KR101931582B1 - 안토시아닌 생합성을 증진시키는 벼 유래 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 안토시아닌 생합성을 증진시키는 벼(Oryza sativa) 유래의 OsBBX14(Oryza sativa zinc finger protein 14 containing B-box domain) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 유래의 OsBBX14 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsBBX14 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물의 안토시아닌 생합성을 증진시키는 방법, 벼 유래의 OsBBX14 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsBBX14 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 안토시아닌 생합성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 벼 유래의 OsBBX14 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 안토시아닌 생합성 증진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 벼 유래의 OsBBX14 유전자가 형질전환된 식물체는 야생형 식물체에 비해 안토시아닌 생합성이 증진되므로, 이를 이용하면 기능성 물질인 안토시아닌 생합성을 증대시킨 고부가가치 작물 개발에 유용하게 활용할 수 있으며, 천연색소인 안토시아닌을 이용하는 건강 기능성 식품 산업, 화장품 산업, 의약품 산업 및 염료 산업 발전에 크게 기여할 수 있다.

Description

안토시아닌 생합성을 증진시키는 벼 유래 유전자 및 이의 용도{Gene enhancing anthocyanin biosynthesis derived from Oryza sativa and uses thereof}

본 발명은 안토시아닌 생합성을 증진시키는 벼(Oryza sativa) 유래의 OsBBX14(Oryza sativa zinc finger protein 14 containing B-box domain) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 유래의 OsBBX14 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsBBX14 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물의 안토시아닌 생합성을 증진시키는 방법, 벼 유래의 OsBBX14 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsBBX14 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 안토시아닌 생합성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 벼 유래의 OsBBX14 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 안토시아닌 생합성 증진용 조성물에 관한 것이다.

안토시아닌(anthocyanin)은 플라보노이드(Flavonoid) 계열에 속하는 2차 대사산물로 다양한 형태로 여러 식물에 분포되어 있다. 안토시아닌 계열 물질은 식물에서 다양한 색소를 생성하는 물질로 주황색에서 붉은색의 색소물질을 생성하는 펠라고니딘(pelargonidin), 분홍색에서 붉은색의 색소물질을 생성하는 시아니딘(cyanidin), 파란색의 색소물질을 생성하는 델피니딘(delphinidin)이 존재한다. 안토시아닌 물질은 과실이나 꽃 등에 축적되며 활성산소를 제거하는 강력한 항산화효과로 인해(Kaarina et al., 2005) 안토시아닌 물질의 생성 기작에 주목하고 있다(Viljanen K. et.al., J. Agric. Food Chem., 53(6):2022-2027, 2005).

식물의 잎, 꽃, 과실 등에 존재하는 안토시아닌은 식물의 생장과 발육, 비생물학적 스트레스에 대한 방어 효과가 있으며, 항균, 항바이러스, 항알레르기, 항염증과 같은 약리 활성 효과, 강력한 항산화 활성 등으로 그 중요성과 활용성이 강조되고 있다(Wim Van den Ende & Sara K. El-Esawe, Environmental and Experimental Botany, 108:4-13, 2014; Pojer E. et.al., Compr. Rev. Food. Sci. Food Saf., 12(5):483-508, 2013; Viljanen K. et.al., J. Agric . Food Chem ., 53(6):2022-2027, 2005).

2007년도 3월 식품기술의 보고에 의하면 국내의 색소의 시장규모가 약 200억원에 달하고 있으며 이 가운데에 합성색소는 20억원, 천연색소는 180억원 대로 추정되고 있다. 일본의 천연색소 시장의 경우 1992년에 270억엔 대의 시장이 형성되었으며, 2002년도에는 대략 500-600억엔의 시장규모인 것으로 보도되고 있으며 앞으로도 계속 커질 전망이다. 색소는 천연 또는 합성색소가 있으며 식품, 화장품 및 의류염색용 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. 합성색소는 착색률이 높고 안정하며 가격이 저렴하여 천연색소를 대신하여 광범위하게 사용되어 왔으나 발암성과 인체에 독성을 갖는 등 안전성 문제가 제기됨에 따라 그 사용이 엄격히 규제되고 있다. 최근 소비자들의 색소의 안전성에 대한 인식이 새로워지고 건강식품, 위생적 식품에 대한 선호 경향이 합성 식용색소를 대체할 천연색소의 수요를 급격히 증가시키게 되었다. 또한 많은 천연색소는 살균, 항염 등 생리활성이 있으며 안전하여 화장품 및 기능성 식품으로 큰 잠재적 수요가 있다. 따라서 천연색소 시장이 크게 신장될 것으로 예상되고 있으나 기술 집약적인 산물이므로 현재도 선진국에서만 독점 생산되고 있다.

천연색소에 관한 연구는 유럽 및 일본 등지에서 안토시아닌(anthocyanin), 사코닌(shikonin), 카르타민(carthamin), 베타시아닌(betacyanin) 등에 대하여 이루어져 왔다. 현재까지 천연색소는 재배농법, 미생물배양, 식물세포 배양법 등에 의하여 생산될 수 있었다. 재배농법의 경우, 재배품종, 시비량, 멀칭 컬러, 촉성재배, 차광, 재배 환경, 전통농법 또는 유기농법 등에 따라서 생산되는 안토시아닌 함량이 차이가 나는 것으로 밝혀졌으나 그 효과는 미비한 것으로 드러났다 (Mikko J. et.al., J. Agric . Food Chem ., 54:2614-2620, 2006).

안토시아닌은 식물체에 존재하는 수용성 색소 배당체(glucoside)로서, 세포액의 산성농도, 색소화합물의 화학적 구조, 여러 금속이온들과의 결합상태에 의해 자색, 적색, 청색 등의 색상을 나타내는 식물성 천연 색소이다. 최근 안토시아닌의 다양한 생리활성작용이 보고되고 있다. 예컨대, 노화억제작용, 항균작용, 돌연변이 억제작용, 콜레스테롤 저하작용, 시력개선효과, 혈관보호기능, 항 궤양기능, 항산화 기능 등이 규명되었다. 특히 항산화 활성 면에서 천연 항산화제인 토코페롤보다 5-7배의 강한 항산화 활성을 나타내는 것으로 알려졌다. 안토시아닌은 독성이 낮다. 따라서, 현재 안토시아닌은 청량음료, 잼, 시력보호용 음료수, 사탕 등의 가공식품 생산과 향장공업, 염료공업, 의약품 개발 등에 활용되고 있다. 최근에는 발암성 및 간 독성이 우려되는 합성 착색료를 대신할 수 있는 안전한 천연 착색료로 주목을 받아 식품 영양학적인 면과 더불어 시각적 신선감 및 즐거움을 줄 수 있는 유용성분으로 평가되고 있다. 이러한 안토시아닌은 다양한 식물 종에 폭넓게 존재하며, 흔히 식물체의 꽃, 과실, 줄기, 잎, 뿌리 등에 함유되어 있다. 포도, 딸기, 올리브, 적양배추, 가지, 장미 등의 식물체로부터 안토시아닌을 추출하여 여러 가지 원료로 사용되고 있다.

한편, 식물에서의 안토시아닌 생합성은 식물 자체가 가지고 있는 유전적 요인과 이것이 잘 발현되도록 하는 환경요인의 상호작용에 의해 조절된다(Timothy A. Holton. et.al., The Plant Cell, 7:1071-1083, 1995). 즉 안토시아닌 생합성 관련 유전자들은 광도, 광질, 일장, 온도, 수분, 화학물질, 기타 요인들에 의해 자극을 받아 발현되는데(Alberto L. Mancinelli, Plant Physiol ., 92(4):1191-1195, 1990; Christie, P.J. et.al., Planta, 194:541-549, 1994), 일단 조절 유전자가 발현이 되면 생합성 과정에 관련된 여러 가지 효소가 생성되어 이들의 작용에 의해 안토시아닌이 만들어진다. 일반적으로 안토시아닌 생합성을 조절하는 유전자로는 R2R3 MYB 타입 유전자와 bHLH 타입 유전자가 밝혀져 있다. 이들 유전자들은 식물체의 다양한 조직, 꽃, 잎, 과실 등에서 단독 또는 서로 중합체를 형성하여 유전자의 발현을 조절하고 있는 것으로 알려져 있다. 안토시아닌 생합성의 전사 조절자인 Myb 전사인자(transcription factor)를 암호화하는 Myb 유전자는 단일 또는 복수의 불완전한 반복으로 구성되는 구조적으로 보존된 DNA 결합 도메인이 특징인 전사인자 클래스를 가지며, R2R3 전사인자는 두 개의 반복 클래스의 DNA 결합 도메인을 지니고 있다. 옥수수(Zea mays), 페투니아(Petunia hybrida), 토마토 등에서 Myb 유전자가 안토시아닌 생합성에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 상기 Myb 유전자는 안토시아닌 생합성 이외에도 페닐프로파노이드 대사(phenyl propanoid metabolism), 발달(development), 신호 전달(signal transduction), 식물 병 저항성(plant disease resistant), 세포 분열(cell division) 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히, 최근에 토마토에서 Myb 유전자 군의 하나인 ANT1 유전자가 분리되었으며, 상기 ANT1 유전자를 과발현시킨 형질전환 토마토에서 자주빛을 띠는 안토시아닌이 축적됨이 보고되었다(Helena Mathew et al., The Plant Cell, 15:1689-1703, 2003). 또한 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서도 Myb 전사인자를 암호화하는 유전자들이 분리된 바 있다(미국등록특허 제6,573,432호).

전사인자(transcriptiona factors, TFs)는 대사 경로의 억제물질 또는 활성제로서의 활성을 갖는 조절 단백질이다. 따라서 TFs는 식물 내에서 전체적인 대사 경로의 조작을 위한 강력한 도구로써 사용될 수 있다. 많은 MYB TFs는 상기 안토시아닌 및 축합형 탄닌 생합성 둘 다를 포함하는 페닐프로파노이드 경로에서의 중요한 조절제이며(Davies., K.M. et.al., Euphytica, 131:259-268, 2003; Debaujon et. al., Plant cell, 15(11):2514-2531, 2003), MYB TFs로서 포도(Vitis vinifera) 유래의 VvMYBPA1와 유채(Brassica napus) 유래의 BnTT2가 최근에 보고된 바 있다(Wei YL. et. al., Mol . Biol . Rep., 34(2):105-120, 2007; Bogs J. et. al., Plant Physiol ., 143(3):1347-1361, 2007).

한편, 한국등록특허 제10-0990842호에는 안토시아닌 대량생산 시스템이 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-1018079호에는 안토시아닌 생합성 촉진 기능을 가지는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 이들의 용도가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2006-0037150호에는 멜론에서 분리된 안토시아닌 생합성 관련 유전자가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 벼 유래의 전사인자 OsBXX14 유전자를 이용하여 안토시아닌 함량을 증가시킨 형질전환 식물체 및 이의 제조방법에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 식물체의 유용 대사물질인 안토시아닌 생산을 위해 활용할 수 있는 식물체를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 식물체 내의 안토시아닌 생합성을 증진시키기 위한 유전자로서, 안토시아닌 증진 신규 전사 유전자인, 벼 유래 OsBBX14 유전자를 발굴하였으며, 이를 형질전환시킨 식물체의 조직에서 안토시아닌의 생합성이 증진되고, 이와 더불어 상기 OsBBX14 유전자가 광형태형성(photomorphogenesis)에 관여하는 양성조절자(positive regulator)로 작용함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

미국등록특허 제6,573,432호 한국등록특허 제10-0990842호 한국등록특허 제10-1018079호 한국공개특허 제2006-0037150호

Viljanen K. et.al., J. Agric. Food Chem., 53(6):2022-2027, 2005 Wim Van den Ende & Sara K. El-Esawe, Environmental and Experimental Botany, 108:4-13, 2014 Pojer E. et.al., Compr. Rev. Food. Sci. Food Saf., 12(5):483-508, 2013 Mikko J. et.al., J. Agric. Food Chem., 54:2614-2620, 2006 Timothy A. Holton. et.al., The Plant Cell, 7:1071-1083, 1995 Alberto L. Mancinelli, Plant Physiol., 92(4):1191-1195, 1990 Christie, P.J. et.al., Planta, 194:541-549, 1994 Helena Mathew et al., The Plant Cell, 15:1689-1703, 2003 Davies., K.M. et.al., Euphytica, 131:259-268, 2003 Debaujon et. al., Plant cell, 15(11):2514-2531, 2003 Wei YL. et. al., Mol. Biol. Rep., 34(2):105-120, 2007 Bogs J. et. al., Plant Physiol., 143(3):1347-1361, 2007

본 발명의 목적은 안토시아닌 생합성이 증진된 작물을 개발하기 위하여, 벼(Oryza sativa) 유래의 OsBBX14(Oryza sativa zinc finger protein 14 containing B-box domain) 유전자를 포함하는, 야생형에 비해 식물의 안토시아닌 생합성을 증진시키는 재조합 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsBBX14 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물의 안토시아닌 생합성을 증진시키는 방법, 상기 유전자를 이용하여 안토시아닌 생합성이 향상된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 안토시아닌 생합성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 안토시아닌 생합성이 증진된 형질전환 식물체로부터 안토시아닌을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 벼 유래의 OsBBX14 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 안토시아닌 생합성 증진용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 벼(Oryza sativa) 유래의 OsBBX14(Oryza sativa zinc finger protein 14 containing B-box domain) 유전자를 포함하는, 야생형에 비해 식물의 안토시아닌 생합성을 증진시키는 재조합 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsBBX14 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물의 안토시아닌 생합성을 증진시키는 방법, 상기 유전자를 이용하여 안토시아닌 생합성이 향상된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 안토시아닌 생합성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 안토시아닌 생합성이 증진된 형질전환 식물체로부터 안토시아닌을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 벼 유래의 OsBBX14 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 안토시아닌 생합성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 벼 유래의 OsBBX14 유전자가 형질전환된 식물체는 야생형 식물체에 비해 안토시아닌 생합성이 증진되므로, 이를 이용하면 기능성 물질인 안토시아닌 생합성을 증대시킨 고부가가치 작물 개발에 유용하게 활용할 수 있으며, 천연색소인 안토시아닌을 이용하는 건강 기능성 식품 산업, 화장품 산업, 의약품 산업 및 염료 산업 발전에 크게 기여할 수 있다.

도 1은 종자 전사체 분석을 통한, 본 발명의 징크 핑거(zinc finger) 단백질 선발 및 발현 분석 결과를 나타낸 도로, (A) 종자 전사체 분석 결과 및 (B) 본 발명의 선발된 징크 핑거 단백질의 종자 발달 단계별 발현 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, HN은 흑남을, HJJ는 흑진주를, JJJ는 적진주를, HoJJ는 홍진주이다. IM5, IM10, IM15, IM20 및 IM30은 각각 수분 후 5일경, 10일경, 15일경, 20일경 및 30일경의 일미 품종이며, HJJ5, HJJ10, HJJ15, HJJ20 및 HJJ30은 각각 수분 후 5일경, 10일경, 15일경, 20일경 및 30일경의 흑진주 품종이며, JJJ5, JJJ10, JJJ15, JJJ20 및 JJJ30은 각각 수분 후 5일경, 10일경, 15일경, 20일경 및 30일경의 적진주 품종이다.
도 2는 안토시아닌 증진 신규 전사 유전자로 선발된, 본 발명의 징크 핑거(zinc finger, ZF) 유전자의 구조 및 아미노산 서열을 나타낸 도로, (A) 징크 핑거 유전자의 구조, (B) 선발된 징크 핑거 단백질 OsBBX14의 정보, 및 (C) 안토시아닌 증진 신규 전사 유전자로 선발된 징크 핑거 단백질인 OsBBX14의 아미노산 서열을 나타낸 도이다. 여기에서, UTR은 미번역 지역(untranslated region)이며, ORF는 번역개시위치(open reading frame)이다.
도 3은 안토시아닌 증진 신규 전사 인자로 선발된, 본 발명의 벼 유래 징크 핑거(zinc finger) 단백질 OsBBX14의 아미노산 서열 및 유전적 계통도를 나타낸 도로, (A) 애기장대(arabidopsis), 콩(soybean), 보리(barley), 사과(apple), 토마토(tomato), 옥수수(maize)의 징크 핑거(zinc finger) 단백질 간의 다중 정렬(multiple alignment) 결과 및, (B) 애기장대와 벼의 징크 핑거 단백질과의 유전적 계통도를 분석하여 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 벼 유래 OsBBX14 유전자 과발현 운반체(vector) 및 애기장대 형질전환체를 나타낸 도로, (A) OsBBX14 유전자 과발현 운반체 및, (B) OsBBX14 유전자 과발현 애기장대 형질전환체(T₁)를 나타낸 도이다. 여기에서, LB는 T-DNA left border 이며, Bar는 제초제 저항성 유전자(BARSTA herbicide resistance gene) 이며, 35S-P는 Cauliflower Mosaic Virus(CaMV) 35S promotor 이며, OsBBX14는 Oryza sativa BBX14(Oryza sativa zinc finger protein 14 containing B-box domain) 이며, 35S-T는 cauliflower mosaic virus(CaMV) 35S terminator 이며, RB는 T-DNA right border 이다. NT는 OsBBX14 유전자 과발현 운반체를 형질전환시키지 않은 애기장대(대조구)이며, OsBBX14-8, OxBBX14-10 및 OsBBX14-15는 OsBBX14 유전자 과발현 운반체를 형질전환시킨 애기장대이다.
도 5는 본 발명의 벼 유래 OsBBX14 유전자 과발현 애기장대 형질전환체의 안토시아닌 함량 분석 결과를 나타낸 도로, (A) OsBBX14 유전자 과발현 애기장대 형질전환체(T₃)의 표현형 및, (B) OsBBX14 유전자 과발현 애기장대 형질전환체의 안토시아닌 함량을 나타낸 그래프이다. 여기에서, NT는 OsBBX14 유전자 과발현 운반체를 형질전환시키지 않은 애기장대(대조구)이며, OsBBX14-8, OxBBX14-10 및 OsBBX14-15는 OsBBX14 유전자 과발현 운반체를 형질전환시킨 T₃ 세대의 애기장대이다.
도 6은 본 발명의 벼 유래 OsBBX14 유전자 과발현 애기장대 형질전환체의 하배축 길이 분석 결과를 나타낸 도로, (A) OsBBX14 유전자 과발현 애기장대 형질전환체(T₃)의 표현형 및, (B) OsBBX14 유전자 과발현 애기장대 형질전환체의 하배축 길이 나타낸 그래프이다. 여기에서, NT는 OsBBX14 유전자 과발현 운반체를 형질전환시키지 않은 애기장대(대조구)이며, OsBBX14-8, OxBBX14-10 및 OsBBX14-15는 OsBBX14 유전자 과발현 운반체를 형질전환시킨 T₃ 세대의 애기장대이다.

본 발명은 안토시아닌 생합성을 증진시키는 벼(Oryza sativa) 유래의 OsBBX14(Oryza sativa zinc finger protein 14 containing B-box domain) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 벼 유래의 OsBBX14 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsBBX14 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물의 안토시아닌 생합성을 증진시키는 방법, 벼 유래의 OsBBX14 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsBBX14 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 안토시아닌 생합성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 벼 유래의 OsBBX14 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 안토시아닌 생합성 증진용 조성물에 관한 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 식물의 안토시아닌 생합성을 증진시키는, 서열번호 1로 표시되는 유전자를 포함하는 형질전환용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어 "안토시아닌(anthocyanin)"이란 식물체에 존재하는 수용성 색소 배당체(glucoside)로서, 세포액의 산성농도, 색소화합물의 화학적 구조, 여러 금속이온들과의 결합상태에 의해 자색, 적색, 청색 등의 색상을 나타내는 식물성 천연 색소이다. 최근 안토시아닌의 다양한 생리활성작용, 예컨대, 노화억제작용, 항균작용, 돌연변이 억제작용, 콜레스테롤 저하작용, 시력개선효과, 혈관보호기능, 항 궤양기능, 항산화 기능 등이 보고되고 있다.

본 발명에서 서열번호 1로 표시되는 유전자인 "OsBBX14(Oryza sativa zinc finger protein 14 containing B-box domain)"는 벼(Oryza sativa) 유래 유전자로, 염색체 5번(chromosome 5)에 위치한 현재까지 안토시아닌 생합성과 관련된 기능을 지니고 있음에 대해서는 전혀 알려지지 않은 전사인자(transcriptiona factors, TFs)이다. 상기 OsBBX14는 징크 핑거(zinc finger) 전사인자 군에 속하는 BBX(zinc finger protein containing B-box domain) 그룹에 속하며, 아연 이온의 결합에 의하여 안정화되는 4차 구조를 지니는 B-box 도메인(domain)을 지니고 있다.

본 발명에서 용어 "전사인자(transcriptiona factors, TFs)"는 대사 경로의 억제물질 또는 활성제로서의 활성을 갖는 조절 단백질로, TFs는 식물 내에서 전체적인 대사 경로의 조작을 위한 강력한 도구로써 사용될 수 있다. 안토시아닌 생합성과 관련된 전사인자로는 Myb 타입 전사인자가 알려져 있으며, MYB TFs로서 포도(Vitis vinifera) 유래의 VvMYBPA1와 유채(Brassica napus) 유래의 BnTT2가 최근에 보고된 바 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 안토시아닌 생합성과 관련된 전사인자로 선발된 벼 유래 OsBBX14 유전자는 기존에 안토시아닌 증진 효과를 지님에 대해서는 전혀 알려져 있지 않은 OsBBX14로 명명된 유전자와 동일한 서열(서열번호 1)을 지님을 확인하였으며, 상기 유전자의 ORF(open reading frame)의 길이는 1,137bp이고, 378개의 아미노산을 암호화하는 단백질이며, 기존에 보고된 GenBank Number, AK106865의 뉴클레오타이드 서열과 OsBBX14 단백질의 아미노산 서열(서열번호 2)이 100% 일치함을 확인하였다(도 2). 또한, OsBBX14 유전자의 과발현을 통해서 애기장대 형질전환체에서 안토시아닌 생합성이 증진됨을 확인하였으며(도 4 및 도 5), OsBBX14 과발현 애기장대 형질전환체가 대조군인 야생형 애기장대에 비해 하배축(hypocotyl) 길이가 줄어듦을 확인할 수 있었다(도 6).

따라서, 본 발명의 OsBBX14(Oryza sativa zinc finger protein 14 containing B-box domain) 유전자는 안토시아닌 생성에 관여하는 양성조절자(positive regulator)일 뿐 아니라, 빛에 의해서 광형태형성(photomorphogenesis)에 관여하는 양성조절자임을 알 수 있었다.

본 발명에서 용어 "야생형"이란 본 발명의 벼 유래 OsBBX14 유전자를 포함하는 형질전환 식물체에 대한 대조군을 의미한다. 구체적으로 상기 식물체는 애기장대 또는 벼일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 용어 "식물체"란 식물이 지닌 유형의 몸으로, 식물의 전체, 식물의 일부, 종자 또는 식물 세포를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 야생형 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 야생형 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 OsBBX14 유전자 서열은 재조합 벡터 내로 삽입될 수 있다. 본 발명의 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 재조합 벡터는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 벡터, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

OsBBX14 유전자 각각의 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터 또는 Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 용어 "프로모터"란 구조 유전자로부터의 DNA 상부의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이며, 본 발명에서는 항시성 프로모터의 사용이 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacteriumtumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 유전자 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), G418, 블레오마이신(Bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 OsBBX14(Oryza sativa zinc finger protein 14 containing B-box domain) 유전자를 포함한 재조합 벡터로 형질전환된 안토시아닌 생합성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

상기 식물체는 OsBBX14 유전자 발현에 의해 안토시아닌 함량이 식물체 전체에서 증가한 것이 바람직하며, 꽃 조직 및 종자에서 증가한 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 용어 "형질전환(transformation)"이란 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 상기 서열번호 1로 표시되는 벼(Oryza sativa) 유래의 OsBBX14(Oryza sativa zinc finger protein 14 containing B-box domain) 유전자 도입에 의해 형질전환된 식물의 안토시아닌 생합성이 증진된 것을 의미한다.

본 발명에서 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세사출법 (microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법 (microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 또는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법 등을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "형질전환체"란 본 발명의 안토시아닌 생합성을 증진시키는 벼 유래의 OsBBX14(Oryza sativa zinc finger protein 14 containing B-box domain) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 의미한다.

상기 형질전환체는 미생물이 바람직하며, 이에 제한되지는 않으나, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 벼 유래의 OsBBX14(Oryza sativa zinc finger protein 14 containing B-box domain) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsBBX14 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 안토시아닌 생합성을 증진시키는 방법을 제공한다.

상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같다.

본 발명의 일실시예에 따른 방법에서, 상기 OsBBX14 유전자는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 벼 유래의 OsBBX14 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsBBX14 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 안토시아닌 생합성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같으며, 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

본 발명의 일실시예에 따른 방법에서, 상기 OsBBX14 유전자는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 안토시아닌 생합성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있다. 바람직하게는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 또는 벼(Oryza sativa) 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 OsBBX14(Oryza sativa zinc finger protein 14 containing B-box domain) 유전자가 과발현된 형질전환 식물체로부터 안토시아닌을 추출하는 단계를 포함하는 식물체로부터 안토시아닌을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 형질전환 애기장대 식물체로부터 안토시아닌을 추출하기 위해, 물 또는 유기용매, 또는 이들의 혼합용매를 이용할 수 있다. 상기 유기용매는 통상 사용할 수 있는 모든 용매가 가능하며, 추출 방법 또한 당업계에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 벼 유래의 OsBBX14 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 안토시아닌 생합성 증진용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 OsBBX14 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환함으로써 식물체의 안토시아닌 생합성을 증진시킬 수 있는 것이다. 즉, OsBBX14 유전자를 식물에 형질전환함으로써 식물체의 안토시아닌 함량을 증가시킬 수 있는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 종자 전사체 분석을 통한 안토시아닌 생합성 신규 전사인자 선발 및 발현 분석

안토시아닌(anthocyanin) 생합성을 조절하는 신규 전사인자를 선발하고자, 종자 전사체 분석을 실시하였다. 전사체 분석은 호분층(aleurone layer)에 안토시아닌 물질이 생성되는 시기인 수분(pollination) 후 15일경의 종자를 이용하였다. 종자는 호분층에 안토시아닌 물질을 생성하는 품종인 흑진주 및 흑남과, 호분층에 프로안토시아닌(proanthocyanin) 물질을 생성하는 품종인 적진주와 홍진주, 그리고 대조구로 호분층에 색소 축적이 이루어지지 않은 일미 품종을 사용하였다.

상기 품종들을 이용하여 종자 전사체 분석을 실시해 본 결과, 대조구로 사용한 일미에 비하여 흑미계통과 적미계통에서 징크 핑거(zinc finger) 단백질이 높은 수준의 발현을 보이는 것을 확인하였으며, 상기 높은 수준의 발현을 보이는 징크 핑거(zinc finger) 단백질을 안토시아닌 생합성을 조절하는 신규 전사인자 후보로 선발하였다(도 1의 A).

상기 안토시아닌 생합성을 조절하는 신규 전사인자 후보로 선발한 징크 핑거(zinc finger) 단백질을 암호화(encoding)하는 징크 핑거 유전자들의 종자 발달 단계별 발현을 알아보기 위하여, qRT-PCR(Quantitative real-time PCR)을 수행하였다. 이때, 수분(pollination) 후 5, 10, 15, 20 및 30일경의 백미계열의 '일미(IM)', 흑미계열의 '흑진주(HJJ)', 적미계열의 '적진주(JJJ)' 품종의 종자를 이용하였다.

qRT-PCR 수행 결과, 징크 핑거(Zinc finger) 유전자의 발현은 일미와 적진주와 비교하여 흑진주에서 가장 높게 나타남을 확인하였다. 흑진주의 종자 발달 시기별로 살펴보면, 종피(seed coat(bran))에 안토시아닌이 축적되는 수분 후 15일과 20일 사이에 높은 발현을 나타내고 종자 성숙이 완성되는 단계에서 발현이 감소 되는 경향을 나타냄을 확인하였다(도 1의 B).

이때, qPCR 조건은 CFX96 Touch^™ Real-Time PCR Detection System을 사용하여 95℃에서 5분 1회, 95℃에서 15초, 55℃에서 30초를 40회로 반복한 후, 95℃에서 1분, 65℃에서 5초 반응 후 0.5℃씩 온도를 높여 95℃에 도달하게 하였다. 3번의 독립적인 반복실험을 수행하여 유전자의 발현 양상을 나타내었다. 유전자 발현 분석을 위해 OsBBX14-1-F(5'-GCCTCCTCCTCCACCATATT-3'; 서열번호 5)과 OsBBX14-1-R(5'-AAGAACCCGAGCTCCTCCT-3'; 서열번호 6) 프라이머를 사용하였고, 유전자 발현을 위한 reference 유전자로는 OsUBI-F(5'-GAAGTAAGGAAGGAGGAGGA-3'; 서열번호 7)와 OsUBI-R(5'-AAGGTGTTCAGTTCCAAGG-3'; 서열번호 8) 프라이머를 사용하였다.

실시예 2: 안토시아닌 증진 신규 전사 유전자인, 벼 유래 OsBBX14 유전자의 클로닝 및 염기서열 분석

상기 실시예 1에서 안토시아닌 생합성을 조절하는 신규 전사인자 후보로 선발한 징크 핑거(zinc finger) 유전자를 분리하기 위해, 흑진주 품종의 수분 후 15일째 되는 종자의 cDNA를 주형으로 하여 PCR 방법으로 유전자를 클로닝하고 전체 염기서열을 결정하였다. 징크 핑거 유전자는 Oryza sativa Japonica 종의 5번 염색체에 위치하며 유전자의 크기가 2,534bp이며 3개의 엑손(exon)과 2개의 인트론(intron)으로 구성되어 있다.

구체적으로, 징크 핑거(zinc finger) 유전자를 분리하기 위해서 흑진주 품종의 수분 후 15일째 되는 종자 cDNA를 주형으로 하여 OsBBX14-F(5'-CACCATCGCCCCCCACCCATGTCGCC-3'; 서열번호 3)와 OsBBX14-R(5'-TTAGCTCCGGCGT TTGGAGGTGGGGC-3'; 서열번호 4) 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 98℃에서 5분 1회, 98℃에서 10초, 65℃에서 10초, 75℃에서 1분을 30회로 반복한 후 72℃에서 5분 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 1% 아가로즈젤에 전기영동 후, QIAGEN gel extraction kit(QOAGEN, USA)를 이용하여 정제하였다. 분리된 유전자를 pENT/D-TOPO(Invitrogen, USA) 운반체에 도입시켜 유전자의 염기서열을 분석하였다.

염기서열 분석 결과, 클로닝(cloning)된 징크 핑거(zinc finger) 유전자는 기존에 안토시아닌 증진 효과를 지님에 대해서는 전혀 알려져 있지 않은 OsBBX14로 명명된 유전자와 동일한 서열을 지님을 확인하였다(서열번호 1).

이에, 본 발명의 안토시아닌 증진 신규 전사 유전자 또한 동일하게 OsBBX14 유전자로 명명하였으며, 상기 유전자의 ORF(open reading frame)의 길이는 1,137bp이고, 378개의 아미노산을 암호화하는 단백질이며, 기존에 보고된 GenBank Number, AK106865의 뉴클레오타이드 서열과 OsBBX14 단백질의 아미노산 서열(서열번호 2)이 100% 일치함을 확인하였다(도 2).

실시예 3: 안토시아닌 증진 신규 전사인자인 OsBBX14 단백질의 구조 및 유전적 계통도 분석

상기 실시예 1 및 실시예 2에서 선발, 분리한 징크 핑거(zinc finger) 단백질은 안토시아닌 생합성 조절과 관련된 기능은 알려져 있지 않으나, OsBBX14라고 명명되어 있었으며 BBX(zinc finger protein containing B-box domain) 그룹에 속하는 것으로 알려져 있었다(Huang et al., 2012). BBX 그룹은 징크 핑거 전사인자 군에 속하며, 아연 이온의 결합에 의하여 안정화되는 4차 구조를 지니는 B-box 도메인(B-box domain)을 지니고 있다. BBX 그룹은 유식물(幼植物, seedling)의 광형태 형성(photomorphogenesis), 개화기(flowering period)를 조절하는 광주기(photoperiod), 음지회피(shade avoidance response), 생물적·비생물적 스트레스와 관련하여 식물의 생장과 발달을 조절한다(Gangappa & Botto, 2014). 여러 식물에서 BBX 그룹이라고 알려진 단백질들과 OsBBX14 단백질을 이용하여 다중 정렬(multiple alignment)을 수행하였다(도 3의 A). 그 결과, 벼 유래의 BBX14 단백질은 기존의 보고된 2BBX 그룹의 단백질들과 비슷하게 N-말단에 2개의 B-box 도메인(B-box domain)과 C-말단에 핵으로 이동하는 NLS(nuclear localization signal)가 잘 보존되어 있음을 확인하였다. 2개의 B-box 도메인을 살펴보면 B-box Ⅰ에는 C-X₂-C-X₈-C-X-C-X₂-C-X₄-H-X₈-H의 형태로, B-box Ⅱ는 C-X₂-C-X₈-C-X₇-C-X₂-C-X₄-H-X₈-H의 형태로 잘 보존되어 있음을 확인하였다. 두 개의 보존된 B-box 도메인과 C-말단의 NLS는 쌍자엽 식물인 애기장대, 콩, 사과, 토마토 뿐만 아니라 단자엽 식물인 옥수수, 보리에서도 잘 보존되어 있음이 확인되었다. 이것은 BBX 단백질이 피자식물(angiosperms)에서 잘 보존되어 있음을 시사한다. 이상의 결과로 OsBBX14가 BBX 그룹에 속하며, 기존에 알려진 여러 작물의 BBX 그룹과 비슷한 기능을 할 것이라고 예상하였다.

2BBX 그룹으로 알려진 애기장대의 8개 단백질과 벼 10개 단백질의 염기서열을 이용하여 유전적 계통도를 작성하였다(도 3의 B). 그 결과 OsBBX14는 AtBBX22와 같은 그룹에 속하는 것으로 확인되었다(Group Ⅰ). OsBBX14는 OSBBX1과 가장 높은 상동성을 나타내었고, OsBBX6, OsBBX13, OsBBX16, OsBBX22, OsBBX30과 같은 그룹에 속하였다(Group Ⅰ). OsBBX4, OsBBX11, OsBBX29가 서로 다른 그룹으로(Group Ⅱ) 분류되었다. 애기장대 AtBBX20, AtBBX21, AtBBX22, AtBBX23은 Group Ⅰ으로 분류되었고, AtBBX18, AtBBX19, AtBBX24, AtBBX25는 Group Ⅱ로 분류되었다. 2BBX 단백질은 유식물체의 탈황백화현상(de-etiolation), 하배축(hypocotyl) 생장, 안토시아닌 생산 및 엽록소의 축적, 측근(lateral root)의 성장 및 자엽 전개(cotyledon unfolding)에 관여하는 것으로 밝혀졌다(Gangappa & Botto, 2014).

Group Ⅰ에 속하는 AtBBX20, AtBBX21, AtBBX22는 광형태형성과 엽록소 축적의 양성조절자(positive regulator)로 알려져 있으며, AtBBX23은 자엽 전개에 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다. Group Ⅱ에 속하는 애기장대의 AtBBX18, AtBBX19, AtBBX24는 광형태발생을 억제하는 것으로 보고되었다(Khanna et al., 2006; Kumagai et al., 2008).

OsBBX14와 같은 Group Ⅰ에 속하는 Atbbx22 돌연변이체의 경우, 적색광(red light), 원적색광(far-red light), 청색광(blue light)에서 긴 하배축 생장과 엽록체 발현이 늦어짐을 확인하였다. AtBBX22 유전자를 과발현시킨 경우, 짧은 하배축 길이를 나타내고 엽록소의 함량이 증가되고 안토시아닌 함량이 증가되었다(Chang et al., 2008). 이상의 결과 및 기존 보고를 바탕으로 OsBBX14 단백질은 광형태발생과 안토시아닌 생성, 엽록소 생성 등에 AtBBX22 단백질과 비슷하게 양성조절자(positive regulator)로 작용하리라 예상하였다.

실시예 4: 벼 유래 OsBBX14 유전자의 안토시아닌 증진 기능 검정

상기 실시예 3에서 벼 유래 징크 핑거(zinc finger) 유전자인 OsBBX14가 안토시아닌 생합성 조절과 관련된 기능이 있을 것으로 예측하였다. 이에, 상기 실시예 1 및 실시예 2에서 선발, 분리한 벼 유래 OsBBX14 유전자의 기능을 검정하고자, 벡터(vector) 및 형질절환체를 제작하고, 형질전환체의 표현형 및 안토시아닌 함량을 분석하였다.

실시예 4-1: OsBBX14 유전자 과발현 애기장대의 형질전환체 및 이의 표현형 분석

OsBBX14 유전자의 식물체 내 기능을 확인하고자, 식물발현 운반체(vector)를 제작하였다. 전신 발현 프로모터인 CaMV(cauliflower mosaic virus) 35S-P가 포함된 pB7WG2D-OsBBX14 운반체를 제작하였다(도 4의 A). 상기 pB7WG2D-OsBBX14 운반체가 도입된 아그로박테리움 GV3101(Agrobacterium GV3101)를 이용하여, 애기장대 형질전환에 사용하였다.

화아침지법(Floral meristem dipping method)을 이용하여 pB7WG2D-OsBBX14 운반체를 애기장대 Col-0(Columbia-0, 야생형(wild type))에 형질전환하였다. 15개의 서로 다른 형질전환체를 얻었다. 상기 OsBBX14 유전자가 도입된 애기장대 T₁ 세대 형질전환체와 Col-0의 표현형을 비교해 본 결과, 육안으로도 Col-0와 비교하여 OsBBX14 유전자 과발현 형질전환체에서 엽병(petiole) 부위에 안토시아닌 축적이 증가된 것을 확인하였다(도 4의 B).

실시예 4-2: OsBBX14 유전자 과발현 애기장대 형질전환체의 표현형 및 안토시아닌 함량 분석

OsBBX14 유전자의 기능을 보다 자세하게 확인하기 위하여, 세 개의 서로 다른 OsBBX14 유전자 과발현 애기장대 형질전환체를 선발하여 세대진전을 실시하였다. OsBBX14 유전자 과발현 애기장대 T₃ 세대 형질전환체와 Col-0를 1/2MS(Murashige & Skoog Medium; MS 배지에 비해 암모니아태질소(ammonia nitrogen)를 1/2만 포함) 기본 배지에 파종하였다. 파종 후 7일 동안 일반 광조건(16시간 명조건/8시간 암조건)에서 생육시킨 결과, OsBBX14 과발현 애기장대 형질전환 식물체에서 더 많은 안토시아닌이 축적됨을 확인하였다(도 5의 A).

OsBBX14 유전자 과발현 애기장대의 안토시아닌 함량을 알아보기 위하여, MS0 배지에 파종한 7일째의 애기장대 유식물체 50개를 이용하여 안토시아닌을 추출하였다. 총 안토시아닌 함량은 Col-0에 비해서 OsBBX14 유전자 과발현 애기장대 형질전환체에서 2배에서 2.5배 이상 증가됨을 확인하였다(도 5의 B).

이때, 총 안토시아닌 함량은 Shin et.al., Plant J., 49:981-994 (2007)에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 상기 조건에서 배양된 Col-0 야생형 애기장대와 OsBBX14 과발현 애기장대 형질전환체의 각각 50개의 유식물체를 액체질소를 이용하여 곱게 분쇄시킨 후 600㎕의 추출용액(1% HCl이 포함된 메탄올)을 넣고 4℃에서 6시간 동안 추출하였다. 추출 후, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액 600㎕에 멸균수 200㎕와 클로로프롬 200㎕를 첨가하여 잘 현탁하였다. 현탁액을 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 새로운 튜브(tube)에 옮겨 총 안토시아닌의 함량을 측정하였다. 총 안토시아닌 함량은 530 nm(A₅₃₀)과 657 nm(A₆₅₇)에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader;Bio-tex, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 측정값은 530 nm(A₅₃₀)-0.25×657 nm(A₆₅₇) 식을 이용하여 총 안토시아닌 함량을 계산하였으며, 3번의 독립적인 반복실험을 수행하여 값을 계산하였다.

상기 결과를 통해, OsBBX14 유전자가 안토시아닌 축적에 관여하는 양성조절자(positive regulator)임을 알 수 있었다.

실시예 4-3: OsBBX14 유전자 과발현 애기장대 형질전환체의 표현형 및 하배축 길이 분석

암조건(dark condition)에서 자란 유식물은 암형태형성(skotomorphogenesis) 발달 양식을 따르게 되어 하배축이 길어지며 황백화 된다. 이와 대조적으로 명조건(light condition)에서 자란 유식물은 광형태형성(photomorphogenesis) 발달 양식에 따라 하배축의 신장이 억제되며 황백화 현상이 억제된다(Ang et al., 1998).

이에, OsBBX14 유전자가 하배축 신장에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여, OsBBX14 유전자 과발현 애기장대 형질전환체의 파종 후 7일째의 유식물의 표현형을 관찰하였다. Col-0 식물체에 비해서 OsBBX14 유전자 과발현 애기장대 식물체의 경우, 자엽(cotyledon)과 줄기에서 안토시아닌의 축적이 관찰되며 짧은 하배축 길이를 나타내었다(도 6의 A). Col-0 개체와 세 개의 서로 다른 OsBBX14 유전자 과발현 애기장대를 100개 이상 파종하여 하배축 길이를 측정하였다. Col-0에 비하여 OsBBX14 유전자 과발현 형질전환체의 경우 40% 정도 하배축 길이가 줄어든 것을 확인하였다(도 6의 B).

상기 결과를 통해, OsBBX14 유전자는 안토시아닌 생성에 관여하는 양성조절자일 뿐 아니라, 빛에 의해서 광형태형성에 관여하는 양성조절자임을 알 수 있었다.

<110> Republic of Korea <120> Gene enhancing anthocyanin biosynthesis derived from Oryza sativa and uses thereof <130> P17R12C0062 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsBBX14 gene <400> 1 atgtcgcctc ctcctccacc atattaccac cacctcctcc tcctccgctc ctcgcccacc 60 accactggag gaggagctcg ggttcttgcc gcggcggagc tcgcacgcat gaagctactg 120 tgcagcgcgt gcgaggcggc ggaggccagc gtcctctgct gcgccgacga ggccgccctg 180 tgcgcgcgct gcgaccgcga catccacgcc gccaaccgcc tcgccgggaa gcacctccgc 240 ctccctctcc tctcccccgc ctcctcctcc tcctcctccg ccgccgccct cgcgccgccg 300 ccgccgtcgc cgcccaagtg cgacatatgc caggagagcc acgcgtactt cttctgcctc 360 gaggaccgcg cgctgctgtg ccggagctgc gacgtggcgg tgcacacggc caacgccttc 420 gtctccgcgc accgccgttt cctcctcacc ggcgtgcagg tcgggcagga gcaggacgag 480 cactcccctg acccgcctga gccgtctcct cctccgccgc cgccgccgcc tgcatccaag 540 agcgaccacc cggcgccgct ctacggcgag ggcggaggag ggttcagctg ggacgccgcc 600 gactcgccgg ccgcgggcgg cctccccgac tggtcggccg tcgtcgacca gttcggctcc 660 ccgccgccgc cgcgccacac ggacaccgcg accgtgacga ccccgccgcc gaccaagagg 720 agcccacgcg cgccggcgtt cggcggccag ggcggcatga tggattggcc cctcggcgag 780 ttcttcggcg gcttcaccga cttcaccggc ggctttggct tcggcttcgg cgacagtggc 840 acctccaagg ctgacagcgg gaagctggga gggagcacgg acggctcgcc gtactaccgg 900 tcgtcatcgg aagatgaccg gaacgccgac gagctcttcg ggcaggtacc agagatccag 960 tggtcggtgc cggagctccc ctcgccgccg acggcctccg gcctccactg gcaacgccat 1020 ccagccgcca ctcacggcgg cggcggcggc ggacccgaca ccaccgcctt cgtccccgac 1080 atctgctccc ccgacagctg cttcccggcc accacctcca aacgccggag gcaataa 1137 <210> 2 <211> 378 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OsBBX14 protein amino acid sequence <400> 2 Met Ser Pro Pro Pro Pro Pro Tyr Tyr His His Leu Leu Leu Leu Arg 1 5 10 15 Ser Ser Pro Thr Thr Thr Gly Gly Gly Ala Arg Val Leu Ala Ala Ala 20 25 30 Glu Leu Ala Arg Met Lys Leu Leu Cys Ser Ala Cys Glu Ala Ala Glu 35 40 45 Ala Ser Val Leu Cys Cys Ala Asp Glu Ala Ala Leu Cys Ala Arg Cys 50 55 60 Asp Arg Asp Ile His Ala Ala Asn Arg Leu Ala Gly Lys His Leu Arg 65 70 75 80 Leu Pro Leu Leu Ser Pro Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ala 85 90 95 Leu Ala Pro Pro Pro Pro Ser Pro Pro Lys Cys Asp Ile Cys Gln Glu 100 105 110 Ser His Ala Tyr Phe Phe Cys Leu Glu Asp Arg Ala Leu Leu Cys Arg 115 120 125 Ser Cys Asp Val Ala Val His Thr Ala Asn Ala Phe Val Ser Ala His 130 135 140 Arg Arg Phe Leu Leu Thr Gly Val Gln Val Gly Gln Glu Gln Asp Glu 145 150 155 160 His Ser Pro Asp Pro Pro Glu Pro Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 165 170 175 Pro Ala Ser Lys Ser Asp His Pro Ala Pro Leu Tyr Gly Glu Gly Gly 180 185 190 Gly Gly Phe Ser Trp Asp Ala Ala Asp Ser Pro Ala Ala Gly Gly Leu 195 200 205 Pro Asp Trp Ser Ala Val Val Asp Gln Phe Gly Ser Pro Pro Pro Pro 210 215 220 Arg His Thr Asp Thr Ala Thr Val Thr Thr Pro Pro Pro Thr Lys Arg 225 230 235 240 Ser Pro Arg Ala Pro Ala Phe Gly Gly Gln Gly Gly Met Met Asp Trp 245 250 255 Pro Leu Gly Glu Phe Phe Gly Gly Phe Thr Asp Phe Thr Gly Gly Phe 260 265 270 Gly Phe Gly Phe Gly Asp Ser Gly Thr Ser Lys Ala Asp Ser Gly Lys 275 280 285 Leu Gly Gly Ser Thr Asp Gly Ser Pro Tyr Tyr Arg Ser Ser Ser Glu 290 295 300 Asp Asp Arg Asn Ala Asp Glu Leu Phe Gly Gln Val Pro Glu Ile Gln 305 310 315 320 Trp Ser Val Pro Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Ala Ser Gly Leu His 325 330 335 Trp Gln Arg His Pro Ala Ala Thr His Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro 340 345 350 Asp Thr Thr Ala Phe Val Pro Asp Ile Cys Ser Pro Asp Ser Cys Phe 355 360 365 Pro Ala Thr Thr Ser Lys Arg Arg Arg Gln 370 375 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsBBX14-F <400> 3 caccatcgcc ccccacccat gtcgcc 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsBBX14-R <400> 4 ttagctccgg cgtttggagg tggggc 26 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsBBX14-1-F <400> 5 gcctcctcct ccaccatatt 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsBBX14-1-R <400> 6 aagaacccga gctcctcct 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsUBI-F <400> 7 gaagtaagga aggaggagga 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsUBI-R <400> 8 aaggtgttca gttccaagg 19

Claims (10)

1. 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 분리한, 서열번호 1의 1,137 bp로 이루어지는 염기서열로 구성된 유전자를 포함하는, 식물의 안토시아닌 생합성을 증진시키는 형질전환용 재조합 벡터.
   
2. 제1항의 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 안토시아닌 생합성이 증진된 형질전환 식물체.
   
3. 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 분리한, 서열번호 1의 1,137 bp로 이루어지는 염기서열로 구성된 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 상기 서열번호 1로 표시되는 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 안토시아닌 생합성을 증진시키는 방법.
   
4. 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 분리한, 서열번호 1의 1,137 bp로 이루어지는 염기서열로 구성된 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 상기 서열번호 1로 표시되는 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 안토시아닌 생합성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법.
   
5. 제4항의 방법에 의해 제조된 안토시아닌 생합성이 증진된 형질전환 식물체.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물인 것인 형질전환 식물체.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대(Arabidopsis thaliana)이며, 상기 단자엽 식물은 벼(Oryza sativa)인 것인 형질전환 식물체.
   
8. 제5항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
   
9. 제5항의 형질전환 식물체로부터 안토시아닌을 추출하는 단계를 포함하는 안토시아닌 생합성이 증진된 형질전환 식물체로부터 안토시아닌을 생산하는 방법.
   
10. 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 분리한, 서열번호 1의 1,137 bp로 이루어지는 염기서열로 구성된 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 안토시아닌 생합성 증진용 조성물.

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