CN1357040A - 病毒基因表达的调节 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用基因的有义和反义RNA片段改变病毒基因在细胞中表达的方法。有义和反义RNA片段能够配对并形成双链RNA分子,从而改变基因的表达。本发明还涉及用本发明的方法获得的细胞、植物或动物,其后代和产生的种子。优选的,这些细胞、植物或动物为病毒抗性或耐受的。

Description

病毒基因表达的调节
本发明涉及利用病毒基因的有义和反义RNA片段改变该基因在细胞、植物或动物中的表达的方法，并涉及利用本发明的方法获得的病毒基因表达改变的细胞、植物或动物。本发明特别涉及对病毒有抗性或耐受性的细胞、植物或动物。
特别有意义的方面是对病毒的抗性或耐受性。病毒可侵袭大多数活的生物。对于作物，可由于病毒感染而损失高比例的产量。农畜也经常被病毒感染，有时必须屠宰以防止可导致严重经济后果的疾病的扩散。宠物也可被病毒感染，最后，病毒感染人，引起多种疾患。尽管抗病毒治疗已有进展，但通常不是极其昂贵，就是效果有限。
希望能修饰细胞、植物或动物，使得特定病毒基因的表达改变，产生对该病毒有抗性或耐受性的细胞、植物或动物。现有的改变基因表达的方法通常依赖于有义或反义抑制技术。但遗憾的是，这些方法在改变基因表达的能力方面常常是易变的且无法预测的，在许多情况下不能实现特定基因活性的完全破坏。
因此，一直需要但尚未有能有效且可预测地改变病毒基因表达，从而获得对病毒有抗性或耐受性的细胞、植物或动物的新方法。
本发明涉及利用病毒基因的有义和反义RNA片段改变该基因在细胞、植物或动物中的表达的方法。重要的是，这些有义和反义RNA片段能够形成双链RNA分子。特别是，本发明涉及赋予细胞、植物或动物病毒抗性或耐受性的方法和组合物。优选地，本发明涉及赋予植物病毒抗性或耐受性的方法。本发明还优选地涉及用这些方法获得的植物细胞，由这些细胞产生的植物，这些植物的后代和这些植物产生的种子。在这些植物细胞或植物中，特定病毒基因表达的改变比利用本领域已知的现有方法获得的特定病毒基因表达的改变更有效、更有选择性且更有可预测性。
因此本发明提供：
一种方法，包括向细胞中导入多种亚序列，例如RNA片段或DNA序列，其特征在于至少两种亚序列含有病毒RNA的有义和反义序列，并且能形成双链RNA分子。优选地，该方法包括向一种细胞中导入由多种亚序列组成的RNA，其特征在于至少两种亚序列含有病毒RNA的序列。优选地，该RNA含有至少一个位于3’末端亚序列上游的翻译终止密码子。在另一个实施方案中，该方法包括向一种细胞中导入编码该RNA表达的核苷酸序列或DNA分子。
因此本发明提供：
一种方法，包括向细胞中导入病毒靶基因的有义RNA片段，和该靶基因的反义RNA片段，其中该有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA分子，其中该靶基因在该细胞中的表达被改变。在一个优选实施方案中，靶基因含有一种病毒基因组或其部分，细胞优选地对病毒有抗性或耐受性。在一个优选实施方案中，所述病毒选自：蕃茄斑萎病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、烟草花叶病毒、黄症病毒、黄瓜花叶病毒、雀麦花叶病毒、长线病毒、番茄丛矮病毒和真菌传棒状病毒。在另一个优选实施方案中，RNA片段含有来源于病毒外壳蛋白基因、病毒核壳蛋白基因、病毒复制酶基因、运动蛋白基因或其部分的核苷酸序列。在另一个优选实施方案中，细胞是一种植物细胞，如单子叶或双子叶植物细胞。在另一个优选实施方案中，RNA片段包含于两种不同的RNA分子中。在另一个优选实施方案中，RNA片段在被导入细胞中之前混合。在另一个优选实施方案中，RNA片段在被导入细胞中之前，在能使其形成双链RNA分子的条件下混合。在另一个优选实施方案中，这些RNA片段被顺序导入所述细胞中。在又另一个优选实施方案中，这些RNA片段包含于一种RNA分子中。在这种情况中，该RNA分子优选地能够折叠，使得其中包含的所述RNA片段形成双链RNA分子。
本发明还提供：
一种方法，包括向一种细胞中导入能在该细胞中表达病毒靶基因的有义RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达该靶基因的反义RNA片段的第二种DNA序列，其中所述有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA分子，其中该病毒靶基因在该细胞中的表达被改变。在一个优选实施方案中，靶基因含有一种病毒基因组或其部分，细胞优选地对病毒有抗性或耐受性。在一个优选实施方案中，所述病毒选自：蕃茄斑萎病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、烟草花叶病毒、黄症病毒、黄瓜花叶病毒、雀麦花叶病毒、长线病毒、番茄丛矮病毒和真菌传棒状病毒。在另一个优选实施方案中，DNA片段含有来源于病毒外壳蛋白基因、病毒核壳蛋白基因、病毒复制酶基因、运动蛋白基因或其部分的核苷酸序列。在另一个优选实施方案中，细胞是一种植物细胞，如单子叶或双子叶植物细胞。在一个优选实施方案中，这些DNA序列稳定地整合于植物细胞的基因组中。在一个优选实施方案中，DNA分子还含有与所述第一种或第二种DNA序列有效连接的启动子。在另一个优选实施方案中，第一种DNA序列和第二种DNA序列包含于两种不同的即分别的DNA分子中。
另外，第一种DNA序列和第二种DNA序列也可包含于一种DNA分子中。在此情况中，第一种DNA序列和第二种DNA序列优选地包含于该DNA分子的同一DNA链中，意味着有义RNA片段和反义RNA片段包含于一个RNA分子中。优选地，该RNA分子能够折叠，使得其中包含的所述RNA片段形成双链区。这种RNA分子的例子包括SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：28的反向重复序列。在另一个优选实施方案中，有义RNA片段和反义RNA片段包含于或者表达为两种RNA分子。在此情况中，第一种DNA序列和第二种DNA序列优选地与一种双向启动子有效连接，或者另外，第一种DNA序列与第一种启动子有效连接，而第二种DNA序列与第二种启动子有效连接，其中第一种启动子和第二种启动子是相同的启动子或不同的启动子。在另一个优选实施方案中，第一种DNA序列和第二种DNA序列包含于该DNA分子的互补链中。
在另一个优选实施方案中，在所述DNA分子中，第一种DNA序列是第二种DNA序列的互补DNA链。在此情况中，该DNA分子另外含有与所述第一种或第二种DNA序列有效连接的第一种启动子。在一个优选实施方案中，该DNA分子另外在第一种启动子与第一种或第二种DNA序列之间含有第一个位点特异性重组位点，在第一种DNA序列3’末端含有第二个位点特异性重组位点，其中第一个和第二个位点特异性重组位点能够在位点特异性重组酶的存在下，翻转位于第一个和第二个位点特异性重组位点之间的第一种或第二种DNA序列。在另一个优选实施方案中，由于这种翻转，第一种启动子能够表达第二种(或第一种，取决于哪种DNA序列与该启动子有效连接)DNA序列。植物细胞优选地另外含有一种能够识别所述位点特异性重组位点的位点特异性重组酶。
在另一个优选实施方案中，该DNA分子另外含有与所述第一种DNA序列有效连接的第一种启动子，和与第二种DNA序列有效连接的第二种启动子，其中第一种启动子和第二种启动子包括相同的启动子或不同的启动子。
在另一个优选实施方案中，DNA分子中的启动子包括该细胞的天然启动子。在另一个优选实施方案中，该启动子是异源启动子，例如组织特异性启动子、发育调节型启动子、组成型启动子或诱导型启动子。任选地，该启动子是一种能在启动子任一侧起始DNA序列转录的趋异(divergent)启动子或双向启动子。
在另一个优选实施方案中，DNA分子在编码有义和反义RNA片段的DNA序列之间含有一个接头。该接头包含，例如，含有功能基因(如选择性标记基因)或调节序列(如内含子加工信号)的表达盒。
本发明另外还提供：
一种细胞，其含有本发明的有义和反义RNA片段，其中所述RNA片段改变了所述病毒靶基因在该细胞中的表达。在一个优选实施方案中，细胞对病毒有抗性或耐受性。在一个优选实施方案中，细胞是一种植物细胞，本发明进一步提供由该植物细胞产生的植物及其后代，和该植物产生的种子。
本发明还提供：
含有本发明的DNA序列的DNA构建体。
在一个优选实施方案中，这种DNA构建体包含能在细胞中表达病毒基因组或其部分的有义RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达该病毒基因组或其部分的反义RNA片段的第二种DNA序列，其中所述有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA分子。在另一个优选实施方案中，该病毒基因组或其部分在该细胞中的表达改变。在另一个优选实施方案中，该细胞中一种植物细胞。在另一个优选实施方案中，该病毒选自：蕃茄斑萎病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、烟草花叶病毒、黄症病毒、黄瓜花叶病毒、雀麦花叶病毒、长线病毒、番茄丛矮病毒和真菌传棒状病毒。在另一个优选实施方案中，DNA序列含有来源于病毒外壳蛋白基因、病毒核壳蛋白基因、病毒复制酶基因、运动蛋白基因或其部分的核苷酸序列。在另一个优选实施方案中，DNA构建体进一步含有与所述第一种或第二种DNA序列有效连接的启动子。在另一个优选实施方案中，DNA构建体含有与所述第一种DNA序列有效连接的第一种启动子，和与第二种DNA序列有效连接的第二种启动子。在另一个优选实施方案中，DNA构建体还含有与第一种DNA序列和第二种DNA序列有效连接的双向启动子。
本发明还提供：
一种DNA构建体，其包含：
(a)能在细胞中表达靶基因的有义RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达该靶基因的反义RNA片段的第二种DNA序列，其中所述有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA分子，其中在该DNA构建体中，第一种DNA序列是第二种DNA序列的互补链。
(b)一种与所述第一种或第二种DNA序列有效连接的启动子。
(c)在该启动子与第一种或第二种DNA序列之间的第一个位点特异性重组位点，和
(d)在第一种或第二种DNA序列3’末端的第二个位点特异性重组位点，其中第一个和第二个位点特异性重组位点能够在位点特异性重组酶的存在下，翻转位于第一个和第二个位点特异性重组位点之间的第一种或第二种DNA序列。
在一个优选实施方案中，该靶基因在该细胞中的表达被改变。
本发明还提供：
一种DNA构建体，其包含：
(a)能在细胞中表达靶基因的有义RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达该靶基因的反义RNA片段的第二种DNA序列，其中所述有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA分子，其中在该DNA构建体中，第一种DNA序列是第二种DNA序列的互补链。
(b)与第一种DNA序列有效连接的第一种启动子。
(c)与第二种DNA序列有效连接的第二种启动子。
在一个优选实施方案中，该靶基因在该细胞中的表达被改变。
“双链RNA(dsRNA)”分子包含靶基因的有义RNA片段和同一靶基因的反义RNA片段，两者都含有彼此互补的核苷酸序列，从而使得有义和反义RNA片段配对，形成双链RNA分子。
“互补的”是指含有反平行核苷酸序列的两种核苷酸序列，它们能在反平行核苷酸序列的互补碱基残基之间形成氢键后彼此配对。
“反平行的”在此是指在互补碱基残基之间通过氢键配对的两种核苷酸序列，在一种核苷酸序列中磷酸二酯键为5’-3’方向，而在另一种核苷酸序列中为3’-5’方向。
“靶基因”是已知功能的任一病毒基因，或者是功能未知但全部或部分核苷酸序列已知的基因。靶基因是该细胞的天然基因，或者是以前已经优选地通过遗传转化或病毒感染细胞而导入细胞中的异源基因。优选地，靶基因是植物细胞中的一种基因。
“天然”基因是指存在于未转化细胞的基因组中的基因。
“必需”基因是编码细胞生长或存活所必需的蛋白质如生物合成酶、受体、信号转导蛋白、结构基因产物或转运蛋白的基因。
“改变”靶基因在细胞中的表达意思是，在应用本发明的方法后，靶基因在细胞中的表达水平不同于其在应用该方法之前在细胞中的表达。改变基因表达优选地是指，靶基因在细胞中的表达降低，优选地强烈降低，更优选地基因的表达不可检测，使细胞或由其衍生的植物或动物产生敲除突变表型。
在本发明申请书中“分离的”是一种分离的核酸分子，其通过人工操作与其天然环境分离，因此不是一种天然产物。分离的核酸分子可能以纯化的形式存在，或者可能存在于非天然环境中，如转基因宿主细胞中。
在此使用时，“表达盒”意思是能引导特定核苷酸序列在合适的宿主细胞中表达的DNA序列，包含与目的核苷酸序列有效地连接的启动子，该核苷酸序列与终止信号有效地连接。它一般还包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码一种目的蛋白，但也可编码一种目的功能性RNA，例如有义或反义方向的反义RNA或非翻译RNA。含有目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意思是其至少一种成分对于至少另一种成分是异源的。表达盒也可是天然存在，但已经以可用于异源表达的重组形式获得的。然而一般而言表达盒对于宿主是异源的，即表达盒的特定DNA序列不在宿主细胞中天然存在，必须通过转化事件被导入宿主细胞或宿主细胞的祖先中。表达盒中核苷酸序列的表达可以受组成型启动子或诱导型启动子控制，该启动子只有在宿主细胞接触某种特定外部刺激物时才起始转录。对于多细胞生物，如植物，启动子也可能是对特定组织或器官或发育阶段特异的。
在此使用时，“异源的”意思是“不同自然来源的”，或者表示一种非自然状态。例如，如果用从来源于另一种生物尤其是另一个种的核酸序列转化宿主细胞，该核酸序列对于该宿主细胞是异源的，对于携带该核酸序列的该宿主细胞的后代也是异源的。类似地，异源是指来源于和插入相同自然、原始细胞型的核苷酸序列，但它以非自然状态存在，例如，不同拷贝数，或处于不同调节元件控制之下。
最广义地来说，当在此对核苷酸序列使用时，术语“基本上类似”意思是一种对应于参照核苷酸序列的核苷酸序列，其中相应的序列编码一种与参照核苷酸序列编码的多肽有基本上相同的结构和功能的多肽，例如，只发生不影响多肽功能的氨基酸改变。希望地，基本上类似的核苷酸序列编码参照核苷酸序列编码的多肽。基本上类似的核苷酸序列与参照核苷酸序列之间同一性的百分数(互补序列中的互补碱基数除以互补序列中的碱基总数)希望地为至少80％，更希望地为85％，优选地至少90％，更优选地至少95％，再更优选地至少99％。
“调节元件”是指参与引起核苷酸序列表达的序列。调节元件包含与目的核苷酸序列有效连接的启动子和终止信号。它们一般还包含该核苷酸序列适当翻译所需的序列。
“植物”指处于任何发育阶段的任何植物或植物的部分。其中也包括插条、细胞或组织培养物和种子。在本发明中使用时，术语“植物组织”包括但不限于，整个植物、植物细胞、植物器官、植物种子、原生质体、愈伤组织、细胞培养物和组织成结构和/或功能单位的任何植物细胞组。
“病毒抗性或耐受性”在此是指，抗性或耐受性细胞、植物或动物不是易感的，与敏感的细胞、植物或动物相比，具有降低的对一种或多种病毒的敏感性。例如，抗性或耐受性是指，病毒感染的普通症状缺如或降低，或病毒在细胞中的积累或复制被阻止或降低，或病毒的运动例如从细胞到细胞的运动被阻止或减少。
“病毒基因组或其部分的表达的改变”一般被理解为，病毒或其部分或成分如病毒的RNA、DNA或蛋白质在细胞中的积累、复制或运动受到影响。
本发明涉及调节即改变病毒基因在细胞、植物或动物中的表达的方法。调节基因在细胞、植物或动物中表达的常用方法缺乏可预测性，并且显示取决于根据所调节的基因的变化性。本方法解决了这些问题，并且为细胞、植物或动物中基因的可重复和有效调节作了准备。
其表达被调节的基因是病毒基因组或其部分。在一个优选实施方案中，细胞是一种真核细胞，更优选地是一种植物细胞，如单子叶或双子叶植物细胞，或一种动物细胞，如来自哺乳动物如人、牛、绵羊、猪、猫或犬，或来自禽类的细胞。
本发明利用病毒靶基因的有义RNA片段和反义RNA片段改变基因在细胞中的表达。在第一个实施方案中，本发明提供了一种方法，包括向细胞中导入靶基因的有义RNA片段，和该靶基因的反义RNA片段，其中有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA分子，其中靶基因在所述细胞中的表达被改变。通过不同转化方法(如粒子轰击或PEG介导的转化或电穿孔)将RNA片段导入细胞中。在另一个优选实施方案中，使用其他技术，如RNA片段的显微注射。在一个优选实施方案中，这些RNA片段包含于两种不同的RNA分子中。在此情况中，RNA片段在被导入所述细胞之前混合，例如在能使其形成双链RNA分子的条件下混合。在另一个优选实施方案中，这些RNA片段被顺序导入所述细胞中。优选地，导入每种RNA分子的时间间隔很短，优选地不到1小时。在又另一个实施方案中，这些RNA片段包含于一种单一RNA分子中。利用一种RNA分子，两种互补的RNA片段紧密接近，引起配对，这是有利的。在这种情况中，RNA分子优选地能够折叠，使得其中包含的RNA片段形成双链区。在这种情况中，RNA片段的互补部分彼此识别，互相配对，形成双链RNA分子。在一个优选实施方案中，在导入细胞中之前，在能使其形成双链RNA分子的条件下温育RNA片段。在又另一个实施方案中，RNA分子在有义RNA片段和反义RNA片段之间含有一个接头。该接头优选地包含含有功能基因(如选择性标记基因)的表达盒所编码的RNA序列。在另一个实施方案中，接头包含调节序列编码的RNA序列，例如，含有内含子加工信号。
在另一个优选实施方案中，本发明提供一种改变病毒基因组表达的方法，包括向细胞中导入能在该细胞中表达该病毒基因组的有义RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达病毒基因组的反义RNA片段的第二种DNA序列，其中有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA分子。在一个优选实施方案中，第一种DNA序列和第二种DNA序列稳定地整合于细胞的基因组中。在另一个优选实施方案中，DNA序列包含于两种不同的DNA分子中。在另一个优选实施方案中，DNA序列包含于一个DNA分子中。在这种情况中，该DNA分子优选地编码一种含有有义和反义RNA片段的单个RNA分子。利用一种单个RNA分子，两种互补的RNA片段紧密接近，引起配对，这是有利的。该DNA分子编码两种不同的RNA分子，例如一种含有有义RNA片段的RNA分子和一种含有反义RNA片段的RNA分子。单个RNA分子或两种不同的RNA分子优选地能够折叠，使得包含的RNA片段形成双链区。其中RNA片段的互补部分彼此识别，互相配对，形成双链RNA分子。
在一个实施方案中，一种DNA分子或两种不同DNA分子的每一种含有与该DNA序列有效连接的启动子。在一个优选实施方案中，该DNA序列中的启动子含有一种天然植物启动子或欲灭活的病毒基因的自然启动子，以确保双链RNA在相同组织中在发育的相同时间表达为病毒靶基因。在另一个实施方案中，启动子是一种异源启动子，例如组织特异性启动子、发育调节型启动子、组成型启动子或诱导型启动子。
在另一个实施方案中，DNA序列在编码两种互补RNA片段的DNA序列之间含有一种接头。该接头优选地包含含有功能基因(如选择性标记基因)的表达盒。在另一个实施方案中，该接头包含调节序列，例如包含内含子加工信号。
本发明的DNA分子通过本领域周知的和以下所述的方法转化细胞。本发明也提供了一种含有本发明的DNA序列的DNA构建体，含有这些DNA构建体的重组载体，和含有本发明的DNA序列的组合物。在本发明中，有义与反义RNA片段之间互补区的长度希望地至少15个核苷酸长，更希望地至少50个核苷酸长，优选地至少500bp长。优选地，互补区小于5kb，更优选地小于2kb。在一个具体实施方案中，有义与反义RNA片段之间的互补区含有靶基因的编码区。在另一个优选实施方案中，互补区含有靶基因的非翻译区(UTR)，例如5’UTR或3’UTR。在另一个优选实施方案中，编码本发明的有义或反义RNA片段的DNA序列来源于一种c-DNA分子，或含有将改变其表达的病毒靶基因的调节元件，如启动子或终止信号。
在另一个优选实施方案中，有义与反义RNA片段之间的互补区与表达被改变的基因的相应序列相同。在另一个优选实施方案中，有义与反义RNA片段之间的互补区基本上类似于表达被改变的基因的相应序列，并且仍能改变该基因的表达。在这种情况中，互补区与表达被改变的基因的相应序列希望地至少50％相同，更希望地至少70％相同，优选地至少90％相同，更优选地至少95％相同。因此，应用一个双链RNA分子可以改变一种基因或多种基因的表达，单个基因包含与双链RNA相同，或基本上类似于双链RNA的序列。
在另一个优选实施方案中，有义与反义RNA片段之间的互补区在有义和反义RNA片段之间不包含任何错配。在另一个优选实施方案中，有义与反义RNA片段之间的互补区在有义与反义RNA片段之间包含至少一个错配，两种RNA片段仍能配对，并形成双链RNA分子，从而改变了基因的表达。希望地，在互补区的有义与反义RNA片段之间有低于50％的错配，更希望地低于30％的错配，优选地低于20％的错配，更优选地低于10％的错配，再更优选地低于5％的错配。病毒的抗性或耐受性
本发明产生具有病毒抗性或耐受性的细胞、动物或植物。用本发明防治的病毒包括但不限于dsDNA病毒、dsRNA病毒、正链和负链ssRNA病毒、双义RNA病毒和反转录病毒。优选防治的是植物病毒，如as蕃茄斑萎病毒(例如，芜菁花叶病毒，缩写为TuMV；莴苣花叶病毒，缩写为LMV；西瓜花叶病毒II，缩写为WMVII；胡瓜黄化花叶病毒，缩写为ZYMV；马铃薯Y病毒，缩写为PVY；和木瓜环斑病毒，缩写为PRSV)、马铃薯X病毒、烟草花叶病毒(例如胡椒淡斑点病毒，缩写为PMMV，和番茄花叶病毒，缩写为ToMV)、黄症病毒(例如甜菜西方黄化病毒，缩写为BWYV，和甜菜淡黄病毒，缩写为BWYV)、黄瓜花叶病毒(例如黄瓜花叶病毒，缩写为CMV)、双粒病毒(例如番茄黄曲叶病毒，缩写为TYLCV)、花椰菜病毒(例如花椰菜花叶病毒，缩写为CaMV)、雀麦花叶病毒、长线病毒、番茄丛矮病毒和真菌传棒状病毒(例如甜菜坏死黄叶脉病毒，缩写为BNYVV)。能用本发明防治的其他类病毒在Zacomer等人(1995)普通病毒学杂志(Jorunal of GeneralVirology)，76：231-247和Martelli(1992)植物病害(Plant Disease)，76：436-441中有述。为实现病毒防治优选的病毒基因组的DNA序列对应于编码病毒外壳蛋白、病毒核壳蛋白、病毒复制酶、运动蛋白等的基因区。在WO 95/09920中叙述了用来控制病毒基因组表达的其他核苷酸序列。优选的DNA序列可包括不翻译为蛋白质的病毒基因组的部分，如5’或3’非翻译区。
优选地，本发明的方法导致对广谱病毒的抗性或耐受性。例如，本发明的方法导致对病毒基因组编码的病毒和相同病毒类、群或属的其他病毒的抗性或耐受性。此外，本发明的方法也导致对病毒基因组编码的病毒和同一病毒的其他分离株的抗性或耐受性。本发明的方法也导致对病毒基因组编码的病毒和相同病毒群或属的其他病毒的抗性或耐受性，它们属于不同的种，优选地相关种，优选地存在这些病毒的种。任选地，使用一对以上，即至少两对能形成dsRNA的有义和反义RNA片段。这些对例如来源于同一病毒基因组，但来源于同一病毒基因组的不同部分。此外，这些对也可来源于不同的病毒基因组。因此，用本发明能获得对不同病毒类、群或属的抗性或耐受性。
具有病毒抗性或耐受性的植物细胞和它衍生的植物优选地是双子叶植物。本发明公开了在甜菜和芸苔中提供真菌传棒状病毒(参见，例如，Rush和Heidel(1995)植物病害79：868-875)抗性或耐受性的方法，并在实施例9中对BNYVV--甜菜rhizomania(crazy root)的病因——更详细描述。提供对“黄化病毒”(参见，例如，《CRC甜菜病害手册》，第二卷，35-52页)如分别感染甜菜和油菜的BMYV和甜菜西方黄化病毒(BWYV)的抗性和耐受性的方法在实施例8中详述。本发明的方法也赋予单子叶植物耐受性和抗性。例如，利用本发明和美国专利5,569,828所述，获得对玉米褪绿矮缩病毒的耐受性或抗性。类似地，利用本发明和美国专利5,428,144所述，获得对玉米矮缩花叶病毒的耐受性或抗性。植物转化技术
利用常规重组DNA技术将本发明的DNA分子掺入植物或细菌细胞中。通常，本发明的DNA分子包含于一种转化载体中。可使用大量的这些本领域所知的载体系统，如质粒、噬菌体病毒及其他修饰的病毒。表达系统的成分也可被修饰，例如，用于增强有义和反义RNA片段的表达。例如，可使用截短序列、核苷酸置换或其他修饰。本领域所知的表达系统可用来在适当条件下实际转化任何作物植物细胞。包含本发明的DNA分子的转基因优选地稳定转化到并整合到宿主细胞基因组中。在另一个优选实施方案中，包含本发明的DNA分子的转基因位于自主复制载体中。自主复制载体的实例是病毒，特别是双生病毒。转化细胞优选地再生为整个植物。
按照本发明转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于：玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、洋白菜、花椰菜、硬花球花椰菜、萝卜、小萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、笋瓜、南瓜、大麻、夏季南瓜、苹果、梨、温柏、甜瓜、李子、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、木莓、黑莓、菠萝、鳄梨、木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油籽油菜、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、稻、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥，和木本植物如松柏类和落叶类树。希望的核苷酸序列转化特定植物种后，可以用传统培育技术在该种中繁殖或转移到相同种的其他品种中，特别包括商业品种。
A.构建植物表达盒的要求
首先在表达盒中在可在植物中表达的适当启动子之后装配欲在转基因植物中表达的基因序列。这些表达盒也可包含转基因表达所需或选择的其他任何序列。这些序列包括但不限于，例如，转录终止子、增强表达的外部序列，如内含子、关键序列和用于将基因产物导向特定细胞器和细胞区室的序列。然后可将这些表达盒容易地转移至上述植物转化载体中。下面是典型表达盒的不同成分的描述。
1.启动子
在表达盒中使用的启动子的选择决定了转基因植物中转基因的空间和时间表达模式。选择的启动子将在特定的细胞型(如叶表皮细胞、叶肉细胞、根皮细胞)或在特定组织或器官(如根、叶或花)中表达转基因，此选择将反映基因产物积累的希望的位置。另外，所选的启动子可在多种诱导条件下引导基因表达。启动子在其强度即促进转录的能力方面不同。根据使用的宿主细胞系统，可使用本领域所知的多种合适启动子中的任一种。例如，对于组成型表达，使用CaMV 35S启动子、稻肌动蛋白启动子或遍在蛋白启动子。例如，对于调节型表达，使用来源于烟草或拟南芥的化学诱导型PR-1启动子(见，例如，美国专利号5,689,044)。
一类优选的启动子是创伤诱导型启动子。曾经描述了可在创伤部位表达的多种启动子。这类优选的启动子包括Stanford等人，分子普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)215：200-208(1989)、Xu等人，植物分子生物学(Plant Molec.Biol.)22：573-588(1993)、Logemann等人，植物细胞(Plant Cell)1：151-158(1989)、Rohrmeier和Lehle，植物分子生物学22：783-792(1993)、Firek等人，植物分子生物学22：129-142(1993)和Warner等人，植物杂志(Plant J.)3：191-201(1993)所述的启动子。
优选的组织特异表达模式包括绿色组织特异、根特异、茎特异及花特异模式。适于在绿色组织中表达的启动子包括调节参与光合作用的基因的多种启动子，和已从单子叶植物和双子叶植物中克隆的多种这类启动子。一种优选的启动子是玉米磷酸烯醇羧化酶基因PEPC启动子(Hudspeth和Grula，植物分子生物学12：579-589(1989))。用于根特异表达的一种优选启动子是de Framond(FEBS 290：103-106(1991)；EP 0 452 269)所述的启动子，另一种优选的根特异启动子是本发明所述的来自于T-1基因的启动子。一种优选的茎特异启动子是美国专利5,625,136所述、能引导玉米trpA基因表达的启动子。
本发明的优选实施方案是以根特异方式表达核苷酸序列的转基因植物。其他的优选实施方案是以创伤诱导或病原体感染诱导方式表达核苷酸序列的转基因植物。
2.转录终止子
多种转录终止子均可在表达盒中使用。它们负责超出转基因之外的转录终止及其正确的聚腺苷酸化。合适的转录终止子是已知在植物中起作用的转录终止子，包括CaMV 35S终止子、tml终止子、胭脂氨酸合酶终止子和豌豆rbcS E9终止子。它们可用于单子叶及双子叶植物中。
3.增强或调节表达的序列
已发现许多序列能增强转录单位内的基因表达，这些序列可与本发明的基因结合使用而增强其在转基因植物中的表达。例如，多种内含子序列如玉米Adh1基因的内含子，显示能增强表达，尤其是在单子叶植物细胞中。另外，已知多种由病毒衍生的非翻译前导序列也可增强表达，且其在双子叶植物细胞中特别有效。
4.编码序列优化
通过改变用于在目的作物种中最佳表达的编码序列，可以遗传改造所选基因的编码序列。修饰编码序列以实现在特定作物种中最佳表达的方法是众所周知的(见，例如，Perlak等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88：3324(1991)；Koziel等人，生物技术(Bio/technol.)11：194(1993))。
在另一个优选实施方案中，本发明的DNA分子被直接转化到质体基因组中。质体转化技术在美国专利号5,451,513、5,545,817和5,545,818中，在PCT申请号WO 95/16783中，和McBride等人(1994)美国国家科学院院报91，7301-7305中有广泛描述。叶绿体转化的基本技术包括，例如使用biolistics或原生质体转化(如氯化钙或PEG介导的转化)，将侧翼为选择性标记的克隆的质体DNA区与目的基因一起导入合适的靶组织中。1-1.5kb的侧翼区，称为导向序列，可促进与质体基因组的同源重组，从而允许原质体系特定区域的替换或修饰。最初，叶绿体16SrRNA和赋予壮观霉素和/或链霉素抗性的rps12基因中的点突变被用作转化的选择性标记(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.(1990)美国国家科学院院报87，8526-8530；Staub，J.M.和Maliga，P.(1992)植物细胞4，39-45)。这些标记间存在克隆位点使得能产生用于导入外源DNA分子的质体导向载体(Staub，J.M.和Maliga，P.(1993)EMBOJ.12，601-606)。通过将隐性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因替换为一种显性选择标记——编码壮观霉素解毒酶氨基糖苷-3′-腺苷转移酶的细菌aadA基因，可获得转化率的大大提高(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)美国国家科学院院报90，913-917)。以前，该标记已成功用于绿藻莱因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)质体基因组的高频转化(Goldschmidt-Clermont，M.(1991)核酸研究(Nucl.Acids Res.)19：4083-4089)。用于质体转化的其他选择性标记在本领域中公知，并包括于本发明的范围之中。
质体表达，其中通过同源重组将基因插入每个植物细胞存在的几千个拷贝的环形质体基因组中。在一个优选实施方案中，本发明的DNA插入质体导向载体中或转化到希望的植物宿主的质体基因组中。获得对含有本发明的DNA分子的质体基因组来说同质的植物，它们优先地能高表达该DNA分子。优选地，该DNA分子编码的有义和反义RNA片段能够配对，并能在植物质体中形成双链RNA分子，从而改变质体基因的表达。在一个优选实施方案中，有义和反义片段在互补区中不包含任何错配。在另一个优选实施方案中，有义和反义片段在互补区中包含至少一个错配。在该情况中，编码RNA片段的DNA分子的DNA序列不能互相重组。
B.植物转化载体的构建
可用于植物转化的多种转化载体为植物转化领域的技术人员所公知，并且与本发明有关的基因可与任何这些载体结合使用。载体的选择取决于优选的转化技术和用于转化的目标种。对于某些目标物种，优选不同的抗生素或除草剂选择标记。转化中常规使用的选择标记包括赋予卡那霉素及相关抗生素抗性的nptII基因(Messing和Vierra，基因(Gene)19：259-268(1982)；Benvan等人，自然(Nature)304：184-187(1983))、赋予除草剂膦丝菌素抗性的bar基因(White等人，核酸研究18：1062(1990)，Spencer等人，理论与应用遗传学(Theor.Appl.Genet.)79：625-631(1990))、赋予抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger和Diggelmann，分子细胞生物学4：2929-2931)，和赋予氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人，EMBO J.2(7)：1099-1104(1983))，和赋予草甘膦抗性的EPSPS基因(美国专利号4,940,935和5,188,642)。
1.适用于农杆菌(Agrobacterium)转化的载体
许多载体可用于应用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的转化。它们一般带有至少一个T-DNA边界序列，并且包括如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))和pXYZ的载体。适用于农杆菌转化的典型载体包括二元载体pCIB200和pCIB2001，以及二元载体pCIB10及其潮霉素选择衍生物。(见，例如，美国专利号5,639,949)。
2.适用于非农杆菌转化的载体
不使用根瘤农杆菌的转化避免了对所选的转化载体中T-DNA序列的需要，所以除上述包含T-DNA序列的载体外，也可应用缺少这些序列的载体。不依赖于农杆菌的转化技术包括通过粒子轰击、原生质体摄取(如PEG和电穿孔)和显微注射的转化。载体的选择主要取决于待转化的物种的优选。适用于非农杆菌转化的典型载体包括pCIB3064、pSOG19和pSOG35(见，例如，美国专利号5,639,949)。
C.转化技术
目的DNA序列被克隆到表达系统中后，即转化植物细胞。植物转化和再生的方法在本领域中众所周知。例如，Ti质粒载体已用于外源DNA的送递，以及直接DNA摄取、脂质体、电穿孔、显微注射和微粒轰击。另外，也可用农杆菌属的细胞转化植物细胞。
用于双子叶植物的转化技术在本领域中众所周知，包括基于农杆菌的技术和不需要农杆菌的技术。非农杆菌的技术包括原生质体或细胞对外源遗传物质的直接摄取。这可通过PEG或电穿孔介导的摄取、粒子轰击介导的送递、或显微注射来完成。在所有情况中，都用本领域公知的标准技术使转化的细胞再生为整个植物。大多数单子叶植物种的转化现也已成为常规。优选的技术包括使用PEG或电穿孔技术向原生质体中直接转移基因，对愈伤组织的粒子轰击，以及农杆菌介导的转化。
将参照下列详细实施例进一步描述本发明。提供这些实施例只是为了说明目的，除非另外指明而不意在限制。
实施例
在此使用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中公知，并由Sambrook等人的《分子克隆》，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY(1989)，和T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist的《基因融合实验》，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1984)，和Ausubel，E.M.等人的《现代分子生物学方法》，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987)描述。实施例1：萤光素酶基因表达的调节
编码萤光素酶RNA双链体的嵌合DNA分子的构建
使用寡核苷酸引物ds_Luc1(5’-CGC GGA TCC TGG AAG ACGCCA AAA ACA-3’，SEQ ID NO：1；BamHI限制位点以下划线标出)和ds_Luc2(5’-CGG AAG CTT AGG CTC GCC TAA TCG CAG TATCCG GAA TG-3’，SEQ ID NO：2；HindIII限制位点以下划线标出)，从pPH108质粒DNA中扩增来源于质粒pLuc+(Promega)的萤火虫萤光素酶基因的738bp“有义”方向片段。按照使用手册在50μl反应体积中使用TurboPfu热稳定DNA聚合酶(Stratagene)，95℃/1分钟、55℃/1.5分钟、72℃/2分钟5个循环，随后95℃/1分钟、72℃/3.5分钟25个循环。用类似的方法，使用寡核苷酸引物ds_Luc3(5’-CGG TCT AGAGGA AGA CGC CAA AAA CAT A-3’，SEQ ID NO：3；XbaI限制位点以下划线标出)和ds_Luc2(5’-CGG AAG CTT AGG CTC GCC TAATCG CAG TAT CCG GAA TG-3’，SEQ ID NO：4；HindIII限制位点以下划线标出)，从pPH108质粒DNA中PCR扩增来源于质粒pLuc+的萤火虫萤光素酶基因的737bp“反义”方向片段。通过由低熔点琼脂糖(FMC)制备的1％Tris-乙酸盐凝胶电泳，随后酚-氯仿抽提切下的含有PCR产物的凝胶片，纯化得到的DNA片段。按照标准方法，用BamHI和HindIII消化有义产物(ds Luc1/2)的DNA，用XbaI和HindIII消化反义产物(ds Luc3/2)的DNA(限制酶从New England Biolabs获得)。得到的粘末端DNA片段如上所述凝胶纯化。通过用BamHI和HincII消化质粒CSA104并纯化564bp DNA片段，获得含有mas 1’启动子的DNA片段(Velten等人(1984)EMBO J.3：2723-2730)。该片段再用BamHI消化，分离并凝胶纯化含有mas 1’启动子的484bp EcoRI-BamHI亚片段。为了构建质粒pPH169，用EcoRI和XbaI消化克隆载体pLitmus29(New England Biolabs)的DNA，并以四路反应用T4 DNA连接酶(New England Biolabs)将分离的片段与mas 1’启动子EcoRI-BamHI片段和有义(BamHI-HindIII)及反义(HindIII-XbaI)ds_Luc萤光素酶基因片段连接。
为了构建二元载体pPH170，以用于应用ds_Luc1/2/3双链构建体的农杆菌介导的植物转化，用EcoRI和XbaI消化带有用于细菌筛选的卡那霉素抗性基因和用于转基因植物筛选的潮霉素抗性基因的二元质粒pSGCHC1的DNA。以四路反应用T4 DNA连接酶(New EnglandBiolabs)将得到的自pSGCHC1分离的11.6kb片段与mas 1’启动子EcoRI-BamHI片段和有义(BamHI-HindIII)及反义(HindIII-XbaI)ds Luc萤光素酶基因片段连接。
农杆菌的转化和拟南芥植物的真空渗入
通过电穿孔将质粒pPH170导入根瘤农杆菌GV3101中，筛选并扩增转化的菌落。用带有pPH170二元T-DNA载体的农杆菌克隆真空渗入组成型(UBQ3启动子(Norris等人(1993)PMB 21：895-906)/UBQ3+CaMV 35S 5’UTR/luc+；pPH108)或诱导型(拟南芥PR-1启动子/luc+；pPH135，6E系)表达萤光素酶的四至五周龄拟南芥突变系植物。在潮霉素和卡那霉素上共筛选转化植物，并在控制的人工气候室条件下生长，以测定萤光素酶活性。另外，在BTH诱导48小时后(BTH处理基本如Lawton等人，植物杂志10：71-82所述)，估测pPH135-6E背景的萤光素酶活性。在加入萤光素底物后，用基于发光的测定法定量组织提取物中的萤光素酶活性。也可用CCD-冷成像系统(Hamamatsu)监测植物中的萤光素酶活性。实施例2：拟南芥GL1基因表达的调节
GL1基因编码起始正常毛状体(叶毛)形成所需的myb样转录因子(Oppenheimer等人(1991)细胞67：483-493)。发育早期GL1表达的敲除产生缺乏毛状体的植物。敲除表型在幼苗中易于鉴定，并且不是致死的。构建了用于组成型表达的三种载体和用于Gal4/C1调节表达的三种载体。检测每种启动子的三种不同载体是GL1基因片段的有义(+)表达、反义(-)表达和双链(+/-)RNA表达。(+)和(-)载体是用于比较其对GL1表达的影响的对照。在每种情况中，用GL1序列(GenBank保藏M79448)从碱基#739-#1781的5’片段进行载体构建。
Gal4C1调节的表达
将GL1基因片段作为NcoI-SacI片段克隆到杂交诱导型载体构建体pJG304-1中。质粒pJG304由pBSSK+衍生。质粒pBS SK+(Stratagene，LaJolla，CA)用SacI线性化，用绿豆核酸酶处理除去SacI位点，并用T4连接酶再连接形成pJG201。用KpnI从pAT71中除去10XGAL4共有结合位点/CaMV 35S最小启动子/GUS基因/CaMV终止子盒，并克隆到pJG201的KpnI位点，形成pJG304。质粒pJG304用限制性内切核酸酶Asp718部分消化，分离全长线性片段。该片段与摩尔过量的22碱基寡核苷酸JG-L(5’-GTA CCT CGA GTC TAG ACT CGA G-3’，SEQ ID NO：4)连接。用限制性分析鉴定该接头插入GAI4 DNA结合位点5’的克隆，该质粒被命名为pJG304DXhoI。
通过合成5’端含有合适限制位点的PCR引物，向(+)和(-)片段的末端添加NcoI和SacI位点。通过首先产生以下两个片段来产生(+/-)GL1片段：在5’端含有NcoI位点，在3’端含有HindIII位点的a(+)片段，在5’端含有HindIII位点，在3’端含有SacI位点的a(-)片段。通过在EcoRI位点处连接得到的片段产生双链单位。该表达单位含有Gal4 DNA结合域，随后是最小TATA序列，和方向为(+)、(-)或(+/-)的GL1基因片段。
组成型表达
使用在双子叶植物中相对较强且为组成型的农杆菌甘露氨酸合酶mas 1’启动子。如上所述，将GL1(+)、(-)和(+/-)片段连接在pBluescript中的1’启动子之后。三种不同的表达盒作为EcoRI/SalI片段连接于pCIB200中(Uknes等人(1993)植物细胞5：159-169)。
实施例3：胱硫醚β-裂合酶基因表达的调节
胱硫醚β-裂合酶(CBL)基因编码甲硫氨酸生物合成途径中的一个步骤。调节其在植物中的表达的作用用有义和反义构建体和双链RNA构建体检测。
反义构建体：使用二元BASTA载体pJG261，其含有pJG304DXhoI载体的片段，并以反义方向插入CBL基因的部分(核苷酸#13-1159，GenBank保藏#L40511)。
有义构建体：除了CBL片段为相反方向外，与反义构建体相同。该构建体含有ATG起始密码子和大多数CBL ORF，用作CBL基因表达调节的对照。
双链构建体：将有义方向的CBL基因片段(#13-1159)插入载体pJG304-1中反义方向形式CBL基因下游的SalI位点。两个拷贝的CBL之间有一个大约10bp的接头。
实施例4：植物表达盒构建的要求
准备在转基因植物中表达的基因序列首先装配在位于合适的启动子之后和合适的转录终止子上游的表达盒中。植物表达盒构建的所有要求适用于本发明的DNA分子，并可用本领域公知的技术进行。
启动子选择
在表达盒中使用的启动子的选择决定转基因植物中DNA分子的空间和时间表达模式。选择的启动子将在特定的细胞型(如叶表皮细胞、叶肉细胞、根皮细胞)或在特定组织或器官(如根、叶或花)中表达DNA分子，这种选择反映该DNA分子编码的RNA片段生物合成的希望的位置。另外，所选的启动子可引导DNA分子在光诱导型或其他时间调节启动子之下的表达。另一个选择是，选择的启动子是化学调节型的。这将提供仅当希望时和用化学诱导剂处理时才诱导DNA分子表达的可能性。
转录终止子
多种转录终止子均可在表达盒中使用。它们负责转录的终止，和优选地正确的聚腺苷酸化。合适的转录终止子是已知在植物中起作用的转录终止子，包括CaMV 35S终止子、tml终止子、胭脂氨酸合酶终止子、豌豆rbcS E9终止子。它们可用于单子叶植物和双子叶植物。
增强或调节表达的序列
已发现许多序列能增强转录单位内的基因表达，这些序列可与本发明的DNA分子结合使用以增强其在转基因植物中的表达。
多种内含子序列显示能增强表达，尤其在单子叶植物细胞中。例如，发现当被导入玉米细胞时，玉米Adh1基因的内含子显著增强位于同源启动子之下的野生型基因的表达。发现内含子1在与氯霉素乙酰转移酶基因的融合构建体中特别有效且增强表达(Callis等人，基因发育(GenesDevelep)1：1183-1200(1987))。在同一实验系统中，玉米bronze1基因的内含子具有类似的增强表达的作用(Callis等人，同上文)。内含子序列已被常规掺入植物转化载体，一般在非翻译前导区内。
已知来源于病毒的多种非翻译前导序列也可增强表达，它们在双子叶植物细胞中特别有效。具体而言，烟草花叶病毒(TMV，“Ω-序列”)、玉米萎黄病斑点病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列显示在增强表达方面有效(如Gallie等人，核酸研究15：8693-8711(1987)；Skuzeski等人，植物分子生物学15：65-79(1990))。实施例5：表达盒构建的实例
本发明包括本发明的DNA分子在可在植物中表达的任何启动子调节下的表达，而不论该启动子的来源如何。因此，用本领域公知的技术将DNA分子插入任何表达盒中。然后可将这些表达盒容易地转移到以下所述的植物转化载体中。
此外，本发明还包括任何可植物表达的启动子与DNA分子表达所需或所选的其他任何序列的联合使用。这些序列包括但不限于：转录终止子、增强表达的外来序列(如内含子[如Adh内含子1]、病毒序列[如TMV-Ω])。
组成型表达：CaMV 35S启动子
质粒pCGN1761的构建如公开专利申请EP 0 392 225所述。pCGN1761含有“双”35S启动子和tml转录终止子，在启动子与终止子之间含有唯一的EcoRI位点，并且具有pUC型骨架。构建了pCGN1761的一种衍生物，它含有一个除已有的EcoRI位点外还包含NotI和XhoI位点的修饰过的多接头。该衍生物被命名为pCGN1761ENX。pCGN1761ENX可用于其多接头内cDNA序列或基因序列(包括微生物开放阅读框序列)的克隆，其目的是在35S启动子控制下在转基因植物中表达。该结构的完整的35S启动子-基因序列-tml终止子盒可切下启动子5’侧的HindIII、SphI、SalI和XbaI位点以及终止子3’侧的XbaI、BamHI和BglI位点，向转化载体转移。此外，通过用HindIII、SphI、SalI、XbaI或PstI进行5′切割，并用任何多接头限制位点(EcoRI、NotI或XhoI)进行3′切割，可切下双35S启动子片段，而替换为另一种启动子。
因此，本发明的DNA分子插入pCGN1761ENX中，用于在CaMV 35S启动子控制下组成型表达。
化学调节型启动子下的表达
本章节描述了用所选的任何启动子替换pCGN1761ENX中的双35S启动子；用实施例的形式描述了化学调节型PR-1a启动子。选择的启动子优选地用限制酶从其来源切下，但另外也可用带有合适的末端限制位点的引物进行PCR扩增。如果进行PCR扩增，则应在克隆靶载体中的扩增启动子之后，对启动子重新测序以检查扩增错误。从质粒pCIB1004(见EP 0 332 104)上切下化学调节型烟草PR-1a启动子，转移至质粒pCGN1761ENX。用NcoI酶切pCIB1004，得到的线性片段的3′突出端通过T4 DNA聚合酶处理成为平端。然后用HindIII酶切该片段，凝胶纯化得到的包含PR-1a启动子的片段，并克隆至已去除双35S启动子的pCGN1761ENX中。实现方法是用XhoI酶切，用T4聚合酶产生平端，随后用HindIII酶切，并分离较大的其中克隆有pCIB1004启动子片段的含载体-终止子片段。这产生一种pCGN1761ENX衍生物，其含有PR-1a启动子和tml终止子以及一个具有唯一EcoRI和NotI位点的间插多接头。
向该载体中插入本发明的DNA分子，随后将融合产物(即启动子-基因-终止子)转移至选择的任何转化载体中，包括本申请所述的转化载体，从而引起DNA分子的化学诱导型表达。
组成型表达：肌动蛋白启动子
已知肌动蛋白的几个同种型可在大多数细胞型中表达，因此肌动蛋白启动子是组成型启动子的一种良好选择。尤其是，稻Act1基因的启动子已被克隆和表征(McElroy等人，植物细胞2：163-171(1990))。发现该启动子的1.3kb片段含有在水稻原生质体中表达所需的所有调节元件。此外，已构建了多种基于Act1启动子的表达载体，特别用于单子叶植物(McElroy等人，分子普通遗传学231：150-160(1991))。其中掺入了Act1-内含子1、Adhl 5′侧翼序列和(玉米乙醇脱氢酶基因的)Adh1-内含子1和CaMV 35S启动子的序列。显示最高表达的载体是35S和Act1内含子或Act1 5′侧翼序列和Act1内含子的融合体。McElroy等人(分子普通遗传学231：150-160(1991))所述的启动子表达盒易于为了本发明DNA分子的表达而修饰，且特别适于在单子叶植物宿主中使用。例如，可从McElroy构建体中切下含启动子片段，用它来替换pCGN1761ENX中的双35S启动子，然后该载体可用于特定基因序列的插入。将这样构建的融合基因转移至合适的转化载体。在个别报道中，也发现含有第一种内含子的水稻Act1启动子可引导在培养的大麦细胞中的高表达(Chibbar等人，植物细胞报道(Plant Cell Rep.)12：506-509(1993))。
将本发明的DNA分子插入该启动子下游，随后将融合产物(即启动子-基因-终止子)转移到选择的任何转化载体中，包括本申请书中所述的载体。
组成型表达：遍在蛋白启动子
遍在蛋白是已知可在多种细胞型中积累的另一种基因产物，其启动子已从几个种中克隆，用于转基因植物(如向日葵-Binet等人，植物科学79：87-94(1991)，玉米-Christensen等人，植物分子生物学12：619-632(1989))。已在转基因单子叶系统中研究了玉米遍在蛋白，并且其序列和为单子叶植物转化构建的载体公开于专利公开文本EP 0342 926中。另外，Taylor等人(植物细胞报道12：491-495(1993))描述了一种载体(pAHC25)，其包含玉米遍在蛋白启动子和第一种内含子，经微粒轰击导入时在多种单子叶植物细胞悬液中具有高活性。遍在蛋白启动子适于在转基因植物尤其单子叶植物中表达本发明的DNA分子。合适的载体是通过导入适当遍在蛋白启动子和/或内含子序列修饰的pAHC25衍生物或本申请所述的任何转化载体。
因此将本发明的DNA分子插入这类启动子中，融合产物(即启动子-基因-终止子)用于植物转化，引起DNA分子的组成型表达。
根特异的表达
本发明的DNA分子的一种优选表达模式是根表达。只在根组织中表达核苷酸序列具有只改变根中靶基因的表达而不同时改变叶和花组织及种子中的表达的优点。一种合适的根启动子是由de Framond(FEBS290：103-106(1991))并在公开的专利申请EP 0 452 269中描述的启动子。该启动子被转移至合适的载体如pCGN1761ENX中，并向该载体中插入该DNA分子。随后将完整的启动子-基因-终止子盒转移至目的转化载体中。
创伤诱导型启动子
已描述了许多这类启动子(例如，Xu等人，植物分子生物学22：573-588(1993)，Logemann等人，植物细胞1：151-158(1989)，Rohrmeier和Lehle，植物分子生物学22：783-792(1993)，Firek等人，植物分子生物学22：129-142(1993)，Warner等人，植物杂志3：191-201(1993))，且均都适用于本发明。Logemann等人(同上文)描述了双子叶植物马铃薯wun1基因的5′上游序列。Xu等人(同上文)证明双子叶植物马铃薯的创伤诱导型启动子(pin2)在单子叶植物水稻中有活性。此外，Rohrmeier和Lehle(同上文)描述了玉米Wipl cDNA的克隆，其为创伤诱导型，并可用来使用标准技术分离同源启动子。类似地，Firek等人(同上文)和Warner等人(同上文)描述了单子叶植物药用芦笋(Asparagus officinalis)的创伤诱导基因，它在局部创伤和病原体侵入部位表达。使用本领域公知的克隆技术，可将这些启动子转移至合适的载体中，与本发明的DNA分子融合，并用来在害虫侵害部位表达这些基因。
木髓偏好的表达
专利申请WO 93/07278描述了玉米trpA基因的分离，该基因优先在木髓细胞中表达。利用标准分子生物学技术，可将该启动子或其部分转移至如pCGN1761的载体中，可替换35S启动子，并用来以木髓偏好的方式引导本发明的DNA分子的表达。实际上，包含木髓偏好启动子或其部分的片段可被转移至任何载体中，并可为用于转基因植物而修饰。DNA分子的木髓偏好的表达通过向该载体中插入DNA分子而实现。
花粉特异的表达
专利申请WO 93/07278另外描述了在花粉细胞中表达的玉米钙依赖的蛋白激酶(CDPK)基因的分离。该基因序列和启动子从转录起点延伸可达1400bp。利用标准分子生物学技术，可将该启动子或其部分转移至如pCGN1761的载体中，替换35S启动子，并用来以花粉特异的方式引导本发明的DNA分子的表达。实际上，包含花粉特异的启动子或其部分的片段可被转移至任何载体中，并可为用于转基因植物而修饰。
叶特异的表达
Hudspeth和Grula(植物分子生物学12：579-589(1989))描述了一种编码磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因。应用标准分子生物学技术，该基因的启动子可用来以叶特异的方式引导本发明的DNA分子在转基因植物中的表达。实施例6：植物转化载体的构建
许多转化载体可用于植物转化，本发明的DNA分子可插入上述任何表达盒中，使其能在适当条件下在希望的细胞中表达该DNA分子。然后将含核苷酸序列的表达盒掺入以下所述的任一合适的转化载体中。
所用载体的选择取决于优选的转化技术和将转化的目标物种。对于某些目标物种，优选不同的抗生素或除草剂选择标记。转化中常规使用的选择标记包括赋予卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因(Messing和Vierra，基因19：259-268(1982)；Benvan等人，自然(Nature)304：184-187(1983))、赋予除草剂膦丝菌素抗性的bar基因(White等人，核酸研究18：1062(1990)，Spencer等人，理论与应用遗传学79：625-631(1990))、赋予抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger和Diggelmann，分子细胞生物学4：2929-2931)和赋予氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人，EMBO J.2(7)：1099-1104(1983))。
适于农杆菌转化的载体
许多载体可用于应用根瘤农杆菌的转化。它们一般具有至少一个T-DNA边界序列，并且包括如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))和pVictorHINK(SEQ ID NO：5)的载体。以下描述了两种典型载体的构建。
pCIB200和pCIB2001的构建
二元载体pCIB200和pCIB2001用于构建农杆菌使用的重组载体，按以下方法构建。通过用NarI消化pTJS75(Schmidhauser和Helinski，细菌学杂志164：446-455(1985))切下四环素抗性基因，随后插入一个来自pUC4K的带有NPTII的AccI片段(Messing和Vierra，基因19：259-268(1982)；Bevan等人，自然304：184-187(1983)；McBride等人，植物分子生物学14：266-276(1990))，产生pTJS75kan。使XhoI接头与pCIB7的EcoRV片段连接，该片段包含左和右T-DNA边界、植物选择性nos/nptII嵌合基因和pUC多接头(Rothstein等人，基因53：153-161(1987))，并将XhoI消化片段克隆入SalI消化的pTJS75kan中产生pCIB200(参见EP 0 332 104)。pCIB200含有下列单一多接头限制位点：EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI和SalI。pCIB2001是pCIB200的衍生物，它是通过向多接头中插入其他限制位点而产生的。pCIB2001多接头的单一限制位点是EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、SalI、MluI、BclI、AvrII、ApaI、HpaI和StuI。除包含这些单一限制位点外，pCIB2001还有植物和细菌卡那霉素的选择性、用于农杆菌介导的转化的左和右T-DNA边界、在大肠杆菌和其他宿主之间转移的RK2衍生的trfA功能，以及也源自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接头适用于含有其自身调节信号的植物表达盒的克隆。
优选地使用多接头，将含本发明的DNA分子的上述任一种植物表达盒插入pCIB2001中。
pCIB10及其潮霉素选择衍生物的构建
二元载体pCIB10含有编码植物中筛选所需卡那霉素抗性的基因、T-DNA右和左边界序列，并且掺入宽宿主范围的质粒pRK252的序列，使其在大肠杆菌和农杆菌中均可复制。其构建由Rothstein等人描述(基因53：153-161(1987))。已构建了pCIB10的多种衍生物，其中掺入了Gritz等人(基因25：179-188(1983))所述的潮霉素B磷酸转移酶基因。这些衍生物能使在仅有潮霉素(pCIB743)或同时有潮霉素和卡那霉素(pCIB715、pCIB717)时筛选转基因植物细胞。该载体用来转化含有本发明的DNA分子的表达盒。
适于非农杆菌转化的载体
不使用根瘤农杆菌的转化避免了对所选的转化载体中T-DNA序列的需要，所以除如上所述包含T-DNA序列的载体外，还可使用缺少这些序列的载体。不依赖于农杆菌的转化技术包括通过粒子轰击、原生质体摄取(如PEG和电穿孔)、显微注射的转化或花粉转化(美国专利5,629,183)。载体的选择主要取决于待转化种的优选。下面，描述了某些典型载体的构建。
pCIB3064的构建
pCIB3064是一种pUC衍生载体，适用于与除草剂basta(或膦丝菌素)筛选结合的直接基因转移技术。质粒pCIB246包含与大肠杆菌GUS基因有效地融合的CaMV 35S启动子和CaMV 35S转录终止子，在PCT公开申请WO 93/07278中有述。该载体的35S启动子在起始位点5′端包含两个ATG序列。用标准PCR技术突变这些位点以去除ATG，产生限制位点SspI和PvuII。新限制位点距唯一的SalI位点96bp和37bp，距实际起始位点101bp和42bp。产生的pCIB246的衍生物命名为pCIB3025。然后通过SalI和SacI消化从pCIB3025上切下GUS基因，使末端变为平端，并再连接，产生质粒pCIB3060。质粒pJIT82从John Innes Centre，Norwich获得，切下含有产绿色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)bar基因的400bp的SmaI片段，将其插入pCIB3060的HpaI位点(Thompson等人，EMBO J.6：2519-2523(1987))。这产生了pCIB3064，其含有位于CaMV 35S启动子和终止子控制下的用于除草剂筛选的bar基因、氨苄青霉素抗性基因(用于在大肠杆菌中筛选)和具有单一SphI、PstI、HindIII、BamHI位点的多接头。该载体适用于含有自身调节信号的植物表达盒的克隆，用来引导本发明的DNA分子的表达。
pSOG19和pSOG35的构建
pSOG35是一种应用大肠杆菌基因二氢叶酸还原酶(DHFR)作为选择性标记提供氨甲喋呤抗性的转化载体。用PCR扩增35S启动子(～800bp)、玉米Adh1基因的内含子6(～550bp)和pSOG10的18bp的GUS非翻译前导序列。也PCR扩增编码大肠杆菌二氢叶酸还原酶II型基因的250bp片段，将这两个PCR片段与包含pUC19载体骨架和胭脂氨酸合酶终止子的pBI221(Clontech)SaeI-PstI片段装配。这些片段的装配产生pSOG19，它含有与内含子6序列、GUS前导序列、DHFR基因和胭脂氨酸合酶终止子融合的35S启动子。pSOG19中的GUS前导序列替换为玉米萎黄病斑点病毒(MCMV)的前导序列产生载体pSOG35。pSOG19和pSOG35携带氨苄青霉素抗性的pUC基因，并且具有可用于克隆外源序列尤其是本发明的DNA分子的HindIII、SphI、PstI和EcoRI位点。
实施例7：叶绿体转化
转化载体
为了在植物质体中表达本发明的DNA分子，使用质体转化载体pPH143(WO 97/32011，实施例36)。将DNA分子插入pPH143中，从而替换PROTOX编码序列。该载体然后用于质体转化和根据壮观霉素抗性的转化子筛选。另外，将DNA分子插入pPH143中，使其替换aadH基因。在这种情况中，根据对PROTOX抑制剂的抗性筛选转化子。
叶绿体转化
每板七个，按1″环形排列于T琼脂培养基上，使烟草c.v.′Xanthi nc′的种子萌发，播种12-14天后，基本如所述(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)PNAS 90，913-917)，用质粒pPH143和pPH145的DNA包被的1μm钨颗粒(M10，Biorad，Hercules，CA)轰击。将轰击的秧苗在T培养基上温育两天，之后切下叶子，远轴侧朝上置于亮光下(350-500μmol光子/m2/s)，置于含有500μg/ml壮观霉素二盐酸盐(Sigma，St.Louis，MO)的RMOP培养基平板上(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.(1990)PNAS 87，8526-8530)。轰击三至八周后在漂白叶下出现的抗性苗被亚克隆至相同的选择培养基上，使之形成愈伤组织，分离并亚克隆第二批苗。用Southern印迹标准技术(Sambrook等人(1989)《分子克隆：实验室手册》，冷泉港实验室，冷泉港)评价独立亚克隆中转化的质体基因组拷贝的完全分离(同质体状态)。BamHI/EcoRI消化的总细胞DNA(Mettler，I.J.(1987)植物分子生物学报道5，346-349)在1％Tris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶上分离，转移至尼龙膜上(Amersham)，用32P-标记的随机引物DNA序列探查，该序列对应于pC8的0.7kb BamHI/HindIII DNA片段，包含一部分rps7/12质体导向序列。同质的苗在含壮观霉素的MS/IBA培养基(McBride，K.E.等人(1994)PNAS 91，7301-7305)上无菌生根，将其转移到温室中。实施例8：由RolC启动子引导的、编码BWYV外壳蛋白的有义和反义(双链)RNA片段的嵌合基因盒的构建
使用引物HiNK025bis(5’-CAA TTA CCA TGG ACA CGG TCGTGG-3’，SEQ ID NO：6；NcoI限制位点以下划线标出)和HiNK226(5’-GCC AAA TGT TTG AAC GCT GCA GCC TAT TTG-3’；SEQ IDNO：7；PstI限制位点以下划线标出)，从质粒pZU046中扩增甜菜西方黄化病毒(BWYV)的0.6kb“有义”方向片段，一种所谓的病毒黄化外壳蛋白(CP)基因。此外，使用引物HiNK025bis2(5’-AAT CGT CCATGG ATA CGG TCG TGG-3’，SEQ ID NO：8；核苷酸3475-3498，NcoI限制位点以下划线标出)和HiNK226bis(5’-CTA GGG CCG GGT TCCTCT GCA GCC TAT TTG-3’；SEQ ID NO：9；核苷酸4114-4085，PstI限制位点以下划线标出)，从质粒pBW17(Veidt等人，核酸研究16：9917-9932，1988；保藏号X13063)中扩增该片段。按照使用说明在50μl反应体积中使用Taq DNA聚合酶(Life Technologies)，94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/90秒的30个循环(+2秒/循环)。通过由Seakem GTG琼脂糖(FMC)制备的1％Tris-乙酸盐凝胶电泳，随后用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)抽提含有PCR产物的凝胶片，纯化得到的DNA片段。随后按照标准方法，用NcoI和PstI消化PCR产物(所有限制酶均从Life Technologies获得)，并再次凝胶纯化。用T4 DNA连接酶(Life Technologies)将纯化的片段连接到RolC启动子和Nos终止子之间。得到的克隆命名为pHiNK138。
以与上所述类似的方法，使用引物HiNK251(5’-CTC CCA GGTTGA GAC TGC CCT GCA GTG CCC A-3’，SEQ ID NO：10；PstI限制位点以下划线标出)和HiNK228(5’-TTA CCA TGC ATA CGG TCGTGG GTA-3’；SEQ ID NO：11；NsiI限制位点以下划线标出)，从质粒Pzu174A中，或使用引物HiNK251(核苷酸4844-4814)和HiNK228bis(5’-CGT TAA TGC ATA CGG TCG TGG GTA-3’；SEQ ID NO：12；核苷酸3478-3503，NsiI限制位点以下划线标出)，从质粒pBW17中，扩增1.4kb“反义”方向BWYV CP片段。待凝胶纯化后，用NsiI和PstI消化PCR产物。4.9kb质粒pHiNK138用PstI线性化，并用热敏感的碱性磷酸酶(Life Technologies)去磷酸化。凝胶纯化这两种载体和PCR片段，随后双向连接PCR片段与pHiNK138。通过限制位点分析确定产生CP基因(SEQ ID NO：13)双链RNA的方向，产生质粒pHiNK152，其中反向重复由0.6kb CP基因组成，该基因被CP基因下游的来源于BWYV基因组的0.7kb间隔序列分开，称为ORF6。该间隔序列为反向方向。最后，将所述基因盒转移到携带磷酸甘露糖异构酶作为选择标记基因的专利二元载体pVictorHiNK(WO 94/20627)中，产生pHiNK179。实施例9.1：由拟南芥Ubi3int启动子引导的，编码BNYVV复制酶基因的有义和反义(双链)RNA片段的嵌合基因盒的构建
用QIAGEN的RNAeasy Plant mini试剂盒从甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)感染的甜菜根中提取总RNA。为了扩增BNYVV复制酶基因的3’端(RNA1)，用SuperscriptTMIIRNAseH-反转录酶(RT)(LifeTechnologies)和反向引物HiNK285(5’-TCG TAG AAG AGA ATT CACCCA AAC TAT CC-3’，SEQ ID NO：14)反转录RNA，产生cDNA。引物HiNK285位于BNYVV RNA1序列(保藏号D00115)的核苷酸6378与6405之间，用来导入一个EcoRI位点。随后用RT反应作为模板用于两次PCR反应：
—反应A使用位于BNYVV RNA1核苷酸5168bp与5178bp之间，
用来引入一个BamHI位点的引物HiNK283(5’-AAG AAT TGC
AGG ATC CAC AGG CTC GGT AC-3’，SEQ ID NO：15)，和位
于BNYVV RNA1核苷酸5597bp与5620之间，用来引入一个
EcoRI位点的引物HiNK284(5’-TTC CAA CGA ATT CGG TCT
CAG ACA-3’，SEQ ID NO：16)。
—反应B使用引物HiNK283与引物HiNK285，均如上所述。
这样获得的RT-PCR产物在组成将来的RNA双链体的核苷酸5168-5620之间具有BNYVV RNA1序列。未来的间隔序列对应于用引物HiNK283和HiNK285获得的RT-PCR产物中存在的BNYVV RNA1的核苷酸5621-6405bp。
按照使用说明在25μl反应体积中使用Taq DNA聚合酶(LifeTechnologies)，94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/90秒的30个循环(+2秒/循环)。通过由Seakem GTG琼脂糖(FMC)制备的1％Tris-乙酸盐凝胶电泳，随后用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)抽提含有PCR产物的凝胶片，纯化得到的DNA片段。待凝胶纯化后，按照标准方法用限制酶BamHI和EcoRI(Life Technologies)消化RT-PCR产物，并如上所述纯化。
最后，使用T4 DNA连接酶(Life Technologies)，利用三路连接反应，将RT-PCR产物克隆到拟南芥遍在蛋白3(Ubi3int)启动子与Nos终止子之间。得到的两个克隆被命名为pHiNK181(反义方向的间隔区，见SEQ ID NO：17)和pHiNK184(有义方向的间隔区，见SEQ IDNO：18)。
为了构建用于农杆菌介导的甜菜转化的二元载体，用AscI和PacI(New England Biolabs)消化含有磷酸甘露糖异构酶基因作为选择性标记(WO 94/20627)的二元载体pVictorHiNK以及质粒pHiNK181和pHiNK184的DNA，载体和插入片段如上所述通过电泳纯化。用T4 DNA连接酶(Life Technologies)将得到的7.7kb pVictorHiNK载体片段与编码BNYVV复制酶基因双链RNA的基因盒连接，分别产生pHiNK187(反义间隔区)和pHiNK188(有义间隔区)。实施例9.2：农杆菌介导的甜菜转化
农杆菌介导转化植物物种的方法已经建立，并为本领域技术人员所公知，并可因外植体类型、农杆菌株或选择性标记和使用的再生系统而不同。以下的方法叙述了利用子叶作为外植体来源，用甘露糖-6-磷酸异构酶作为选择性标记基因对甜菜的农杆菌介导的转化(Joersbo等人，分子栽培(Molecular Breeding)4：111-117，1998)。表面消毒后，甜菜籽在水琼脂上并在约12℃下在微光下萌芽。横向切割结节区以下，从幼苗中切下完全发育的子叶，并通过轻轻拉开切割切下子叶。通过将子叶外植体浸于含有适当转化载体的农杆菌株EHA101的悬液中接种子叶外植体，该悬液用补充有20g/l蔗糖、0.25mg/l BA、0.05mg/l NAA、500μM乙酰丁香酮的MS培养基pH5.2稀释，将光密度(OD600)由0.1稀释为0.3。经5分钟的温育后，从农杆菌悬液中取出外植体，在无菌滤纸上蘸一下，除去过量的接种悬液，转移到共培育平板中。共培育平板包括含有1/10 MS培养基ph5.7、30g/l蔗糖、200μM乙酰丁香酮的平皿，用4.7g/l琼脂糖固化，并在固化培养基顶部覆盖用1.5ml TXD培养基(补充有PGO维生素、0.005mg/l细胞分裂素、4mg/l CPA(对氯苯氧乙酸)、30g/l蔗糖的MS盐，pH5.7)湿润的滤纸。在21℃和弱光下共培育外植体4天，随后转移到选择性再生培养基中，该培养基由pH5.9的MS培养基组成，其中补充有20g/l蔗糖、1.25g/l甘露糖、0.25mg/l BA、0.05mg/lNAA、500mg/l羧苄青霉素，并用9g/l琼脂固化。每到第三周将外植体亚培养到含有逐渐提高的浓度、最大可达15g/l的甘露糖的新鲜培养基中。筛选并在21℃下再生12周后，收获再生的幼苗，生根，基本按照Feramisco和同事(Feramisco等人，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)55：636-641，1973)所述的偶联酶测定法分析PMI活性。阳性植物埋于土壤中，最后转移到温室中。实施例9.3：rhizomania抗性的筛选
在播种并埋入土壤中后，首先用幼苗或T0转化子建立完全发育的根系统约4周，之后转移到遭携带BNYVV的Polymyxa betae侵袭的土壤中。从德国rhizomania感染的田间收集遭侵袭的土壤。在抗性测定中，植物在12cm区域中在约21℃和16小时的光照期中生长。转移到遭侵袭土壤中4周后，从土壤中拔出植物，通过用水漂洗去除根系统底部附着的任何泥土。利用Pollahne压力收集0.5g根组织的随机样品的汁液，加到10ml抽提缓冲液中，该缓冲液包含补充有2％PVP和0.2％卵白蛋白的磷酸缓冲液，pH7.2。基本按照使用说明书，利用英国苏格兰Adgen Ltd商品化的BNYVV三抗体夹心(TAS)ELISA测定样品(通过体外繁殖获得的克隆)中存在的病毒量。对每种植物制作标准曲线，由测量的吸光度值计算根系统的病毒含量。未转化的敏感性甜菜植物用作阴性对照，携带自然rhizomania抗性的C28基因的植物用作阳性对照。表1总结了用质粒pNIHK188获得的转化事件的结果。
表1
    事件     克隆数   ELISA值   病毒含量ng/ml
事件279-15-A     1     3.265     ＞900
    2     3.420     ＞900
    3     2.987     ＞900
事件284-22-A     1     0.119     4
事件284-22-G     1     0.022     0
    2     0.006     0
事件284-22-I     1     0.010     0
事件284-22-M     1     1.400     216
    2     1.127     138
事件284-22-Q     1     0.447     29
    2     0.049     1
事件284-22-U     1     3.420     ＞900
    2     3.587     ＞900
    事件     克隆数     ELISA值   病毒含量ng/ml
事件284-22-1F     1     3.945     ＞900
    2     0.131     4
 C28阳性对照     1     0.677     56
    2     0.679     56
    3     0.377     22
    4     0.756     67
    5     1.122     137
    6     0.640     51
阴性对照A     1     3.186     ＞900
    2     3.362     ＞900
    3     3.487     ＞900
    4     3.311     ＞900
    5     3.478     ＞900
阴性对照B     1     3.678     ＞900
    2     3.582     ＞900
    3     3.326     ＞900
    4     3.502     ＞900
    5     3.330     ＞900
    6     3.439     ＞900
    7     3.439     ＞900
    8     3.682     ＞900
实施例10：甜瓜中胡瓜黄化花叶马铃薯Y病毒(ZYMV)和木瓜环斑马铃薯Y病毒(PRSV)抗性的植物转化载体的构建
NOS终止子(Bevan，M.等人，1983核酸研究11(2)，369-385)作为260bp HindIII/PstI片段克隆到HindIII/PstI消化的质粒pZO1560中。pZO1560是一种pUC衍生的质粒，其中多克隆位点已被替换为更通用的位点。在插入NOS终止子后获得的新构建体被命名为pZU533。
通过BamHI消化，随后T4 DNA聚合酶处理和KpnI消化，分离1728bp Ubi3启动子/内含子片段(Callis，J.等人，(1995遗传学139(2)，921-939))。将该片段克隆到SmaI消化的pZU533中。新构建体被命名为pZU615。
首先用PfxDNA聚合酶PCR扩增将插入pZU615中的其他DNA片段，并将获得的PCR片段克隆到pBluescript SK+中。为了扩增513bpActin2 IntronL(前导内含子)片段，根据An等人，植物杂志，10：107-121，1996的序列设计两条引物。5’引物(ZUP1563：5’-GGGCGGATCCGCTAGCCCGCGGCCGCTCTTTCTTTCCAAGG-3’，SEQ ID NO：19)直接在5’剪切位点下游退火，并向将扩增的Actin2IntronL片段5’端添加一个BamHI、一个NheI和一个SacII限制位点。3’引物(ZUP1564：5’-CCCGCCATGGGTCGACGCCATTTTTTATGAGCTGC-3’，EQ ID NO：20)直接在3’剪切位点下游退火，并向将扩增的Actin2 IntronL片段3’端添加一个SalI和一个NcoI限制位点。将用ZUP1563和ZUP1564扩增的PCR片段克隆到pBluescript的EcoRV位点中。新质粒被命名为pZU611。为了提供含Act2 IntronL的质粒pZU615，从pZU611中分离499bp BamHI/NcoI Act2 IntronL片段，并克隆到BamHI和NcoI消化的pZU615中Ubi3启动子/内含子的下游，和NOS终止子的上游。新构建体被命名为pZU616。该片段的插入同时为下三个克隆步骤提供了含有5个另外限制位点的盒。
为了扩增非翻译(nt)739bp PRSV CP片段(Shyi-Dong，Y.等人，(1992)普通病毒学杂志73，2531-2541)，根据Shyi-Dong Yeh的法国田间分离株的序列设计两条引物。5’引物(ZUP1565：5’-CCCGCCATGGGAGCCGATGATTTCTACCGAGAATTAAGGG-3’，SEQ ID NO：21)在PRSV CP起始密码子285bp下游退火，并向非翻译PRSV CP片段的5’端添加一个NcoI和一个BamHI限制位点。3’引物(ZUP1566：5’-GGGCGCTAGCCTAATGCTTATATAGTACC-3’，EQID NO：22)在PRSV CP终止密码子55bp下游退火，并向非翻译PRSVCP片段添加一个NheI限制位点。将扩增的PCR片段克隆到pBluescript的EcoRV位点中。新质粒被命名为pZU612。
为了扩增735bp非翻译ZYMV CP片段(Gal-On，A.等人，(1990)基因87，273-277)，根据Gal-On，A.的法国田间分离株的序列设计两条引物。5’引物(ZUP1567：5’-GGGCGCTAGCCTTGCTGGAGTATAAGCCGG-3’，SEQ ID NO：23)在ZYMV CP起始密码子253bp下游退火，在ZYMV CP非翻译片段的5’端含有一个NheI限制位点。3’引物(ZUP1568：5’-GGGCGTCGACCGCGGGCTTTAAAGGTGGGAGGCCC-3’，EQ ID NO：24)在ZYMV CP终止密码子89bp下游退火，在非翻译ZYMV CP片段3’端含有一个SacII和SalI限制位点。将扩增的PCR片段克隆到pBluescript的EcoRV位点中。新质粒被命名为pZU613。随后将ZYMV CP非翻译片段克隆到pZU616中Ubi3启动子/内含子下游和Act2 IntronL上游。为此，从pZU613中分离719bpNheI/SacII ZYMV CP非翻译片段，并克隆到pZU616的NheI和SacII位点。该构建体被命名为pZU617。随后将PRSV CP非翻译片段克隆到pZU617中Ubi3启动子/内含子下游和ZYMV CP非翻译片段上游。为此，从pZU612中分离720bp BamHI/NheI PRSV CP非翻译片段，并克隆到pZU617的BamHI和NheI位点。该新构建体被命名为pZU618。
将克隆完成基因盒的最终片段含有PRSV CP非翻译片段，在其下游以相同方向含有一个ZYMV CP非翻译片段。用Pfx PCR和引物ZUP1565和ZUP1568，由pZU618作为模板扩增相应的片段。将PCR片段克隆到pBluescript的EcoRV位点中，得到的质粒被命名为pZU619。
为了产生反向重复基因盒，将PRSV CP(nt)/ZYMV CP(nt)片段以与pZU618质粒中已经存在的PRSV CP(nt)/ZYMV CP(nt)片段相反的方向插入pZU618中。为此，从pZU619中分离1445bp SalI/NcoIPRSV CP(nt)/ZYMV CP(nt)片段，并克隆到SalI和NcoI消化的pZU618中Act2 IntronL下游和NOS终止子上游。得到的质粒被命名为pZU622。将该盒插入二元载体pZU547中，它是一种来源于另外含有SMAS启动子/PMI/NOS终止子选择盒的质粒pVictorHink二元载体。为此，从pZU622中分离含有反向重复基因盒的5414bp AscI/PacIDNA片段，并以串联方向克隆到pZU547的AscI和PacI位点，和选择盒上游。终构建体被命名为pZU623(SEQ ID NO：25)。实施例11：在番茄中马铃薯Y病毒(PVY)抗性的植物转化载体的构建
根据RA.A.van der Vlugt(1993)的论文“对马铃薯Y病毒的工程抗性”中公开的PVYn(PVY的一种法国田间分离株)的序列，利用两条引物(ZUP1598：5’-CATGCCATGGATCCAATGGCCACGAATTAAAGCTATCACGTC-3’，SEQ ID NO：26，和ZUP1590：5’-ACGCGTCGACCGCGGATTCAAACGATTATTAATTACGATAAAAG-3’，SEQ IDNO：27)，使用来自Life Technologies的Platinum Pfx DNA聚合酶，通过标准PCR技术扩增含有外壳蛋白顺反子序列和3’端非翻译区的99个核苷酸的804bp片段。扩增的PCR片段作为平端片段克隆到pBluescriptSK+的EcoRV位点中，该质粒被命名为pZUA。扩增的PVY特异插入片段作为BamHI/SacI片段切下，克隆到pZU616(参见实施例10)的BamHI/SacI位点中，产生pZUB。pZUB和pZUA都用NcoI和SalI消化。来自pZUA的PVY特异性片段从琼脂糖凝胶中纯化，并与NcoI和SalI消化的pZUB连接，产生含有下列元件的pZUC：
含内含子的UBI3启动子之后是有义方向的PVY PCR产物作为BamHI/SacI片段，之后是SacII/SalI ACT2内含子，之后是反义方向的PVY PCR产物作为SalI/NcoI片段，最后是nos终止子作为NcoI/HindIII片段。最后，将pZUC克隆到含有来自pHiNK085二元载体的SMAS启动子/PMI/NOS终止子选择盒的二元载体pZU547中。最终的构建体被命名为pZU634(SEQ ID NO：28)。实施例12：二元载体对甜瓜和番茄植物材料的转化
向植物材料转移二元载体的方法已经建立，并为本领域技术人员所公知。该方法的变化是由于，例如，所使用的农杆菌株的差异，外植体材料的不同来源，再生系统的不同，以及欲转化的植物种的不同栽培品种。按照下列方法在转化实验中使用以上实施例10和11中所述的二元植物转化载体。通过电穿孔将二元载体转移到根瘤农杆菌中，随后用转化的农杆菌株接种并与植物外植体材料共培育，用合适的抗生素选择性杀伤农杆菌株，通过在含甘露糖的选择性培养基上生长筛选转化的细胞，向诱导萌发培养基中转移组织，向诱发生根培养基中转移选择的幼芽，并向土壤中转移小植物。为了证实以上实施例10和11中所述的基因盒的存在，用众所周知的Sourthern印迹分析技术表征来源于转基因植物的总DNA。实施例13：为ZYMV和PRSV抗性筛选转基因甜瓜植物
转化的植物在标准检疫条件下在温室中生长，以防止病原体的任何感染。初级转化子自体受粉，并收获种子。
分析初级转化子的S1后代的100株植物，分析插入基因的分离和随后通过机械接种感染ZYMV。系统感染ZYMV的宿主植物的组织在5倍体积的冰预冷的接种缓冲液(10mM磷酸缓冲液)中研磨，并在碳化硅粉存在下在1周龄幼苗的子叶和第一只叶子上摩擦。在接种后3周内监视接种的植物的症状发展。与未转化的对照植物相比——它们在接种7天后显示严重的系统ZYMV症状，含有ZYMV序列的植物显示对ZYMV感染的敏感性降低。ZYMV耐受植物自体受粉，并收获种子。按照上述方法用PRSV机械接种转基因ZYMV抗性植物。与未转化的对照植物相比——它们在接种7天后显示严重的系统PRSV症状，已有ZYMV抗性的植物也显示对PRSV感染的敏感性降低。实施例14：为PVY抗性对转基因番茄植物的筛选
转化的植物在标准检疫条件下在温室中生长，以防止病原体的任何感染。初级转化子自体受粉，并收获种子。
分析初级转化子的S1后代的50株植物，分析插入基因的分离和随后通过机械接种感染PVY。系统感染PVY的宿主植物的组织在5倍体积的冰预冷的接种缓冲液(10mM磷酸缓冲液)中研磨，并在碳化硅粉存在下在5周龄幼苗的前两个完全展开的叶子上摩擦。在接种后3周内监视接种的植物的症状发展。与未转化的对照植物相比——它们在接种7天后显示严重的系统PVY症状，含有PVY序列的植物显示对PVY感染的敏感性降低。
以上公开的实施方案是说明性的。本发明的公开内容将使本领域技术人员了解本发明的许多变化。所有这些明显且可预知的变化均为附加权利要求所包括。
                           序列表<110>Novartis AG<120>病毒基因表达的调节<130>S-30959A<140><141><150>US 09/309038<151>1999-05-10<160>28<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：ds_Luc1<400>1cgcggatcct ggaagacgcc aaaaaca                             27<210>2<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：ds_Luc2<400>2cggaagctta ggctcgccta atcgcagtat ccggaatg                 38<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：ds_Luc3<400>3cggtctagag gaagacgcca aaaacata                            28<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：JG-L<400>4gtacctcgag tctagactcg ag                                          22<210>5<211>4732<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：pVictorHINK<400>5gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 60caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 120agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 180tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 240tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 300gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 360gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 420aaggatcttc acctagatcc ttttgatccg gaattaattc ctgtggttgg catgcacata 480caaatggacg aacggataaa ccttttcacg cccttttaaa tatccgatta ttctaataaa 540cgctcttttc tcttaggttt acccgccaat atatcctgtc aaacactgat agtttaaact 600gaaggcggga aacgacaatc tgatcatgag cggagaatta agggagtcac gttatgaccc 660ccgccgatga cgcgggacaa gccgttttac gtttggaact gacagaaccg caacgctgca 720ggaattggcc gcagcggcca tttaaatcaa ttgggcgcgc cgaattcgag ctcggtaccc 780ggggatcctc tagagtcgac catggtgatc actgcaggca tgcaagcttc gtacgttaat 840taattcgaat ccggagcggc cgcacgcgtg ggcccgttta aacctcgaga gatctgctag 900ccctgcagga aatttaccgg tgcccgggcg gccagcatgg ccgtatccgc aatgtgttat 960taagttgtct aagcgtcaat ttgtttacac cacaatatat cctgccacca gccagccaac 1020agctccccga ccggcagctc ggcacaaaat caccactcga tacaggcagc ccatcagaat 1080taattctcat gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca 1140ggcagccatc ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt 1200cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg 1260gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt 1320gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaccatgag ggaagcggtg atcgccgaag 1380tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc 1440tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg 1500atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg 1560accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca 1620ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat 1680ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca 1740ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag 1800cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa 1860ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta 1920cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg 1980ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctaggc 2040aggcttatct tggacaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg 2100ttcactacgt gaaaggcgag atcaccaagg tagtcggcaa ataaagctct agtggatccc 2160cgaggaatcg gcgtgacggt cgcaaaccat ccggcccggt acaaatcggc gcggcgctgg 2220gtgatgacct ggtggagaag ttgaaggccg cgcaggccgc ccagcggcaa cgcatcgagg 2280cagaagcacg ccccggtgaa tcgtggcaag cggccgctga tcgaatccgc aaagaatccc 2340ggcaaccgcc ggcagccggt gcgccgtcga ttaggaagcc gcccaagggc gacgagcaac 2400cagatttttt cgttccgatg ctctatgacg tgggcacccg cgatagtcgc agcatcatgg 2460acgtggccgt tttccgtctg tcgaagcgtg accgacgagc tggcgaggtg atccgctacg 2520agcttccaga cgggcacgta gaggtttcag cagggccggc cggcatggcc agtgtgtggg 2580attacgacct ggtactgatg gcggtttccc atctaaccga atccatgaac cgataccggg 2640aagggaaggg agacaagccc ggccgcgtgt tccgtccaca cgttgcggac gtactcaagt 2700tctgccggcg agccgatggc ggaaagcaga aagacgacct ggtagaaacc tgcattcggt 2760taaacaccac gcacgttgcc atgcagcgta cgaagaaggc caagaacggc cgcctggtga 2820cggtatccga gggtgaagcc ttgattagcc gctacaagat cgtaaagagc gaaaccgggc 2880ggccggagta catcgagatc gagctagctg attggatgta ccgcgagatc acagaaggca 2940agaacccgga cgtgctgacg gttcaccccg attacttttt gatcgatccc ggcatcggcc 3000gttttctcta ccgcctggca cgccgcgccg caggcaaggc agaagccaga tggttgttca 3060agacgatcta cgaacgcagt ggcagcgccg gagagttcaa gaagttctgt ttcaccgtgc 3120gcaagctgat cgggtcaaat gacctgccgg agtacgattt gaaggaggag gcggggcagg 3180ctggcccgat cctagtcatg cgctaccgca acctgatcga gggcgaagca tccgccggtt 3240cctaatgtac ggagcagatg ctagggcaaa ttgccctagc aggggaaaaa ggtcgaaaag 3300gtctctttcc tgtggatagc acgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccgga 3360acccgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg gtcacacatg taagtgactg 3420atataaaaga gaaaaaaggc gatttttccg cctaaaactc tttaaaactt attaaaactc 3480ttaaaacccg cctggcctgt gcataactgt ctggccagcg cacagccgaa gagctgcaaa 3540aagcgcctac ccttcggtcg ctgcgctccc tacgccccgc cgcttcgcgt cggcctatcg 3600cggccgctgg ccgctcaaaa atggctggcc tacggccagg caatctacca gggcgcggac 3660aagccgcgcc gtcgccactc gaccgccggc gctgaggtct gcctcgtga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RNA gene<220><221>启动子<222>(1)..(1131)<223>RolC启动子<220><221>重复单元<222>(1132)..(1737)<223>BWYV CP反向重复片段<220><221>茎—环<222>(1738)..(2470)<223>BWYV CP基因下游0.7kb间隔基片段<220><221>重复单元<222>(2471)..(3074)<223>BWYV CP反向重复片段<220><221>终止子<222>(3076)..(3338)<223>NOS终止子<400>13ggatccggcg tcggaaactg gcgccaatca gacacagtct ctggtcggga aagccagagg 60tagtttggca acaatcacat caagatcgat gcgcaagaca cgggaggcct taaaatctgg 120atcaagcgaa aatactgcat gcgtgatcgt tcatgggttc atagtactgg gtttgctttt 180tcttgtcgtg ttgtttggcc ttagcgaaag gatgtcaaaa aaggatgccc ataattggga 240ggagtggggt aaagcttaaa gttggcccgc tattggattt cgcgaaagcg cattggcaaa 300cgtgaagatt gctgcattca agatactttt tctattttct ggttaagatg taaagtattg 360ccacaatcat attaattact aacattgtat atgtaatata gtgcggaaat tatctatgcc 420aaaatgatgt attaataata gcaataataa tatgtgttaa tctttttcaa tcgggaatac 480gtttaagcga ttatcgtgtt gaataaatta ttccaaaagg aaatacatgg ttttggagaa 540cctgctatag atatatgcca aatttacact agtttagtgg gtgcaaaact attatctctg 600tttctgagtt taataaaaaa taaataagca gggcgaatag cagttagcct aagaaggaat 660ggtggccatg tacgtgcttt taagagaccc tataataaat tgccagctgt gttgctttgg 720tgccgacagg cctaacgtgg ggtttagctt gacaaagtag cgcctttccg cagcataaat 780aaaggtaggc gggtgcgtcc cattattaaa ggaaaaagca aaagctgaga ttccatagac 840cacaaaccac cattattgga ggacagaacc tattccctca cgtgggtcgc tgagctttaa 900acctaataag taaaaacaat taaaagcagg caggtgtccc ttctatattc gcacaacgag 960gcgacgtgga gcatcgacag ccgcatccat taattaataa atttgtggac ctatacctaa 1020ctcaaatatt tttattattt gctccaatac gctaagagct ctggattata aatagtttgg 1080atgcttcgag ttatgggtac aagcaacctg tttcctactt tgttaccatg gacacggtcg 1140tgggtaggag aattatcaat ggaagaagac gaccacgcag gcaaacacga cgcgctcagc 1200gccctcagcc agtggttgtg gtccaaacct ctcgggcaac acaacgccga cctagacgac 1260gacgaagagg taacaaccgg acaggaagaa ctgttcctac cagaggagca ggttcgagcg 1320agacatttgt tttctcaaaa gacaatctcg cgggaagttc cagcggagca atcacgttcg 1380ggccgagtct atcagactgc ccggcattct ctaatggaat gctcaaggcc taccatgagt 1440ataaaatctc aatggtcatt ttggagttcg tctccgaagc ctcttcccaa aattccggtt 1500ccatcgctta cgagctggac ccacactgta aactcaactc cctttcctca actatcaaca 1560agttcgggat cacaaagccc gggaaaaggg cgtttacagc gtcttacatc aacggaacgg 1620aatggcacga cgttgccgag gaccaattca ggatcctcta caaaggcaat ggttcttcat 1680cgatagctgg ttctttcaga atcaccatta agtgtcaatt ccacaacccc aaataggctg 1740cagtgcccaa ctctctttgg tctttctgtc tttacggaac cggatgagcc ttgttcatca 1800agtgctatgg cgatcatccc tatctccatc atccgatctg tccaggctcc gtacgaaacg 1860gcgtaattat atttagattg cttctggaca gcgggtccaa caacaaagaa ggaggcattg 1920tcaccagtcg tcttgatatg acaagtcaaa tctccatctc tttccagaca ctgtccttga 1980ttgaaatgac agccattgag ttccatgtct gggtggccat acttcaaagt attatcggcc 2040ttgttgttgg ttatctccac attattgtaa atccccacgt tccaaccttc actaagatca 2100tcgttgtagg cgatgagacc atcttgtttg tccttgttag gatctgtggt gcttgaggtt 2160ggttgatacc cctccatcga tatttccacg gtccactcac cttgagggac tggcactatt 2220atcatcggga tggctttcaa agaattctgg gaataccatc gagaatcgag gttcgtccag 2280ttcatgttct cgtcctctat gtagcgaaac cgttgggacg gcatatcata caaagagatg 2340gcatcatccg tagattgagc cattatacga gtcacgggga ctccagtata gacgataaaa 2400cgatatttct tttggggtgt gggttgtgga gagggagaag gccctgggct agggccgggt 2460tcctcgtcta cctatttggg gttgtggaat tgacacttaa tggtgattct gaaagaacca 2520gctatcgatg aagaaccatt gcctttgtag aggatcctga attggtcctc ggcaacgtcg 2580tgccattccg ttccgttgat gtaagacgct gtaaacgccc ttttcccggg ctttgtgatc 2640ccgaacttgt tgatagttga ggaaagggag ttgagtttac agtgtgggtc cagctcgtaa 2700gcgatggaac cggaattttg ggaagaggct tcggagacga actccaaaat gaccattgag 2760attttatact catggtaggc cttgagcatt ccattagaga atgccgggca gtctgataga 2820ctcggcccga acgtgattgc tccgctggaa cttcccgcga gattgtcttt tgagaaaaca 2880aatgtctcgc tcgaacctgc tcctctggta ggaacagttc ttcctgtccg gttgttacct 2940cttcgtcgtc gtctaggtcg gcgttgtgtt gcccgagagg tttggaccac aaccactggc 3000tgagggcgct gagcgcgtcg tgtttgcctg cgtggtcgtc ttcttccatt gataattctc 3060ctacccacga ccgtatgcag atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa 3120tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt 3180aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc 3240gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaacct aggataaatt 3300atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tctctaga                         3338<210>14<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：HiNK285<400>14tcgtagaaga gaattcaccc aaactatcc                                   29<210>15<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：HiNK283<400>15aagaattgca ggatccacag gctcggtac                                   29<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：HiNK284<400>16ttccaacgaa ttcggtctca gaca                                        24<210>17<211>3648<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：pHiNK181<220><221>启动子<222>(1)..(1738)<223>遍在蛋白3启动子加内含子<220><221>重复单元<222>(1739)..(2166)<223>BNYVV RNA1重复片段<220><221>misc_feature<222>(2167)..(2946)<223>间隔基片段<220><221>重复单元<222>(2947)..(3375)<223>BNYVV RNA1重复片段<220><221>茎—环<222>(1739)..(3375)<223>由间隔基分隔的BNYVV RNA1片段的反向重复<220><221>终止子<222>(3376)..(3648)<223>NOS终止子<400>17ggtaccggat ttggagccaa gtctcataaa cgccattgtg gaagaaagtc ttgagttggt 60ggtaatgtaa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Claims (33)

1.一种改变病毒基因组的表达的方法，包括向一种细胞中导入能在该细胞中表达该病毒基因组的有义RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达该病毒基因组的反义RNA片段的第二种DNA序列，其中有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA。
2.权利要求1的方法，其能使该细胞具有病毒抗性或耐受性。
3.权利要求1的方法，其中该细胞是一种植物细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述病毒选自：蕃茄斑萎病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、烟草花叶病毒、黄症病毒、黄瓜花叶病毒、雀麦花叶病毒、长线病毒、番茄丛矮病毒和真菌传棒状病毒。
5.权利要求1的方法，其中所述DNA序列含有一种来源于病毒外壳蛋白基因、病毒核壳蛋白基因、病毒复制酶基因或病毒运动蛋白基因的核苷酸序列。
6.权利要求1的方法，其中所述第一种DNA序列和第二种DNA序列稳定整合于所述细胞的基因组中。
7.权利要求1的方法，其中所述第一种DNA序列和第二种DNA序列包含于两种不同的DNA分子中。
8.权利要求1的方法，其中将第一种和第二种DNA序列的至少两对导入细胞中。
9.权利要求8的方法，其中每一对DNA序列编码不同病毒种或分离株的有义和反义RNA片段。
10.权利要求1的方法，其中所述第一种DNA序列和第二种DNA序列包含于一种DNA分子中。
11.权利要求10的方法，其中所述第一种DNA序列和第二种DNA序列包含于该DNA分子的同一DNA链中。
12.权利要求11的方法，其中有义RNA片段和反义RNA片段包含于一种RNA分子中。
13.权利要求12的方法，其中所述RNA分子能够折叠，使得其中所含的RNA片段形成双链区。
14.权利要求1的方法，其中表达的RNA分子包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：28的反向重复序列。
15.权利要求24的方法，其中所述RNA分子的表达由异源的启动子、组织特异性启动子、发育调节型启动子、组成型启动子或诱导型启动子驱动。
16.权利要求15的方法，其中所述DNA分子的表达由一种遍在蛋白启动子如拟南芥Ubi3启动子驱动。
17.权利要求15的方法，其中所述DNA分子的表达由农杆菌rolC启动子驱动。
18.权利要求12的方法，其中所述DNA分子在编码有义RNA片段和反义RNA片段的DNA序列之间含有一个接头。
19.权利要求18的方法，其中所述接头由拟南芥肌动蛋白2基因的前导内含子的核苷酸序列确定。
20.权利要求18的方法，其中所述接头由侧翼为有义或反义RNA片段的病毒区的核苷酸序列确定。
21.权利要求18的方法，其中所述接头包含功能基因如选择性标记基因的表达盒。
22.权利要求21的方法，其中所述接头包含调节序列如内含子加工信号。
23.权利要求11的方法，其中所述有义RNA片段和反义RNA片段包含于两种不同的RNA分子中。
24.权利要求23的方法，其中所述第一种DNA序列和第二种DNA序列与一种双向启动子有效连接。
25.权利要求11的方法，其中所述第一种DNA序列和第二种DNA序列包含于所述DNA分子的互补链中。
26.权利要求25的方法，其中在所述DNA分子中，第一种DNA序列是第二种DNA序列的互补DNA链。
27.一种可改变病毒基因组的表达的DNA构建体，其包含能在一种细胞中表达该病毒基因组的有义RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达该病毒基因组的反义RNA片段的第二种DNA序列，其中有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA分子。
28.权利要求27的DNA构建体，其中该DNA构建体含有与所述第一种DNA序列有效连接的第一种启动子，和与第二种DNA序列有效连接的第二种启动子。
29.权利要求27的DNA构建体，其中该DNA构建体含有与第一种DNA序列和第二种DNA序列有效连接的双向启动子。
30.一种显示改变的病毒基因组表达的细胞，其包含能在该细胞中表达该病毒基因组的有义RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达该病毒基因组的反义RNA片段的第二种DNA序列，其中有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA。
31.一种显示改变的病毒基因组表达的植物及由其产生的后代，其含有能在该细胞中表达该病毒基因组的有义RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达该病毒基因组的反义RNA片段的第二种DNA序列，其中有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA。
32.权利要求31的植物，其中该植物是病毒抗性或耐受的。
33.由权利要求31的植物产生的种子。
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