CN110317249A

CN110317249A - 蜡梅CpAP1基因及其编码的蛋白与应用

Info

Publication number: CN110317249A
Application number: CN201910588100.3A
Authority: CN
Inventors: 李志能; 李玲; 眭顺照; 李名扬; 李先源
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-07-02
Filing date: 2019-07-02
Publication date: 2019-10-11
Anticipated expiration: 2039-07-02
Also published as: CN110317249B

Abstract

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及蜡梅CpAP1基因及其编码的蛋白与应用。本发明克隆得到蜡梅开花关键基因CpAP1，得到1个534bp的开放阅读框，编码177个氨基酸。该基因转化拟南芥野生型后发现，转基因拟南芥的三个株系与野生型拟南芥相比，莲座叶数均显著少于野生型WT；同时，转基因植株的抽葶时间、第一朵花开放时间、第一个荚果形成时间均显著早于野生型。转化拟南芥ap1突变体后发现，ap1突变体表型恢复。表明该基因具有促进植物开花的功能，具有花发育“ABCDE”模型中典型A类基因的功能，调节植物花萼与花瓣的发育。

Description

蜡梅CpAP1基因及其编码的蛋白与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个蜡梅CpAP1基因、其编码的蛋白和应用。

背景技术

蜡梅科是第三纪孑遗植物，起源十分古老，演化的历史悠久。蜡梅(Chimonanthuspraecox)是蜡梅科(Calycanthaceae)蜡梅属(Chimonanthus Lindl.)落叶丛生灌木，株高3至4米。叶对生，半革质；花着生于叶腋，最外轮的花被片成褐色鳞片状，向内过渡为黄色；冬季开花并且耐寒、耐旱、耐剪切。花期12月至翌年2月。傲雪屹立，凌寒怒放，与白梅，山茶，水仙一起被称为“雪中四友”。在李时珍《本草纲目》记载“蜡梅，释其名为黄梅花，此物非梅类，因其与梅同时，香又相近，色似蜜蜡，故得此名”。是我国特有的传统名贵观赏花木。

生物技术随着现代生物学的发展，已经广泛应用于动物，植物和微生物的研究。而对蜡梅的分子生物学研究已取得结果如下：

眭順照等人利用EST技术构建了国内第一个蜡梅花cDNA文库，且对蜡梅开花过程中的基因进行了表达分析，在其基础上先后克隆出不同功能相关的基因，并对其进行了系统的研究；此外赵明晓等分别提取蜡梅成熟叶和嫩叶的基因组并进行检测比较，为今后利用AFLP分子标记技术对蜡梅品种分类和自然居群的遗传多样性的分析垫下基础。杜灵娟等采用RAPD分析方法来研究南京蜡梅自然居群的遗传变异，并对其进行了分析，研究发现群内单株间遗传差异较大，居群间遗传距离近，因此得出遗传的变异主要来自于群居内，与形态分类研究结果相符。杨佳采用EST-SSR分子标记技术对蜡梅的遗传多样性和遗传结构进行了初步探讨分析。

对蜡梅花香的分子生物学研究，庞宏东等在花香方向有所突破，李莹莹通过测定不同蜡梅品种的芳香成分差异确定主要成分为芳樟醇，并证明芳樟醇释放的关键因素并非是芳樟醇启动子结构差异导致。

对蜡梅花发育的分子生物学研究，方子义探究了CHS启动子(CpCHSP29)对于蜡梅花色的影响，结果显示，瞬时表达可见启动子可在拟南芥的花器官中表达，且在转基因的拟南芥全株中均有表达；宋晓惜通过在拟南芥中过表达CpbHLH1和CpbHLH2是拟南芥植株茎部变红，证明其对于蜡梅花青素的合成起重要作用；雷兴华将CpAP3基因转入烟草，推测CpAP3-1与其他的很多AP3基因同时参与花瓣和雄蕊器官决定不同，它仅参与花瓣状器官的发育过程；王蓓果将蜡梅基因CpAGL6置于CaMV 35S启动子控制下在拟南芥中异位表达，转基因拟南芥表现出植株矮小，开花时间提前，雄蕊数目和形态发生变化等性状；刘华敏将蜡梅CpCZF1及CpCZF2基因转入拟南芥，发现转基因拟南芥花期提前、莲座叶减少、雄蕊发育不正常等表型现象。

对蜡梅的抗性方面的分子生物学研究，秦华克隆得到了蜡梅冷适应蛋白基因即Cpcor413pm1与蜡梅的抗寒性相关，将其转入烟草，对转基因烟草进行处理发现转基因烟草的耐低温能力提高；赵亚虹将蜡梅过氧化物酶体生成蛋白基因即PEX22转入烟草中，发现了抗氧化作用可能与抗衰老有一定关系；白玉克隆得到了蜡梅REM基因，发现这基因与盐胁迫相关，在野生型烟草中的过表达提高了烟草的盐胁迫耐性。敬帆利用hiTAIL-PCR法，从蜡梅基因组中克隆到花发育相关基因CpAGL6的启动子序列转化到烟草中，发现该基因在抵抗非生物肋迫中具有重要作用。阮文进在对CpHSP70-1基因进行研究时，发现高温处理后转基因拟南芥种子萌发率明显高于野生型对照，且转基因植株的存活率远高于野生拟南芥，提高了转基因植株的耐热性。周仕清将蜡梅CpCAF1基因转入野生型拟南芥，转基因植株提早开花且耐寒性提高。上述蜡梅基因功能的初步研究，为以后蜡梅分子生物学研究做出一定贡献。

植物的成花过程是植物由营养生长转向生殖生长的关键阶段，包括开花诱导、花的发端以及花器官的发育3个阶段，这个过程受多种基因的调控。调控植物开花过程的基因大致可分为三类:花序分生组织特征基因、花分生组织特征基因以及花器官形态特征基因。

通过对模式植物拟南芥、金鱼草(Antirrhinum majus)中同源异型突变体进行系统地遗传学分析，解释了植物花器官的特性，从而提出了著名的花器官发育“ABC模型”。该模型指出从花分生组织到花器官的形成主要由A、B、C三类功能基因控制，A类基因特异性地控制花萼发生和发育，A和B类基因共同控制花瓣的形成，B和C类基因共同决定雄蕊的发生，而C类基因则控制心皮的发育。随后在矮牵牛和酵母双杂交试验中发现了D、E功能的基因，将胚珠发育调控相关基因归属于D类功能基因，D类基因能够和C类基因功能重叠，被认为在胚珠发育过程中是C类基因的亚功能化基因。Pelaz等成功从拟南芥中克隆出SEPALLATA1/2/3(SEP1/2/3)基因全长，并发现三者同时发生基因突变时，整个发育时期的花瓣呈现萼片状结构，因此得出E类基因参与调控所有花器官的形成及发育。由此“ABC模型”进一步发展为“ABCDE模型”。随着研究“ABCDE模型”的深入，发现“ABCDE模型”中的基因大多数属于MADS-box基因，该类基因编码的转录因子在真核生物的发育控制和信号转导中起到关键作用。

在模式植物拟南芥中，行使A类功能的MADS-box基因是AP1和FUL(FRUITFULL，之前命名为AGL8)；其在对花分生组织的建立、花器官的形成、调控萼片和花瓣的正常发育等各方面发挥着重要的作用，并且还能激活B类功能基因。Dubois等通过对重瓣玫瑰的研究表明，A功能基因表达领域的拓展会引起重瓣花的发生。到目前为止，已从牡丹(Paeoniasuffruticosa L.)、日本晚樱(Prunuslannesiana)、白桦(Betula platyphyla)等多种植物中克隆了A类功能基因，并对其表达模式和功能开展了相关的研究。B类基因的代表是AP3(APETALA3)和PI(PISTILLATA)，其功能主要是参与调控花瓣和雄蕊的发育；C类基因的代表主要是AG(AGAMOUS)，其功能主要负责调控雄蕊和心皮发育；D类基因的代表有AGL11(AGAMOUS-LIKE 11)，后命名为STK(SEEDSTICK)，主要在胚珠中特异表达；E类基因的代表为SEP 1/2/3/4(SEPALLATA1/2/3/4)(曾命名AGL2，4，9和3)，负责调控四轮花器官的形成。

AP1是MADS-box家族中控制开花的基因，是典型的MIKC型MADS-box家族的基因，含有MADS盒、K区、I区和C区。AP1家族基因可分为euFUL，euAP1和FUL-like，euFUL和euAP1主要存在于核心真双子叶植物，FUL-like则存在于其它物种中。自拟南芥AP1基因的成功克隆以来，在许多植物中相继克隆得到AP1同源基因，尤其在木本植物和观赏类植物中研究较多，如从柑橘(Citrus reticulata)、地被菊(Chrysanthemum morifolium)、山核桃(Caryecathayensis)和百合等多种植物中克隆获得AP1同源基因。

多种植物的研究表明AP1基因在植物的许多组织中均有表达，而主要部位为花器官。在枣树中孟玉平等克隆出AP1同源基因ZjAP1，其在花发育过程中都有表达，且在根、茎、叶中也有表达。Kotoda等从苹果中克隆了MdMADS5基因，与拟南芥AP1是同源基因，转化到拟南芥使拟南芥花序变短，并且簇生叶减少。罗聪等克隆出的两个四季芒AP1同源基因MSAP1-1和MSAP1-2在花中的表达量最高，在果实生长过程中也进行表达。此外，也有研究发现AP1可以影响番茄叶片的形状，引起烟草和拟南芥植株矮化。袁友泉等人研究发现，将草莓FaAP1转入野生型拟南芥，与对照相比，转基因株系提早开花10d以上，同时其营养生长受到抑制，植株个体矮小，莲座叶数目减少。

AP1作为花分生组织特征基因,在花原基发育早期阶段发挥重要作用，研究表明，AP1基因的表达能够促使花期提前，具有促进开花的功能。如Kotoda等从苹果中克隆MdMADS5基因，研究发现该基因与拟南芥AP1基因是同源的，转化到拟南芥后表现为开花时间提前。Chi等人将大豆GmAP1基因转入烟草中，结果显示GmAP1基因过量表达能够促进植株提早开花，对花分生组织的形成有影响并参与花器官的特化作用。Li等将白杨AP1基因整合到烟草基因组中，与野生型烟草相比，促使转基因烟草植物提早开花。Qu和Huang等将白桦BpAP1基因在烟草和白桦中进行遗传转化，结果表明BpAP1基因在同源和异源转化中，均可促进转基因植株提前开花，缩短植物的生长周期。Chen等克隆3个百合的AP1同源基因，过量表达这3个基因均能使转基因拟南芥提早开花；WANG等对甜樱桃(Prunus avium)AP1进行研究，发现PaAP1能够有效促进拟南芥早花。

AP1作为花器官形态特征基因,它属于植物花发育ABCDE模型中的A类基因，能够参与花器官形成的调控。如引起花瓣、雌蕊和雄蕊数量增加及花萼异常等现象，是萼片和花瓣等花器官正常发育的控制因子。研究发现，金鱼草AP1同源基因SQUA发生突变后，促使开花部位发育为枝条即AP1基因突变可引起萼片和花瓣异常生长。苹果的MdMADS2和兰花的OMADS1在烟草中异位表达能使花器官变化，Fernando和Zhang在拟南芥中异源表达柳树的2个AP1基因，能使拟南芥出现花瓣、雌蕊和雄蕊等畸形的现象。

近年来，随着研究技术和研究手段的不断更新和丰富，人们对AP1基因的研究更为系统，逐渐丰富了以AP1基因为中心的成花调控网络，但是在蜡梅中有关AP1研究报到还没有出现，且对其的功能及作用机制并不清楚，还需要进一步研究。

发明内容

本发明的目的是提供蜡梅CpAP1基因及其编码的蛋白与应用。

首先，本发明提供蜡梅CpAP1蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供编码所述的蜡梅CpAP1蛋白的基因。

优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供含有所述基因的载体，宿主细胞和工程菌。

本发明还提供所述基因在调控花期中的用途。

在本发明一个实施方案中，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，使所述植物提前开花。

在本发明另一个实施方案中，将所述基因转入ap1突变的植物的基因组中，并在转基因植物中超量表达，使所述植物发育出正常的花萼与花瓣。

本发明还提供一种使植物提前开花的方法，其为将含有所述基因的载体转入所述植物基因组中，并在转基因植株中超量表达。

本发明通过PCR技术克隆得到蜡梅开花关键基因CpAP1，得到1个534bp的开放阅读框，编码177个氨基酸。在NCBI数据库中blast比对结果显示，该基因与葡萄、鳄梨和荷花等植物的同源基因具有较高的相似性，同源相似性分别为81.53％、84.71％和77.07％。

本发明利用荧光定量PCR技术分析了CpAP1基因在蜡梅不同器官和不同发育阶段花芽中的表达特性，结果表明：CpAP1基因在蜡梅各时期中均有表达，在3月至9月初，以雌雄蕊原基形成期表达量最高，随后随低温积累逐渐升高，直到打破休眠露瓣(DP)阶段，表达量急剧降低，此后初开(IB)和盛开(OF)逐渐下降至最低。随后对蜡梅CpAP1基因在蜡梅各器官中进行表达分析发现：该基因在蜡梅各器官中均有表达，在腋芽中的表达量最高，叶片的表达量次之，其中在蜡梅花器官中，外瓣的表达量高于内瓣。

利用花序侵染法将蜡梅35S::CpAP1超表达转化拟南芥及ap1突变体，并对侵染的拟南芥种子进行Kan抗性筛选，T₀代转基因植株DNA检测，T₂代纯合体转基因阳性植株进行GUS染色，最终获得35S::CpAP1/Col-0拟南芥6个株系15个纯合体单株和35S::CpAP1/ap1拟南芥11个株系8个纯合体单株，并选取转基因拟南芥中不同表达量(高、中、低)的3个纯合体株系进行后续分析及表型观察。

对35S::CpAP1/Col-0拟南芥不同株系开花途径相关的内源基因进行表达分析。发现在花序原基形成前，CpAP1基因在拟南芥中的异源表达促使其内源SOC1、FT、SVP、LFY和SEP3等开花基因在拟南芥中的表达上调，TFL1基因的表达下调。表型观察发现：转基因拟南芥的三个株系与野生型拟南芥相比，莲座叶数均显著少于野生型WT；同时，转基因植株的抽葶时间、第一朵花开放时间、第一个荚果形成时间均显著早于野生型。故可推测出蜡梅CpAP1基因具有促进植物开花的功能。

对35S::CpAP1/ap1拟南芥不同株系进行表型观察时，发现回复突变的转基因单株CpAP1/11-4和CpAP1/7-3的莲座叶、显蕾时间、抽葶时间、第一朵花形成时间和第一个荚果形成时间均与野生型拟南芥一致，且花器官(花萼和花瓣)与野生型拟南芥一致，ap1突变体表型恢复。故可推测出蜡梅CpAP1基因具有花发育“ABCDE”模型中典型A类基因的功能，调节植物花萼与花瓣的发育。

附图说明

图1所示为蜡梅CpAP1基因ORF框的克隆。M(maker)：DNA分子量标准DL2000；1、2、3：cDNA为模板；CK：阴性对照(ddH₂O)。

图2所示为CpAP1基因与其同源基因蛋白的进化树。

图3所示为蜡梅CpAP1基因在蜡梅不同组织中的相对表达量。

图4所示为蜡梅CpAP1基因在蜡梅不同花发育时期的相对表达量。

图5所示为pCAMBIA2301g-CpAP1的双酶切验证。M：DNA分子量标准，DL2000；1-2：pCAMBIA2301g-CpAP1的双酶切验证。

图6所示为pCAMBIA2301g-CpAP1转化农杆菌GV3101的PCR鉴定。M：DNA分子量标准，DL2000；1-9：pCAMBIA2301g-CpAP1转化农杆菌GV3101的PCR检测；CK：阴性对照(ddH₂O)。

图7所示为蜡梅35S::CpAP1/Col-0拟南芥的Kan抗性筛选。A：35S::CpAP1/Col-0拟南芥T₀代筛选；B：35S::CpAP1/Col-0拟南芥T₂代纯合体。

图8所示为蜡梅35S::CpAP1/ap1拟南芥的Kan抗性筛选。

图9所示为蜡梅35S::CpAP1/Col-0拟南芥的GUS染色。

图10所示为蜡梅35S::CpAP1/ap1拟南芥的GUS染色。

图11所示为蜡梅35S::CpAP1/Col-0拟南芥中CpAP1基因的PCR检测。M：DNA分子量标准，DL2000；1-8：抗性株系；WT:野生型拟南芥；CK：阴性对照(ddH₂O)。

图12所示为蜡梅35S::CpAP1/ap1拟南芥中CpAP1基因的PCR检测。M：DNA分子量标准，DL2000；1-10：抗性株系；ap1:突变体；CK：阴性对照(ddH₂O)。

图13所示为蜡梅35S::CpAP1/Col-0拟南芥CpAP1/T₂代不同单株CpAP1基因的相对表达分析。WT：野生型拟南芥；其他：转CpAP1基因拟南芥不同单株系。以拟南芥Actin基因作为内参基因，每次实验设3次技术重复，每一组值为平均数±标准误(N＝3)。

图14所示为蜡梅35S::CpAP1/ap1拟南芥T₂代不同单株CpAP1基因的相对表达分析。ap1:拟南芥突变体；其他：35S::CpAP1/ap1拟南芥CpAP1/T2代不同株系。以拟南芥Actin基因作为内参基因，每次实验设3次技术重复，每一组值为平均数±标准误(n＝3)。

图15所示为35S::CpAP1/Col-0拟南芥T₂代植株在花序原基形成前内源基因的相对表达量。A～F：依次为拟南芥内源基因FT、LFY、SEP3、SOC1、SVP和TFL1在转基因拟南芥中的表达量；a、b、c、d表示P＜0.05水平上差异显著。

图16所示为35S::CpAP1/Col-0拟南芥T2代植株表型观察。A、B、C、D：抽葶约1cm时莲座叶数；E：开花时间情况；标尺：2.2cm(A、B、C、D、E)。

图17所示为35S::CpAP1/ap1拟南芥CpAP1/T₂代植株表型观察。A、B、C、D、E：抽葶约1cm时莲座叶数；F、G、H、I、J：开花时间情况；标尺：2.7cm(A、B、C、D、E),2.92cm(F、G、H、I、J)。

图18所示为35S::CpAP1/ap1拟南芥T₂代植株表型观察。A、B、C、D和E：拟南芥ap1、转基因各株系和野生型拟南芥植株；F：拟南芥ap1的花簇；G、和I：转基因各株系的花簇；WT：野生型拟南芥；J：野生型拟南芥花簇；K：拟南芥ap1花序；L、M和N：转基因各株系花序；O：野生型拟南芥花序；P：拟南芥ap1荚果；Q、R和S：转基因各株系的果实；T：野生型拟南芥的果实；标尺：2.92cm(A、B、C、D、E)，1cm(F-T)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1蜡梅CpAP1基因的克隆

将从转录组获得的蜡梅CpAP1基因进行序列分析设计特异引物，以蜡梅cDNA第一链为模板，扩增蜡梅CpAP1基因，PCR反应体系及反应条件如下：

CpAP1-F(5'-3')：ACGAAGATGGGGAGGGGTAG

CpAP1-R(5'-3')：CCAGGAAAAGCACTAGGATG

PCR扩增体系：

PCR反应程序：

94℃变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，26个循环；72℃延伸10min。

将蜡梅CpAP1基因开放阅读框PCR扩增结果进行电泳检测，结果显示目的条带特异(如图1)。将PCR产物克隆到pMD19-T载体中，转化大肠杆菌，用CpAP1-F(10μM)，CpAP1-R(10μM)特异引物检测，将PCR检测为阳性的单克隆进行测序，序列如SEQ ID No.1所示。

将蜡梅AP1基因的测序结果翻译为氨基酸序列，在NCBI上进行blast比对发现，其编码的氨基酸序列与其他物种约100条AP1基因编码的氨基酸序相似性很高。如与鳄梨P.americana(ABD62862.1)、山核桃C.cathayensis(AHI85952.1)、五峰玉兰M.wufengensis(AOZ15903.1)等相似性高。为了进一步确定所克隆的序列是来源于蜡梅的开花关键基因CpAP1的序列，对该基因NCBI进行了blast分析，并没有发现已发表的与其同源的蜡梅基因序列，因此推测这个基因是我们首次在蜡梅中克隆到的蜡梅AP1基因，将其命名为CpAP1。

用Vector NTI 9.0和DNAstar软件包中的EditSeq对CpAP1基因的序列特征进行分析，克隆得到1个534bp的开放阅读框(Opening Read Frame，ORF)的CpAP1基因序列，编码177个氨基酸(SEQ ID No.2)。编码区由159个A、136个G、114个C、和125个T组成，A+T含量约为53.18％，G+C含量约为46.82％。

用EditSeq和ProtParam软件在线分析结果表明：蜡梅AP1基因编码蛋白长177个氨基酸，包含37个碱性氨基酸[Strongly Basic(+)Amino Acids]，占总数的20.9％，22个酸性氨基酸[Strongly Acidic(－)Amino Acids]，占总数的12.4％，66个疏水氨基酸(Hydrophobic Amino Acids)，占总数的37.3％，111个极性氨基酸(Polar Amino Acids)，占总数的62.8％；预测分子式为C₉₂₀H₁₄₈₅N₂₇₃O₂₆₁S₁₀；分子量为20867.18，等电点pI值为9.49；不稳定系数(instability index)为34.98，由此可以推测该蛋白是一个稳定的蛋白。

通过用SignalP在线软件预测得到，CpAP1蛋白不含有信号肽序列；TMHMM工具预测显示CpAP1蛋白没有跨膜结构域；PSORT进行亚细胞定位的预测结果表明该蛋白属于细胞核蛋白。

将蜡梅CpAP1的开放阅读框翻译的蛋白序列在NCBI上blast，选取与其同源的序列进行进化树分析，可以看出不同物种的AP1同源基因聚为一支，拟南芥的AtAGL6，买麻藤的GGM11和辐射松的PrMADS3聚为一支；双子叶植物的AP1同源基因聚为一支，单子叶植物的AP1同源基因聚为一支，且蜡梅与木兰科和樟科等聚为一支，亲缘关系最近(图2)。

实施例2蜡梅CpAP1基因的表达特性分析

本试验所采用的蜡梅材料均为磬口蜡梅(Chimonanthus praecox)。提取的蜡梅茎、叶、腋芽和果以及成年开花植株不同时期的腋芽及花的各部分器官的总RNA。

选用蜡梅的Actin与Tublin基因作为蜡梅CpAP1基因实时荧光定量的双内参基因，运用Primer Premier 5.0软件设计内参基因和目标基因CpAP1的荧光定量特异性引物，后送至北京六合华大基因科技股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1实时荧光定量PCR引物

引物名称	引物序列
		qCpAP1-F	GGGAACTAACTCTCTGTGGGC
qCpAP1-R	CTCTCTGAGACTCAAGGCGTC
		qCpActin-F	GTTATGGTTGGGATGGGACAGAAAG
qCpActin-R	GGGCTTCAGTAAGGAAACAGGA
		qCpTublin-F	TAGTGACAAGACAGTAGGTGGAGGT
qCpTublin-R	GTAGGTTCCAGTCCTCACTTCATC

以3.2.3中反转录获得的蜡梅cDNA第一链为模板，反应体系及反应程序如下所示，对蜡梅CpAP1基因在蜡梅不同组织及不同开花时期花器官中的表达情况进行实时荧光定量PCR分析。

反应体系：

反应程序：

试验数据通过Bio-Rad Manager^TM Software(Version 1.1)软件进行分析，用法获得目的基因的相对表达量。

(1)蜡梅CpAP1基因在蜡梅不同组织中的表达特性分析

通过实时荧光定量PCR对蜡梅CpAP1基因在蜡梅不同组织中的表达特性分析，结果显示该基因在蜡梅各组织中均有表达，以腋芽的表达量最高，叶片的表达量次之；其中在蜡梅花器官中，雌蕊的表达量最高，外瓣的表达量次之，内瓣的表达量最低，其中雌蕊中的表达量约为雄蕊中的0.97倍，外瓣中的表达量约为内瓣中的6.02倍(图3)。

(2)蜡梅CpAP1在蜡梅不同花发育时期的表达特性分析

通过实时荧光定量PCR分析蜡梅CpAP1基因在蜡梅开花各时期中的相关表达特性分析，结果显示，3-4月花萼、花瓣原基分化阶段，CpAP1表达量逐渐升高，4月18日表达量达到最高；随后的5月份雌雄蕊原基分化阶段先降低后升高，5月25日雌雄蕊原基形成期达到最高，且高于6月至9月初休眠阶段花芽中的表达量；9月9日花芽中表达量有所升高、随后至9月23日降至最低；随后10月子房成熟阶段，10月1日有所提高，10月中旬先下降，然后逐渐升高；11月份低温积累阶段先有所下降，随着低温的累积逐渐升高，至12月9日升至最高，12月24日打破休眠露瓣阶段(DP)表达量急剧降低(只是12月9号花芽中表达量的1/3)，此后初开(IB)和盛开(OF)逐渐下降至最低(图4)。

实施例3蜡梅CpAP1基因拟南芥遗传转化及功能分析

结合CpAP1基因ORF框序列自身含有的限制性酶切位点及分布特点和所用的植物超表达载体pCAMBIA2301g所含多克隆位点的特征，在原来特异引物上下游加入酶切位点BamHI和EcoRI及其相应的保护碱基，用于扩增携带适宜酶切位点的CpAP1基因编码区并将其克隆到植物表达载体的多克隆位点植物表达载体构建流程图。引物名称及序列如下：

p-CpAP1-F(CG ACGAAGATGGGGAGGGGTAG，下划线部分是保护碱基，方框部分为BamHI酶切位点)；

p-CpAP1-R(CG CCAGGAAAAGCACTAGGATG，下划线部分是保护碱基，方框部分为EcoRI酶切位点)。

将PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，连接到克隆载体pMD19-T上，再转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，最后涂布在Amp的LB平板上37℃倒置过夜培养，挑取单克隆进行PCR鉴定，鉴定为阳性的菌液送至英潍捷基有限公司测序。将测序正确的菌液提取质粒，正确的阳性质粒命名为pT-CpAP1。

提取质粒，用BamHI和EcoRI分别酶切pT-CpAP1质粒和植物表达载体pCAMBIA2301g质粒，琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物中pCAMBIA2301g载体大片段及CpAP1小片段。将回收的CpAP1基因片段与表达载体pCAMBIA 2301g片段按照Fermentas公司T4连接酶说明书进行连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，涂布在含50mg/L Kan的LB平板上37℃倒置过夜培养，挑取单克隆进行PCR检测，将电泳检测为阳性的菌液活化后提取质粒进行双酶切验证(图5)。将PCR鉴定和双酶切验证均正确的阳性质粒进行测序，确定无碱基突变后，命名为pCAMBIA2301g-CpAP1，即为CpAP1基因植物超表达重组载体。

将pCAMBIA2301g-CpAP1重组质粒电击法转化农杆菌GV3101感受态细胞，挑取单菌落，置于800μl无菌的YEB液体培养基(含有50mg/LKan+50mg/LGen)中，28℃振荡培养36-48h，以菌液为模板进行PCR检测(图6)。并进一步提取农杆菌转化子质粒，反转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，涂布在含Kan的LB平板上37℃倒置过夜培养，挑取单克隆进行PCR检测，将检测为阳性的菌液再提取质粒进行双酶切验证。验证正确的农杆菌菌液即为含有植物表达载体pCAMBIA2301g-CpAP1重组质粒的工程菌。

(1)转基因拟南芥的Kan抗性筛选

a.35S::CpAP1/Col-0拟南芥的抗性筛选

通过农杆菌花序侵染法转化拟南芥哥伦比亚野生型。将获得的转基因拟南芥T₀代种子分别播种在含50mg/L kan的MS固体培养基上进行阳性植株筛选，成功转入目的基因的拟南芥能够在抗性培养基上正常生长，而未成功转入的则在子叶期黄化死亡，经筛选共获得8个蜡梅CpAP1转基因拟南芥株系。将筛选出的抗性植株进行移栽，分别收获种子后继续进行抗性筛选，将表现出分离比接近3:1的株系各单株分别移栽收种，并再次进行抗性筛选，最终在T₂代获得6个株系15个纯合体转基因单株。T₀代和T₂代筛选结果如下图7所示。

b.35S::CpAP1/ap1拟南芥的抗性筛选

通过农杆菌花序侵染法转化拟南芥ap1突变体。通过农杆菌花序侵染获得的转基因拟南芥T₀代种子分别播种在含50mg/L kan的MS固体培养基上进行阳性植株筛选，成功转入目的基因的拟南芥能够在抗性培养基上正常生长，而未成功转入的则在子叶期黄化死亡，经筛选共获得12个35S::CpAP1/ap1拟南芥株系。将筛选出的抗性植株进行移栽，分别收获种子后继续进行抗性筛选，将表现出分离比接近3:1的株系各单株分别移栽收种，并再次进行抗性筛选，最终在T2代获得11个株系。T₀代筛选结果如图8所示。

(2)转基因拟南芥的GUS组织染色检测

a.35S::CpAP1/Col-0拟南芥的GUS组织染色检测

将通过Kan抗性筛选获得的T₂代转基因拟南芥纯合的株系和野生型的拟南芥同时进行播种，取在MS培养基上生长2周左右的植株进行GUS染色鉴定，把野生型的拟南芥作为对照参考。结果表明，筛选获得的6个转基因拟南芥的单株均能被染成蓝色，且表达量高的株系除少量叶柄不能被染成蓝色外，其余均被染成蓝色，而表达量低的植株只有叶片和少量根上部被染成蓝色，野生型的拟南芥则不能被染成蓝色(图9)。

b.35S::CpAP1/ap1拟南芥的GUS组织染色检测

将通过Kan抗性筛选获得的T₂代转基因株系和突变体ap1同时进行播种，取在MS培养基上生长2周左右的植株进行GUS染色鉴定，把拟南芥突变体ap1作为对照参考。结果显示，筛选获得的转基因拟南芥的单株均能被染成蓝色，拟南芥突变体ap1则均不能被染成蓝色(图10)。

(3)转基因植株PCR检测

a.蜡梅35S::CpAP1/Col-0拟南芥的PCR检测

分别提取T₀代Kan抗性筛选出的拟南芥和野生型拟南芥(WT)植株的叶片基因组DNA，以蜡梅CpAP1基因特异引物CpAP1-F和CpAP1-R进行PCR检测(如图11)。结果表明，野生型拟南芥WT没有扩增出条带外，其余抗性株系均扩增出与目的片段大小一致的条带，说明目的基因CpAP1可能插入到拟南芥基因组中。

b.蜡梅35S::CpAP1/ap1拟南芥的PCR检测

分别提取T₀代Kan抗性筛选出的拟南芥植株和突变体ap1植株的叶片基因组DNA，以蜡梅CpAP1基因特异引物CpAP1-F和CpAP1-R进行PCR检测(如图12)。结果表明，突变体ap1没有扩增出条带外，其余抗性株系均扩增出与目的片段大小一致的条带，说明目的基因CpAP1可能插入到拟南芥基因组中。

(4)实时荧光定量PCR检测转基因拟南芥CpAP1基因的表达量

a.实时荧光定量PCR检测35S::CpAP1/Col-0拟南芥CpAP1基因的表达量

为了进一步检测分析CpAP1基因在转基因拟南芥中的表达水平，根据上述(1)a和(2)a中筛选和检测结果，分别提取在含Kan抗生素的MS固体培养基上播种后生长约14天左右的T₂代纯合体转基因拟南芥和野生型拟南芥WT幼苗整株总RNA。以反转录后的cDNA作为模板，拟南芥AtActin基因为内参，野生型拟南芥WT为对照，进行实时荧光定量PCR检测和分析，引物见表2，结果如图13所示。

结果显示，野生型拟南芥WT中没有检测到CpAP1基因的表达，在所检测的5个株系15个T₂代纯合体转基因拟南芥单株中，CpAP1基因的表达水平各不相同，2号株系表达量最高，3号株系表达量次之，4号株系的表达量最低；1号株系的表达量高于4号株系，低于3号株系；其中在2号株系中以2-7单株中表达量最高。

根据荧光定量结果，分别选取表达量最高的CpAP1/2-7、表达量中等的CpAP1/3-8和表达量稍低的CpAP1/1-5单株用于后期对35S::CpAP1/Col-0拟南芥的研究分析及表型观察。

b.实时荧光定量PCR检测35S::CpAP1/ap1拟南芥CpAP1基因的表达量

为了进一步检测分析CpAP1基因在35S::CpAP1/ap1拟南芥中的表达水平，根据上述(1)b和(2)b中筛选和检测结果，分别提取在含相应抗生素的MS固体培养基上播种后生长约14天左右的T₂代转基因株系和突变体ap1幼苗整株总RNA。以反转录后的cDNA作为模板，拟南芥AtActin基因为内参，突变体ap1为对照，进行实时荧光定量PCR检测和分析，引物见表2，结果如图14所示

结果显示，拟南芥突变体ap1中没有检测到CpAP1基因的表达，在所检测的4个株系8个T₂代纯合体转基因拟南芥单株中，CpAP1基因的表达水平各不相同，7号株系表达量最高，其中以7-3单株中表达量最高；8号株系表达量比7号株系表达量低，比5号株系表达量高；在这四个株系中，11号株系表达量最低。

根据荧光定量结果，分别选取表达量最高的CpAP1/7-3、表达量中等的CpAP1/8-1和表达量稍低的CpAP1/11-4单株用于后期对35S::CpAP1/ap1拟南芥的研究分析及表型观察。

为了研究分析蜡梅35S::CpAP1/Col-0拟南芥的超表达对其自身开花基因的影响，分别对转基因株系及野生型拟南芥提取RNA，进行荧光定量PCR检测，引物如下表所示。

表2实时荧光定量PCR引物

结果如图15所示，转基因植株在花序原基形成前，蜡梅CpAP1在拟南芥中的表达会使其内源SVP、FT、SOC1、LFY和SEP3等基因的表达量不同程度的上升，而TFL1基因的表达量则会下降；对于SVP基因，转基因拟南芥中CpAP1/2-7单株的表达量为野生型WT的8.04倍，CpAP1/3-8和CpAP1/1-5单株分别为WT的6.04倍和3.56倍，且各转基因株系与野生型WT具有极显著差异，各转基因株系之间差异极显著；对于FT基因，在转基因拟南芥中1-5单株的表达量为野生型拟南芥(WT)的1.8倍，CpAP1/3-8和CpAP1/2-7单株分别为WT的3倍和9倍，且CpAP1/1-5单株与WT相比具有显著差异，CpAP1/3-8和CpAP1/2-7单株相比具有极显著差异，且三个转基因株系之间差异极显著；对于SOC1基因，在转基因单株CpAP1/2-7与CpAP1/3-8的表达量基本持平，约为WT的5倍，与WT相比差异极显著，而在CpAP1/1-5单株的表达量为WT的1.5倍，与WT相比差异显著，且转基因三个单株之间，CpAP1/2-7与CpAP1/3-8之间无显著差异，但与CpAP1/1-5单株相比差异极显著；对于LFY基因，转基因拟南芥各单株与WT的表达量相比均增加，CpAP1/2-7单株表达量显著增加，为WT的9.82倍，CpAP1/3-8和CpAP1/1-5单株表达量与WT相比显著增加，均为WT的5.1倍，但CpAP1/3-8和CpAP1/1-5单株之间无显著差异；对于SEP3基因，在转基因拟南芥中三个单株的表达量与野生型拟南芥相比均明显增加，与WT相比具有差异极显著，CpAP1/2-7单株为WT的23.56倍，CpAP1/3-8和CpAP1/1-5单株则分别为WT的13.20和8.37倍，且转基因三个单株之间差异极显著；对于TFL1基因，转基因拟南芥中各单株均比WT的表达量低，CpAP1/2-7单株与WT相比差异显著，为WT的0.84倍，CpAP1/1-5和CpAP1/3-8单株与WT差异极显著，分别为WT的0.16和0.19倍，且CpAP1/1-5和CpAP1/3-8之间无显著差异，与CpAP1/2-7相比差异极显著。

4转基因株系的表型观察

(1)35S::CpAP1/Col-0拟南芥的表型观察

以野生型拟南芥作为对照，与纯合的转基因拟南芥T₂株系进行表型观察，结果发现，转基因拟南芥株系(2-7，1-5和3-8)的抽葶时间、第一朵花开的时间和第一个果荚出现时间均比野生型拟南芥(WT)植株早(表3)。抽葶时间，转基因拟南芥的三个株系与野生型拟南芥相比，均有显著差异，且明显比野生型抽葶时间早，CpAP1/2-7单株比WT抽葶时间早5d左右，CpAP1/1-5和CpAP1/3-8单株比WT抽葶时间早2d左右，且CpAP1/1-5和CpAP1/3-8二者之间差异不明显；第一朵花开放时间，转基因拟南芥的三个株系与WT相比同样均有显著差异，开花时间均比WT早，CpAP1/2-7单株比WT提前4d开花，CpAP1/3-8单株比WT提前2d开花，CpAP1/1-5单株比WT提前1d开花；第一个荚果形成时间，转基因拟南芥的三个株系与野生型拟南芥相比均明显提前，且有显著差异；转基因拟南芥的三个株系与野生型拟南芥相比，莲座叶数均比WT(莲座叶平均数9.61片)少，且有显著差异，CpAP1/2-7(莲座叶平均数7.66片)最少，CpAP1/1-5(莲座叶平均数8.75片)和CpAP1/3-8(莲座叶平均数8.69片)次之，且CpAP1/1-5和CpAP1/3-8二者间莲座叶数无显著差异；转基因拟南芥的三个株系与野生型拟南芥的株高相比，只有CpAP1/2-7单株的株高相对于WT明显降低，而CpAP1/3-8和CpAP1/1-5与WT株高相比没有显著差异(图16)。

以上结果分析显示，蜡梅CpAP1基因表达量越高，转基因拟南芥的莲座叶数越少，抽葶时间、第一朵花开放时间、第一个果实形成时间越短。由于植株由营养生长向生殖生长转化的时间提前，导致营养生长时间缩短，莲座叶数减少，开花时间提前。综合以上结果，推测蜡梅CpAP1基因能够促进植株开花，同时对植株的营养生长具有抑制作用。

表3 35S::CpAP1/Col-0拟南芥T2代株系表型观察

观察指标/株系	WT	CpAP1 1-5	CpAP1 3-8	CpAP1 2-7
					抽葶时间(d)	24.97+0.13a	22.78+0.53b	22.88+0.71b	19.39+0.34c
第一朵花开(d)	29.00+0.15a	28.02+0.18b	27.01+0.71c	25.86+0.48d
					第一个荚果(d)	30.24+0.16a	29.20+0.13b	28.17+0.93c	27.24+0.38d
莲座叶(片)	9.61+0.24a	8.75+0.39b	8.69+0.18b	7.66+0.14d
					株高(cm)	25.63+0.66a	25.44+0.28a	25.53+1.09a	22.71+1.04b

表中每组数据均为“平均值±标准差”；a、b、c、d表示P＜0.05水平上差异显著；各株系均为3次重复，每重复12棵植株

(2)35S::CpAP1/ap1拟南芥的表型观察

为进一步了解CpAP1基因的功能，将CpAP1转入拟南芥ap1中，以野生型拟南芥(WT)和ap1作为对照，在T₂代株系(11-4，7-3和8-1)中进行相关表型观察，发现转基因CpAP1/11-4和CpAP1/7-3单株能够恢复成哥伦比亚野生型Col-0的表型。如表4所示，转基因拟南芥的莲座叶数与ap1相比有显著差异，均少1片左右，而与WT相比，无显著差异；抽葶时间，转基因拟南芥CpAP1/11-4和CpAP1/7-3单株与WT相比无显著差异，与ap1相比差异极显著，且抽葶时间均晚3d左右，而CpAP1/8-1单株与ap1的抽葶时间基本一致，无显著差异；第一朵花开放时间，转基因三个单株与WT无显著差异，而与ap1相比具有显著差异，明显提早1d开花；转基因拟南芥的第一个荚果形成时间和ap1相比，均明显提前，其中CpAP1/11-4和CpAP1/7-3约提前3d，CpAP1/8-1株系约提前1d，且三个单株与WT的第一个荚果形成时间相比，CpAP1/8-1单株比WT晚2d左右，而CpAP1/11-4和CpAP1/7-3单株则与WT无显著变化；对于侧枝数，CpAP1/11-4和CpAP1/7-3单株的侧枝数均比ap1的少15枝，差异极显著，而与WT相比无显著差异，但转基因CpAP1/8-1单株的侧枝数则与ap1明显一致；同样，转基因拟南芥CpAP1/11-4和CpAP1/7-3单株的株高与ap1相比具有显著差异，而与WT相比无显著差异，但CpAP1/8-1单株则与ap1无显著差异(图17)。

表4 35S::CpAP1/ap1拟南芥T2代株系表型观察

表中每组数据均为“平均值±标准差”；a、b、c表示P＜0.05水平上差异显著；各株系均为3次重复，每重复12棵植株

正常的哥伦比亚野生型拟南芥植株与突变体在形态上是明显区分的，野生型植株的顶生花，由萼片，花瓣、雄蕊、雌蕊组成，而ap1的表型无明显的花瓣和花萼。在花器官的表型观察上如图18，在转基因的三个株系中，CpAP1/11-4和CpAP1/7-3的花器官的表型与野生型拟南芥一致，萼片均为四片，花瓣四枚，形状大小无显著差别，而转基因CpAP1/8-1株系的花器官表型则和突变体ap1一致，没有花萼和花瓣。

综上所述，回复突变的转基因株系CpAP1/11-4和CpAP1/7-3在莲座叶、显蕾时间、抽葶时间、第一朵花形成时间、第一个荚果形成时间、侧枝数和株高均与野生型拟南芥无显著差异，且花萼和花瓣与野生型拟南芥一致，则证明转基因株系CpAP1/11-4和CpAP1/7-3恢复成哥伦比亚野生型拟南芥；转基因株系CpAP1/8-1在莲座叶、显蕾时间、第一朵花形成时间、侧枝数和株高与野生型拟南芥相比无明显变化，在抽葶时间上与ap1突变体一致，第一个荚果形成时间比WT晚，比ap1早，且花萼和花瓣与ap1表型一致，则转基因株系CpAP1/8-1没有恢复成哥伦比亚野生型拟南芥。由以上的结果可以推测出CpAP1基因符合花发育ABCDE模型中典型A类基因的特点，控制花萼与花瓣的发育。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 蜡梅CpAP1基因及其编码的蛋白与应用

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 534

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 1

atggggaggg gtagagtgca gctgaagcgg atcgagaaca agataaatcg ccaggtcacc 60

ttctccaagc gccggatggg gctgctgaag aaggcgcacg agatctccgt cctctgcgat 120

gccgaggtcg ctctcatcgt cttctccacc aaaggaaaac tctacgagta ctccaccgat 180

tcctgcatgc caaggattct tgaacgatac gagcgatatt cctacgcaga acgggaacta 240

actctctgtg ggcctgaatc tgaggggaac tggtgccaag aatacggaaa acttaaggct 300

aaggttgagg caatacaaag aaacctaagg cattttatgg gagaggagct tgacgccttg 360

agtctcagag agctccaaca tttagaacaa cagcttgatg ctgctttgaa gcatgttaga 420

gcaagaaaga accaacttat gtttgaatcg atagctgatc ttcaaagaaa ggttcgtatt 480

gtaaattatc atatgtttca tacattcaat ggcattgtcg tatatacaag gtga 534

<210> 2

<211> 177

<212> PRT

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 2

Met Gly Arg Gly Arg Val Gln Leu Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Met Gly Leu Leu Lys Lys Ala

20 25 30

His Glu Ile Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe

35 40 45

Ser Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Glu Tyr Ser Thr Asp Ser Cys Met Pro

50 55 60

Arg Ile Leu Glu Arg Tyr Glu Arg Tyr Ser Tyr Ala Glu Arg Glu Leu

65 70 75 80

Thr Leu Cys Gly Pro Glu Ser Glu Gly Asn Trp Cys Gln Glu Tyr Gly

85 90 95

Lys Leu Lys Ala Lys Val Glu Ala Ile Gln Arg Asn Leu Arg His Phe

100 105 110

Met Gly Glu Glu Leu Asp Ala Leu Ser Leu Arg Glu Leu Gln His Leu

115 120 125

Glu Gln Gln Leu Asp Ala Ala Leu Lys His Val Arg Ala Arg Lys Asn

130 135 140

Gln Leu Met Phe Glu Ser Ile Ala Asp Leu Gln Arg Lys Val Arg Ile

145 150 155 160

Val Asn Tyr His Met Phe His Thr Phe Asn Gly Ile Val Val Tyr Thr

165 170 175

Arg

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 3

acgaagatgg ggaggggtag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 4

ccaggaaaag cactaggatg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 5

gggaactaac tctctgtggg c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 6

ctctctgaga ctcaaggcgt c 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 7

gttatggttg ggatgggaca gaaag 25

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 8

gggcttcagt aaggaaacag ga 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 9

tagtgacaag acagtaggtg gaggt 25

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 10

gtaggttcca gtcctcactt catc 24

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 11

cgggatccac gaagatgggg aggggtag 28

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 12

cggaattccc aggaaaagca ctaggatg 28

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 13

cttcgtcttc cacttcag 18

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 14

atcataccag tctcaacac 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 15

aattcgccag ctccaatatg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 16

cctcgattga gcatgttcct 20

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 17

gcacaacaga tgctacgttt ggc 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 18

cctatgcttg gccttggcaa ttc 23

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 19

caaggacttg acattgaaga gcttca 26

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 20

ctgatctcac tcataatctt gtcac 25

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 21

ggaacaacct ttggcaat 18

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 22

agccactctc cctctgacaa 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 23

attggttcaa gcaccacctc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 24

caagaagctc ccaacgaaag 20

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 25

ccaactctat ttgaatcttt ctcac 25

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 26

acaagacaga aaacatgaga gaggt 25

Claims

1.蜡梅CpAP1蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2.编码权利要求1所述的蜡梅CpAP1蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。

6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

7.权利要求2或3所述基因在调控植物花期中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，使所述植物提前开花。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，将所述基因转入ap1突变的植物的基因组中，并在转基因植物中超量表达，使所述植物发育出正常的花萼与花瓣。

10.一种使植物提前开花的方法，其为将含有权利要求2或3所述基因的载体转入植物基因组中，并在转基因植株中超量表达。