CN102061289A - 增加植物β-胡萝卜素含量的β-胡萝卜素羟化酶基因及其用途 - Google Patents

增加植物β-胡萝卜素含量的β-胡萝卜素羟化酶基因及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN102061289A
CN102061289A CN2010105480331A CN201010548033A CN102061289A CN 102061289 A CN102061289 A CN 102061289A CN 2010105480331 A CN2010105480331 A CN 2010105480331A CN 201010548033 A CN201010548033 A CN 201010548033A CN 102061289 A CN102061289 A CN 102061289A
Authority
CN
China
Prior art keywords
luobusu
plant
gene
carotene
beta
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2010105480331A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102061289B (zh
Inventor
郭尚洙
李幸顺
安荣玉
郑在哲
金善荷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Original Assignee
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB filed Critical Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Publication of CN102061289A publication Critical patent/CN102061289A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102061289B publication Critical patent/CN102061289B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/8265—Transgene containment, e.g. gene dispersal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13129—Beta-carotene 3-hydroxylase (1.14.13.129)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供甘薯的β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase)蛋白质，编码上述蛋白质的基因，含上述基因的重组载体，转化上述重组载体的宿主细胞，含上述基因的重组植物RNAi载体，并且提供利用上述重组植物RNAi载体来增加植物β-胡萝卜素含量的方法，还提供转化上述重组植物RNAi载体的、β-胡萝卜素含量增加的植物体及其种子。

Description

增加植物β-胡萝卜素含量的β-胡萝卜素羟化酶基因及其用途
技术领域
本发明涉及来源于具有高含量类胡萝卜素的新黄美甘薯品种的β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase)基因，具体地涉及通过抑制β-胡萝卜素的分解酶，即β-胡萝卜素羟化酶的表达(expression)，进而提高植物体内β-胡萝卜素含量的方法。
背景技术
经济水平提高后，人们的饮食生活变得多样化且饮食生活水平逐渐提高，随着消费者对健康食品需求的增大，抗氧化物质、β-胡萝卜素及膳食纤维的优点被广泛普及，人们对作为健康食品的甘薯有了新的认识。
甘薯的块茎状根的营养除水分之外，大部分为作为热量供给源的碳水化合物，是高热量的食品，特别是β-胡萝卜素和各种无机物质、维生素及膳食纤维的含量并不逊色于其他作物，并且甘薯的叶与叶柄作为蔬菜的利用价值很高。
并且含有大量维生素B、维生素C、钙、铁等成分，并且含有花青素等类黄酮类或绿原酸(chlorogenic acid)等数种多酚类物质。(Bovell-Benjamin2007，Adv Food Nutr Res 52：1-59)。肉质为黄色的甘薯品种含有高含量的类胡萝卜素成分，全世界范围内在克服维生素A缺乏方面(vitaminA deficiency，VAD)起到了重要的作用。
在发展中国家，VAD会导致一时性或永久性失明，特别是对于儿童、孕妇、哺乳期女性来说更加致命。全世界很多人因为VAD而受苦，这可以通过摄取维他命原A(β-胡萝卜素或其他类胡萝卜素)来克服(Stephenson et al.2000，Parasitology 121 Suppl：S5-22)。早在90年前就已知甘薯可以克服老鼠的VAD现象(Steenbock 1919，Science 50：352-353)，在肯尼亚将黄色甘薯定为每年可以摄取的最经济的β-胡萝卜素的原料，并将其进行广泛宣传(Solomons and Bulux1997，Eur J Clin Nutr 51 Suppl 4：S39-45)。
甘薯是由类胡萝卜素的大部分转换为维生素A的转换活性最高的β-胡萝卜素而构成，是比其他植物更优秀的维生素A摄取源。并且Van Jaarsveld(2005，Am J Clin Nutr 81：1080-1087)等指出在发展中国家加大黄色甘薯的消费是最有效的通过饮食消除维生素A缺乏的战略方法。表现为红色，黄色，朱黄色的类胡萝卜素在植物体中通过类异戊二烯的生物合成而得到，被广泛地认为在去除脂质氧化自由基及活性氧上起到重要作用(Ben-Amotz and Fishler 1998，RadiatEnviron Biophys 37：187-193)。
植物中的类胡萝卜素是光合作用系的必要成分，并且是水果及花的挥发性成分，作为植物荷尔蒙ABA的前体物和provitaminA的前体物，不仅对植物体本身，对包括人类在内的动物也是非常有用的物质。如β-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素等类胡萝卜素类成分具有很强的抗氧化功效，不仅作为营养素，在癌症、心脏疾患、眼疾病方面也是被广泛利用的重要物质。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明是由如上所述的要求而导出，本发明的完成实现于对来源于甘薯的新型β-胡萝卜素羟化酶的片段基因进行解析，通过调节上述基因的表达(expression)，选择性地提高β-胡萝卜素的含量，进而增大机能性活性物质的生产，致使开发抗氧化活性增强的植物体。
(二)技术方案
为解决上述问题，本发明提供一种来源于甘薯的β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase)蛋白质。
并且，本发明还提供编码上述蛋白质的基因。
并且，本发明还提供含有上述基因的重组载体。
并且，本发明还提供转化上述重组载体的宿主细胞。
并且，本发明还提供含有上述基因的重组植物RNAi载体
并且，本发明还提供利用上述重组植物RNAi载体，提高植物β-胡萝卜素含量的方法。
并且，本发明还提供转化上述重组植物RNAi载体的，β-胡萝卜素含量增加的植物体及其种子。
(三)有益效果
根据本发明，抑制编码本发明中的新黄美甘薯的β-胡萝卜素羟化酶蛋白质的基因表达的转化体(transformant)，不仅能够选择性地增加作为生理活性物质的β-胡萝卜素的含量，并且已确定其具有很强的抗氧化活性，因此本发明中的转化愈伤组织可以应用于开发对如高盐等环境，具有强耐受性的植物。
附图说明
图1为本发明中来源于甘薯(品种为新黄美)的β-胡萝卜素羟化酶基因的部分序列。
图2为由本发明中甘薯β-胡萝卜素羟化酶基因推测得到的蛋白质的氨基酸序列表与各种植物(牵牛花、番茄、葡萄、豆子、杨树、咖啡豆、胡萝卜、土豆、柑橘、水芹菜、甘蓝、玉米、水稻外9种)的β-胡萝卜素羟化酶基因氨基酸序列的比对图。
图3为在图2中进行比较的β-胡萝卜素羟化酶基因之间的亲缘关系的示意图。
图4为在甘薯植物体中，通过RT-PCR对本发明中的β-胡萝卜素羟化酶基因按组织形态分类表达所得到的电泳照片。L，叶子；S，茎；FR，须根；SR，贮藏根。
图5为在植物体内抑制β-胡萝卜素羟化酶基因的表达而构建转化载体(RNAi)的相关图。
图6为通过基因组DNA PCR选出β-胡萝卜素羟化酶基因的RNAi载体转化愈伤组织的图。
图7为转化愈伤组织由于β-胡萝卜素含量的增加表现为黄色的图。
图8为以转化愈伤组织为对象，通过RT-PCR调查β-胡萝卜素羟化酶基因表达的结果图。
图9为以转化愈伤组织为对象，通过HPLC分析，进而分析β-胡萝卜素生产的结果图。
图10为以转化愈伤组织为对象，通过DPPH自由基消除活性调查分析低分子抗氧化活性的结果图。
图11为在转化愈伤组织分别进行150mM和200mM的NaCl处理后，观察表型(A)再分析氧化的DAB含量(B)的结果图。
具体实施方式
为达到本发明的目的，本发明提供一种来源于甘薯(Ipomoeabatatas)的β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase)蛋白质。
本发明中β-胡萝卜素羟化酶蛋白质的范围包括具有用从甘薯(Ipomoea batatas)分离的SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的蛋白质及同等活性的上述蛋白质的衍生物。
所谓“同等活性衍生物”是指经过氨基酸的添加、置换或缺失，与上述SEQ ID No.2表示的氨基酸序列至少有70％以上的序列同源性，优选为80％以上，更优选为90％以上，最优选为95％以上。与用SEQ ID No.2表示的蛋白质实质性地具有同质的生理活性的蛋白质。
并且本发明还提供编码上述β-胡萝卜素羟化酶蛋白质的基因。本发明中的基因是与甘薯β-胡萝卜素含量的增加有关，编码β-胡萝卜素羟化酶蛋白质的基因组DNA和cDNA都包括在内。优选地，本发明中上述碱基序列的突变包括在本发明的范围之内。具体地，上述基因可包括与SEQ ID No.1的碱基序列分别具有70％以上的相同性的碱基序列。优选为80％以上，更优选为90％以上，最优选为95％以上。对于多核苷酸的“序列相同性的％”通过两个最优排列的序列和比对区域进行比对而确定，在比对区域中的多核苷酸序列的一部分与对于两个序列的最优排列的参考序列(不包括添加或删除)相比可以包括添加或删除(即，缺隙(gap))。
并且，本发明提供含有本发明中的β-胡萝卜素羟化酶基因的重组载体。
术语“重组”是指细胞复制不同种类的核酸或表达上述核酸或表达肽、不同种类的肽或表达不同种类的核酸进行编码的蛋白质的细胞。重组细胞可以将在上述细胞的天然形态中没有被发现的基因或基因片段，可以用正义或反义形态表达。并且重组细胞能够表达从天然状态的细胞中发现的基因，但上述基因是经过变形的，是通过人为手段重新导入到细胞内部的。
术语“载体”是指向细胞内传递的DNA片段，指核酸分子时使用。载体对DNA进行复制，能够独立地在宿主细胞中再生产。术语“传达体”通常与“载体”互换使用。术语“表达载体”是指包括能够在目标编码序列和特定宿主植物中可动性地进行连接的，对表达编码序列所必需的适合的核酸序列重组DNA分子。在真核细胞中可利用的信号有启动子(启动子、增强子、终止子及多腺苷酸化信号。这是公知的。
重组载体的优选的例子有如土壤杆菌属一样的，存在于适当的宿主时，能将本身的一部分，所谓T-区转移到植物细胞中的Ti-质粒载体。其他类型的Ti-质粒载体(参照EP 0116718B1号)是将现有植物细胞或杂种DNA适当地嵌入到植物的基因组内的作为能够产生新的植物的原生质体，应用于转移杂种DNA序列。
Ti-质粒载体最优选的形态为如EP 0120516B1号及美国专利第4,940,838号所申请的所谓二元载体。能够将本发明涉及的DNA导入到植物宿主中的另一适合的载体有来自于双链植物病毒(例如，CaMV)及单链病毒及双生病毒等的病毒载体，例如可选自非完全性植物病毒载体。在难以将植物宿主进行适当地转化时使用这种载体特别有利。
表达载体优选地包括一个以上的选择性标记。上述标记通常情况下作为具有用化学方法可以选择的特性的核酸序列，所有可以区别被转化的细胞和没有被转化的细胞的基因都能与之对应。例如有像草甘膦(glyphosate)或草胺膦(phosphinothricin)等除草剂抗性基因，像卡那霉素(kanamycin)、G418、伯莱霉素(Bleomycin)、潮霉素(hygromycin)、氯霉素(chloramphenicol)等抗生素抗性基因，但并不仅限于这些。
本发明中的重组载体中，启动子可以为CaMV 35S、肌动蛋白、泛蛋白、pEUM、MAS或组蛋白启动子等，但并不仅限于此。
术语“启动子”意味着结构基因的DNA上游区域，是指为了开始转录，与RNA聚合酶结合的DNA分子。“植物启动子”是指在植物细胞中能够开始转录的启动子。“组成型启动子”是在大部分环境条件及发育状态或细胞分化条件下具有活性的启动子。
转化体的选择可根据各阶段的各种组织而构成，因此本发明中的启动子可以优选为组成型启动子。并且组成型启动子不限制选择可能性。
在本发明中的重组载体中，可使用常规的终止子，例如有一氧化氮合成酶(NOS)、水稻α-淀粉酶RAmyl A终止子、菜豆碱终止子(Phaseoline)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的章鱼碱(Octopine)基因的终止子等，但并不仅限于此。
有关终止子的必要性，其领域是为了增加植物细胞中的转录的确定性及效率，这是一般所公知的。因此终止子的使用在本发明的内容中是非常优选的。
并且，本发明还提供转化上述重组载体的宿主细胞。将本发明中的重组载体安定于原核细胞上，能够连续无性繁殖及表达的宿主细胞可以使用业界公知的任意一种宿主细胞，例如有，如E.coli JM109、E.coli BL21、E.coli RR1、E.coli LE392、E.coli B、E.coli X 1776、E.coli W3110、枯草芽胞杆菌、苏云金杆菌等杆菌属菌株，还有，如鼠伤寒沙门(氏)菌、粘质沙雷菌及多样的假单胞菌属等肠内菌科菌株等。
并且，将本发明中的载体转化到真核细胞中的情况下，作为宿主细胞可以利用酵母((Saccharomyce cerevisiae)、昆虫细胞、人细胞(例如，CHO细胞株(中华仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary))、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN及MDCK细胞株)及植物细胞等。宿主细胞优选为植物细胞。
将本发明中的载体向宿主细胞内运输的方法，当宿主细胞是原核细胞时，可采用CaCl2方法、哈纳汉方法(Hanahan，D.，J.Mol.Biol.，166：557-580(1983))及电穿孔方法等。并且宿主细胞为真核细胞时，可采用显微注射法、磷酸钙沉淀法、电穿孔法、脂质体-介导的形质感染法、DEAE-右旋糖苷处理法及基因枪法等方法将载体注入进宿主细胞内。
并且，本发明还提供含有本发明涉及的β-胡萝卜素羟化酶基因的重组植物RNAi载体。
RNA干扰(RNA interfernce)是指将具有与靶基因mRNA相同的序列的正义RNA和与之对应的具有互补序列的反义RNA构成的双链RNA(double strand RNA，dsRNA)注入到细胞中，进而诱导靶基因mRNA的降解来抑制蛋白质表达的现象。
利用RNAi的基因抑制方法不仅简便，对基因表达的抑制效果也很优秀，是最近非常受欢迎的方法。上述重组植物RNAi载体优选为图5中所记载的载体，但并不仅限于此。
并且，本发明还提供利用含本发明涉及的β-胡萝卜素羟化酶基因的重组植物RNAi载体对植物进行转化，提供一种包括抑制β-胡萝卜素羟化酶的表达阶段的植物的，增加β-胡萝卜素含量的方法。上述植物优选为甘薯。
植物的转化表示将DNA转移到植物中的任意的方法。这样的转化方法不一定必需再生及(或)组织培养时间。植物的转化现在不仅是针对双子叶植物的，而对包括单子叶植物的植物种也都是普遍的。原则上，任意的转化方法可利用于将有关本发明的杂种DNA导入到适当的初始细胞中。采用的方法可从对原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.et al.，1982，Nature 296，72-74；Negrutiu I.et al.，June1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)、原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.et al.，1985 Bio/Technol.3，1099-1102)、作为植物要素的显微注射法(Crossway A.et al.，1986，Mol.Gen.Genet.202，179-185)、各种植物要素的(被编译了DNA或RNA)粒子冲击法、或依靠植物的浸润或成熟的花粉或小孢子的转化的，以根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)为介导的基因转移(非完全性)，由病毒引起的感染(EP0301316号)等方法中做适当的选择。关于本发明优选的方法为包括以农杆菌为介导的DNA传递。特别优选的方法为如EP A 120516号及美国专利第4,940,838号所记载的利用所谓二元载体的技术。
用于植物的转化的“植物细胞”可采用任意一种植物细胞。植物细胞为培养细胞、培养组织、培养器官或整个植物体。
“植物组织”可为分化的或未分化的植物组织，例如，包括根、茎、叶、花粉、种子、瘤组织及用于培养的多样形态的细胞，即单一细胞，原生质体(protoplast)、种子及愈伤组织，但并不限于此。植物组织可为植物体(in planta)或器官培养，组织培养或细胞培养状态。
并且，本发明还提供转化含β-胡萝卜素羟化酶基因的重组植物RNAi载体的，β-胡萝卜素含量增加的植物。上述植物优选为甘薯。
并且，本发明还提供由β-胡萝卜素含量增加的植物得到的种子。
下面，将对本发明进行详细说明。
本发明提供来源于甘薯的β-胡萝卜素羟化酶的cDNA片段。本发明中的β-胡萝卜素羟化酶基因片段长度为371bp，编码123个氨基酸(图1)。将基因在数据库中进行Blast比对，结果表明其与各个植物中的β-胡萝卜素羟化酶高度同源(图2)。并且，用Blast(BlastX)对本发明中的β-胡萝卜素羟化酶的编码片段的氨基酸序列进行比对调查时，与牵牛花的putative基因有99％的最高同源性，对柿子、龙胆、咖啡、蜜桔等也有80％以上的很高的同源性。(图3)
本发明所涉及的β-胡萝卜素羟化酶基因确认为除了茎以外的，尤其在叶子和根部强表达的基因(图4)。
构建了旨在抑制本发明中β-胡萝卜素羟化酶基因表达的RNAi载体。(图5)
从本发明所涉及的旨在抑制β-胡萝卜素羟化酶基因表达的RNAi载体转化的愈伤组织中提取出基因组DNA，并进行PCR分析。在β-胡萝卜素羟化酶基因RNAi转化体中，从3、5、6、7、10、23、38愈伤组织中确认了PCR产物(图6)。
将本发明中的β-胡萝卜素羟化酶RNAi转化愈伤组织与对照的‘栗米’(甘薯品种)愈伤组织进行比较的结果为，确认出转化的愈伤组织因生产β-胡萝卜素显示为深黄色的表现形态(图7)。并且，由于在本发明中导入通过克隆而得的β-胡萝卜素羟化酶基因的RNAi载体，使β-胡萝卜素的生物合成增加，因此确认为愈伤组织呈黄色。
将本发明中的β-胡萝卜素羟化酶基因的转化愈伤组织作为对象，通过RT-PCR实际确认了β-胡萝卜素羟化酶基因的表达是否被抑制。
为β-胡萝卜素羟化酶转化愈伤组织的情况下，确认了所有的愈伤组织(5，7，38)中基因的表达被完全抑制。(图8)
将本发明中的β-胡萝卜素羟化酶基因的转化愈伤组织作为对象，利用HPLC对β-胡萝卜素的生产进行了分析。对照栗米愈伤组织中在保留时间12.5min时没有出现特征峰，并且通过与β-胡萝卜素的标准品的比较分析，确认了新出现的特征峰为β-胡萝卜素。因此可以确认抑制β-胡萝卜素羟化酶基因表达的转化愈伤组织β-胡萝卜素含量的增加(图9)。
以本发明中的β-胡萝卜素羟化酶基因的转化愈伤组织为对象，对表现出低分子抗氧化活性的DPPH自由基(radical)消除活性进行调查的结果为，确认了比对照栗米的活性高出2～4倍以上，可知相当于β-胡萝卜素含量很高的新黄美品种的活性水准。并且，确认了本发明中β-胡萝卜素含量增加的转化体实际上其低分子抗氧化活性也一起增加了(图10)。
对本发明中的β-胡萝卜素羟化酶基因的转化愈伤组织分别用150mM和200mM的NaCl进行处理后，通过DAB染色测定了细胞内氧化程度。结果为，对照栗米愈伤组织由活性氧的增加引起的DAB褐变的进行多于转化愈伤组织。(图11A)。具体地说，对氧化的DAB的量进行测定的结果，总体上，200mM的NaCl的处理中，由细胞内氧化压力引起的DAB氧化程度要高于150mM的NaCl处理。并且，对氧化的DAB的量进行测定的结果，确认出，与对照相比，由减少1/2变成减少到1/5以上(图11B)。并且抑制β-胡萝卜素羟化酶基因表达的转化愈伤组织，随着β-胡萝卜素的含量增加其抗氧化活性也随之增加，可确认细胞内去除活性氧的能力也增加了。
并且，本发明中，通过调节基因的表达，提高β-胡萝卜素含量，不仅提高了机能性，也可以有效应用于开发具有高耐受性的植物体。
下面，通过实施例对本发明进行详细地说明。下述实施例只是对本发明的例示，本发明的内容并不仅限于下列实施例。
实施例1甘薯β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆，碱基序列分析及亲缘关系分析
利用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit，从甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam)新黄美品种植物体的叶子中分离出了总RNA。利用Invitrogen的RT-PCR用SuperScript III First-Strand Synthesis System合成了第一链cDNA。为分离β-胡萝卜素羟化酶基因，在TIGR PlantTranscript Assemblies的网站中(http://plantta.tigr.org/)用番茄(Lycopersicon esculentum)的β-胡萝卜素羟化酶基因进行了Blast比对。结果为，从与甘薯接近的牵牛花(Ipomoea nil)的EST克隆(clone)中，找到了与β-胡萝卜素羟化酶基因具有相似的碱基序列的克隆，并根据这些基因设计了从甘薯中克隆的PCR引物(primer)。
为了利用Invitrogen的gateway表达系统，在引物的碱基序列5’末端各追加了衔接(adapter)序列(用大写表示)。碱基序列为β-胡萝卜素羟化酶正向引物(5′-CAAAAAAGCAGGCTNNaagttccgtatactgagatgttc-3′；SEQ ID No.3)和反向引物(5′-CAAGAAAGCTGGGTN cactctcctaaaataaggcacgtc-3′；SEQ ID No.4)。
利用Clonetech公司的advantage2聚合酶进行了PCR，并利用pGEMeasy克隆载体(promega)将具有目的片段大小的PCR产物进行转化后进行测序，确认了碱基序列。
β-胡萝卜素羟化酶基因的cDNA片段长度为371bp，编码123个氨基酸(图1)。将基因在数据库中进行Blast比对，其与各个植物中的β-胡萝卜素羟化酶表现出了高度同源(图2)。
并且，对本发明中的β-胡萝卜素羟化酶的编码片段的氨基酸序列进行Blast(BlastX)比对调查后，与牵牛花的putative基因有99％之高的同源性，对柿子、龙胆、咖啡、蜜桔等也有80％以上的很高的同源性。(图3)
实施例2按组织分类分析甘薯β-胡萝卜素羟化酶基因的表达
为了分析本发明中的甘薯β-胡萝卜素羟化酶基因的按组织分类的表达模式，进行了RT-PCR。
利用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit，分离了总RNA，利用RT-PCR用SuperScript III First-Strand Synthesis System合成了第一链cDNA。引物的碱基序列为β-胡萝卜素羟化酶正向引物(5′-CAAAAAAGCAGGCTNN aagttccgtatactgagatgttc-3′；SEQ ID No.5)和反向引物(5′-CAAGAAAGCTGGGTN cactctcctaaaataaggcacgtc-3′；SEQ ID No.6)。
结果为，本发明所涉及的β-胡萝卜素羟化酶基因确认为除了茎以外，尤其在叶子和根部表达很强的基因。(图4)
实施例3甘薯β-胡萝卜素羟化酶基因的植物表达载体的构建及转化体的获得
构建了目的在于抑制本发明中的β-胡萝卜素羟化酶基因表达的RNAi载体(图5)。先将克隆有β-胡萝卜素羟化酶基因的pDONR207载体进行BP反应，将基因克隆到pDONR207载体上。之后通过pDONR207和作为RNAi载体的pH7GWIWG2(I)的LR反应构建出了克隆的β-胡萝卜素羟化酶基因的RNAi载体。将RNAi载体以农杆菌(Agrobacterium)为介导转化到栗米愈伤组织(Ym)，并且选取了抗生素。利用IntronBIOtechnology株式会社的G-spinTM IIp基因组提取试剂盒(植物用)，将转化的愈伤细胞作为对象提取出基因组DNA后，用基因特异性引物进行了PCR分析。β-胡萝卜素羟化酶RNAi转化体中，从3、5、6、7、10、23、38的转化愈伤组织中确认了PCR产物(图6)。并且已确认转化的愈伤细胞中导入β-胡萝卜素羟化酶RNAi载体。
实施例4 由β-胡萝卜素羟化酶基因抑制表达引起的β-胡萝卜素含量增加
为了确认本发明中的β-胡萝卜素羟化酶基因的表达抑制后，是否实际上引起了β-胡萝卜素含量的增加，在表型方面，与作为对照愈伤组织的栗米进行了比较，结果为，通过基因组DNA PCR确认的转化愈伤细胞的颜色呈现深黄色(图7)。并且，为确认β-胡萝卜素羟化酶基因是否得到了实际抑制，用上述实施例1的方法从转化的愈伤细胞中提取出RNA，进行了RT-PCR。结果为，在β-胡萝卜素羟化酶转化愈伤组织的情况下，确认出在所有的愈伤细胞(5、7、38)中基因的表达被完全抑制(图8)。因此，可以确认由于本发明中的β-胡萝卜素羟化酶RNAi载体的导入，β-胡萝卜素羟化酶基因的表达被抑制。
并且，为了确认转化愈伤细胞颜色的变化是否是由于β-胡萝卜素含量的增加所引起的，利用HPLC对愈伤组织的类胡萝卜素进行了分析。用100％的丙酮对作为对照的栗米愈伤组织和转化愈伤组织进行萃取后，在包括5％THF的氰化甲烷的移动相上注入到C18柱(Alltech，Apollo C18 5u column，250mm×4.6mm)，在450nm处测定吸光度，用利用β-胡萝卜素的标准曲线进行了比较分析。结果，作为对照的栗米愈伤组织中未在保留时间12.5min处出现特征峰，而在转化的愈伤组织萃取液中出现了该特征峰，再与β-胡萝卜素标准品进行比较后，确认了这个新特征峰为β-胡萝卜素(图9)。
实施例5由转化愈伤细胞的β-胡萝卜素含量增加引起的抗氧化活性增加
以本发明中的β-胡萝卜素羟化酶基因转化愈伤组织为对象，对表现出低分子抗氧化活性的DPPH自由基消除活性进行了调查。着眼于β-胡萝卜素的抗氧化活性高这一特点，为了确认转化愈伤组织实际上是否由β-胡萝卜素含量增加引起了抗氧化活性的提高，以栗米愈伤组织和转化愈伤组织作为对象测定了DPPH自由基消除活性，对低分子抗氧化活性进行了分析，分别进行150mM和200mM的NaCl处理后，做了抗氧化活性比较。将栗米和转化愈伤组织用100％甲醇萃取后，在10mM的DPPH溶液中反应30分钟后，计算剩余的DPPH量，测定了低分子抗氧化活性，活性表现为与抗坏血酸具有相应的值。其结果确认为，比对照的栗米活性高出2～4倍以上，可知达到了相似于β-胡萝卜素含量很高的新黄美品种(Hm)的活性水准(图10)。并且，可以确认本发明中β-胡萝卜素含量增加的转化体，实际上其低分子抗氧化活性也一同增加了。
并且，以进行了NaCl处理的愈伤组织作为对象，与活性氧进行反应而被氧化后，再用褐变的DAB进行染色，对表型进行了比较。结果为对照的栗米愈伤组织内的由活性氧的增加引起的DAB的褐变多于转化愈伤组织中(图11A)。具体地，对氧化的DAB的量进行测定的结果，总体上，200mM的NaCl的处理中由细胞内氧化压力引起的DAB氧化程度要高于在150mM的NaCl处理中的DAB的氧化度。并且对氧化的DAB的量进行测定的结果为，与对照相比，可以确认由减少1/2变成减少1/5以上(图11B)。并且，抑制β-胡萝卜素氧化酶基因表达的转化愈伤组织，随着β-胡萝卜素含量的增加，抗氧化活性也增加，并能够确认细胞内去除活性氧的能力也得到了增加。
Figure ISA00000350119600011

Claims (11)

1.甘薯(Ipomoea batatas)的β-胡萝卜素羟化酶蛋白质，其由SEQID No.2所示的氨基酸序列构成。
2.编码权利要求1中所述的β-胡萝卜素羟化酶蛋白质的基因。
3.如权利要求2中所述的基因，其特征在于，所述基因由SEQ IDNo.1所示的碱基序列构成。
4.含有权利要求2所述基因的重组载体。
5.转化权利要求4所述的重组载体的宿主细胞。
6.含有权利要求2所述基因的重组植物RNAi载体。
7.用重组植物RNAi载体转化植物，抑制β-胡萝卜素羟化酶基因的表达，增加植物中β-胡萝卜素含量的方法。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述植物为甘薯。
9.转化权利要求6中所述的重组植物RNAi载体的，β-胡萝卜素含量增加的植物体。
10.如权利要求9所述的植物体，其特征在于，所述植物体为甘薯。
11.权利要求9中所述的植物体的种子。
CN2010105480331A 2009-11-13 2010-11-15 增加植物β-胡萝卜素含量的β-胡萝卜素羟化酶基因及其用途 Expired - Fee Related CN102061289B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090109562A KR101190257B1 (ko) 2009-11-13 2009-11-13 식물의 베타카로틴 함량을 증가시키는 베타카로틴 히드록실라아제 유전자 및 이의 용도
KR10-2009-0109562 2009-11-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102061289A true CN102061289A (zh) 2011-05-18
CN102061289B CN102061289B (zh) 2013-01-23

Family

ID=43996795

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010105480331A Expired - Fee Related CN102061289B (zh) 2009-11-13 2010-11-15 增加植物β-胡萝卜素含量的β-胡萝卜素羟化酶基因及其用途

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101190257B1 (zh)
CN (1) CN102061289B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102559713A (zh) * 2011-12-14 2012-07-11 天津大学 枸杞胡萝卜素β-羟化酶基因及包括该基因的重组载体和宿主细胞及应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101359308B1 (ko) * 2011-08-05 2014-02-10 한국생명공학연구원 카로티노이드 및 안토시아닌 고축적 형질전환 고구마 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체
US20240067976A1 (en) * 2020-12-28 2024-02-29 Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation Method for promoting beta-carotene or lutein by using tomato lycopene epoxidase
KR102635736B1 (ko) * 2020-12-28 2024-02-14 경북대학교 산학협력단 토마토 라이코펜 에폭시다아제를 이용한 베타카로틴 증진방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1352689A (zh) * 1999-04-09 2002-06-05 Basf公司 胡萝卜素羟化酶和制备叶黄素衍生物的方法
CN1380415A (zh) * 2001-04-06 2002-11-20 上海永业农科生物工程有限公司 用于转基因植物中生产类胡萝卜素的相关基因的合成
CN101432436A (zh) * 2004-08-16 2009-05-13 纳幕尔杜邦公司 类胡萝卜素羟化酶

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7663021B2 (en) 2002-12-06 2010-02-16 Del Monte Fresh Produce Company Transgenic pineapple plants with modified carotenoid levels and methods of their production
US9115338B2 (en) 2004-12-20 2015-08-25 Boyce Thompson Institute For Plant Research Enhancement of beta-carotene content in plants

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1352689A (zh) * 1999-04-09 2002-06-05 Basf公司 胡萝卜素羟化酶和制备叶黄素衍生物的方法
CN1380415A (zh) * 2001-04-06 2002-11-20 上海永业农科生物工程有限公司 用于转基因植物中生产类胡萝卜素的相关基因的合成
CN101432436A (zh) * 2004-08-16 2009-05-13 纳幕尔杜邦公司 类胡萝卜素羟化酶

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《农业生物技术学报》 20031231 徐昌杰 等 甜橙beta-胡萝卜素羟化酶cDNA克隆及其瞬间反义表达 593-597 1-11 第11卷, 第6期 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102559713A (zh) * 2011-12-14 2012-07-11 天津大学 枸杞胡萝卜素β-羟化酶基因及包括该基因的重组载体和宿主细胞及应用
CN102559713B (zh) * 2011-12-14 2013-11-13 天津大学 枸杞胡萝卜素β-羟化酶基因及包括该基因的重组载体和宿主细胞及应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110052865A (ko) 2011-05-19
CN102061289B (zh) 2013-01-23
KR101190257B1 (ko) 2012-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. Salt tolerance conferred by overexpression of Arabidopsis vacuolar Na+/H+ antiporter gene AtNHX1 in common buckwheat (Fagopyrum esculentum)
AU2016335853A1 (en) Potato cultivar Y9
CN102191230B (zh) 增加植物β-胡萝卜素含量的番茄红素ε-环化酶基因及其用途
CN102268435A (zh) 种子中蛋白质含量降低的植物及其制备方法和利用方法
CN102061289B (zh) 增加植物β-胡萝卜素含量的β-胡萝卜素羟化酶基因及其用途
CN110317249A (zh) 蜡梅CpAP1基因及其编码的蛋白与应用
CN109369789A (zh) ZmDRR206蛋白质及其编码基因在调控植物抗病性与生长发育中的应用
CN102725411A (zh) 改变植物外形（形态）并增加产量的OsMPT基因及其用途
Lu et al. SA-responsive transcription factor GbMYB36 promotes flavonol accumulation in Ginkgo biloba
CN102827263B (zh) MuMADS2在培育果实品质改良的转基因植物中的应用
CN103917087B (zh) 大量蓄积类胡萝卜素以及花青素的转化甘薯植物体的制备方法以及由此制备的植物体
CN108004267B (zh) 一种利用基因工程技术延长番茄果实货架期的方法
CN104611345A (zh) 一种改良植物果实品质的基因及其编码产物与应用
AU2005213506B2 (en) Use of genes encoding outward potassium channels for modifying at least one phenotype linked to the size and organic acid content of at least one plant storage organ
EP1722624B1 (en) Method for preparing transgenic pepper using callus induction
KR101351265B1 (ko) 안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 알팔파 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 알팔파 식물체
CN102382852A (zh) 一种重组基因获得番茄红素含量高且抗青枯病番茄的方法
KR101987663B1 (ko) 식물체에서 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 LeMADS-RIN 유전자 편집에 의해 에틸렌 생산을 감소시키는 방법
JPH10507920A (ja) 植物の花の咲き方を改変する方法
US7521600B2 (en) Regulation of flavonoid expression in alfalfa using maize regulatory genes
CN101942460B (zh) 一种拟南芥AtACDO1基因及其表达系统和应用
Babaei et al. Increasing vitamin E content of canola (Brassica napus L.) by transferring γ-tmt gene
KR101566692B1 (ko) 스틸벤 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체
KR101515152B1 (ko) ＬＣＹ－β 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체
CN116286952B (zh) 大豆GmSAMMT基因在调控植物蛋白含量和/或产量中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130123

Termination date: 20171115