KR100809736B1 - 안토시아닌 생합성 억제 활성을 가진 ｍｙｂ６０ 유전자와상기 유전자가 도입된 형질전환 상추 및 그 제조방법 - Google Patents

안토시아닌 생합성 억제 활성을 가진 ｍｙｂ６０ 유전자와상기 유전자가 도입된 형질전환 상추 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 애기장대 유래의 전사조절 유전자 MYB60 및 상기 유전자를 도입한 형질전환 상추에 관한 것이다. 보다 상세하게는 안토시아닌 생합성 억제 활성을 가진 전사조절 유전자 MYB60과 상기 유전자를 도입한 형질전환 상추 및 상기 형질전환 상추를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 본 발명을 통하여 화훼작물을 비롯한 화색 조절을 목적으로 하는 작물에 도입, 응용함으로써 향후 농가의 부가가치를 높이는데 기여할 수 있다.
안토시아닌, 전사조절인자, 아그로박테리움, 상추, 애기장대, 형질전환, bar.

Description

안토시아닌 생합성 억제 활성을 가진 ＭＹＢ６０ 유전자와 상기 유전자가 도입된 형질전환 상추 및 그 제조방법 {MYB60 gene for the inhibition of anthocyanin biosynthesis, the transgenic lettuces that the MYB60 gene is transduced and the preparing method thereof}
도 1은 MYB60 단백질 유전자 분리용 서열번호 2와 3의 프라이머를 이용하여 애기장대 RACE cDNA로부터 분리한 MYB60 단백질 유전자의 PCR 산물 사진이다.(M : 1kb ladder plus DNA marker)
도 2는 식물 형질전환용 운반체를 제작용 제한효소 부위(MluI 과 XbaI)를 포함하는 MYB60 II 선발용 서열번호 4와 5의 프라이머를 이용한 PCR 산물 사진이다.(M : 1kb ladder plus DNA marker)
도 3은 상추에 MYB60 유전자를 형질전환하기 위하여 개발한 식물 형질전환용 운반체의 모식도(A)와 아그로박테리움 EH105에 형질전환된 운반체의 전기영동 사진(B)이다.(LB : left border, RB : right border, P35S : CaMV 35S promotor, bar : phosphinothricin acetyltransferase, Ti7 : terminator transcript 7, T : 3' region of nopaline synthase)
도 4는 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법에 따라 상추 자엽에 아그로박테리움을 감염시켜 형질전환하고 형질전환 상추로 재부하시키는 과정을 보여주는 사진이다.(A : 아그로박테리움과 공동배양한 상추 자엽으로부터 PPT 선발배지에서 형질전환 shoot 유기, B : PPT가 포함된 뿌리 유기배지에서 유도된 재분화 상추, C : 제초제 살포후 선발된 형질전환 상추)
도 5는 본 발명에 의한 형질전환 상추(T1)에 대한 제초제 선발 후의 생육 사진(A)과 비형질전환체와 전사인자들의 형질전환체들간의 표현형 비교 사진(B)이다.
도 6은 본 발명에 의한 형질전환된 식물체에서 목표 유전자들의 발현여부를 보여주는 RT-PCR 분석 결과 사진이다.(WT : 비형질전환 식물체)
도 7은 본 발명에 의한 형질전환 식물체를 야외 포장에 재배하면서 발생한 잎의 표현형 차이를 보여주는 사진이다.
도 8은 본 발명에 의한 형질전환 식물체의 안토시아닌 생합성 관련 구조 유전자들의 발현여부에 대한 RT-PCR 분석 결과 사진이다.
도 9는 본 발명에 의한 형질전환 식물체의 MYB60에 의한 안토시아닌 생합성 관련 구조유전자의 억제 모식도이다.
도 10은 본 발명에 의한 형질전환 식물체의 안토시아닌 성분에 대하여 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)분석을 통한 비교분석 결과이다.(C; cyanidin)
본 발명은 애기장대 유래의 전사조절 유전자 MYB60 및 상기 유전자를 도입한 형질전환 상추에 관한 것이다. 보다 상세하게는 안토시아닌 생합성 억제 활성을 가 진 전사조절 유전자 MYB60과 상기 유전자를 도입한 형질전환 상추 및 상기 형질전환 상추를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 본 발명을 통하여 화훼작물을 비롯한 화색 조절을 목적으로 하는 작물에 도입, 응용함으로써 향후 농가의 부가가치를 높이는데 기여할 수 있다.
전사조절인자를 이용함으로써 생합성 단계가 제대로 규명되지 않은 효소에 대한 정보를 얻는데 효과적이고, T-DNA 및 activation tagging을 통하여 대사 및 저해관련 전사조절인자의 특성을 규명하는 것은 최근 각광받는 세계적인 추세이며, 이들 유전자의 작물 내 형질전환으로 고부가 신기능 농작물 개발과 관련된 새로운 유전자의 개발과 유용 유전자를 지닌 새로운 작물의 출현이 시급한 실정이다.
MYB60은 안토시아닌 생합성을 억제하여 형질전환 식물의 표현형 분석을 통한 안토시아닌 생합성 억제효과가 확실함을 확인하였다. 따라서, 꽃잎 특이적인 프로모터와 결합하여 화색 조절용으로 이용하면 향후 화훼작물의 화색 조절을 비롯한 다양한 새로운 화훼작물 신품종 창출에 기여할 수 있을 것이다.
현재 국내외적으로 아그로박테리움을 이용하여 MYB-type 전사조절인자 유전자를 형질전환한 보고는 다양하며, 이중 대사산물 생합성 관련(리그닌 생합성 억제, 안토시아닌 생합성 증대) 또는 환경 스트레스 저항성 관련(내한, 내냉, 내염) 실험이 이루어지고 있다. 그러나 식물 시스템을 이용하여 안토시아닌 생합성 억제 효과를 표현형으로 확인한 경우는 본 발명이 최초이다.
이에 본 발명자들은 상기 종래의 문제점을 해결하기 위하여 애기장대 유래의 전사조절 유전자 MYB60이 안토시아닌 생합성 억제 활성을 가진 전사조절 유전자임을 밝혀내고, 상기 유전자를 활용하여 화색 조절을 비롯한 다양한 화훼작물 신품종 창출에 기여할 수 있을 것으로 보고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 안토시아닌 생합성 억제 활성을 가진 전사조절 유전자 MYB60과 상기 유전자를 도입한 형질전환 상추 및 상기 형질전환 상추를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 안토시아닌 생합성 억제 활성을 가진 전사조절 유전자 MYB60과 상기 유전자를 도입한 형질전환 상추 및 상기 형질전환 상추를 제조하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 아그로박테리움을 이용한 MYB-type 전사인자 유전자의 상추 형질전환과 이로 인한 안토시아닌 생합성 억제 기능을 확인한 상추 형질전환체에 관한 것으로서, (가) MYB60 유전자와 선발 유전자로서 제초제 바스타(basta) 저항성 bar 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터를 제조하는 단계; (나) 상기 제조된 발현벡터로 형질전환 시켜 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105를 제조하는 단계; (다) 상기 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105를 상추 식물체의 자엽과 공동배양하는 단계; (라) 상기 공동배양된 적상추 식물체 자엽유래의 shoot를 선발배지에서 선발 후 식물체 유도배지에서 식물체를 유도하는 단계; 및 (마) 유도된 상추 식물체를 기내 식물 생육배지 및 기외 토양에 이식하여 순화 시키는 단계를 포함한다.
본 발명에서 상기 (A)단계에서의 식물 형질전환용 발현벡터의 선발표식인자로는 제초제인 바스타에 대한 저항성 유전자를 적용하여 형질전환시 shoot와 형질전환 식물체의 선발을 용이하게 하였다.
식물체는 많은 이차대사산물들을 생합성하며 이들의 조절은 특이적인 전사인자들에 의하여 조절된다. 특히 식물의 많은 종류의 MYB 단백질들은 염기특이적인 DNA 결합(binding)을 통해서 특정 유전자들의 발현을 조절하여 대사과정 및 발육 과정의 전사 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다. 애기장대에는 약 125종이 알려졌으며, 이중 아직 특성구명이 되지 않은 MYB-type 유전자들을 분리하여 상추에서의 발현을 통해 특성 구명을 실시하였으며, MYB60 유전자를 이용한 식물발현용 운반체(22103-MYB60)의 주요 부분의 유전자 배열과 상기 제조된 발현 운반체가 형질전환된 아그로박테리움을 (도 3A, B)에 나타내었다. 상기 형질전환된 아그로박테리움은 2006년 03월 03일자로 한국농업미생물 자원센터에 기탁하여 미생물 명칭을 "MYB60"으로 하여 기탁번호 KACC 95045P를 부여받았다.
본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 이용되는 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105(Agrobacterium tumefaciens EHA105)를 이용하였고, 상기 식물형질전환 운반체 22103-MYB60를 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105에 통상의 방법으로 도입·선발하여 적상추 자엽 절단면과 공동배양하여 도입하였다.(도 4)
본 발명에서는 상기와 같은 방법으로 생산된 형질전환체를 대상으로 실제로 형질전환된 식물체들이 외래 유전자를 포함하고 있는가를 확인하기 위하여 일차로 제초제를 살포하여 선발한 후 RT-PCR을 수행하였으며, bar 유전자와 MYB60 유전자의 삽입을 확인할 수 있었다.(도 6)
형질전환 식물체의 이차대사산물 생합성 과정이 환경요인에 영향 받는 것을 제외시키기 위하여 확보한 20종의 T0 계통(상추 자엽에 MYB60유전자 형질진환용 운반체를 함유하는 아그로박테리움을 접종 후 재분화 과정을 거쳐서 선발된 형질전환체)으로부터 종자를 채종한 후, 동일한 생육단계의 T1(형질전환 상추)들을 대상으로 실제 표현형의 변화를 분석하였다. 형질전환 상추에서는 (도 7)에서 보는 바와 같이, 초록색(MYB60-117) 또는 얼룩 무늬의 반점(MYB60-112)을 나타내어, 비형질전환 식물체의 적색에 비하여 안토시아닌 생합성이 억제되었음을 확인하였고, 관련 구조유전자들에 대한 RT-PCR 분석 결과 DFR 유전자의 전사가 억제되었음을 확인하였다.(도 8, 9)
이하, 본 발명의 구성을 실시예를 들어 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들에 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1] 애기장대 cDNA 제작 및 RACR-PCR을 이용한 MYB60 유전자 분리
애기장대 유래의 MYB-type 전사조절 유전자 MYB60은 843 bp로 아미노산 280개를 코드하고 있다. 애기장대 잎으로부터 분리한 total RNA를 주형으로 하여 RACE 용 cDNA를 합성한 후 (SMARTTMRACE cDNA kit) MYB60 선발용 서열번호 2와 3의 프라이머를 이용하여 PCR [ 35cycle : 변성 94oC (30 sec), 어닐링 60oC (30sec), 확장 72oC (2min) ]을 실시하였다.(도 1)
[실시예 2] 식물 형질전환용 운반체 작성 및 아크로박테리움에의 도입
식물 형질전환용 운반체를 제작하고, 이를 아그로박테리움에 도입·선별하였다. 형질전환용 운반체인 pBSPAP22103에 MYB60 유전자를 삽입하기 위하여 MYB60의 양 말단에 각각 MluI 과 XbaI 염기서열을 포함하는 서열번호 4와 5의 프라이머를 이용하여 PCR [ 35cycle : 변성 94oC (30 sec), 어닐링 60oC (30sec), 확장 72oC (2min) ]을 실시하였다.(도 2)
PCR 산물을 pGEM T-Easy 운반체에 삽입한 후 제한효소(MluI 과 XbaI)로 절단하고, 동일한 제한효소로 절단된 pBSPA-22103에 삽입하여 목표 유전자를 포함하는 식물 형질전환 운반체인 22103-MYB60을 제작하였다. 상기 플라스미드 22103-MYB60의 주요 부분의 유전자 배열을 (도 3A)에 나타내었다.
아그로박테리움 선발 항생제는 카나마이신(kanamycin)을 사용하였으며, 제작된 형질전환용 이중 벡터(binary vector) DNA인 22103-MYB60을 freeze-thaw방법으로 아그로박테리움 투메페시엔스 EHA105에 도입하고, 카나마이신이 50μg/mL 포함된 YEP배지(펩톤 (Peptone) 10g/L, 효모(Yeast) 10g/L. NaCl 5g/L) 에서 선발하였 다. 선발된 아그로박테리움을 배양하여 플라스미드를 분리하고 아그로박테리움의 형질전환을 재확인한 후(도 3B), 22103-MYB60에 의해 형질전환된 아그로박테리움 투메파시언스 EHA105를 상추 형질전환에 사용하였다.
[실시예 3] 상추 형질전환 방법
상추 형질전환을 위하여 적상추 종자 (진자측면)를 이용하였다. 먼저 종자를 2% sodium hypochloride (시판 '락스')용액에 10분간 교반하면서 종자 표면을 살균하였다. 이후 종자를 멸균수로 4-5회 세척하고 파종배지 (2.22g/L MS salt, 3% sucrose, 2g/L phytogel)에 종자를 치상하였다. 치상한 종자를 28oC에서 4일간 배양시키면 절단 가능한 크기의 자엽 (4mm)이 전개된다. 22103-MYB60으로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105를 36시간 배양 후 균액의 농도를 MS0 배지(Murashige & Skoog medium 4.4g/L, Duchefa Biochem M0222.0050)로 OD600=0.7로 희석하여 절단된 자엽과 10분간 방치하였다. 자엽을 멸균한 여과지(filter paper)로 건조시킨 후 공동배양배지( 4.43g/L MS salt, 3% 슈크로오스(sucrose), 2g/L 피토겔(phytogel), 0.25mg/L NAA, 0.5mg/L 키네틴(kinetin), 10mg/L 시스테인(cysteine) )에서 24oC 암조건하에 2일간 공동배양(co-culture) 하였다.
표면에 잔류하는 아그로박테리움을 제거하기 위하여, 공동배양한 자엽을 카베니셀린(carbenicellin) 400mg/L가 첨가된 MS0 배지(Murashige & Skoog medium 4.4g/L, Duchefa Biochem M0222.0050)로 세척한 후 멸균된 여지에 올려 표면의 수 분을 제거하고 선별배지 (4.43g/L MS salt, 3% 슈크로오스, 2g/L 피토겔, 0.25mg/L NAA, 0.5mg/L 키네틴, 400mg/L 카베니실린(carbenicellin), 1g/L PPT, 10mg/L 시스테인)에 옮겨서 형질전환된 shoot를 유도하였다. 2주마다 새로운 선별배지로 계대배양하고 4-6주 경과 후 선발된 shoot로 뿌리유도배지(4.43g/L MS salt, 3% 슈크로오스, 2g/L 피토겔, 0.5g/PPT)에서 재분화 식물체를 유도하였다.(도 4)
일정 크기로 성장한 재분화 개체들은 배양병에서 꺼내서 뿌리를 물로 잘 씻어 준 후 질석(vermiculite)으로 채워진 포트(pot)로 이식하고 순화상자에서 1주일간 순화시켰다.
재분화 식물체들에 대하여 0.3% 제초제 (바스타)를 처리하여 Bar 저항성 식물체를 선발하였다. 본 발명에 의한 형질전환 식물체들에 0.3% 제초제 처리하에서도 생존하는 것을 확인한 바, 이는 상기 획득한 개체들에서 제초제 저항성 단백질이 생성되고 있음을 증명하는 것이다.
각 형질전환체들에 대한 이차대사산물 생합성 분석은 동일한 성장 단계(growth stage)를 유지하는 것이 필수적이므로, T0세대에서 채종된 종자들을 동시에 50포트(pot)에 파종하고, 제초제를 살포한 후 동일한 성장 단계(growth stage)의 대조군(control) 상추 식물체와 함께 분자생물학적 분석 및 물질분석에 이용하였으며, 제초제 선발 후의 형질전환 식물체 생육상황은 (도 5A, B)에 나타내었다.
[실시예 4] 형질전환 식물체 표현형 및 분자생물학적 분석
1) 도입 유전자들에 대한 RT-PCR 분석
제초제 살포를 통해서 선발된 형질전환 식물체에 외래유전자인 MYB60과 bar가 게놈(genome)상에 삽입되어 전사가 이루어졌는지 여부를 total RNA에 대한 RT-PCR 방법으로 다시 검정하였다. Total RNA 100ng에 20mM Tric-HCl(pH7.9), 100mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, M-MLV 역전사효소(RNaseH minus), 슈퍼 taq 플러스 DNA 중합효소(super taq plus DNA polymerase), 10pmol 프라이머를 이용하여 50oC에서 30분간 역전사를 수행하고 96oC에서 3분간 불활성화 시킨 후, PCR [ 35cycle : 변성 94oC (30 sec), 어닐링 60oC (30sec), 확장 72oC (2min) ]을 실시하였다. 실험 결과 사진을 (도 6)에 도시하였다. RT-PCR에 사용된 프라이머는 서열번호 2와 3 (MYB60) 및 서열번호 6과 7 (bar)을 사용하였으며 RT-PCR 산물 크기는 각각 841bp 와 281bp 이다.
2) 형질전환 식물체의 표현형 분석
표현형 분석을 위하여 적상추 품종인 진자축면에 MYB60 유전자를 형질전환한 계통들과 비형질전환체와의 표현형을 비교한 결과, 비형질전환체는 적색의 표현형을 보였으나 MYB60 형질전환체는 안토시아닌 생합성 경로가 억제(repress) 작용을 받아 적색 안토시아닌의 축적이 저해되었다.(도 5A, B)
특히 MYB60(117) 계통은 전혀 안토시아닌이 생합성 되지 않고 초록색을 띈 반면 MYB60(112)계통은 안토시아닌 생합성이 부분적으로 억제되어 얼룩무늬 모양을 보여, 안토시아닌 생합성 관련 구조유전자들의 전사를 억제하는 정도에 있어서 차 이를 보였다.(도 7)
3) 안토시아닌 생합성 구조 유전자들에 대한 RT-PCR
안토시아닌 생합성에 관여하는 구조유전자들(CHS, F3H, DFR, FGT)과 정량을 위한 리보좀(Ribosome)에 대한 RT-PCR 분석을 실시한 결과 형질전환된 MYB60이 DFR 유전자의 전사가 억제됨을 확인하였다. 또한 MYB60 형질전환 식물체 계통들 간에도 표현형의 차이를 보여 117계통의 MYB60 형질전환 식물체는 DFR의 발현이 완전히 억제되어 초록색 표현형을 보인 반면, 112 계통의 MYB60 형질전환 식물체는 DFR의 발현이 비형질전환체에 비하여 상대적으로 줄어들어 안토시아닌이 얼룩무늬 형태로 부분적으로 축적되는 표현형과 상관성 있는 결과를 보였다. RT-PCR 방법은 도입유전자 분석과 동일하였으며, 사용된 프라이머는 서열번호 8과 9 (CHS), 10과 11 (F3H), 12와 13 (DFR), 14와 15 (FGT) 및 16과 17 (리보좀)이었으며, RT-PCR 산물 크기는 각각 398, 319, 534, 153 및 386 bp 였다. 실험결과 사진을 (도 8)에 도시하였으며, MYB60에 의한 DFR 유전자 발현 억제 모식도를 (도 9)에 나타내었다.
[실시예 5] 형질전환 식물체 물질분석
상기 선발된 형질전환 식물체의 물질 분석을 위하여 비형질전환체를 포함한 식물 재료를 액체질소와 함께 유발로 분쇄하고, 동결건조 후 동량 (0.1g)에 대하여 추출용액 (1% HCl, 20% methanol)을 이용하여 4oC 조건에서 48시간 추출하였다. 형질전환 식물체내의 안토시아닌 생합성을 분석하기 위하여 고성능 액체크로마토그래 피(HPLC) 분석을 실시하였으며, 510nm에서의 분석결과 비형질전환 식물체에서 주(major)로 존재하던 시아니딘(적색색소) 피크가 MYB60 형질전환 식물체에서 생합성되지 않거나 급격히 줄어들었으며, 그 결과는 (도 10)에 도시하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명자들은 MYB60 유전자를 도입하여 형질전환한 상추 식물체의 표현형과 생합성 대사 관련 유전자들의 발현 분석을 통하여 상기 유전자가 안토시아닌 생합성을 억제하는 기능을 가진다는 것을 규명하였다.
따라서, 본 발명에서 특성이 규명된 상기 유전자를 화훼작물을 비롯한 화색조절을 목적으로 하는 작물에 도입하여 새로운 고부가 작물 개발에 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 발명에서의 제초제 저항성이 도입된 상추는 재배 및 관리시에 제초제 살포에 의한 잡초 제거가 용이한 부수적인 효과도 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 안토시아닌 생합성을 억제하는 전사조절인자인 서열번호 1의 MYB60 유전자.
  2. 제 1항의 서열번호 1의 MYB60 유전자를 포함하여 제조된 형질전환용 운반체 22103-MYB60.
  3. 제 2항의 형질전환용 운반체 22103-MYB60에 의해 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105(기탁번호 KACC 95045P).
  4. (가) 제 1항의 MYB60 유전자와 선발 유전자로서 제초제 바스타(basta) 저항성 bar 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터를 제조하는 단계;
    (나) 상기 제조된 발현벡터로 형질전환 시켜 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105를 제조하는 단계;
    (다) 상기 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105를 상추 식물체의 자엽과 공동배양하는 단계;
    (라) 상기 공동배양된 적상추 식물체 자엽유래의 어린 싹(shoot)을 선발배지에서 선발 후 식물체 유도배지에서 식물체를 유도하는 단계; 및
    (마) 유도된 상추 식물체를 기내 식물 생육배지 및 기외 토양에 이식하여 순화시키는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 상추의 제조 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상추 자엽에 아그로박테리움 공동배양 후 선별 및 재분화 단계에 사용되는 배지의 조성에 4.43g/L 엠에스배지(MS salt: Murashige & Skoog salt medium), 3% 슈크로오스(sucrose), 2g/L 피토겔(phytogel), 0.25mg/L 나프탈렌아세트산(NAA: α-Naphthalene acetic acid), 0.5mg/L 키네틴(kinetin), 400mg/L 카베니셀린 (carbenicellin), 1g/L 포스피노트리신(PPT: DL-Phosphinothricin) 및 10mg/L 시스테인(cysteine)이 첨가되는 것을 특징으로 하는 형질전환 상추의 제조 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 선별배지에서 선별된 어린 싹(shoot)의 재분화를 위한 뿌리유배지의 조성에 4.43g/L 엠에스배지(MS salt: Murashige & Skoog salt medium), 3% 슈크로오스(sucrose), 2g/L 피토겔(phytogel) 및 0.5g/L 포스피노트리신(PPT: DL-Phosphinothricin)이 첨가되는 것을 특징으로 하는 형질전환 상추의 제조 방법.
  7. 제 4항에 의한 형질전환 방법에 의해 서열번호 1의 MYB60 유전자가 도입된 형질전환 상추 식물체 또는 그의 종자.
  8. 삭제
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