KR101459584B1

KR101459584B1 - 신규한 안토시아닌 생합성 증진 유전자 및 이의 이용

Info

Publication number: KR101459584B1
Application number: KR1020130044797A
Authority: KR
Inventors: 임선형; 하선화; 송지혜; 김재광; 이종렬; 김영미; 구본성
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-04-23
Filing date: 2013-04-23
Publication date: 2014-11-12
Also published as: KR20140126528A

Abstract

본 발명은 진홍무로부터 분리한 신규한 RsMYB1 및 이를 형질전환한 식물체의 안토시아닌 색소 축적량 증가 효과에 관한 것으로, 안토시아닌 생합성에 관련된 MYB 타입 전사인자인 신규한 RsMYB1 유전자로 형질전환된 형질전환 식물체에서 안토시아닌 색소의 축적이 증가하였으며, 안토시아닌 생합성 관련 유전자들의 발현이 증가하였으므로 이를 안토시아닌 색소의 생합성 및 생산에 이용할 수 있다.

Description

신규한 안토시아닌 생합성 증진 유전자 및 이의 이용{Novel gene promoting biosynthesis of anthocyanin and uses thereof}

진홍무로부터 분리한 신규한 안토시아닌 생합성 관련 전사인자 유전자 RsMYB1 및 이를 형질전환한 식물체의 안토시아닌 생합성 증가 효과에 관한 것이다.

2007년도 3월 식품기술의 보고에 의하면 국내의 색소의 시장규모가 약 200억원에 달하고 있으며 이 가운데에 합성색소는 20억원, 천연색소는 180억원 대로 추정되고 있다. 일본의 천연색소 시장의 경우 1992년에 270억엔 대의 시장이 형성되었으며, 2002년도에는 대략 500-600억엔의 시장규모인 것으로 보도되고 있으며 앞으로도 계속 커질 전망이다. 색소는 천연 또는 합성색소가 있으며 식품, 화장품 및 의류염색용 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. 합성색소는 착색률이 높고 안정하며 가격이 저렴하여 천연색소를 대신하여 광범위하게 사용되어 왔으나 발암성과 인체에 독성을 갖는 등 안전성 문제가 제기됨에 따라 그 사용이 엄격히 규제되고 있다. 최근 소비자들의 색소의 안전성에 대한 인식이 새로워지고 건강식품, 위생적 식품에 대한 선호 경향이 합성 식용색소를 대체할 천연색소의 수요를 급격히 증가시키게 되었다. 또한 많은 천연색소는 살균, 항염 등 생리활성이 있으며 안전하여 화장품 및 기능성 식품으로 큰 잠재적 수요가 있다. 따라서 천연색소 시장이 크게 신장될 것으로 예상되고 있으나 기술 집약적인 산물이므로 현재도 선진국에서만 독점 생산되고 있다.

천연색소에 관한 연구는 유럽 및 일본 등지에서 안토시아닌(anthocyanin), 사코닌(shikonin), 카르타민(carthamin), 베타시아닌(betacyanin) 등에 대하여 이루어져 왔다. 현재까지 천연색소는 재배농법, 미생물배양, 식물세포 배양법 등에 의하여 생산될 수 있었다. 재배농법의 경우, 재배품종, 시비량, 멀칭 컬러, 촉성재배, 차광, 재배 환경, 전통농법 또는 유기농법 등에 따라서 생산되는 안토시아닌 함량이 차이가 나는 것으로 밝혀졌으나 그 효과는 미비한 것으로 드러났다 (Mikko J. Anttonen, Kalle I. Hoppula, Rolf Nestby, Michel J. Verheul, and Reijo O. Karjalainen. (2006) Influence of Fertilization, Mulch Color, Early Forcing, Fruit Order, Planting Date, Shading, Growing Environment, and Genotype on the Contents of Selected Phenolics in Strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) Fruits. J Agric. Food Chem. 54:2614-2620).

안토시아닌은 식물체에 존재하는 수용성 색소 배당체(glucoside)로서, 세포액의 산성농도, 색소화합물의 화학적 구조, 여러 금속이온들과의 결합상태에 의해 자색, 적색, 청색 등의 색상을 나타내는 식물성 천연 색소이다. 최근 안토시아닌의 다양한 생리활성작용이 보고되고 있다. 예컨대, 노화억제작용, 항균작용, 돌연변이 억제작용, 콜레스테롤 저하작용, 시력개선효과, 혈관보호기능, 항 궤양기능, 항산화 기능 등이 규명되었다. 특히 항산화 활성 면에서 천연 항산화제인 토코페롤보다 5-7배의 강한 항산화 활성을 나타내는 것으로 알려졌다. 안토시아닌은 독성이 낮다. 따라서, 현재 안토시아닌은 청량음료, 잼, 시력보호용 음료수, 사탕 등의 가공식품 생산과 향장공업, 염료공업, 의약품 개발 등에 활용되고 있다. 최근에는 발암성 및 간 독성이 우려되는 합성 착색료를 대신할 수 있는 안전한 천연 착색료로 주목을 받아 식품 영양학적인 면과 더불어 시각적 신선감 및 즐거움을 줄 수 있는 유용성분으로 평가되고 있다. 이러한 안토시아닌은 다양한 식물 종에 폭넓게 존재하며, 흔히 식물체의 꽃, 과실, 줄기, 잎, 뿌리 등에 함유되어 있다. 포도, 딸기, 올리브, 적양배추, 가지, 장미 등의 식물체로부터 안토시아닌을 추출하여 여러 가지 원료로 사용되고 있다.

한편, 식물에서의 안토시아닌 생합성은 식물 자체가 가지고 있는 유전적 요인과 이것이 잘 발현되도록 하는 환경요인의 상호작용에 의해 조절된다 (The Plant Cell, 7: 1071-1083). 즉 안토시아닌 생합성 관련 유전자들은 광도, 광질, 일장, 온도, 수분, 화학물질, 기타 요인들에 의해 자극을 받아 발현되는데(Plant Physiol. 92: 1191-1195; Planta, 194:541-549), 일단 조절 유전자가 발현이 되면 생합성 과정에 관련된 여러 가지 효소가 생성되어 이들의 작용에 의해 안토시아닌이 만들어진다. 일반적으로 안토시아닌 생합성을 조절하는 유전자로는 R2R3 MYB 타입 유전자와 bHLH 타입 유전자가 밝혀져 있다. 이들 유전자들은 식물체의 다양한 조직- 꽃, 잎, 과실등-에서 단독 또는 서로 중합체를 형성하여 유전자의 발현을 조절하고 있는 것으로 알려져 있다. 안토시아닌 생합성의 전사 조절자인 Myb 전사인자(transcription factor)를 암호화하는 Myb 유전자는 단일 또는 복수의 불완전한 반복으로 구성되는 구조적으로 보존된 DNA 결합 도메인이 특징인 전사인자 클래스를 가지며, R2R3 전사인자는 두개의 반복 클래스의 DNA 결합 도메인을 지니고 있다. 옥수수(Zea mays), 페투니아 히브리다(Petunia hybrida ), 토마토 등에서 Myb 유전자가 안토시아닌 생합성에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 상기 Myb 유전자는 안토시아닌 생합성 이외에도 페닐프로파노이드 대사(phenyl propanoid metabolism), 발달(development), 신호 전달(signal transduction), 식물 병 저항성(plant disease resistant), 세포 분열(cell division) 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히, 최근에 토마토에서 Myb 유전자 군의 하나인 ANT1 유전자가 분리되었으며, 상기 ANT1 유전자를 과발현시킨 형질전환 토마토에서 자주빛을 띠는 안토시아닌이 축적됨이 보고되었다 (Helena Mathew et al., The Plant Cell, 15:1689-1703, 2003). 또한 아라비돕시스(Arabidopsis thaliana)에서도 Myb 전사인자를 암호화하는 유전자들이 분리된 바 있다 (미국특허 제6,573,432호).

전사인자(transcriptiona factors, TFs)는 대사 경로의 억제물질 또는 활성제로서의 활성을 갖는 조절 단백질이다. 따라서 TFs는 식물 내에서 전체적인 대사 경로의 조작을 위한 강력한 도구로써 사용될 수 있다. 많은 MYB TFs는 상기 안토시아닌 및 축합형 탄닌 생합성 둘 다를 포함하는 페닐프로파노이드 경로에서의 중요한 조절제이다 (Debaujon et al, 2003; Davies and Schwinn, 2003). 포도(Vitis vinifera)에서의 다른 MYB TFs[CT 생합성의 조절과 관련이 있는 포도(VvMYBPA1) 버드풋 트레포일(Birdsfoot trefoil) 및 유채(Brassica napus)(BnTT2)]가 최근에 보고되었다 (Wei et al., 2007; Bogs et al., 2007; Yoshida et al., 2008).

이에, 본 발명자들은 식물체 내의 안토시아닌 생합성을 증진시키기 위해 MYB 타입 전사인자의 유전자를 탐색하였으며, 진홍무(Raphanus sativus L)로부터 신규한 RsMYB1 유전자를 발굴하고, 이를 형질전환시킨 식물체의 모든 조직에서 안토시아닌 합성이 증가함을 확인하였으므로 이를 기능성 유용 물질인 안토시아닌의 생산을 위해 활용할 수 있다.

본 발명의 목적은 서열번호 1로 기재되는 안토시아닌 생합성 유전자 RsMYB1를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자로부터 유추되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 식물체 내로 도입하는 것을 포함하는 안토시아닌이 축적된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 안토시아닌 생합성 유전자 RsMYB1를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자로부터 유추되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 유전자를 식물체 내로 도입하는 것을 포함하는 안토시아닌이 축적된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 신규한 RsMYB1 유전자가 포함된 벡터로 형질전환된 식물체는 모든 조직에서 안토시아닌의 색소 축적이 증가하였으므로, 본 발명의 안토시아닌 생합성이 증가한 형질전환체를 이용하면 안토시아닌의 지속적인 생산 및 공급이 가능하다.

도 1은 진홍무에서 분리한 RsMYB1 유전자의 계통도이다;
파란색 네모 박스: 본 발명에서 동정된 RsMYB1.
도 2는 RsMYB1 유전자 함유 식물형질전환용 발현 벡터를 나타내는 도식이다.
도 3은 RsMYB1 유전자를 포함한 발현 벡터로 형질전환한 애기장대의 사진이다;
WT: 야생형; 및
1 내지 4: 형질전환 애기장대.
도 4는 RsMYB1 유전자를 포함한 발현 벡터로 형질전환한 애기장대의 안토시아닌 함량을 확인한 그래프이다;
Col: 대조구 식물체; 및
1, 2: RsMYB1 유전자를 포함한 발현 벡터로 형질전환한 애기장대.
도 5는 RsMYB1 유전자를 포함한 발현 벡터로 형질전환한 애기장대의 꽃 및 종자의 표현형을 나타내는 사진이다.
도 6은 안토시아닌 생합성에 관련된 페닐프로파노이드 생합성 경로의 주요 효소의 유전자의 발현을 qRT-PCR로 확인한 그래프이다;
AtCHS: 애기장대 찰콘 신타아제(chalcone synthase)를 암호화하는 유전자;
AtDFR: 애기장대 디하이드로플라보놀 4-리덕타아제(dihydroflavonol 4-reductase)를 암호화하는 유전자;
AtANS: 애기장대 안토시아니딘 신타아제(anthocyanin synthase)를 암호화하는 유전자;
WT: 야생형; 및
1 내지 4: 형질전환 애기장대.
도 7은 페닐프로파노이드 생합성 경로에서의 안토시아닌 합성 과정을 모식화한 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 안토시아닌 생합성 유전자 RsMYB1를 제공한다.

상기 유전자는 상기 유전자는 진홍무(Raphanus sativus L)로부터 분리된 유전자인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 RsMYB1 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

상기 발현 벡터는 안토시아닌 생합성 증진용인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 발현 벡터는 제초제 저항성 Bar 유전자가 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 RsMYB1 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 상기 발현 벡터는 바람직하게는 과발현 벡터 pB7WG2D일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 도 2에 기재된 RsMYB1/pB7WG2D 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 발현 벡터는 재조합 벡터이고, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 발현 벡터가 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 테트라사이클린 및 바스타 제초제에 대한 내성 유전자가 있다.

상기 식물체는 RsMYB1 유전자 발현에 의해 안토시아닌 함량이 식물체 전체에서 증가한 것이 바람직하며, 꽃 조직 및 종자에서 증가한 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주), 식물세포 및 식물체 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물체이다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 발현 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 상기에서 세포는 효모, 식물 세포와 같은 진핵세포 또는 대장균과 같은 원핵세포일 수 있다. 바람직하게는 박테리아(bacteria)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 대장균 또는 아그로박테리움 속 미생물이다. 상기 본 발명에 따른 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 공지된 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 아그로박테리움 매개 형질전환법(Agrobacterium-mediated transformation), 입자 총 충격법(particle gun bombardment or microparticle bombardment), 실리콘 탄화물 위스커 (Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 폴리에틸렌글리콜에 의한 침전법 (polyethylenglycol-mediated uptake) 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움 매개 형질전환법을 사용할 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명에 따른 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다.

아울러, 본 발명은 본 발명의 유전자를 식물체 내로 도입하는 것을 포함하는 안토시아닌이 축적된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 진홍무로부터 신규한 MYB 타입의 안토시아닌 생합성 전사인자 유전자를 분리하고 이를 RsMYB1로 명명하였으며 (도 1 참조), 상기 유전자를 포함하는 과발현 벡터를 제작하여 (도 2 참조) RsMYB1 유전자를 형질전환한 애기장대를 제작하였다 (도 3 참조). 제작한 형질전환 애기장대의 안토시아닌 함량 (표 2 및 도 4 참조), 및 형질전환체의 꽃 조직 및 종자에서의 안토시아닌 색소 축적을 확인하여 (도 5 참조) 안토시아닌 색소가 증가한 표현형을 확인하였으며 , 이와 같은 표현형 결과가 안토시아닌 생합성에 관련된 효소의 유전자들의 발현을 증가시켜서 발생하는 것임을 확인하였다 (도 6 참조).

따라서, 본 발명의 신규한 RsMYB1 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 식물체는 기존의 특정 조직이나 시기에만 생산되던 것 (어린잎 조직 (여름)-UV 빛 조건하에서 식물조직을 보호,꽃 (봄) 및 과실 (가을)-수분을 매개하는 곤충 또는 종자산포를 위한 동물 유인)과 달리, 모든 조직에서 안토시아닌 색소 생합성이 유의적으로 증가하므로, 이를 지속적이고 안정적인 안토시아닌 생산 및 공급에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 진홍무 유래 RsMYB1 유전자 분리 및 염기서열 확인

본 발명자들은, 안토시아닌 물질생산을 증진시키는 신규한 전사인자를 발굴하기 위해서 다중 정렬(multiple alignment)을 이용하여 무로부터 MYB1 전사인자를 분리하여 염기서열을 결정하고 이를 계통 분류하였다.

구체적으로, MYB 전사인자들을 다중 정렬을 수행하여 공통의 염기서열이 존재하는 부위에 대한 프라이머 RsMYB-F 및 RsMYB-R (서열번호 3 및 4)을 제작하였다. 그 후, 뿌리 및 잎 조직에 안토시아닌을 생산하는 진홍무의 잎으로부터 총 RNA를 분리한 뒤, 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR로 증폭된 안토시아닌 색소합성 전사인자의 단편의 염기서열을 바탕으로 3'-, 5'- RACE PCR을 수행하였고, 단편의 염기서열을 분석한 후 완전장(full-length) cDNA합성을 위한 프라이머 full RsMYB-F 및 full RsMYB-R (서열번호 5 및 6)을 제작한 뒤, 이를 이용하여 PCR을 하였다. 증폭된 PCR 산물을 클로닝한 뒤 염기서열을 분석하여 서열번호 1의 신규한 전사인자 유전자 RsMYB1을 확인하였다. 확인된 RsMYB1를 계통 분류한 결과, 다른 안토시아닌 색소 합성 전사인자들과 같은 그룹 내로 클러스터링 됨을 확인하였다 (도 1).

서열번호	서열 명칭	서열 (5'->3')
3	RsMYB-F	TGKTCCATGGAGGGTWYGTCCAAAGGGCT
4	RsMYB-R	GAAACACTAATCAARTTMYACAGTCTCTCC
5	full RsMYB-F	ATGGAGGGTTCGTCCAAAGG
6	full RsMYB-R	GAAACACTAATCAAATTACACAGTCTCTCC

< 실시예 2> RsMYB1 유전자 기능 검정

<2-1> RsMYB1 발현 벡터 및 형질전환체 제작

본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 분리한 RsMYB1 유전자의 기능을 확인하기 위하여 벡터 및 형질전환체를 제작하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 분리한 RsMYB1 유전자를 Gateway Technology (invitrogen)를 이용하여 식물 과발현 벡터인 pB7WG2D 내로 도입하고 RsMYB1/pB7WG2D로 명명하였다 (도 2). 제작한 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101에 형질전환시킨 뒤 화아 배양법을 이용하여 애기장대에 형질전환을 수행하였다. 형질전환 후 제초제인 0.3%의 바스타(Basta)를 처리하여 형질전환된 개체를 선발하였다 (도 3).

<2-2> RsMYB1 발현 형질전환체의 표현형 확인

본 발명자들은 상기 실시예 <2-1>에서 제작한 형질전환 애기장대의 안토시아닌 생산량을 확인하기 위하여 표현현을 확인하였다.

구체적으로, 대조구 애기장대와 RsMYB1 유전자가 도입된 상기 실시예 <2-1>에서 선발된 애기장대 형질전환체를 MS 기본배지 (자당 3% 함유)에 배양한 후 전신조직에서 안토시아닌 색소를 추출하는 방법 (pH differential method, J. AOAC Int . 2005 88:1269-1278)을 이용하여 안토시아닌의 함량을 확인하였다.

그 결과, 대조구 식물체에 비해서 형질전환체에서 안토시아닌의 함량이 증가됨을 2.5배에서 3.6배 정도 증가됨을 확인할 수 있었다 (표 2 및 도 4).

또한, 영양 생장 조직인 잎 조직에서 대조구 애기장대에 비해서 안토시아닌 색소가 축적되어 있었으며, 생식 생장 조직인 꽃 조직 (암술대, 수술, 꽃잎 및 꽃받침) 및 종자에서도 안토시아닌 색소가 축적됨을 확인할 수 있었다 (도 5).

plant line	monomeric anthocyanin (C3G) contents (ug/g FW)	fold change
Col-0	49.4±9.39	1
1	124.6±39.81	2.52
2	178.2±69.2	3.61

<2-3> RsMYB1 발현 형질전환체의 유전자 발현 분석

본 발명자들은 상기 실시예 <2-1>에서 제작한 형질전환 애기장대의 표현형 결과와 안토시아닌 생합성관련 유전자의 발현증대와의 연관성을 확인하였다.

구체적으로, 안토시아닌 합성을 위한 페닐프로파노이드 생합성 경로 (도 7 참조)의 AtCHS (찰콘 신타아제를 암호화하는 유전자), AtDFR (디하이드로플라보놀 4-리덕타아제를 암호화하는 유전자) 및 AtANS (안토시아니딘 신타아제를 암호화하는 유전자) 유전자의 발현을 qRT-PCR을 이용하여 분석하였다.

그 결과, 안토시아닌 생합성 경로의 유전자의 발현이 대조구에 비해 크게 증가함을 확인하였다 (도 6).

따라서, 색소합성 전사인자인 RsMYB1 유전자의 식물체 발현으로 인한 생합성경로 유전자의 발현증대로 인해 안토시아닌의 생합성이 증가함을 알 수 있었다.

<110> republic of Korea <120> Novel gene promoting biosynthesis of anthocyanin and uses thereof <130> p130071 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 747 <212> DNA <213> Raphanus sativus L <400> 1 atggagggtt cgtccaaagg gctgagaaaa ggtgcatgga ctgctgaaga agataatctc 60 ttgaggcaat gcattgataa gtatggagaa gggaaatggc accaagttcc tttaagagct 120 gggctgaatc ggtgcaggaa gagttgtaga ctaagatggt tgaactattt gaagccaagt 180 atcaagagag ggaaacttaa ctctgatgaa gttgatcttc ttgttcgcct tcataaactt 240 ttgggaaaca ggtggtcttt aattgctggt agattacccg gtcggactgc caatgatgtc 300 aaaaattact ggaacaccca tttgagtaag aaacatgaac caggttgcaa gacccagatg 360 aaaaaagaaa agagaaacat tccttgctct cctactacac tagcccaaaa aatcgacgtt 420 ttcaaacctc gacctcgatc cttcaccgtt aacaacggct gcagccatat tattggcatg 480 ccaaaacctg acgttgttcc tctatgcctt cgatccaaca acaccaaaaa tgtttgtgaa 540 agtattgcta catgtaacaa agatgacgat aaatctgagc ttgatagtaa tttgatggat 600 ggtcagaata tgtggtggga gggtttgcta aatgaaaacc cagatccagc tgcactcttt 660 ccagaagcta cagcaacaga aaaaggcgca acctccgcat ttgacgttga gcaactttgg 720 agcctgttag atggagagac tgtgtaa 747 <210> 2 <211> 248 <212> PRT <213> Raphanus sativus L <400> 2 Met Glu Gly Ser Ser Lys Gly Leu Arg Lys Gly Ala Trp Thr Ala Glu 1 5 10 15 Glu Asp Asn Leu Leu Arg Gln Cys Ile Asp Lys Tyr Gly Glu Gly Lys 20 25 30 Trp His Gln Val Pro Leu Arg Ala Gly Leu Asn Arg Cys Arg Lys Ser 35 40 45 Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Lys Pro Ser Ile Lys Arg Gly 50 55 60 Lys Leu Asn Ser Asp Glu Val Asp Leu Leu Val Arg Leu His Lys Leu 65 70 75 80 Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro Gly Arg Thr 85 90 95 Ala Asn Asp Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu Ser Lys Lys His 100 105 110 Glu Pro Gly Cys Lys Thr Gln Met Lys Lys Glu Lys Arg Asn Ile Pro 115 120 125 Cys Ser Pro Thr Thr Leu Ala Gln Lys Ile Asp Val Phe Lys Pro Arg 130 135 140 Pro Arg Ser Phe Thr Val Asn Asn Gly Cys Ser His Ile Ile Gly Met 145 150 155 160 Pro Lys Pro Asp Val Val Pro Leu Cys Leu Arg Ser Asn Asn Thr Lys 165 170 175 Asn Val Cys Glu Ser Ile Ala Thr Cys Asn Lys Asp Asp Asp Lys Ser 180 185 190 Glu Leu Asp Ser Asn Leu Met Asp Gly Gln Asn Met Trp Trp Glu Gly 195 200 205 Leu Leu Asn Glu Asn Pro Asp Pro Ala Ala Leu Phe Pro Glu Ala Thr 210 215 220 Ala Thr Glu Lys Gly Ala Thr Ser Ala Phe Asp Val Glu Gln Leu Trp 225 230 235 240 Ser Leu Leu Asp Gly Glu Thr Val 245 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsMYB-F primer <400> 3 tgktccatgg agggtwygtc caaagggct 29 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsMYB-R primer <400> 4 gaaacactaa tcaarttmya cagtctctcc 30 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> full RsMYB-F primer <400> 5 atggagggtt cgtccaaagg 20 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> full RsMYB-R primer <400> 6 gaaacactaa tcaaattaca cagtctctcc 30

Claims

서열번호 1로 이루어지는 안토시아닌 생합성 유전자 RsMYB1.
제 1항에 있어서, 상기 유전자는 진홍무(Raphanus sativus L)로부터 분리된 MYB 타입 전사인자인 것을 특징으로 하는 유전자.
제 1항의 유전자로부터 유추되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질.
제 1항의 유전자를 포함하는 발현 벡터.
제 4항의 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체.
제 1항의 유전자를 식물체 내로 도입하는 것을 포함하는 비형질전환 식물체보다 안토시아닌이 더 많이 축적된 형질전환 식물체의 제조 방법.