CN116063746B - 提升壳聚糖材料机械性能的方法及制备的壳聚糖复合材料 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了提升壳聚糖材料机械性能的方法及制备的壳聚糖复合材料，所述提升壳聚糖材料机械性能的方法为在壳聚糖材料中加入昆虫类围食膜因子表皮蛋白BmCPAP3s，和/或加入所述表皮蛋白BmCPAP3s的功能性截短体、突变体、多肽中的至少一种。本发明提供了机械性能得到显著提升的CS/CPAP3复合薄膜材料，该复合材料克服了纯壳聚糖薄膜材料普遍存在的刚性与韧性互斥的问题，使家蚕表皮蛋白与壳聚糖复合薄膜材料在生物医学、电子、包装、能源、环境和光学等领域的柔性电子器件中具有广阔的应用前景。本发明提升壳聚糖材料机械性能简易且生物友好，值得行业领域推广。
Description
技术领域
本发明涉及壳聚糖材料制备的技术领域，具体涉及提升壳聚糖材料机械性能的方法及其制备得到的壳聚糖材料。
背景技术
壳聚糖是一种生物高分子材料，为几丁质经过去乙酰化处理后的产物，不仅容易制备获取，并且具有可自然降解、生物相容性好、抗菌、可自组装等优良特性。壳聚糖纳米纤维网络结构的力学性能对其在功能材料中的应用至关重要，然而只使用单一的壳聚糖制作的生物薄膜材料却存在着延伸率差、拉伸强度低以及韧性弱等问题。此前，为了改善壳聚糖薄膜材料存在的上述问题，主要对壳聚糖使用一些物理或化学方法处理以改变壳聚糖分子量大小、链的长度或交联状态。但采用物理或化学方法处理不仅存在能源消耗或环境污染等问题，而且处理后的壳聚糖薄膜材料会出现生物相容性变差的问题，导致其不能很好地应用于如生物医学等领域。
目前研究人员试图通过仿生材料的方法解决上述难题，如专利号为CN201610244966.9的“一种用家蚕丝素蛋白与羧甲基壳聚糖制备多孔材料的方法”制得的多孔材料，表面光滑，质地柔软，蓬松多孔，可塑性强，吸水性更好，具有抗菌抗感染作用，与生物体的生物相容性更好，可广泛适用于生物医学。专利号为CN201911087179.8的“一种导电壳聚糖/角蛋白纳米纤维膜的制备方法”制备的纳米纤维膜机械强度高于一般的角蛋白纳米维维膜，且具备良好的导电性，电导率较高。上述两专利技术通过在壳聚糖体系中引入丝素蛋白或角蛋白以提升材料的多孔性或机械性能。但以上专利中使用的蛋白与壳聚糖结合能力弱，壳聚糖薄膜材料的拉伸强度提升有限，无法很好地增强壳聚糖材料的机械性能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种提升壳聚糖材料机械性能的方法，大幅度地提升了壳聚糖的机械性能(如拉伸强度、韧性等)，从而克服了上述现有技术的不足。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供了一种提升壳聚糖材料机械性能的方法，在壳聚糖材料中加入昆虫类围食膜因子表皮蛋白CPAP3，和/或加入表皮蛋白CPAP3的功能性截短体、突变体、多肽中的至少一种。
所述昆虫选自鳞翅目家蚕、棉铃虫；鞘翅目昆虫赤拟谷盗；双翅目昆虫埃及伊蚊，冈比亚按蚊，黑腹果蝇，致倦库蚊；同翅目昆虫豌豆长管蚜；膜翅目昆虫意大利蜂，蝇蛹金小蜂；虱目昆虫人体虱。
对不同目的昆虫CPAP3蛋白通过进化树进行聚类分析，其中选取鳞翅目代表昆虫为家蚕(Bombyx mori，Bm)，棉铃虫(Helicoverpa armigera，Ha)；鞘翅目代表昆虫为赤拟谷盗(Tribolium castaneum，Tc)；双翅目代表昆虫埃及伊蚊(Aedes aegypti，Tc)，冈比亚按蚊(Anopheles gambiae，Ag)，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster，Dm)，致倦库蚊(Culexquinquefasciatus，Cq)；同翅目代表昆虫豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum，Ap)；膜翅目代表昆虫意大利蜂(Apis mellifera，Am)，蝇蛹金小蜂(Nasonia vitripennis，Nv)；以及虱目代表昆虫人体虱(Pediculus humanus corporis，Phc)。
以上所述CPAP3表皮蛋白来自不同目的昆虫，并且CPAP3家族蛋白又划分为A1，A2，B，C，D1，D2，E1，E2不同组等，但图9所示的进化树结果显示昆虫表皮蛋白CPAP3能够根据氨基酸序列特征进行很好的分类。因此在以上检验的昆虫物种中，CPAP3家族蛋白在结构域分布和序列相似度上都是高度保守的，推测CPAP3家族蛋白与底物互作的模式也是保守的。
进一步，所述表皮蛋白BmCPAP3s选自家蚕类围食膜因子表皮蛋白BmCPAP3s。
家蚕表皮蛋白BmCPAP3s为含有3个几丁质结合结构域的类围食膜因子表皮蛋白，属于CPAP家族。家蚕表皮蛋白BmCPAP3s与壳聚糖结合能力强，能够很好地增强壳聚糖材料的机械性能。
进一步，所述表皮蛋白BmCPAP3s选自BmCPAP3-A1、BmCPAP3-A2、BmCPAP3-B、BmCPAP3-E1、BmCPAP3-E2、BmCPAP3-C-A、BmCPAP3-C-B、BmCPAP3-D1、BmCPAP3-D2-A、BmCPAP3-D2-B中的至少一种。
使用ESPript 3.0对家蚕10个CPAP3表皮蛋白的氨基酸序列进行比对，如图10所示，氨基酸序列比对的结果显示家蚕CPAP3表皮蛋白的序列保守序较高，其中参与二硫键形成的半胱氨酸，以及可能参与底物结合的极性氨基酸和芳香族氨基酸的保守性更为明显，推测CPAP3家族表皮蛋白结合底物的模式是一致的。
进一步优选所述类围食膜因子表皮蛋白BmCPAP3s为BmCPAP3-A1和/或BmCPAP3-C。
其中，BmCPAP3-A1表皮蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，长度为237个氨基酸。编码BmCPAP3-A1表皮蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，长度为714个碱基。
BmCPAP3-C表皮蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，长度为262个氨基酸。编码BmCPAP3-C表皮蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，长度为786个碱基。
进一步，对壳聚糖材料的机械性能参考指标不作具体限定。优选机械性能指标选自拉伸强度、韧性、杨氏模量、延伸能力中的一种或多种。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述壳聚糖材料为壳聚糖薄膜材料、壳聚糖多孔材料、壳聚糖支架材料或壳聚糖凝胶，优选为壳聚糖薄膜材料。
本发明通过家蚕表皮蛋白和壳聚糖材料制备的壳聚糖薄膜材料、壳聚糖多孔材料、壳聚糖支架材料、壳聚糖凝胶等，使用的原料均为天然生物材料，具有绿色安全环保、机械性能优异，生物相容性良好等优良性能。壳聚糖薄膜材料可以作为可降解包装材料，减少环境污染；壳聚糖多孔材料可作为生物细胞培养介质，过滤材料等；壳聚糖支架材料可开发作为动植物体内体外移植材料；壳聚糖凝胶可以开发为粘合剂，吸附材料等。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述壳聚糖薄膜材料为家蚕表皮蛋白BmCPAP3-A1和/或BmCPAP3-C与壳聚糖复合薄膜材料。
所述复合薄膜材料的组合可以分为三种情况：(1)家蚕表皮蛋白BmCPAP3-A1与壳聚糖复合；(2)BmCPAP3-C与壳聚糖复合；(3)家蚕表皮蛋白BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C与壳聚糖复合。
优选所述复合薄膜材料的材料厚度为25-35μm，更优选30μm。优选复合薄膜材料的厚度既可以避免厚度太大造成资源的浪费，又可以避免厚度太小造成的不易制备和容易破损的问题。
进一步，所述复合薄膜材料中，家蚕表皮蛋白的含量为1-20wt％，优选1-10wt％，更优选1wt％、5wt％、10wt％。
在本发明的一种实施方式中，BmCPAP3-A1与壳聚糖复合薄膜材料中，BmCPAP3-A1的含量可以为1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％、16wt％、17wt％、18wt％、19wt％或20wt％；优选1wt％、5wt％、10wt％。
在本发明的一种实施方式中，BmCPAP3-C与壳聚糖复合薄膜材料中，BmCPAP3-C的含量可以为1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％、16wt％、17wt％、18wt％、19wt％或20wt％；优选1wt％、5wt％、10wt％。
本发明制备的壳聚糖复合薄膜材料，家蚕表皮蛋白与壳聚糖结合能力强，较大幅度地提升了壳聚糖薄膜材料的机械性能(能够显著的提升复合薄膜材料的拉伸强度、韧性、杨氏模量、延伸能力)，克服了传统的纯壳聚糖薄膜材料普遍存在的刚性与韧性互斥的问题，且绿色环保，不会影响壳聚糖通过仿生设计制备的复合薄膜材料在生物医学、电子、包装、能源、环境和光学等领域的柔性电子器件中具有广阔的应用前景。
通过将壳聚糖与昆虫表皮蛋白混合的方式制备新材料，一方面充分利用了昆虫表皮蛋白的多种生理生化性质，另一方面昆虫表皮蛋白可以通过基因重组的方式获得，克服了现有技术中结构蛋白在制备材料中存在的诸多缺点。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述提升壳聚糖材料机械性能的方法，包括以下步骤：将所述昆虫表皮蛋白CPAP3、截短体、突变体或多肽，或含有其的介质，与壳聚糖或含有其的介质混合的步骤；优选所述家蚕表皮蛋白通过基因重组的方法获得。
上述制备方法中，介质优选液体，例如家蚕表皮蛋白BmCPAP3s的水溶液或其他能够溶解家蚕表皮蛋白但不影响其性能的液体。
相较于通过物理或化学的方式获得的蛋白而言，本发明中所述家蚕表皮蛋白通过基因重组的方法获得，蛋白纯度高，避免引入其他种类的蛋白杂质，对蛋白的性能没有影响。
在本发明一种优选地实施方式中，壳聚糖薄膜材料的制备方法包括以下步骤：将含有家蚕表皮蛋白BmCPAP3-A1的水溶液与含有壳聚糖的乙酸溶液混合均匀后，经过成膜处理获得家蚕表皮蛋白与壳聚糖复合薄膜材料。
在本发明一种优选地实施方式中，将含有家蚕表皮蛋白BmCPAP3-C的水溶液与含有壳聚糖的乙酸溶液混合均匀后，经过成膜处理获得家蚕表皮蛋白与壳聚糖复合薄膜材料。
本发明第二方面提供了一种壳聚糖材料，采用所述提升壳聚糖材料机械性能的方法获得。
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明提供的提升壳聚糖材料机械性能的方法，如家蚕表皮蛋白与壳聚糖复合薄膜材料，较大幅度地提升了壳聚糖薄膜材料的机械性能，克服了纯壳聚糖薄膜材料普遍存在的刚性与韧性互斥的问题，使家蚕表皮蛋白与壳聚糖复合薄膜材料在生物医学、电子、包装、能源、环境和光学等领域的柔性电子器件中具有广阔的应用前景。
(2)本发明提供的提升壳聚糖材料机械性能的方法，采用基因重组的方法获得家蚕表皮蛋白，蛋白纯度高，家蚕表皮蛋白与壳聚糖结合能力强；而且制备方法简单易操作，便于工业推广应用。
附图说明
图1所示为实施例1中表皮蛋白BmCPAP3-A1的SDS-PAGE电泳图。其中，M是蛋白质标记，泳道1是纯化的表皮蛋白BmCPAP3-A1。
图2所示为实施例1中表皮蛋白BmCPAP3-C的SDS-PAGE电泳图。其中，M是蛋白质标记，泳道2是纯化的表皮蛋白BmCPAP3-C。
图3所示为实施例2中测试表皮蛋白BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C与壳聚糖和几丁质结合能力的结果图。其中，M：标记；T：结合前的总蛋白；FT：未结合的蛋白质；E：结合的蛋白质；BSA：牛血清白蛋白。
图4所示为实施例2中表皮蛋白BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C与壳聚糖和几丁质的结合能力结果图。
图5为实施例3中表皮蛋白BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C与α-几丁质晶态纤维结合的扫描电镜结果图。其中，A-D是作为对照组的α-几丁质晶态纤维，E-H是加入了BmCPAP3-A1蛋白之后的α-几丁质晶态纤维，I-L是加入了BmCPAP3-C蛋白之后的α-几丁质晶态纤维。
图6为实施例4中表皮蛋白BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C与壳聚糖共同制备复合膜材料的流程示意图，其中CPAP3s蛋白是由三个几丁质结合结构域(CBD)所组成，因此每个几丁质结合结构域分别表示为CBD-1，CBD-2，以及CBD-3。
图7为实施例4中CS/CPAP3-A1和CS/CPAP3-C复合薄膜的透光率表征图。
图8所示为实施例5中CS/CPAP3-A1和CS/CPAP3-C复合薄膜的力学性能检测图。其中，*为p值＜0.05，**为p值＜0.01，***为p值＜0.001，未标柱差异无显著性；误差条表示n＝5的标准偏差。
图9为实施例5中CS/CPAP3-A1和CS/CPAP3-C复合薄膜的平面结构以及断裂面结构的SEM图像。其中A、D、G、J、M为薄膜表面平面SEM图，B、E、H、K、N、C、F、I、L、O为断裂面SEM图。
图10为不同目的昆虫CPAP3蛋白进化树聚类分析结果。
图11为家蚕10个CPAP3表皮蛋白的氨基酸序列比对图，其中相似性质氨基酸标注为加粗字体并且由灰色框架标明，相同的氨基酸则由黑色框架标明。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
实施例1 BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C基因的克隆及表达纯化
步骤一、家蚕总RNA的获取和cDNA的合成
(1)将研钵、研杵和药匙用锡箔纸包好后180℃下灭菌5小时，待冷却后放入超净台中，开始试验前加入适量液氮预冷。
(2)将家蚕蛹期第一天个体放入研钵，充分研磨至粉末状。研磨过程中不断补加液氮，保持家蚕组织处于低温状态。
(3)用灭菌药匙将研钵中的家蚕组织粉末收集至1.5mL RNase-free灭菌离心管中，加入1mL RNAiso Plus裂解液，颠倒混匀，待管内溶液变得澄清后，室温下静置5min，4℃、12000rpm离心10min。
(4)离心后将上清液转移至新的1.5mL离心管内。加入约1/5体积的氯仿，缓慢颠倒混匀，室温静置5min，4℃、12000rpm离心15min，继续将上清转移到新离心管。
(5)向离心管中加入等体积的异丙醇，混合均匀后室温下静置15min，12000rpm离心10min，弃上清。缓慢加入1mL 75％的乙醇，轻柔颠倒洗涤沉淀，12000rpm离心5min，弃上清。
(6)沉淀在室温下风干2min，待乙醇挥发完全后，用适量RNase-free水溶解，加入Recombinant DNase I(RNase-Free)处理去除DNA，最终溶于DEPC处理水，于-80℃冰箱中保存。取1μL RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，分析纯度。
以提取的家蚕总RNA为模板，反转录合成cDNA。
反转录反应体系：500ng RNA，2μL 5×Buffer，0.5μL PrimeScriptTM RT EnzymeMix I，0.5μL Random 6mers(100μM)，0.5μL Oligo dT Primer(50μM)，最后用RNase-Free水补至总体积10μL。
反转录反应条件：37℃反应15min，85℃终止反应5s。
(7)新合成的cDNA置于-20℃冰箱保存。
步骤二、PCR克隆获得BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C基因序列全长
(1)根据家蚕基因组数据库(SilkDB)提供的BmCPAP3基因序列信息设计引物，见表1。
(2)以步骤一获得的家蚕cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，目的条带切胶回收后连接到-T1 Cloning Vector，送测序，测序结果正确。
表1引物列表
步骤三、BmCPAP3-A1与BmCPAP3-C的重组表达和纯化
(1)目的片段的PCR扩增
以包含有家蚕BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C的基因序列的T-vector为模板，进行PCR扩增，PCR引物见表2。引物中带有下划线部分表示引物上的酶切位点，粗体部分代表添加在序列C-末端的His-tag，用于金属螯合层析对蛋白进行分离与纯化。用1％琼脂糖凝胶电泳验证结果。
表2引物列表
(2)目的片段回收
按照TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒说明书进行操作，对上述步骤(1)的PCR产物进行切胶回收。
(3)制备载体
使用Nco I/Xho I对pET28b质粒进行酶切处理，所得产物按照TaKaRa AgaroseGel DNA Purification Kit Ver.2.0说明书进行回收，1％琼脂糖凝胶电泳验证回收效率。
(4)目的基因与载体连接、转化、质粒提取及测序
按试剂盒In-Fusion HD Cloning Kit说明书进行操作，将目的基因片段与酶切处理后的pET28b载体相连接。反应结束后，将产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，于平板上均匀涂布，37℃培养箱中生长24h。挑取生长状态良好的阳性菌落扩大培养并提取质粒，送测序。
(5)大肠杆菌诱导表达BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C
将测序验证正确的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，平板涂布培养，挑取阳性菌株在加入Kanamycin的LB培养基中大规模培养，待培养基OD600到达0.4后，加入IPTG(终浓度0.04mM)16℃诱导20h。离心收集菌体。取等量的湿菌进行SDS-PAGE电泳，观察目的蛋白表达情况。
(6)BmCPAP3-A1与BmCPAP3-C表皮蛋白的分离纯化
Buffer A：50mM Tris-Hcl，0.5M NaCl，5％glycerin，0.02％Triton X-100，pH8.0
Buffer B：50mM Tris-Hcl，0.5M NaCl，0.5M imidazole，5％glycerin，0.02％TritonX-100，pH 8.0
收集的菌体用Buffer A重悬，匀浆机低温破碎菌体，12000rpm离心收集上清，用HisTrapTM FF亲和层析柱(5mL,GE Healthcare)对目的蛋白进行分离纯化。先用Buffer A冲洗层析柱，进行预平衡，然后通过调节两种缓冲液的比例，用含不同咪唑浓度的缓冲液清洗杂蛋白，目的蛋白在300mM咪唑的缓冲液中洗脱获得。
收集各阶段的样品用于后续的SDS-PAGE分析，结果如下：表皮蛋白BmCPAP3-A1如图1所示；表皮蛋白BmCPAP3-C如图2所示。BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C表皮蛋白的纯度较高，没有杂带。
实施例2检测表皮蛋白BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C与壳聚糖和几丁质结合能力
反应体系：5μM BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C蛋白，2mg几丁质(Chitin)和壳聚糖(Chitosan)底物，结合缓冲液为20mM NaH2PO4，20mM NaCl，pH 6.5，反应总体积500μL。
反应过程：反应在室温(25℃)下进行，蛋白和底物在2mL离心管中持续颠倒混匀并孵育2h，记为加入总蛋白量液(T：Total Protein)。反应结束后，12000rpm离心5min，用1mL注射器将管内的上清全部吸出至新的1.5mL离心管中，记为透过液(FT：Flow Through)。向沉淀中加入1mL的结合缓冲液，将沉淀重悬，颠倒混匀，对沉淀进行清洗，清洗过程中尽量将管壁上粘附的几丁质冲洗下来，12000rpm离心5min，弃上清。重复清洗3次。向沉淀中加入50μL的1×SDS loading buffer，沸水浴5min。12000rpm离心5min，取出上清进行SDS-PAGE电泳分析(其上清记为E：Elution)。
实验结论：分别取等体积的反应初始加入的蛋白溶液和透过液用于SDS-PAGE电泳分析，结果如图3所示，可以看出BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C蛋白均能与壳聚糖和几丁质结合。(SDS-PAGE凝胶上的较小条带是由于这些蛋白质在结合缓冲液中的不稳定性所致)
考马斯亮蓝法测定透过液中的蛋白浓度并与初始加入的蛋白浓度进行比较，牛血清蛋白(BSA)不具有几丁质结合结构域，理论上不能结合几丁质，故将其作为结合实验的阴性对照。每种蛋白对壳聚糖/几丁质底物的结合实验分三次进行。测定每种检测中的蛋白质浓度，然后计算三次的平均值和标准差。计算与壳聚糖和几丁质结合蛋白的量，绘制柱形图，比较各个蛋白的结合能力差异，结果如图4所示。
结果表明，BmCPAP3-A1与BmCPAP3-C均能与壳聚糖以及几丁质有较好的结合能力，且对两种底物的结合程度均超过了50％。BmCPAP3-A1与BmCPAP3-C并未表现出对壳聚糖或几丁质较为明显的结合偏好性，推测CPAP3蛋白对两种底物的可能通过极性氨基酸与糖环上的羟基基团或乙酰氨基基团之间的氢键相互作用，或通过芳香族氨基酸与糖环之间的疏水相互作用等方式。
实施例3表皮蛋白BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C与α-几丁质晶态纤维结合形成纤维束
(1)从棕囊藻(Phaeocystis globosa)中提取α-几丁质晶态纤维。首先将棕囊藻离心去上清，并使用0.1mol/L的HCL在50℃下处理3小时，离心去除上清。再加入1mol/L的KOH在室温下处理过夜，离心去上清。最后加入0.3％的NaClO2将pH调至4.0，80℃下处理3小时。在每次酸碱处理过后，均需要使用纯水重悬清洗沉淀2-3次。
(2)将终浓度为0.5mg/ml的BmCPAP3-A1或BmCPAP3-C蛋白与α-几丁质晶态纤维在磷酸盐缓冲液(10mM NaH2PO4，pH 7.0)中进行混合并4℃下孵育过夜。
(3)取等体积的α-几丁质晶态纤维溶液，以及BmCPAP3-A1或BmCPAP3-C和α-几丁质晶态纤维的混合液经过震荡之后滴加到硅片上室温中干燥，然后使用扫描电镜对样品进行观测。未加入任何蛋白的α-几丁质晶态纤维作为空白对照。
观察结果如图8所示，对照组SEM结果显示α-几丁质晶态纤维呈分散状态，纤维排列无序且不发生聚集。并且α-几丁质晶态纤维的弯曲处呈一定角度，纤维整体形态更加竖直。BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C表皮蛋白与α-几丁质晶态纤维结合后，SEM结果显示α-几丁质晶态纤维相互缠绕，捆绑，聚集形成更高级的纤维束结构。在一些特殊位置可以看到几丁质纳米纤维平行排列并紧密贴合在一起形成平面的结构。并且α-几丁质晶态纤维变得容易弯曲，弯曲处角度不明显。
由此推测：BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C表皮蛋白能够与α-几丁质晶态纤维进行结合，并将几丁质纤维捆绑聚集形成更高一级的几丁质纤维束结构。
实施例4制备BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C与壳聚糖复合薄膜材料
(1)将壳聚糖(CS，脱乙酰度≥95％，粘度100-200mpa.s，分子量100kDa)粉末溶解于最终浓度为20mg/mL的1％乙酸溶液中，连续搅拌直至完全溶解。分别将0.3、0.6、1.8、5和10mg BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C蛋白溶解于水中，制备不同浓度的BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C溶液。
(2)将不同浓度的蛋白质溶液加入5ml壳聚糖溶液中，以100rpm的速度搅拌，浇铸在直径6cm的聚苯乙烯培养皿中，室温下晾干。在培养皿上形成厚度约30μm的透明复合膜并剥离。制备了表皮蛋白质含量分别为1wt％、5wt％和10wt％的CS/CPAP3-A1和CS/CPAP3-C复合薄膜。
(3)用步骤(2)同样的方法制备纯壳聚糖膜(纯CS膜)，不添加蛋白质。
实施例5壳聚糖复合薄膜的性能表征
1、机械性能表征
从实施例3获得的完整的CS/CPAP3-A1和CS/CPAP3-C复合薄膜，以及纯CS膜上分别小心地切下尺寸约为25×7mm的至少5个试样，纯CS膜作为对照组。使用配备有100N容量力传感器(BAB-XS-10M)，在20℃和20±5％相对湿度下进行所有试验。杨氏模量由拉伸应力-应变曲线的初始斜率确定，抗拉强度确定为试样断裂时的应力。韧性定义为断裂功，计算为应力-应变曲线下的面积。测量值报告为至少五个样本的平均值，如图5和表3。
表3机械性能参数
通过图5和表3的结果可以看出，通过引入重量比约为1％、5％或10％的BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C到壳聚糖复合薄膜中，在基本不损耗模量的情况下，能够提升或显著的提升复合薄膜材料的拉伸强度，延伸能力和韧性，解决了传统壳聚糖薄膜材料刚性与韧性互斥的问题。
由于说明书中已经证明，不同昆虫，如鳞翅目家蚕、棉铃虫；鞘翅目昆虫赤拟谷盗；双翅目昆虫埃及伊蚊，冈比亚按蚊，黑腹果蝇，致倦库蚊；同翅目昆虫豌豆长管蚜；膜翅目昆虫意大利蜂，蝇蛹金小蜂；虱目昆虫人体虱。其中CPAP3家族蛋白在结构域分布和序列相似度上都是高度保守的，推测CPAP3家族蛋白与底物互作的模式也是保守的，因此，能够推测上述昆虫的CPAP3家族蛋白也能提升壳聚糖材料机械性能。
2、微观结构观测
用场发射扫描电子显微镜(FESEM，日本东京日立SU8220)观察了纯壳聚糖膜和CS/CPAP3-A1和CS/CPAP3-C复合薄膜的平面结构以及经过拉伸试验后的断裂面结构。将纯壳聚糖膜和CS/CPAP3-A1和CS/CPAP3-C复合薄膜放置在干燥器中以除去水分，再使用离子溅射镀膜机溅射一薄层金/钯。在5kv加速电压和10uA条件下拍摄了SEM图像，如图6所示。
通过FESEM观测发现，BmCPAP3-A1与BmCPAP3-C的加入能够使壳聚糖微丝有序的定向排列，并且能够明显的观测到壳聚糖微丝组装成壳聚糖纤维束，显著的提升壳聚糖薄膜材料的机械性能。
3、透光性能测试
采用紫外-可见分光光度计(LAMBDA 750，PerkinElmer，USA)对纯壳聚糖膜和含有表皮蛋白BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C的复合薄膜在300-800nm波长范围内的光学透射率进行了表征，如图7。结果表明无论是纯壳聚糖薄膜，还是含有表皮蛋白的复合薄膜，在600nm可见光下，其透光率均达到90％左右。
对制备的CS/CPAP3-A1和CS/CPAP3-C复合薄膜材料的机械性能以及微观结构探究后发现，在一定的蛋白含量范围内，BmCPAP3-A1和BmCPAP3-C的引入能够在保证模量不受损的情况下显著的提升壳聚糖薄膜材料的机械性能以及改变微观层次结构，使其断裂延伸率以及韧性大幅度提升。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种提升壳聚糖材料机械性能的方法，其特征在于，在壳聚糖材料中加入昆虫类围食膜因子表皮蛋白CPAP3，得到壳聚糖复合材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述昆虫选自鳞翅目家蚕、棉铃虫；鞘翅目昆虫赤拟谷盗；双翅目昆虫埃及伊蚊，冈比亚按蚊，黑腹果蝇，致倦库蚊；同翅目昆虫豌豆长管蚜；膜翅目昆虫意大利蜂，蝇蛹金小蜂；虱目昆虫人体虱。
3.根据权利要求2所述的方法，所述表皮蛋白CPAP3为家蚕类围食膜因子表皮蛋白BmCPAP3s。
4.根据权利要求3所述的方法，所述表皮蛋白BmCPAP3s选自BmCPAP3-A1、BmCPAP3-A2、BmCPAP3-B、BmCPAP3-E1、BmCPAP3-E2、BmCPAP3-C、BmCPAP3-D1、BmCPAP3-D2中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的方法，所述表皮蛋白BmCPAP3s为BmCPAP3-A1和/或BmCPAP3-C，所述表皮蛋白BmCPAP3s的含量为1-20wt％。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，所述壳聚糖复合材料为壳聚糖薄膜材料、壳聚糖多孔材料、壳聚糖支架材料或壳聚糖凝胶。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述壳聚糖复合材料为壳聚糖薄膜材料，所述表皮蛋白BmCPAP3s的含量为1-10wt％；将含有家蚕表皮蛋白BmCPAP3-A1和/或BmCPAP3-C溶液，以及含有壳聚糖的溶液混合均匀后，经成膜处理获得家蚕表皮蛋白与壳聚糖复合薄膜材料。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述家蚕表皮蛋白BmCPAP3-A1和/或BmCPAP3-C通过基因重组的方法获得，所述家蚕表皮蛋白BmCPAP3-A1和/或BmCPAP3-C溶液为水溶液，所述含有壳聚糖的溶液为乙酸溶液，所述壳聚糖薄膜材料的厚度为25-35μm。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法制备得到的壳聚糖复合材料。
10.权利要求9所述的壳聚糖复合材料在包装领域或生物医学领域中的应用。
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