KR20060037150A

KR20060037150A - 멜론에서 분리된 안토시아닌 생합성 관련 유전자

Info

Publication number: KR20060037150A
Application number: KR1020040086322A
Authority: KR
Inventors: 김신제; 김창균
Original assignee: 주식회사 에프앤피
Priority date: 2004-10-27
Filing date: 2004-10-27
Publication date: 2006-05-03

Abstract

본 발명은 멜론에서 분리된 안토시아닌 생합성 관련 유전자에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 CmMyb1 유전자는 안토시아닌 생합성에 관여하는 Myb 전사 인자(transcription factor)를 암호화한다. 따라서, 본 발명의 CmMyb1 단백질 및 이를 암호화하는 핵산은 안토시아닌이 축적된 고품질의 식물 품종을 육성하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

안토시아닌 생합성, 멜론, Myb

Description

멜론에서 분리된 안토시아닌 생합성 관련 유전자{Anthocyanin biosynthesis-related gene isolated from melon}

도 1은 실시예 1에서 스크리닝된 클론의 염기서열 및 이로부터 추정되는 아미노산 서열을 도시한 것이다.

도 2는 본 발명의 CmMyb1 단백질(서열번호 2)과 종래 알려진 Myb 전사 인자들의 아미노산 서열을 다중 서열 정렬(multiple sequence alignment)하여 비교한 결과이다.

도 3은 여러 가지 제한효소로 절단된 멜론의 게놈 DNA을 대상으로 서던 블럿을 수행한 결과이다.

A: CmMyb1 유전자(Probe A)를 탐침으로 하여 수행한 서던블럿 결과

B: CmMyb1 유전자의 5′UTR(Probe B)을 탐침으로 하여 수행한 서던블럿 결과

C: 서던 블럿 분석에 사용된 탐침의 위치를 나타낸 모식도

도 4는 CmMyb1 유전자의 과실 발달 단계 및 조직별 발현 양상을 분석한 결과이다.

Fruit: 과실 L: 잎

MF: 웅화 FF: 자화

S: 줄기 T: 덩굴손

도 5는 CmMyb1 유전자의 식물체 내에서 위치를 확인한 결과를 나타낸다.

A: Myb:GFP와 GFP:Myb를 원형질체에 도입한 결과

B: Myb:GFP와 NLS:RFP를 원형질체에 공동형질전환(co-transformation)한 결과

C: 항-GFP 단일항체를 탐침으로 하여 원형질체에서 Myb:GFP와 GFP:Myb의 발현을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과로서 'S'는 상층액(supernatant)을 나타나고, 'P'는 펠렛(pellet)을 나타내는 것이다.

도 6은 CmMyb1 유전자를 삽입하여 제조한 재조합 벡터들의 개략적인 모식도이다.

A: CmMyb1 유전자의 안티센스 단편을 삽입한 재조합 벡터

B: CmMyb1 유전자의 센스 단편을 삽입한 재조합 벡터

C: CmMyb1 유전자의 RNAi 단편을 삽입한 재조합 벡터

도 7은 본 발명의 실시예 <5-1>에서 형질전환된 멜론의 모습이다.

CmMyb1(sense): CmMyb1 유전자의 센스 단편이 도입된 형질전환 멜론

CmMyb1RNAi: CmMyb1 유전자의 RNAi 단편이 도입된 형질전환 멜론

도 8은 형질전환된 멜론에서 CmMyb1 유전자의 도입 여부를 PCR을 통해 확인한 결과이다.

M: 분자량 사이즈 마커

(-): 형질전환 시키지 않은 멜론의 게놈 DNA

1: CmMyb1 유전자의 RNAi 단편이 도입된 형질전환 멜론 #1의 게놈 DNA

2: CmMyb1 유전자의 RNAi 단편이 도입된 형질전환 멜론 #2의 게놈 DNA

3: CmMyb1 유전자의 RNAi 단편이 도입된 형질전환 멜론 #3의 게놈 DNA

4: CmMyb1 유전자의 RNAi 단편이 도입된 형질전환 멜론 #4의 게놈 DNA

(+): 멜론의 형질전환에 사용된 CmMyb1 유전자의 RNAi 단편 함유 재조합 벡터

본 발명은 멜론에서 분리된 안토시아닌 생합성 관련 유전자에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 및 이의 용도에 관한 것이다.

안토시아닌은 식물체에 존재하는 수용성 색소 배당체(glucoside)로서, 세포액의 산성농도, 색소화합물의 화학적 구조, 여러 금속이온들과의 결합상태에 의해 자색, 적색, 청색 등의 색상을 나타내는 식물성 천연 색소이다. 최근 안토시아닌이 다양한 생리활성을 가지고 있음이 보고 되고 있다. 예컨대, 노화억제작용, 항균작용, 돌연변이성 억제작용, 콜레스테롤 저하작용, 시력개선효과, 혈관보호기능, 항궤양기능, 항산화 기능 등이 규명되었다. 특히 항산화 활성면에서는 천연 항산 화제인 토코페롤보다 5-7배의 강한 항산화 활성을 나타내는 것으로 알려졌다. 안토시아닌은 독성이 낮다. 따라서, 현재 안토시아닌은 청량음료, 잼, 시력보호용 음료수, 사탕 등의 가공식품 생산과 향장공업, 염료공업, 의약품 개발 등에 활용되고 있다. 최근에는 발암성 및 간 독성이 우려되는 합성 착색료를 대신할 수 있는 안전한 천연 착색료로 주목을 받아 식품 영양학적인 면과 더불어 시각적 신선감 및 즐거움을 줄 수 있는 유용성분으로 평가되고 있다. 이러한 안토시아닌은 다양한 식물 종에 폭넓게 존재하며, 흔히 식물체의 꽃, 과실, 줄기, 잎, 뿌리 등에 함유되어 있다. 포도, 딸기, 올리브, 적양배추, 가지, 장미 등의 식물체로로부터 안토시아닌을 추출하여 여러 가지 원료로 사용되고 있다.

한편, 식물에서의 안토시아닌 생합성은 식물 자체가 가지고 있는 유전적 요인과 이것이 잘 발현되도록 하는 환경요인의 상호작용에 의해 조절된다(The Plant Cell, 7: 1071-1083). 즉 안토시아닌 생합성 관련 유전자들은 광도, 광질, 일장, 온도, 수분, 화학물질, 기타 요인들에 의해 자극을 받아 발현되는데(Plant Physiol. 92: 1191-1195; Planta, 194:541-549), 일단 조절 유전자가 발현이 되면 생합성 과정에 관련된 여러 가지 효소가 생성되어 이들의 작용에 의해 안토시아닌이 만들어진다. 안토시아닌 생합성 관련 유전자 중 하나가 Myb 유전자이다. Myb 유전자는 안토시아닌 생합성의 전사 조절자인 Myb 전사 인자(transcription factor)를 암호화한다. 옥수수(Zea mays), 페투니아 히브리다(Petunia hybrida), 토마토 등에서 Myb 유전자가 안토시아닌 생합성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 상기 Myb 유전자는 안토시아닌 생합성 이외에도 페닐프로파노이드 대사(phenyl propanoid metabolism), 발달(development), 신호 전달(signal transduction), 식물 병 저항성(plant disease resistant), 세포 분열(cell division) 등에도 관여하는 것으로 알려졌다. 특히 최근에 토마토에서 Myb 유전자 군의 하나인 ANT1 유전자가 분리되었으며, 상기 ANT1 유전자를 과발현시킨 형질전환 토마토에서 자주빛을 띠는 안토시아닌이 축적됨이 보고되었다(Helena Mathew et al., The Plant Cell, 15:1689-1703, 2003). 또한 아라비돕시스(Arabidopsis thaliana)에서도 Myb 전사 인자를 암호화하는 유전자들이 분리된 바 있다(미국특허 제6,573,432호).

그러나, 아직까지 멜론에서는 Myb 유전자가 분리된 바 없으며, 멜론 과실의 색 결정과 관련하여 Myb 유전자의 기능에 대해서도 아직까지 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 멜론으로부터 Myb 유전자를 분리하고 이의 특성을 규명하기 위하여 연구를 거듭하던 중, 멜론으로부터 서열번호 3의 Myb 단백질을 암호화는 CmMyb1 유전자를 분리함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 멜론으로부터 분리된 Myb 유전자 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 핵산을 함유하는 재조합 벡터 및 형질전환 숙주 세포를 제공한다.

또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 핵산을 증폭시키기 위한 프라이머를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 핵산을 식물체 내로 도입하는 것을 포함하는 안토시아닌이 축적된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

나아가 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩티드 또는 이의 변이형, 이들을 암호화하는 핵산, 이들의 절편 또는 유도체를 탐침으로 하여 식물의 안토시아닌 생합성 관련 물질을 탐색하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 멜론으로부터 안토시아닌 생합성에 관여하는 Myb 전사 인자(transcription factor)를 암호화하는 유전자를 처음으로 분리하였다.

본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 상기 폴리펩티드는 종래 알려진 안토시아닌 생합성에 관여하는 Myb 전사 인자와 매우 높은 상동성을 나타낸다. 구체적으로 본 발명에 따른 폴리펩티드는 헤아바 브라실리엔시스(Heava brasiliensis)에서 분리된 HbMyb1 단백질과 72.0%, 그리고 안티리눔 마주스(Antirrhinum majus)에서 분리된 DIVARICATA 단백질과 59.4%의 상동성을 나타낸다(도 2 참조). 따라서 본 발명에서 분리된 서열번호 3의 폴리펩티드를 'CmMyb1'이라 명명하였다.

본 발명의 CmMyb1 단백질은 천연형 또는 재조합 단백질 또는 이들과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질을 말한다. 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질에는 천연형/재조합 CmMyb1 단백질과 그 기능적 동등물(functional equivalent) 및 기능적 유도체(functional derivative)가 포함된다. 상기 "기능적 동등물"에는 천연형 단백질 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체로서 천연형 CmMyb1 단백질과 실질적으로 동등한 생리활성을 갖는 것을 말한다. 따라서, 본 발명에는 상기 CmMyb1 단백질과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드가 모두 포함된다. 또한 상기 "기능적 유도체"는 상기 CmMyb1 단백질의 물리/화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질로서 CmMyb1 단백질과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 것을 의미한다. 본 발명의 CmMyb1 단백질은 공지된 서열로부터 당업계에 공지된 유전공학적 방법으로 제조할 수 있다. 또한 당업계게 공지된 통상의 방법에 따라 분리· 정제될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 CmMyb1 단백질을 암호화하는 핵산을 제공한다. 상기 핵산은 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것이 바람직하다. 예컨대, 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다. 보다 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 가질 수 있다. 본 발명의 핵산에는 CmMyb1 단백질의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산이 포함될 수 있다.

본 발명의 핵산은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. "작동 가능하게 연결된다(operably linked)"는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 또한, "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 개시하기 위한 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터(operator) 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

본 발명에 따른 핵산은 적절한 발현 벡터 내에 센스 방향 및/또는 안티센스 방향으로 삽입될 수 있다. 여기서, "발현 벡터"라 함은 본 발명의 핵산이 삽입될 수 있는 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 식물 세포내로 본 발명의 핵산을 도입시키기 위한 적합한 벡터로는 Ti-플라스미드, 뿌리 유도성(Ri)-플라스미드 및 식물 바이러스 벡터가 있으며, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 pCAMBIA2300 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 상기에서 세포는 효모, 식물 세포와 같은 진핵세 포 또는 대장균과 같은 원핵세포일 수 있다. 바람직하게는 박테리아(bacteria)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 대장균 또는 아그로박테리움 속 미생물이다. 상기 본 발명에 따른 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 공지된 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 아그로박테리움 매개 형질전환법(Agrobacterium-mediated transformation), 입자 총 충격법(particle gun bombardment or microparticle bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 폴리에틸렌글리콜에 의한 침전법(polyethylenglycol-mediated uptake) 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움 매개 형질전환법을 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 핵산을 증폭하기 위한 프라이머를 제공한다. 상기 프라이머는 본 발명의 단백질 또는 이의 기능적 동등물을 증폭하기 위해 당업자가 디자인할 수 있는 모든 프라이머를 포함한다. 상기 프라이머에는 본 발명에 따른 CmMyb1 유전자의 센스, 안티센스 또는 RNAi 단편을 증폭할 수 있는 프라이머가 모두 포함된다. 또한 상기 프라이머는 그 서열 내에 증폭된 유전자의 용이한 클로닝을 위하여 적절한 제한효소 인식 서열을 포함할 수 있다. CmMyb1 유전자의 센스 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 가지는 것이 바람직하다. 바람직하게는 서열번호 4와 5; 서열번호 8과 9; 서열번호 10과 11; 및 서열번호 15와 16으로 이루어진 군 에서 선택되는 어느 하나의 프라이머 조합을 사용할 수 있다. 또한 CmMyb1 유전자의 안티센스 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한 CmMyb1 유전자의 RNAi 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 CmMyb1 유전자의 안티센스 및 센스 단편을 증폭하기 위한 모든 프라이머가 포함된다. 바람직하게는 서열번호 13과 14의 염기서열을 갖는 CmMyb1 유전자의 안티센스 단편 증폭용 프라이머 조합 및 서열번호 15와 16의 염기서열을 갖는 CmMyb1 유전자의 센스 단편 증폭용 프라이머 조합을 사용하여 CmMyb1 유전자의 RNAi 단편을 제조할 수 있다.

본 발명의 CmMyb1 유전자는 식물체 내로 도입하여 과발현시킴으로써 안토시아닌이 축적된 식물체를 제조하는 데 사용될 수 있다. 상기에서 "과발현"이란, 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다. 따라서 본 발명은 CmMyb1 유전자를 식물체 내로 도입하는 것을 포함하는 안토시아닌이 축적된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명의 방법은

(a) 본 발명의 CmMyb1 단백질을 암호화하는 핵산을 발현 벡터에 삽입하는 단계; 및

(b) 상기 발현 벡터를 식물체 내로 도입하는 단계를 포함한다.

상기 (a) 단계에서 본 발명의 CmMyb1 단백질을 암호화하는 핵산은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한 상기 발현 벡터는 핵산의 발현을 조절할 수 있는 프로모터를 함유하고 있는 것이 바람직하다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter), 식물의 조직 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터 또는 식물의 발달 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터가 모두 사용될 수 있다. 프로모터의 예로는 CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature, 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632, 1989) 및 ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다. 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터를 사용한다.

상기 (b) 단계에서 식물체로의 도입은 공지의 식물체 형질전환방법을 이용할 수 있다. 예컨대, 앞서 기재한 바와 같이, 아그로박테리움 매개 형질전환법, 입자 총 충격법, 실리콘 탄화물 위스커, 초음파 처리, 전기천공법 및 폴리에틸렌글리콜에 의한 침전법 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움 매개 형질전환법을 이용한다.

본 발명에 적용될 수 있는 식물은 쌍자엽 식물(dicotyledonous plant) 또는 단자엽 식물(monocotyledonous plant)일 수 있다. 구체적으로, 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리 및 수수와 같은 식량작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근과 같은 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채와 같은 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 멜론, 살구 및 바나나와 같은 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립과 같은 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스와 같은 사료작물류가 모두 이용될 수 있다. 바람직하게는 멜론일 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 형질전환 식물체는 안토시아닌이 축적됨으로써 항산화활성, 노화억제활성, 콜레스테롤 저하활성 등 다양한 생리활성이 우수할 뿐 아니라 변형된 과색을 나타내므로 상품적 가치가 매우 높다. 따라서, 본 발명의 방법은 고품질의 식물 품종을 육성하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

아울러, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 이를 암호화하는 핵산, 이들의 절편 또는 유도체를 이용하여 식물의 안토시아닌 생합성 관련 물질을 탐색하는 방법을 제공한다. 상기 안토시아닌 생합성 관련 물질은 유전자 또는 단백질일 수 있으며, 또한 천연에서 분리되거나 화학적으로 합성된 화합물 또는 추출물일 수도 있다. 바람직하게 상기 방법은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 이를 암호화하는 핵산, 이들의 절편 또는 유도체를 '탐침'으로 하여 수행될 수 있다. 상기에서 '탐침(probe)'이란 원하는 것을 찾아내는 매개체를 의미한다. 상기 탐침은 찾아내는 물질의 스크리닝 및 분리를 용이하게 하기 위하여 방사성 동위원소, 형광 색소 또는 발색 효소 등으로 표지될 수 있다. 바람직하게는 ³H, ³²P, ³⁵S, FITC(Fluorescein Isohiocyanate), TRITC(Tetrame-thylrhodamine isothiocyanate), 바이오틴(Biotin), 디그옥시제닌( Digoxigennin), HRP(Horse-Radish Peroxidase), 글루코스 옥시다제(Glucose Oxidase), 알칼린 포스파타제(Alkaline Phosphatase) 등으로 표지될 수 있다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 핵산의 표지 방법으로는 닉 트랜스레이션(nick translation), 랜덤 올리뉴클레오티드 프라이머를 이용한 방법과 같은 핵산 전체를 균일하게 표식하는 방법 또는 키네이션(kination)과 필링-인(filling-in)과 같이 5' 말단이나 3' 말단을 표지하는 방법을 사용할 수 있다. 또한 폴리펩티드의 경우에는 방사성 옥소화를 통해 표지할 수 있다. 폴리펩티드의 티로신 또는 히스티딘에 방사성 옥소를 직접 표지할 수도 있고, 클로라민 T법(Chloramine-T), 요오드젠법(Iodogen) 또는 락토과산화효소(lactoperoxidase)를 이용하여 표지할 수 있다.

보다 구체적으로 본 발명의 방법은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 CmMyb1 단백질, 이의 절편 또는 유도체와의 단백질 결합 양상을 분석함으로써 안토시아닌 생합성 관련 단백질을 탐색할 수도 있으며, 본 발명에 따른 CmMyb1 단백질의 활성을 억제 또는 활성화하는 물질을 탐색할 수 있다. 또한 상기 CmMyb1 단백질을 암호화하는 핵산 또는 이의 절편을 식물체로부터 추출한 RNA 또는 mRNA로부터 제조된 cDNA와 혼성화 반응을 수행함으로써 안토시아닌 생합성 관련 유 전자를 탐색할 수 있다. 또한, 직접적으로 상기 CmMyb1 유전자 또는 이의 변이형 유전자와 결합하는 물질 또는 이들의 발현을 억제 또는 활성화하는 화학물질 등을 탐색할 수 있다. 아울러, 본 발명의 방법은 상기 CmMyb1 단백질을 암호화하는 핵산과 염기서열을 비교하여 높은 서열 상동성을 가진 유전자를 탐색할 수도 있다. 일반적으로 사용되는 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응(PCR), 노던 블럿, 서던 블럿, 웨스턴 블럿, 효소 면역 반응(ELISA), 2-D 겔 분석, 효모 이중 혼성화 반응(yeast two hybrid system) 및 시험관 내 결합 어세이(in vitro binding assay)를 포함하는 다양한 방법으로 탐색을 수행할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

멜론으로부터 CmMyb1 유전자의 분리 및 서열 분석

<1-1> 과실발달에 따른 차별적 유전자 발현 분석

a) 멜론 과실 발달별 cDNA 라이브러리의 제작

멜론(Cucumis melo cv. Reticulatus F1 Alpha)의 과실로부터 0, 9, 36 및 37 DAP(day after pollination)에 pBK-CMV 파지미드 벡터(Strategene)를 이용하여 cDNA 라이브러리를 각각 제작하였다. 형질전환된 세포를 37℃에서 45분 동안 배양한 후, X-gal(80 ㎍/㎖)과 IPTG(0.55 mM), 그리고 가나마이신(50 ㎍/㎖)을 포함하 는 LB 배지에 도말하였다. 재조합 DNA를 포함하는 화이트 콜로니를 선발하여 이를 384 well 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)에 피킹(picking)하였다. 이후, 자동 눈금 시스템(automatic gridding system) TAS(BioRobotics, Cambridge, UK)를 이용하여 콜로니들을 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다.

b) 탐침의 제조

멜론(Cucumis melo cv. Reticulatus F1 Alpha)의 과실과 잎(대조군)으로부터 0, 9, 18, 27 및 36 DAP에 RNA 분리 키트를 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 추출된 총 RNA를 주형으로 하고, 인비트로젠(Invitrogen)사의 수퍼스크립트(Superscript, #12371-019)를 이용하여 1차-스트랜드 cDNA(first-strand cDNA)를 합성하였다. 합성된 1차-스트랜드 cDNA를 키트(RediprimeTM random prime labelling kit, Amersham Biosciences, #RPN1633)를 이용하여 [α-³²P]dCTP로 표지된 탐침으로 제조하였다. 이후, 멜론 과실발달별로 차별적 발현을 나타내는 유전자를 분리하기 위하여 상기 제조된 탐침을 이용하여 상기 a)에서 멜론 과실발달별로 제작된 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다.

c) cDNA 라이브러리 스크리닝

상기 a)에서 제작된 멜론의 cDNA 라이브러리를 나일론 멤브레인으로 옮겼다. 이후, 나일론 멤브레인을 상기 b)에서 제조된 탐침과 65℃에서 24시간 동안 혼성화 시켰다. 0.1% SDS를 함유하는 2×SSC 용액에서 1시간, 0.1% SDS를 함유하는 1×SSC 용액에서 1시간, 0.1% SDS를 함유하는 0.5×SSC 용액에서 30분, 0.1% SDS를 함유하는 0.1×SSC 용액에서 20분 동안 순차적으로 세척하였다. 이후, X-ray 필름에 감광시켜 과실발달별로 차별적 발현을 보인 유전자를 탐색하였다. 그 결과, 0 DAP 및 9 DAP에서만 특이적으로 발현되는 클론을 확인하였다.

<1-2> CmMyb1 유전자의 클로닝 및 서열분석

상기 실시예 <1-1>에서 선별된 클론을 LB 브로쓰(broth)에 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 분리하였으며, 제한효소 EcoRI과 XhoI으로 절단한 후, 1% 아가로즈 젤에서 전기영동을 하였다. 전기영동 결과에서 약 1.2 kb의 DNA 삽입물(insert)을 확인하였다. 상기 DNA의 서열분석을 수행하였다. 그 결과, 0 DAP 및 9 DAP에서만 특이적으로 발현되는 클론(1,237 bp)은 340 bp의 5' UTR과 795 bp의 코딩부분, 그리고 102 bp의 3' UTR을 포함하였다(도 1 참조). 클론의 전체 염기서열을 서열번호 1로 기재하였으며, 전체 염기서열 중에서도 단백질로 발현되는 코딩 부분의 서열만을 서열번호 2로 기재하였다. 상기 클론으로부터 암호화되는 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 3으로 기재하였다.

코딩 부분으로부터 암호화되는 아미노산 서열(서열번호 3)을 이용하여 유사성 탐색(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast)을 한 결과, Myb 전사 인자들과 높은 유사성을 보였다. 구체적으로 헤아바 브라실리엔시스(Heava brasiliensis)에서 분 리된 HbMyb1 단백질(GenBank accession no. AF239956)과 72.0%의 상동성을 나타내었고, 안티리눔 마주스(Antirrhinum majus)에서 분리된 DIVARICATA 단백질(GenBank accession no. AY077454)과 59.4%의 상동성을 나타내었다(도 2 참조). 따라서, 본 발명자들은 서열번호 2의 핵산을 'CmMyb1 유전자'라 명명하였다.

<실시예 2>

CmMyb1 유전자의 게놈 구조 분석

멜론 CmMyb1 유전자의 게놈 구조를 분석하기 위하여 서던블럿을 실시하였다. 멜론의 게놈 DNA를 제한효소 HindⅢ, EcoRⅠ, EcoRⅤ 및 XbaⅠ으로 각각 절단한 후, 1.0% 아가로즈 젤에 전기영동하였다. 이후 젤 상의 DNA를 나일론 멤브레인으로 옮기고, 도 2의 C에 표시된 상기 CmMyb1 유전자(서열번호 2; Probe A)와 이의 5′UTR(서열번호 1의 1-340 bp; Probe B)을 각각 탐침으로 하여 65℃에서 밤새 혼성화시켰다. 0.1% SDS를 함유하는 2×SSC 용액에서 1시간, 0.1% SDS를 함유하는 1×SSC 용액에서 1시간, 0.1% SDS를 함유하는 0.5×SSC 용액에서 30분, 0.1% SDS를 함유하는 0.1×SSC 용액에서 20분 동안 순차적으로 세척하였다. 이후, X-ray 필름에 감광시켜 결과를 분석하였다.

그 결과, 멜론의 게놈 내에 CmMyb1 유전자는 하나의 카피(copy)를 보이는 것으로 나타났다(도 3 참조).

<실시예 3>

CmMyb1 유전자의 과실 발달 및 조직별 발현 양상 분석

CmMyb1 유전자의 과실발달 및 조직별 발현양상을 조사하기 위하여 과실발달별로 0, 9, 18, 27 및 36 DAP의 과실에서, 그리고 조직별로는 수분 직후(0 DAP)의 잎(leaf, L), 웅화(male flower, MF), 자화(female flower, FF), 줄기(stem, S) 및 덩굴손(tendril, T)에서 각각 총 RNA를 추출하였다. 이후, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 1차-스트랜드 cDNA를 합성하였다. 합성된 1차-스트랜드 cDNA를 주형으로 CmMyb1 F 프라이머(서열번호 4)와 CmMyb1 R 프라이머(서열번호 5)를 이용하여 PCR을 수행하였다.

PCR은 94℃에서 3분 동안 전변성(predenaturation)을 시킨 후, 94℃에서 1분; 50℃에서 1분; 72℃에서 1분 30초를 한 사이클로 하여 총 30사이클을 반복 수행하였으며, 최종적으로 72℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이 때 대조군으로는 멜론의 액틴(actin) 유전자를 증폭할 수 있는 CmActin-F 프라이머(서열번호 6)와 CmActin-R 프라이머(서열번호 7)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이후, PCR을 통해 증폭된 밴드가 CmMyb1 유전자인지를 확인하기 위하여, 서열번호 2의 CmMyb1 유전자를 탐침으로 하여 상기 실시예 2와 동일한 방법에 따라 서던블럿을 실시하였다.

그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, CmMyb1 유전자는 과실 발달별로 0 및 9 DAP에서 상대적으로 높게 발현이 되었으며, 조직별로는 잎에서 높은 수준으로 발현되는 것으로 나타났다.

<실시예 4>

CmMyb1 유전자의 식물 세포 내 이동

멜론의 CmMyb1 유전자의 세포 내에서의 이동을 조사하기 위하여 본 발명자들은 GFP 융합 단백질을 다음과 같이 제조하였다.

먼저, CmMyb1 cDNA 클론을 주형으로 하고 서열번호 8 및 서열번호 9의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 HindⅢ와 SalI으로 절단한 후, 326GFP-3G 벡터(Jin et al., Plant Cell, 13: 1511-1526, 2001)에서 GFP의 뒷부분(downstream)에 삽입하였다(GFP:Myb). 한편, CmMyb1 cDNA 클론을 주형으로 하고 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 XbaI과 BamHI으로 절단한 후, pBIN35S-mGFP4 벡터 (Haseloff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2122-2127, 1997)에서 GFP 유전자의 앞부분(upstream)에 삽입하였다(Myb:GFP).

원형질체는 1-2 주령 애기장대 묘목(seedling)으로부터 준비하였다. 이후, 폴리에틸렌 글리콜-매개 형질전환 방법(polyethylene glycol-mediated transformation method)으로 GFP와 융합된 CmMyb1 유전자를 함유하는 재조합 벡터(GFP:Myb 및 Myb:GFP)를 상기 원형질체에 각각 삽입하였다. 또한 핵에서의 발현을 보다 정확히 확인하기 위하여 NLS(nuclear location signal)과 융합된 RFP(red fluorescent protein) 유전자를 포함하는 NLS:RFP 벡터(Lee et al., Plant Cell, 13: 2175-2190, 2001)를 상기 벡터와 함께 각각 공동형질전환하였다. 원형질체에서 GFP와 RFP의 발현은 형광 현미경(Zeiss Axioplan fluorescence microscope, Jena)을 사용하여 이미지를 분석하였다.

그 결과, 도 5의 A 및 B에서 보는 바와 같이, CmMyb1 유전자가 핵으로 이동함을 확인할 수 있었다. 이로부터 CmMyb1이 전사를 조절하는 인자인 것으로 추정되었다. 또한 항-GFP 단일항체(Clontech, Palo Alto, CA)를 이용하여 웨스턴블럿을 수행한 결과, 도 5의 C에서 보는 바와 같이, CmMyb1:GFP의 경우에는 그 발현이 미약하였으나, CmMyb1:GFP 및 GFP:CmMyb1 모두 본 실시예에 사용한 원형질체에서 모두 발현됨을 확인하였다.

<실시예 5>

CmMyb1 유전자의 기능 규명

본 발명자들은 멜론에서 분리한 CmMyb1 유전자의 기능을 알아보기 위하여, 상기 유전자의 안티센스, 센스 그리고 RNAi 단편을 함유하는 재조합 벡터를 제조하여 분석을 수행하였다.

<5-1> 멜론의 형질전환

CmMyb1 유전자의 안티센스, 센스 또는 RNAi 단편을 식물형질전환용 벡터인 pCAMBIA2300 벡터에 삽입하기 위하여(도 6 참조), 먼저 각 단편을 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제작하였다. CmMyb1 유전자의 안티센스 단편(서열번호 12)은 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한, CmMyb1 유전자의 센스 단편은 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. PCR 반응은 상기 실시예 3과 동일한 방법에 따라 수행하였다. 증폭된 각 PCR 산물은 키트(Qia quick PCR purification kit, QIAGEN, #28104)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 pCAMBIA2300 벡터에 각각 삽입하였다.

한편, RNAi 단편을 함유하는 재조합 벡터는 35S 프로모터, GUS 유전자 및 Nos를 포함하는 pCAMBIA2300 벡터를 이용하여 다음과 같이 제조하였다: 먼저, 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머에 의해 증폭된 안티센스 단편을 XbaI과 BamHI으로 절단하여 pCAMBIA2300 벡터 내 GUS 유전자의 앞부분에 삽입하였다. 그와 동시에 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머에 의해 증폭된 센스 단편을 KpnI과 SacI으로 절단하여 상기 벡터 내 GUS 유전자의 뒷부분에 삽입하였다.

각 재조합 벡터를 전기천공법(electrophoration)으로 DH10B 세포에 도입하였다. 세포를 가나마이신(50 ㎎/L)을 함유하고 있는 LB 고체배지에 도말하고, 37℃에서 밤새 배양하여 형질전환체를 선발하였다. 선발된 콜로니들을 대상으로 PCR 분석과 DNA 제한효소 절단분석을 수행하여 유전자 삽입을 확인하였다(결과 미도시). 이후, 각 재조합 벡터를 분리하고, 이를 다시 아그포박테리움 튜메파시엔스 LBA4404에 도입시켰다. 형질전환된 아그포박테리움 튜메파시엔스 LBA4404는 PCR 분석을 통해 형질전환여부를 확인하였다.

멜론의 형질전환은 다음과 같이 수행하였다. 먼저 멜론의 종자를 발아용 배지(GM; MS 4.4 g/L, Sucorse 20 g/L, Agar 8g/L)에 2일간 발아시킨 후, 자엽에서(cotyledone)에서 외식편(explant)을 제작하였다. 상기 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4401을 멜론의 외식편과 공동배양하였다. 이후, 상기 외식편을 전배양 배지(MPM; LS 4.4g/L, Sucrose 20g/L, BA 5uM, Agar 8g/L)에 2일간 배양한 후, 선별배지(MSM; LS 4.4g/L, Sucrose 20g/L, BA 5uM, Km 50mg/L, Cf 250mg/LAgar 8g/L)에서 신초(shoot)를 유도하였다. 3-6주 후, 유도된 신초를 뿌리 유도용배지(MRM; MS 2.2g/L, Sucorse 20g/L, Agar 6g/L)에 옮겨 배양하였다. 그 결과, CmMyb1의 센스, 안티센스 및 RNAi 단편이 삽입된 신초에서 뿌리가 모두 유도되었음을 확인할 수 있었다(도 7 참조). 뿌리가 유도된 유식물체를 기내에서 순화시켰다.

<5-2> 형질전환 여부의 확인

상기 실시예 <5-1>에서 제조된 각 형질전환 멜론의 유식물체의 잎으로부터 키트(DNeasy Plant Mini kit, QIAGEN, #69104)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 분리된 DNA를 주형으로 서열번호 17의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 PCR을 수행하여 CmMyb1 유전자의 삽입여부를 조사하였다. 그 결과, 도 8에서 보는 바와 같이, 모든 형질전환 멜론에서 CmMyb1 유전자가 삽입되었음을 확인할 수 있었다.

<5-3> 형질전환 멜론에서의 이차대사산물 축적 확인

상기 실시예 <5-1>에서 제조된 각 형질전환 멜론의 과실에서 총 RNA를 추출한다. 이후, 상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 1차-스트랜드 cDNA를 합성한다. RT-PCR 및 노던블럿을 통해서 CmMyb1의 발현유무를 확인하고, 종래 알려진 안토시아닌 생합성경로에 관여하는 효소들[예; chalcone synthease (CHS), dihydroflavonol 4-hydroxylase(DFR), leucoanthocyanidin dioxygenase (LDOX)]의 발현양상을 분석한다. 이를 통해 안토시아닌 생합성 경로에서 CmMyb1 단백질이 어느 부분을 조절하는지를 확인할 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 멜론으로부터 안토시아닌 생합성에 관계하는 CmMyb1 유전자를 분리하였다. 본 발명의 유전자를 도입한 형질전환 식물체는 안토시아닌이 축적됨으로써 항산화활성, 노화억제활성, 콜레스테롤 저하활성 등 다양한 생리활성이 우수할 뿐 아니라 변형된 과색을 나타내므로 상품적 가치가 매우 높다. 따라서, 본 발명의 CmMyb1 유전자은 고품질의 식물 품종을 육성하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

<110> FnP corp., Ltd <120> Anthocyanin biosynthesis-related gene isolated from melon <130> NP04-0115 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1237 <212> DNA <213> Cucumis melo <400> 1 aattcggcac gagctccaca aaaacaataa ccaattttct tttcttttcc ttttcctttt 60 tatattgaaa aatcttcgat ttccggaatt tttcttgttt aatatctttc tgagaaattc 120 ccatattgtt atatgtaagg atcaatccag ttctttggtt aattttgact tctctgcaat 180 ttgtctctgt ttttcttcct gtttctattc ttgcgatctg tgtagttttc gacctagttt 240 gtgttgaatt cttcaaattc actgcatttc ctcaactggg tttccgattt tcttcaactt 300 ctatgtgttt tattttttaa ttgtttttga aattgggctg atgaaacgag gaattgggat 360 tctgtctccg gcaacctacc tacgaaattc cggctgctcc aaatggacgc cggaggaaaa 420 caagcggttc gaaaatgctt tggctttgtt tgatagagat acgccggacc ggtgggtgaa 480 agtcgccgcc atgattcccg gaaaaaccgt angcgatgtg gtgaaacagt acagagagtt 540 agtggaggac gtgagtgata ttgaagcagg gcttgttccg gttccggggt atggcgttgg 600 gaattctttt gtgttggagt ggtcgaatga tggcggcgag tttgcgccga tgtatatcgg 660 cgccgggaag agaggcggtt ccgttcgggc ttccgatcag gaaaggaaaa agggagtgcc 720 ttggactgag gaagaacaca gacaattctt gatggggttg aagaagtatg gtaaagggga 780 ttggcgaaac atctctcgta gctttgtcat gacaaggact ccaacacaag tggctagtca 840 cgctcaaaaa tacttcatta gacaactcac aggaggaaaa gacaaaagaa gatcaagcat 900 ccacgatatc accactaccc atcttttcga taacccaatt caacccaacc atgataaaat 960 ctccccacct tcttacgtcg aagttacaat ggctccgctt tgtgggatct cttcacttcg 1020 acccaaacta ctgcaagacc aaatatttct tagaagcaat aactttcatg gctgccaaaa 1080 tgttagtcct tacagcccca atgcttttca agtgcaaagg gagcaacaat atcagtgagc 1140 tttactatat ggttagaatt tggtaaataa atgagtgtga agttggaatg tgaatgtgtg 1200 gattaatgaa ttaattgaac ctcaaaaaaa aaaaaaa 1237 <210> 2 <211> 795 <212> DNA <213> Cucumis melo <400> 2 atgaaacgag gaattgggat tctgtctccg gcaacctacc tacgaaattc cggctgctcc 60 aaatggacgc cggaggaaaa caagcggttc gaaaatgctt tggctttgtt tgatagagat 120 acgccggacc ggtgggtgaa agtcgccgcc atgattcccg gaaaaaccgt angcgatgtg 180 gtgaaacagt acagagagtt agtggaggac gtgagtgata ttgaagcagg gcttgttccg 240 gttccggggt atggcgttgg gaattctttt gtgttggagt ggtcgaatga tggcggcgag 300 tttgcgccga tgtatatcgg cgccgggaag agaggcggtt ccgttcgggc ttccgatcag 360 gaaaggaaaa agggagtgcc ttggactgag gaagaacaca gacaattctt gatggggttg 420 aagaagtatg gtaaagggga ttggcgaaac atctctcgta gctttgtcat gacaaggact 480 ccaacacaag tggctagtca cgctcaaaaa tacttcatta gacaactcac aggaggaaaa 540 gacaaaagaa gatcaagcat ccacgatatc accactaccc atcttttcga taacccaatt 600 caacccaacc atgataaaat ctccccacct tcttacgtcg aagttacaat ggctccgctt 660 tgtgggatct cttcacttcg acccaaacta ctgcaagacc aaatatttct tagaagcaat 720 aactttcatg gctgccaaaa tgttagtcct tacagcccca atgcttttca agtgcaaagg 780 gagcaacaat atcag 795 <210> 3 <211> 265 <212> PRT <213> Cucumis melo <400> 3 Met Lys Arg Gly Ile Gly Ile Leu Ser Pro Ala Thr Tyr Leu Arg Asn 1 5 10 15 Ser Gly Cys Ser Lys Trp Thr Pro Glu Glu Asn Lys Arg Phe Glu Asn 20 25 30 Ala Leu Ala Leu Phe Asp Arg Asp Thr Pro Asp Arg Trp Val Lys Val 35 40 45 Ala Ala Met Ile Pro Gly Lys Thr Val Xaa Asp Val Val Lys Gln Tyr 50 55 60 Arg Glu Leu Val Glu Asp Val Ser Asp Ile Glu Ala Gly Leu Val Pro 65 70 75 80 Val Pro Gly Tyr Gly Val Gly Asn Ser Phe Val Leu Glu Trp Ser Asn 85 90 95 Asp Gly Gly Glu Phe Ala Pro Met Tyr Ile Gly Ala Gly Lys Arg Gly 100 105 110 Gly Ser Val Arg Ala Ser Asp Gln Glu Arg Lys Lys Gly Val Pro Trp 115 120 125 Thr Glu Glu Glu His Arg Gln Phe Leu Met Gly Leu Lys Lys Tyr Gly 130 135 140 Lys Gly Asp Trp Arg Asn Ile Ser Arg Ser Phe Val Met Thr Arg Thr 145 150 155 160 Pro Thr Gln Val Ala Ser His Ala Gln Lys Tyr Phe Ile Arg Gln Leu 165 170 175 Thr Gly Gly Lys Asp Lys Arg Arg Ser Ser Ile His Asp Ile Thr Thr 180 185 190 Thr His Leu Phe Asp Asn Pro Ile Gln Pro Asn His Asp Lys Ile Ser 195 200 205 Pro Pro Ser Tyr Val Glu Val Thr Met Ala Pro Leu Cys Gly Ile Ser 210 215 220 Ser Leu Arg Pro Lys Leu Leu Gln Asp Gln Ile Phe Leu Arg Ser Asn 225 230 235 240 Asn Phe His Gly Cys Gln Asn Val Ser Pro Tyr Ser Pro Asn Ala Phe 245 250 255 Gln Val Gln Arg Glu Gln Gln Tyr Gln 260 265 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmMyb1 F primer <400> 4 tgaaattggg ctgatgaaac ga 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmMyb1 R primer <400> 5 tcacattcca acttcacact ca 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmActin F primer <400> 6 gctgtgttcc ccagtattgt tg 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmActin R primer <400> 7 actggcatag agagatagaa cg 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmMyb1HindIII F primer <400> 8 tgaaagcttg ctgatgaaac ga 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmMyb1SalI R primer <400> 9 accatatagt cgacctcact ga 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmMyb1XbaI F primer <400> 10 tgatctagag ctgatgaaac ga 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmMyb1BamHI R primer <400> 11 agcggatcca tattgttgct cc 22 <210> 12 <211> 798 <212> DNA <213> Cucumis melo <400> 12 tcactgatat tgttgctccc tttgcacttg aaaagcattg gggctgtaag gactaacatt 60 ttggcagcca tgaaagttat tgcttctaag aaatatttgg tcttgcagta gtttgggtcg 120 aagtgaagag atcccacaaa gcggagccat tgtaacttcg acgtaagaag gtggggagat 180 tttatcatgg ttgggttgaa ttgggttatc gaaaagatgg gtagtggtga tatcgtggat 240 gcttgatctt cttttgtctt ttcctcctgt gagttgtcta atgaagtatt tttgagcgtg 300 actagccact tgtgttggag tccttgtcat gacaaagcta cgagagatgt ttcgccaatc 360 ccctttacca tacttcttca accccatcaa gaattgtctg tgttcttcct cagtccaagg 420 cactcccttt ttcctttcct gatcggaagc ccgaacggaa ccgcctctct tcccggcgcc 480 gatatacatc ggcgcaaact cgccgccatc attcgaccac tccaacacaa aagaattccc 540 aacgccatac cccggaaccg gaacaagccc tgcttcaata tcactcacgt cctccactaa 600 ctctctgtac tgtttcacca catcgcntac ggtttttccg ggaatcatgg cggcgacttt 660 cacccaccgg tccggcgtat ctctatcaaa caaagccaaa gcattttcga accgcttgtt 720 ttcctccggc gtccatttgg agcagccgga atttcgtagg taggttgccg gagacagaat 780 cccaattcct cgtttcat 798 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmMyb1(AS)BamHI F primer <400> 13 tgaggatccg ctgatgaaac ga 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmMyb1(AS)XbaI R primer <400> 14 agcttctaga tattgttgct cc 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmMyb(S)KpnI F primer <400> 15 tgggtaccgg ctgatgaaac ga 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmMyb1(S)SacI R primer <400> 16 accatataga gctcctcact ga 22 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmMyb1SacI R2 primer <400> 17 ccacgagctc tggagtcctt g 21

Claims

서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
제1항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
제2항에 있어서, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산.
제2항의 핵산을 함유하는 재조합 벡터.
제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아.
제2항의 핵산을 증폭하기 위한 프라이머.
제4항에 있어서, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 프라이머.
제2항의 핵산을 식물체 내로 도입하는 것을 포함하는 안토시아닌이 축적된 형질전환 식물체의 제조방법.
서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 이를 암호화하는 핵산, 이들의 절편 또는 유도체를 탐침으로 하여 식물의 안토시아닌 생합성 관련 물질을 탐색하는 방법.
제9항에 있어서, DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응(PCR), 노던 블럿, 서던 블럿, 웨스턴 블럿, 효소 면역 반응(ELISA), 2-D 겔 분석, 효모 이중 혼성화 반응(yeast two hybrid system) 및 시험관 내 결합 어세이(in vitro binding assay)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.