KR101190257B1

KR101190257B1 - 식물의 베타카로틴 함량을 증가시키는 베타카로틴 히드록실라아제 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101190257B1
Application number: KR1020090109562A
Authority: KR
Inventors: 곽상수; 이행순; 안영옥; 정재철; 김선하
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-11-13
Filing date: 2009-11-13
Publication date: 2012-10-12
Also published as: CN102061289A; CN102061289B; KR20110052865A

Abstract

본 발명은 고구마 유래의 베타카로틴 히드록실라아제 (β-carotene hydroxylase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 벡터, 상기 재조합 식물 RNAi 벡터를 이용한 식물의 베타카로틴 함량을 증가시키는 방법, 상기 재조합 식물 RNAi 벡터로 형질전환되어, 베타카로틴 함량이 증가된 식물체 및 이의 종자에 관한 것이다.

고구마, 베타카로틴 히드록실라아제, 베타카로틴, RNAi 벡터

Description

식물의 베타카로틴 함량을 증가시키는 베타카로틴 히드록실라아제 유전자 및 이의 용도{β-carotene hydroxylase gene increasing β-carotene content of plants and uses thereof}

본 발명은 카로티노이드 함량이 높은 신황미 품종 고구마 유래의 베타카로틴 히드록실라아제(β-carotene hydroxylase) 유전자에 관한 것으로, 구체적으로는 베타카로틴을 분해하는 효소인 베타카로틴 히드록실라아제의 발현을 억제하여 식물체 내에서 베타카로틴의 함량을 높이는 방법에 관한 것이다.

경제성장 이후 다양해진 식생활의 변화와 수준이 향상되면서 기능성 건강식품에 대한 소비자의 욕구증대와 함께 항산화 물질, 베타카로틴 및 식이섬유 등의 기능성이 알려지면서 건강식품으로서의 고구마가 새로이 인식되고 있다.

고구마 괴근의 영양가는 수분을 제외한 대부분이 에너지 공급원인 탄수화물로 높은 열량식품이면서 특히 베타카로틴과 각종 무기물, 비타민 및 식이섬유의 함량이 다른 작물과 비교해 볼 때 손색이 없는 작물이며 고구마 잎과 잎자루는 채소로서의 이용가치가 높다.

또한, 비타민 B와 C, Ca, Fe 등의 성분을 다량 함유하고 있으며 안토시아닌 등의 플라보노이드류나 클로로겐산 (chlorogenic acid) 등의 다양한 폴리페놀을 가지고 있다 (Bovell-Benjamin 2007, Adv Food Nutr Res 52:1-59). 육질이 노란색인 고구마 품종은 높은 카로티노이드 성분을 함유하고 있고 전세계적으로 비타민 A의 결핍 (vitamin A deficiency, VAD)을 극복하는데 중요한 역할을 하고 있다. 개발도상국가에서의 VAD는 일시적, 영구적 실명을 초래하고 특히 어린이, 임산부, 수유기 여성에게 더욱 치명적이다. 세계적으로 수많은 사람들이 이 VAD로 고생하고 있으며 이는 프로비타민 A (베타카로틴이나 다른 카로티노이드)를 섭취함으로써 극복할 수 있다 (Stephenson et al. 2000, Parasitology 121 Suppl:S5-22). 이미 90 여년 전에 고구마가 쥐의 VAD 현상을 극복한다는 것이 알려졌으며 (Steenbock 1919, Science 50:352-353), 케냐에서는 황색 고구마를 년 중 섭취 가능한 가장 경제적인 베타카로틴의 재료로 규정하고 이를 널리 홍보하고 있다 (Solomons and Bulux 1997, Eur J Clin Nutr 51 Suppl 4:S39-45).

고구마는 카로티노이드의 대부분이 비타민 A로의 전환 활성이 가장 높은 베타카로틴으로 구성되어 있어 다른 식물보다 훨씬 훌륭한 비타민 A의 섭취원이다. 따라서 Van Jaarsveld (2005, Am J Clin Nutr 81:1080-1087) 등은 황색고구마의 소비를 증가시키는 것이 개발도상국가에서 음식을 통하여 비타민 A 결핍을 해소하는 가장 효율적인 전략이라고 결론지었다. 붉은색, 노란색, 주황색으로 나타나는 카로티노이드는 식물체에서 이소프레노이드의 생합성을 통해 만들어지며 지질 산화 라디칼과 활성산소종을 제거하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Ben-Amotz and Fishler 1998, Radiat Environ Biophys 37:187-193).

식물에서의 카로티노이드는 광합성계의 필수성분이면서 과일과 꽃의 휘발성 성분, 식물호르몬인 ABA의 전구물질, provitamin A의 전구체서로 식물 자체뿐만 아니라 인간을 비롯한 동물에게도 매우 유용한 물질이다. 베타카로틴, 라이코펜, 루테인과 같은 카로티노이드들은 강력한 항산화 효능으로 영양소뿐 아니라 암, 심장질환, 눈 질환과 같은 산업적으로 널리 이용되는 중요한 물질이다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 고구마 유래의 신규한 베타카로틴 히드록실라아제 부분 유전자를 분리하고, 상기 유전자의 발현을 조절하여 베타카로틴 함량을 선택적으로 높임으로써 기능성 활성물질의 생산을 증대시키고 항산화 활성이 증가된 식물체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고구마 유래의 베타카로틴 히드록실라아제 (β-carotene hydroxylase) 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 RNAi 벡터를 이용한 식물의 베타카로틴 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 RNAi 벡터로 형질전환되어, 베타카로틴 함량이 증가된 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 신황미 고구마 유래 베타카로틴 히드록실라아제 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 형질전환체는 유용 생리활성 물질인 베타카로틴의 함량을 선택적으로 증가시킬 뿐만 아니라 높은 항산화 활성을 보이는 것을 확인함으로써 본 발명의 형질전환 캘러스는 고염과 같은 환경 스트레스에 내성이 강한 식물체 개발에 응용될 수 있을 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 유래의 베타카로틴 히드록실라아제 (β-carotene hydroxylase) 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 베타카로틴 히드록실라아제 단백질의 범위는 고구마 (Ipomoea batatas)로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 본 발명은 상기 베타카로틴 히드록실라아제 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 고구마의 베타카로틴 함량을 증가시키는데 관여하며, 베타카로틴 히드록실라아제 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구 체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 베타카로틴 히드록실라아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적 인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니 콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 베타카로틴 히드록실라아제 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 벡터를 제공한다. RNA 간섭(RNA interfernce)은 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA와 이에 대한 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중나선 RNA(double strand RNA, dsRNA)를 세포 등에 도 입하여 표적 유전자 mRNA의 분해를 유도함으로써 단백질의 발현을 억제할 수 있는 현상이다. RNAi를 이용한 유전자 녹-다운 방법은 간편하고 유전자의 발현 억제 효과가 우수하기 때문에, 최근에 각광받고 있는 방법이다. 상기 재조합 식물 RNAi 벡터는 바람직하게는 도 5에 기재된 것이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 본 발명의 베타카로틴 히드록실라아제 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 벡터로 식물을 형질전환하여, 베타카로틴 히드록실라아제의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 식물의 베타카로틴 함량을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 식물은 바람직하게는 고구마이다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물이다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 베타카로틴 히드록실라아제 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 벡터로 형질전환되어, 베타카로틴 함량이 증가된 식물체를 제공한다. 상기 식물체는 바람직하게는 고구마이다.

본 발명은 또한, 베타카로틴 함량이 증가된 식물체로부터 얻은 종자를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 고구마 유래 베타카로틴 히드록실라아제 부분 cDNA를 제공한다. 본 발명의 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 부분 길이는 371 bp의 cDNA가 123 아미노산을 코딩하고 있다 (도 1). 유전자를 데이터베이스에서 블라스트한 결과 여러 식물체의 베타카로틴 히드록실라아제와 높은 상동성을 보였다 (도 2). 또한, 본 발명의 베타카로틴 히드록실라아제의 코딩 부분의 아미노산 서열을 블라스트 (BlastX)로 조사하였을 때 나팔꽃(Ipomoea nil) 의 putative 유전자와 99%의 가장 높은 상동성을 보였으며 감 (Diospyros kaki), 용담(Gentiana lutea), 커피(Coffee arabica), 시트러스(Citrus unshiu) 등과도 80% 이상의 높은 상동성을 보였다 (도 3).

본 발명의 베타카로틴 히드록실라아제 유전자는 줄기를 제외한 잎과 뿌리에 강하게 발현되는 유전자임을 확인하였다 (도 4).

본 발명의 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 벡터를 제작하였다 (도 5).

본 발명의 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 벡터를 형질전환한 캘러스로부터 genomic DNA를 추출하여 PCR 분석하였다. 베타카로틴 히드록실라아제 RNAi 형질전환체의 경우 3, 5, 6, 7, 10, 23, 38 캘러스에서 PCR 산물이 확인되었다 (도 6).

본 발명의 베타카로틴 히드록실라아제 RNAi 형질전환 캘러스를 대조구인 율미 캘러스와 비교한 결과 형질전환 캘러스들이 베타카로틴의 생산으로 진한 노란색의 표현형을 나타내는 것을 확인하였다 (도 7). 따라서 본 발명에서 클로닝하여 제작한 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 RNAi 벡터 도입으로 베타카로틴의 생합성이 증가하여 캘러스가 노란색을 나타내는 것을 확인하였다.

본 발명의 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 형질전환 캘러스를 대상으로 RT-PCR을 통해 실제로 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 발현이 억제되었는지를 확인하였다. 베타카로틴 히드록실라아제 형질전환 캘러스의 경우 모든 캘러스 (5, 7, 38)에서 유전자의 발현이 완전히 억제된 것을 확인하였다 (도 8).

본 발명의 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 형질전환 캘러스를 대상으로 HPLC를 이용하여 베타카로틴 생산을 분석하였다. 대조구인 율미 캘러스에서 보이지 않는 피크가 retention time 12.5 min에서 보였으며 authentic 베타카로틴과의 비교 분석으로 새롭게 나타난 피크가 베타카로틴이라는 것을 확인하였다. 이로써 베타카로틴 히드록실라아제 발현을 억제시킨 형질전환 캘러스의 베타카로틴 함량이 증가한 것을 확인할 수 있었다 (도 9).

본 발명의 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 형질전환 캘러스를 대상으로 저분자 항산화 활성을 나타내는 DPPH 라디칼 소거 활성을 조사한 결과, 대조구인 율미보다 2-4 배 이상 활성이 높음을 확인하였고 이는 베타카로틴 함량이 높은 신황미 품종의 활성과 비슷한 수준임을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 베타카로틴 함량이 증가된 형질전환체가 실제로 저분자 항산화 활성도 함께 증가되었음을 확인하였다 (도 10).

본 발명의 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 형질전환 캘러스에 150 mM과 200 mM의 NaCl을 각각 처리한 후 DAB 염색을 통한 세포 내의 산화 정도를 측정하였다. 그 결과 대조구인 율미 캘러스가 세포 내의 활성 산소종의 증가로 인한 DAB의 갈변이 형질전환 캘러스보다 훨씬 많이 진행됨을 확인할 수 있었다 (도 11A). 구체 적으로 산화된 DAB 양을 측정한 결과 전반적으로 150 mM의 NaCl 처리에서보다 200 mM의 NaCl 처리에서 세포 내의 산화 스트레스에 의한 DAB의 산화도가 높았다. 또한 산화된 DAB의 양을 측정한 결과 대조구에 비해 1/2에서 1/5 이상으로 감소하였음을 확인할 수 있었다 (도 11B). 따라서 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 발현을 억제한 형질전환 캘러스가 베타카로틴의 함량이 증가하면서 항산화 활성이 증가하여 세포 내의 활성 산소종을 제거하는 능력이 증가하였음을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명이 유전자의 발현 조절을 통한 베타카로틴 함량을 높임으로써 기능성 향상뿐만 아니라 환경스트레스에 내성이 강한 식물체 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 본다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 고구마 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 클로닝 , 염기서열 분석 및 유연관계 분석

고구마 (Ipomoea batatas (L.) Lam) 품종 신황미 식물체의 잎에서 QIAGEN사의 RNeasy Mini Kit를 이용하여 total RNA를 분리하였다. Invitrogen의 RT-PCR용 SuperScript III First-Strand Synthesis System을 이용하여 first cDNA를 합성하였다. 베타카로틴 히드록실라아제 유전자를 분리하기 위해, TIGR Plant Transcript Assemblies의 웹사이트 (http://plantta.tigr.org/)에서 토마토 (Lycopersicon esculentum)의 베타카로틴 히드록실라아제 유전자를 가지고 블라스트 하였다. 그 결과 고구마와 가까운 나팔꽃 (Ipomoea nil)의 EST 클론으로부터 베타카로틴 히드록실라아제 유전자와 비슷한 염기서열을 갖는 클론을 찾았고 이 유전자들을 고구마로부터 클로닝하기 위한 PCR 프라이머를 제작하였다. 프라이머의 염기서열에는 Invitrogen의 gateway expression system을 이용하기 위해 5' 말단에 어댑터 서열 (대문자로 표시)을 각각 추가하였다. 염기서열은 베타카로틴 히드록실라아제 정방향 프라이머 (5'-CAAAAAAGCAGGCTNN aagttccgtatactgagatgttc-3'; 서열번호 3)와 역방향 프라이머 (5'-CAAGAAAGCTGGGTN cactctcctaaaataaggcacgtc-3'; 서열번호 4)이다. Clonetech 사의 advantage2 polymerase를 이용하여 PCR을 수행하였고 기대한 크기의 PCR 산물을 pGEMeasy cloning vector (promega) 를 이용하여 클로닝한 후 시퀀싱하여 염기서열을 확인하였다. 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 부분 길이는 371 bp의 cDNA가 123 아미노산을 코딩하고 있다 (도 1). 유전자를 데이터베이스에서 블라스트한 결과, 여러 식물체의 베타카로틴 히드록실라아제와 높은 상동성을 보였다 (도 2). 또한 본 발명의 베타카로틴 히드록실라아제의 코딩 부분의 아미노산 서열을 블라스트 (BlastX)로 조사하였을 때 나팔꽃(Ipomoea nil)의 putative 유전자와 99%의 가장 높은 상동성을 보였으며 감 (Diospyros kaki), 용담(Gentiana lutea), 커피(Coffee arabica), 시트러스(Citrus unshiu) 등과도 80% 이상의 높은 상동성을 보였다 (도 3).

실시예 2: 고구마 조직별 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 발현 분석

본 발명의 고구마 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 조직별 발현양상을 분석하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. QIAGEN사의 RNeasy Mini Kit를 이용하여 total RNA를 분리하고 Invitrogen 사의 RT-PCR용 SuperScript III First-Strand Synthesis System을 이용하여 first cDNA를 합성하였다. 프라이머의 염기서열은 베타카로틴 히드록실라아제 정방향 프라이머 (5'-aagttccgtatactgagatgttc-3'; 서열번호 5)와 역방향 프라이머 (5'-cactctcctaaaataaggcacgtc-3'; 서열번호 6)이다.

그 결과 본 발명의 베타카로틴 히드록실라아제 유전자는 줄기를 제외한 잎과 뿌리에 강하게 발현되는 유전자임을 확인하였다 (도 4).

실시예 3: 고구마 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 식물발현벡터 제작 및 형질전환체 개발

본 발명의 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 벡터를 제작하였다 (도 5). 먼저 베타카로틴 히드록실라아제의 유전자가 클로닝되어 있는 pDONR207 벡터를 BP 반응시켜 pDONR207 벡터에 유전자를 클로닝하였다. 이후 pDONR207와 RNAi 벡터인 pH7GWIWG2(I)의 LR 반응으로 클로닝한 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 RNAi 벡터를 제작하였다. RNAi 벡터를 아그로박테리움 매개로 율미(Ym) 캘러스에 형질전환하고 항생제 선발하였다. 형질전환한 캘러스를 대상으로 (주)인트론바이오테그놀로지사의 G-spin^TM IIp Genomic DNA Extraction Kit (식물용)를 이용하여 genomic DNA를 주출한 후 유전자 특이적 프라이머를 가지고 PCR 분석하였다. 베타카로틴 히드록실라아제 RNAi 형질전환체의 경우 3, 5, 6, 7, 10, 23, 38 형질전환 캘러스에서 PCR 산물이 확인되었다 (도 6). 따라서 형질전환을 시도한 캘러스들에 베타카로틴 히드록실라아제 RNAi 벡터가 도입되었음을 확인하였다.

실시예 4: 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 발현 억제로 인한 베타카로틴 함량 증가

본 발명의 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 발현 억제가 실질적으로 베타카로틴의 함량이 증가되었는지를 확인해보기 위해, 대조구 캘러스인 율미와 표현형을 비교해 본 결과 genomic DNA PCR을 통해 확인된 형질전환 캘러스의 색이 진한 노란색을 나타내는 것을 알 수 있었다 (도 7). 또한 실제로 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 발현이 억제되었는지를 확인하기 위해 상기 실시예 1의 방법으로 형질전환한 캘러스로부터 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과 베타카로틴 히드록실라아제 형질전환 캘러스의 경우 모든 캘러스 (5, 7, 38)에서 유전자의 발현이 완전히 억제된 것을 확인하였다 (도 8). 이로써 본 발명의 베타카로틴 히드록실라아제 RNAi 벡터 도입으로 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 발현이 억제되었음이 확인되었다.

또한 형질전환 캘러스 색의 변화가 베타카로틴의 함량 증가로 인한 것인지를 확인하기 위해, HPLC를 이용하여 캘러스의 카로티노이드 분석을 하였다. 대조구인 율미 캘러스와 형질전환된 캘러스를 100% 아세톤으로 추출한 후 5% THF를 포함하는 아세토니트릴의 이동상에서 C18 컬럼 (Alltech, Apollo C18 5u column, 250mm X 4.6mm)에 주입하여 450 nm에서 흡광도를 구하고 β-카로틴을 이용한 표준곡선으로 비교분석하였다. 그 결과 대조구인 율미 캘러스에서 보이지 않는 retention time 12.5 min 위치의 피크가 형질전환 캘러스의 추출액에서 보였으며 authentic β-카로틴과의 비교분석으로 이 새로운 피크가 β-카로틴임을 확인하였다 (도 9).

실시예 5: 형질전환 캘러스의 베타카로틴 함량 증가로 인한 항산화 활성 증가

본 발명의 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 형질전환 캘러스를 대상으로 저분자 항산화 활성을 나타내는 DPPH 라디칼 소거 활성을 조사하였다. 베타카로틴이 항산화 활성이 높은 점에 착안하여 실제로 형질전환 캘러스가 베타카로틴의 함량 증가로 인한 항산화 활성이 높아졌는지를 확인하기 위해, 율미 캘러스와 형질전환 캘러스를 대상으로 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하여 저분자 항산화 활성을 분석하고 150 mM과 200 mM의 NaCl을 각각 처리한 후 항산화 활성을 비교하였다. 율미와 형질전환 캘러스를 100% 메탄올로 추출한 후 10 mM의 DPPH 용액에 30분간 반응시킨 후 남아있는 DPPH 양을 계산하여 저분자 항산화 활성을 측정하였으며 활성은 아스코브산에 상응하는 값으로 표현하였다. 그 결과 대조구인 율미보다 2-4 배 이상 활성이 높음을 확인하였고 이는 베타카로틴 함량이 높은 신황미 품종(Hm)의 활성과 비슷한 수준임을 알 수 있었다 (도 10). 따라서 본 발명의 베타카로틴 함량이 증가된 형질전환체가 실제로 저분자 항산화 활성도 함께 증가되었음을 확인하였다.

또한 NaCl을 처리한 캘러스를 대상으로 활성 산소종과 반응하여 산화되면 갈 변하는 DAB으로 염색한 후 표현형을 비교하였다. 그 결과 대조구인 율미 캘러스가 세포 내의 활성 산소종의 증가로 인한 DAB의 갈변이 형질전환 캘러스보다 훨씬 많이 진행됨을 확인할 수 있었다 (도 11A). 구체적으로 산화된 DAB 양을 측정한 결과 전반적으로 150 Mm의 NaCl 처리에서보다 200 mM의 NaCl 처리에서 세포 내의 산화스트레스에 의한 DAB의 산화도가 높았다. 또한 산화된 DAB의 양을 측정한 결과 대조구에 비해 1/2에서 1/5 이상으로 감소하였음을 확인할 수 있었다 (도 11B). 따라서 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 발현을 억제한 형질전환 캘러스가 베타카로틴의 함량이 증가하면서 항산화 활성이 증가하여 세포내의 활성 산소종을 제거하는 능력이 증가하였음을 확인할 수 있었다.

도 1은 본 발명의 고구마 (품종 신황미) 유래 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 부분 서열이다.

도 2는 본 발명의 고구마 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 추론된 단백질의 아미노산 서열과 여러 식물(나팔꽃, 토마토, 포도, 콩, 포플러, 커피, 당근, 감자, 시트러스, 애기장대, 양배추, 옥수수, 벼외 9종)의 베타카로틴 히드록실라아제 유전자 아미노산 서열을 비교한 그림이다.

도 3은 도 2에서 비교한 베타카로틴 히드록실라아제 유전자 사이의 유연관계를 나타낸 그림이다.

도 4는 고구마 식물체에서 본 발명의 베타카로틴 히드록실라아제 유전자가 조직별 발현하는 양상을 RT-PCR을 수행하여 전기영동한 사진이다. L, leaf (잎); S, stem (줄기); FR, fibrous roots (실뿌리); SR, storage roots (저장뿌리).

도 5는 식물체 내에서 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 발현을 억제하기 위한 형질전환벡터 (RNAi) 제작에 관한 그림이다.

도 6은 genomic DNA PCR을 통해 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 RNAi 벡터 형질전환 캘러스를 선발한 그림이다.

도 7은 형질전환 캘러스가 베타카로틴 함량 증가로 인해 노란색의 표현형을 나타내는 그림이다.

도 8은 형질전환 캘러스를 대상으로 RT-PCR을 통해 베타카로틴 히드록실라아제 유전자의 발현을 조사한 결과이다.

도 9는 형질전환 캘러스를 대상으로 HPLC 분석을 통해 베타카로틴의 생산을 분석한 결과이다.

도 10은 형질전환 캘러스를 대상으로 DPPH 라디칼 소거 활성 조사를 통한 저분자 항산화 활성을 분석한 결과이다.

도 11은 형질전환 캘러스에 150 mM 과 200 mM의 NaCl을 각각 처리한 후 표현형(A)을 살펴보고 산화된 DAB 함량(B)을 분석한 결과이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Beta-carotene hydroxylase gene increasing beta-carotene content of plants and uses thereof <130> PN09247 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 371 <212> DNA <213> Ipomoea batatas <400> 1 aagttccgta tactgagatg ttcgggacat ttgctctctc cgtcggagcc gcggtgggaa 60 tggaattctg ggccagatgg gctcacagag cgctatggca cgcttcgttg tggcacatgc 120 acgagtctca ccacaaacca agagaaggac cgttcgagct caacgatgtt ttcgccataa 180 ctaacgctgt ccctgccatc gctctcctct cctacggttt cttccacaaa ggtctcgttc 240 ctggcctctg cttcggagct gggcttggaa tcacagtgtt cgggatggcc tacatgttcg 300 tccacgatgg cctcgttcac aagcgattcc ccgtggggcc catcgccgac gtgccttatt 360 ttaggagagt g 371 <210> 2 <211> 123 <212> PRT <213> Ipomoea batatas <400> 2 Val Pro Tyr Thr Glu Met Phe Gly Thr Phe Ala Leu Ser Val Gly Ala 1 5 10 15 Ala Val Gly Met Glu Phe Trp Ala Arg Trp Ala His Arg Ala Leu Trp 20 25 30 His Ala Ser Leu Trp His Met His Glu Ser His His Lys Pro Arg Glu 35 40 45 Gly Pro Phe Glu Leu Asn Asp Val Phe Ala Ile Thr Asn Ala Val Pro 50 55 60 Ala Ile Ala Leu Leu Ser Tyr Gly Phe Phe His Lys Gly Leu Val Pro 65 70 75 80 Gly Leu Cys Phe Gly Ala Gly Leu Gly Ile Thr Val Phe Gly Met Ala 85 90 95 Tyr Met Phe Val His Asp Gly Leu Val His Lys Arg Phe Pro Val Gly 100 105 110 Pro Ile Ala Asp Val Pro Tyr Phe Arg Arg Val 115 120 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 caaaaaagca ggctnnaagt tccgtatact gagatgttc 39 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 caagaaagct gggtncactc tcctaaaata aggcacgtc 39 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 aagttccgta tactgagatg ttc 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 cactctccta aaataaggca cgtc 24

Claims

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서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 고구마(Ipomoea batatas) 유래의 베타카로틴 히드록실라아제 (β-carotene hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 벡터로 고구마 식물을 형질전환하여, 베타카로틴 히드록실라아제의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 고구마 식물의 베타카로틴 함량을 증가시키는 방법.
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서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 고구마(Ipomoea batatas) 유래의 베타카로틴 히드록실라아제 (β-carotene hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 벡터로 형질전환되어, 베타카로틴 함량이 증가된 고구마 식물체.
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제9항에 따른 고구마 식물체의 종자.