACC
AVCTC-32
AAGAAGAGTGAAAGTTGATCGATACAAGACTGAGACATTCGGTCCAAAAACTTCAATCGA
AVCTC-33
GATCAACTTTCACTCTTCTTCGAGTTGAAATACAGGAAGTCTGGGGCAGAGGCTGCCTTA
AVCTC-34
ACTGAAAATTAGCGGTGTACTTCTTAAAGGCACCTAGCATTAAGGCAGCCTCTGCCCCAG
AVCTC-35
GTACACCGCTAATTTTCAGTCCTACAAAGAACTCTATTATTCAGATCGTCGTCAGTGCGA
AVCTC-36
CTCAATCCTCAACTCTACACAACTAAACGAATTGATCAATTCGCACTGACGACGATCTGA
AVCTC-37
GTGTAGAGTTGAGGATTGAGCGTTCGAGTTTCATTAAGCAGCGAAAGAAGAAAGATGGAA
AVCTC-38
GCCTACGTTCAATTCCATCTTTCTTCTTTCGCGAGCTC
以AVCTC-1、AVCTC-38为外侧引物，AVCTC-2～AVCTC-37为内侧引物，利用PCR进行扩增AVCTC片段，在50μl反应体系中，内侧的引物浓度分别为1.5pmol，外侧的两个引物浓度分别为30pmol。PCR反应得到了一个1506的片段，产物经回收，克隆和测序，其核苷酸序列如SEQIDNo1所示，具体如下：AATCAGGTCATGTTCTTCTTGGTTCGTGATAGAAGGCCCTATGGAAACAGCCCAATGGATTTTGGACAGGTTTTTAATATGTTCGATAATGAGCCCAGTACCGCAACCGTGAAGAATGATTTGCGGGATAGGTTTCAAGTGATGAGGAAATTTCATGCTACAGTTATTGGTGGGCCCTCTGGAATGAAGGAACAGGCATTAGTTAAGAGATTTTTTAGAATTAACAGTCACGTAACTTATAATCATCAGGAGGCAGCCAAGTATGAGAACCATACTGAAAACGCCTTGTTATTGTATATGGATTTCGTTGCATGTTAGCTATTAAATATTTGCAGGCCGTTGAGGAAACTTACGAGCCCAATACATTGGGCCACGATTTAATTAGGGATCTTATATCTGTTGTAAGGGCCCGTGACTATGTCGAAGCGACCAGGCGATATAATCATTTCCACGCCCGTCTCGAAGGTTCGCCGAAGGCTGAACTTCGACAGCCCATACAGCAGCCGTGCTGCTGTCCCCATTGTCCAAGGCACAAACAAGCGACGATCATGGACGTACAGGCCCATGTACCGGAAGCCCAGAATATACAGAATGTATCGAAGAAATCCGAGGCCCTCAATATATTAAAAGAGAAGGCCCCAAAGGACTATATTTTACAATTTCATAATTTAAGTTCAAATTTAGATAGGATTTTTAGTCCTCCTTTAGAAGTTTATGTTTCTCCATTTCTTTCTTCTTCTTTTAATCAAGTTCCAGATGAACTTGAAGAGTGGGTCGCCGAGAACGTCGTATCTTCCGCTGCGCGGCCATGGAGACCCATAAGTATTGTCATTGAGGGTGATAGCAGAACAGGCAAAACAATGTGGGCCAGGTCTCTAGGCCCACATAATTATTTATGTGGACATTCTTCGGTTAAAAAGTCTGTTTCGCAGGAGATGGTCGGCGGAGCCGCCGTGATCAATCCGATCTCAAAACCCTTGCATGGCAAGATCCTGACTTTTACCCAATCGGATAAAGAAGCTCTGCTTTCAAGAGGGTATTCAGATGTTCACACTGTGCATGAAGTGCAAGGCGAGACATACTCTGATGTTTCACTAGTTAGGTTAACCCCTACACCGGTCTCCATCATTGCAGGAGACAGCCCACATGTTTTGGTCGCATTGTCAAGGCACACCTGTTCGCTCAAGTACTACACTGTTGTTATGTTGTTTGCTCACTTCATGCAGTTTGTTGATCGATTGAAGTTTTTGGACCGAATGTCTCAGTCTTGTATCGATCAACTTTCACTCTTCTTCGAGTTGAAATACAGGAAGTCTGGGGCAGAGGCTGCCTTAATGCTAGGTGCCTTTAAGAAGTACACCGCTAATTTTCAGTCCTACAAAGAACTCTATTATTCAGATCGTCGTCAGTGCGAATTGATCAATTCGTTTAGTTGTGTAGAGTTGAGGATTGAGCGTTCGAGTTTCATTAAGCAGCGAAAGAAGAAAGATGGAATTGAACGTAGGC
实施例2：抗番茄黄化曲叶病毒得多基因嵌合体干涉载体构建
通过PCR技术分别获得两端分别带有XbaI和BamHI切点的AVCTC嵌合基因反义片段AVCTC1和两端分别带有KpnI和SacI切点的AVCTC嵌合基因正义片段AVCTC2。随后分别将AVCTC1和AVCTC2的酶切片段插入pYPX145植物RNAi双元载体的相应酶切点间，最终构成AVCTC嵌合基因植物RNAi干涉载体pYPX146（AVCTC），如图1所示。
实施例3：农杆菌培养和番茄转化
农杆菌菌株为根癌农杆菌LBA4404菌株。上述得到的AVCTC嵌合基因植物RNAi干涉载体pYPX146（AVCTC）重组质粒经电击法导入根癌农杆菌LBA4404菌株中。挑取单菌到25mlYEB培养基（50mg/l利福平）培养过夜，取5ml菌液转接到100mlYEB培养基（50mg/l利福平），培养至OD600=0.7-0.8，菌液冰上放置10分钟，5000rpm离心10min，4℃，收集菌体，加入100ml无菌双蒸水清洗两次。加入4ml10%甘油悬浮菌体，转到50ml离心管。5500rpm离心10min，4℃。收集菌体，加入500μl10%甘油悬浮菌体，转到1.5ml离心管，得到农杆菌感受态细胞。取70μl感受态细胞，加入1μl重组质粒，用去头的黄枪头混匀，转到0.1cm电击杯中。电击参数：200Ω，1.7KV，2.5F，电击后立即加入800μlSOC培养液。培养1小时后，取100μl涂抗性板，28℃培养过夜，以筛选成功导入重组质粒的菌株。
挑选较饱满的番茄种子（品种为沪番1479），用75%的酒精清洗1分钟，次氯酸钠加1滴吐温灭菌10分钟，种子铺在MS0培养基上，28℃培养待发芽。将番茄子叶或下胚轴剪成1cm2，放入A培养基：MS0+NAA(1ug/ml)+BA(4ug/ml)中，22℃培养1天。将上述电击法导入重组质粒的根癌农杆菌在YEB(每升含蔗糖5.0g，蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，MgSO449mg，琼脂15g)+利福平(Rif)50mg/L+卡那霉素(Km)50mg/L平板上划线，27℃培养48-72h，菌落长到1-2mm时挑取单菌落接入YEB液体培养基(加Rif25mg/L，Km25mg/L)，27℃培养12h左右，用生长至对数生长期(OD600=0.3)的根癌农杆菌感染番茄外植体。把在A培养基上预培养24h（25℃，散射光14h、黑暗10h）的外植体投入根癌农杆菌菌液中，摇动5-10min。灭菌纸吸干菌液，接入A培养基。同时取没有感染的正常外植体接种于A培养基作为对照(CK-1)。
感染后的外植体与农杆菌共培养3d(光照、温度同预培养)后，从培养基A转移到培养基B:MS0+NAA(1ug/ml)+BA(4ug/ml)+Km(30ug/ml)+Cb(500ug/ml)上。同时取部分对照CK-1外植体转入培养基B上。另取少量感染后的外植体转入新鲜的A培养基继续培养，设为CK-2，以观察抗菌素筛选效果。20-30d后转入C培养基:MS0+NAA(1ug/ml)+BA(2ug/ml)+Km(50ug/ml)+Cb(500ug/ml)。小苗长到1.5-2.5cm高时，转移到长根培养基D:MS0+IAA(0.1ug/ml)Km(5ug/ml)+Cef(200ug/ml)。待10-30d长出根后，移入蛭石中培养7-14d再移至营养土中，得到转基因番茄植株。
从获得的番茄植株中取一部分叶子，侵入含有含有X-GLUC的染色液中，筛选叶片变蓝的转基因植株进行分子检测。提取叶片总DNA，参照《分子克隆》的方法，以AVCTC-1和AVCTC-38为引物对转基因植株进行PCR检测，扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，4min。共25个循环，结果如图2所示。从图2中可以看到水为模板的阴性对照中和野生型植株中都没有检测到375bp的目的条带，而转基因株系TV1～TV7中都有很亮的375bp的目的条带，证明这些株系都是阳性苗，从分子水平上证明了目的基因已经成功导入。
实施例4：多基因嵌合体AVCTC转化植物对番茄黄化曲叶病毒的抵抗能力检测
本实施例中采用烟粉虱接种法，对不同生长期的转基因和野生型番茄植株进行了病毒接种。将生长至6片真叶的转基因和野生型番茄植株放入40目网袋内，将带番茄黄化曲叶病毒的烟粉虱放入所述网袋内，每个所述网袋内放入6头所述带番茄黄化曲叶病毒的烟粉虱进行接种传毒，完成番茄黄化曲叶病毒的接种。番茄传毒后，定期观察转基因和野生型番茄植株的初发病时间及病情发展情况，人工接种传毒较田间自然传毒发病快，野生型番茄植株在传毒1周后表现出极其轻微发病症状。分别在传毒1、2、3周后进行PCR检测，并在2周、3周后调查发病率及症状病级，计算其病情指数。病情指数反应了植株发病的严重程度，是反应耐、抗病性的重要指标。烟粉虱传毒2、3周后分别进行两次发病率及病级调查，计算发病率及病情指数。结果发现不同时期野生型番茄植株比转基因番茄都明显矮化、生长缓慢甚至停滞，无法正常开花结果，这表明转基因番茄具有较强的抗番茄黄化曲叶病毒的能力。如图3所示为开花期的生长情况，从图3中可观察到，前排的对照野生型番茄小苗矮化明显，而后排的转基因番茄生长正常，叶片稍有卷曲，不影响开花结果。
由此可知，本发明通过设计38条引物并利用基因合成法将番茄复制酶基因AV1（ORF400-700）、番茄复制酶基因AV2(ORF45-345)、番茄复制酶基因AC1(ORF420-720)、烟草复制酶基因TMVREP(ORF2964-3264)和黄瓜复制酶CMVREP(ORF2057-2357)5个基因片段进行拼接，构成如SEQIDNo1所示的多基因嵌合体AVCTC基因片段，并将该多基因嵌合体AVCTC成功导入番茄中，经过烟粉虱接种法检测发现得到的转基因番茄具有很强的抗番茄黄化曲叶病毒的能力，表明本发明合成的多基因嵌合体AVCTC具有提高植物抗番茄黄化曲叶病毒的能力。
Claims (3)
1.一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC，其特征在于，所述多基因嵌合体AVCTC是番茄TMV病毒复制酶基因片段ORF400-700、番茄CMV病毒复制酶基因片段ORF45-345、番茄TYLCV病毒复制酶基因片段ORF420-720、烟草TMV病毒复制酶基因ORF2964-3264和黄瓜CMV复制酶基因ORF2057-2357的嵌合基因，所述多基因嵌合体AVCTC的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
2.一种用于合成核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的多基因嵌合体AVCTC的引物，其特征在于，所述的引物包括AVCTC-1～AVCTC-38，具体序列如下：
AVCTC-1
AATGGATCCCAGGTCATGTTCTTCTTGGTTCGTGATAGAAGGCCCTATGGAAACAGCCCA
AVCTC-2
GCTCATTATCGAACATATTAAAAACCTGTCCAAAATCCATTGGGCTGTTTCCATAGGGCC
AVCTC-3
TAATATGTTCGATAATGAGCCCAGTACCGCAACCGTGAAGAATGATTTGCGGGATAGGTT
AVCTC-4
CCCACCAATAACTGTAGCATGAAATTTCCTCATCACTTGAAACCTATCCCGCAAATCATT
AVCTC-5
ATGCTACAGTTATTGGTGGGCCCTCTGGAATGAAGGAACAGGCATTAGTTAAGAGATTTT
AVCTC-6
GCCTCCTGATGATTATAAGTTACGTGACTGTTAATTCTAAAAAATCTCTTAACTAATGCC
AVCTC-7
ACTTATAATCATCAGGAGGCAGCCAAGTATGAGAACCATACTGAAAACGCCTTGTTATTG
AVCTC-8
CTGAAAACGCCTTGTTATTGTATATGGATTTCGTTGCATGTTAGCTATTAAATATTTGCA
AVCTC-9
TTAGCTATTAAATATTTGCAGGCCGTTGAGGAAACTTACGAGCCCAATACATTGGGCCAC
AVCTC-10
CACGGGCCCTTACAACAGATATAAGATCCCTAATTAAATCGTGGCCCAATGTATTGGGCT
AVCTC-11
ATCTGTTGTAAGGGCCCGTGACTATGTCGAAGCGACCAGGCGATATAATCATTTCCACGC
AVCTC-12
GGGCTGTCGAAGTTCAGCCTTCGGCGAACCTTCGAGACGGGCGTGGAAATGATTATATCG
AVCTC-13
AGGCTGAACTTCGACAGCCCATACAGCAGCCGTGCTGCTGTCCCCATTGTCCAAGGCACA
AVCTC-14
TCCGGTACATGGGCCTGTACGTCCATGATCGTCGCTTGTTTGTGCCTTGGACAATGGGGA
AVCTC-15
GTACAGGCCCATGTACCGGAAGCCCAGAATATACAGAATGTATCGAAGAAATCCGAGGCC
AVCTC-16
AAATATAGTCCTTTGGGGCCTTCTCTTTTAATATATTGAGGGCCTCGGATTTCTTCGATA
AVCTC-17
GGCCCCAAAGGACTATATTTTACAATTTCATAATTTAAGTTCAAATTTAGATAGGATTTT
AVCTC-18
AGAAAGAAATGGAGAAACATAAACTTCTAAAGGAGGACTAAAAATCCTATCTAAATTTGA
AVCTC-19
ATGTTTCTCCATTTCTTTCTTCTTCTTTTAATCAAGTTCCAGATGAACTTGAAGAGTGGG
AVCTC-20
CTCCATGGCCGCGCAGCGGAAGATACGACGTTCTCGGCGACCCACTCTTCAAGTTCATCT
AVCTC-21
TCCGCTGCGCGGCCATGGAGACCCATAAGTATTGTCATTGAGGGTGATAGCAGAACAGGC
AVCTC-22
AATAATTATGTGGGCCTAGAGACCTGGCCCACATTGTTTTGCCTGTTCTGCTATCACCCT
AVCTC-23
TCTAGGCCCACATAATTATTTATGTGGACATTCTTCGGTTAAAAAGTCTGTTTCGCAGGA
AVCTC-24
TTTTGAGATCGGATTGATCACGGCGGCTCCGCCGACCATCTCCTGCGAAACAGACTTTTT
AVCTC-25
TGATCAATCCGATCTCAAAACCCTTGCATGGCAAGATCCTGACTTTTACCCAATCGGATA
AVCTC-26
GTGTGAACATCTGAATACCCTCTTGAAAGCAGAGCTTCTTTATCCGATTGGGTAAAAGTC
AVCTC-27
GGGTATTCAGATGTTCACACTGTGCATGAAGTGCAAGGCGAGACATACTCTGATGTTTCA
AVCTC-28
CTGCAATGATGGAGACCGGTGTAGGGGTTAACCTAACTAGTGAAACATCAGAGTATGTCT
AVCTC-29
ACCGGTCTCCATCATTGCAGGAGACAGCCCACATGTTTTGGTCGCATTGTCAAGGCACAC
AVCTC-30
AGCAAACAACATAACAACAGTGTAGTACTTGAGCGAACAGGTGTGCCTTGACAATGCGAC
AVCTC-31
CTGTTGTTATGTTGTTTGCTCACTTCATGCAGTTTGTTGATCGATTGAAGTTTTTGGACC
AVCTC-32
AAGAAGAGTGAAAGTTGATCGATACAAGACTGAGACATTCGGTCCAAAAACTTCAATCGA
AVCTC-33
GATCAACTTTCACTCTTCTTCGAGTTGAAATACAGGAAGTCTGGGGCAGAGGCTGCCTTA
AVCTC-34
ACTGAAAATTAGCGGTGTACTTCTTAAAGGCACCTAGCATTAAGGCAGCCTCTGCCCCAG
AVCTC-35
GTACACCGCTAATTTTCAGTCCTACAAAGAACTCTATTATTCAGATCGTCGTCAGTGCGA
AVCTC-36
CTCAATCCTCAACTCTACACAACTAAACGAATTGATCAATTCGCACTGACGACGATCTGA
AVCTC-37
GTGTAGAGTTGAGGATTGAGCGTTCGAGTTTCATTAAGCAGCGAAAGAAGAAAGATGGAA
AVCTC-38
GCCTACGTTCAATTCCATCTTTCTTCTTTCGCGAGCTC。
3.一种核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的多基因嵌合体AVCTC在提高番茄抗番茄黄化曲叶病毒中的应用。
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