CN109722429A - 来源于酿酒酵母中几丁质脱乙酰酶及编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种来源酿酒酵母菌的几丁质脱乙酰基酶的克隆表达及其应用。酿酒酵母菌几丁质脱乙酰酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；酿酒酵母菌几丁质脱乙酰酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示所示。本发明还提供了一种制备该几丁质脱乙酰酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将该几丁质脱乙酰酶的基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZα上，获得可异源表达该酶的毕赤酵母重组菌株，用该菌株异源表达制备的几丁质脱乙酰酶ScCDA2，PH适应范围广，具有专一脱乙酰模式的特点。能作用于虾蟹壳等不同来源的几丁质和几丁寡糖。本发明提供的几丁质脱乙酰酶可广泛应用于食品科学、生物医药、化工材料等方面。

Description

来源于酿酒酵母中几丁质脱乙酰酶及编码基因与应用

技术领域

本发明涉及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的超嗜热耐高温PH适应范围广的几丁质脱乙酰酶编码基因及制备与应用。本发明还提供了该几丁质脱乙酰酶的重组质粒和重组基因工程菌株。本发明的几丁质脱乙酰酶ScCDA₂可以广泛应用于食品科学、生物医药、化工材料等方面。

背景技术

几丁质是自然界中仅次于纤维素的第二大可再生自然资源，广泛存在于海洋中。(陈少波,吴根福.科技通报,2004,(03):258-262.)壳聚糖是几丁质的脱乙酰产物，是自然界唯一存在的一种碱性多糖，分子式为(C6H11NO4)n，具有广谱的抑菌性，保水性，可再生性、良好的生物相容性，可降解性，较高的载药性、无毒副作用等特性，通过戊二醛交联法，接枝、乙酰化等多种化学物理改性之后，广泛应用于医药、环保、食品、农业、造纸、化妆品等领域。传统化学法生产壳聚糖的流程如下：挑选干净的虾蟹壳用4％～6％盐酸浸泡除去无机盐，然后用10％氢氧化钠煮沸洗脱蛋白，漂白清洗晒干得到几丁质，用40％～60％的浓氢氧化钠100～180℃保温1-3小时脱去乙酰基清洗烘干即可得到壳聚糖。此法不仅反应条件要求苛刻，而且会有大量的副产物产生，环境污染严重，存在分离困难等技术缺陷。生物酶法生产壳聚糖反应条件温和，无污染，脱乙酰度稳定，在壳聚糖的生产方面提供了一种新的方法。目前人们已经发现几丁质脱乙酰酶可以直接从几丁质上脱去乙酰基生成壳聚糖，该酶广泛存在于真核生物和原核生物中[Zhao Y.Journal of Biotechnology,2008,136:290]。研究表明几质脱乙酰酶已经实现了在毕赤酵母或大肠杆菌中异源表达，以获得表达量高，稳定性好，活性高的几丁质脱乙酰酶，并且部分已经应用于生产实践中。

Blair,D.E.等通过对CDA家族的多重序列比对显示，CDA家族的序列中含有五个保守序列，这些序列中含有几个保守的天冬氨酸和组氨酸残基，这些保守序列构成了CDA的活性位点。这五个基序被分别命名为基序1(TFDD)、基序2(HSWSHP)、基序3(RPPY)、基序4(DSLDW)、基序5(GSIVLMH)。基序1(TFDD)包括两个天冬氨酸残基；一个天冬氨酸残基与锌或钴相互作用，第二个天冬氨酸残基与底物结合，使反应生成乙酸。基序2(HSWSHP)中含有两个组氨酸，一个丝氨酸或一个苏氨酸，其中组氨酸可以与金属离子结合稳定酶的结构，丝氨酸或苏氨酸可以与组氨酸结合形成氢键。基序3(RPPY)形成了活性位点凹槽的一侧，它可以与结合醋酸、锌、并协调天冬氨酸的催化活性，酪氨酸可以与乙酸形成氢键，当来源于肺炎链球菌的肽聚糖脱乙酰酶中酪氨酸突变为丙氨酸时，该酶就会发生失活。基序4(DSLDW)构成了活性位点沟槽的另一侧，色氨酸是该基序的关键氨基酸。基序5(GSIVLMH)包含来自于疏水口袋的亮氨酸和来自于和产物乙酸结合的组氨酸(Blair D E,Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,2005,102(43):15429-15434)。

最早发现CDA是Hearaki等在1974年时从接合菌纲(Zygomycota)的鲁氏毛霉属(Mucorrouxii)中发现的，并对该酶的的一些酶学性质进行了研究。在真菌中人们也发现包括毛霉、根霉、青霉、曲霉、以及黄瓜炭疽病(cucumber anthracnose、小麦条锈病菌(Puccinia striformis)等能够产CDA。另外，CDA在杆菌属的Alcaligenessp细菌中也有发现,1998年Srinivasan分离出了这种能够在胞外大量分泌CDA的碱性细菌。

表1部分CDA产生菌株及酶学性质

从表中可以看出CDA的分子量大多在30-80KD之间，等电点都在酸性范围内PH值都不大于4，酶的最适温度大多在50℃,但是不同来源的CDA的最适PH值范围较大从酸性PH到碱性PH。CDA也被发现存在于很多甲壳类昆虫的中肠围食膜，如Drosophila melanogaster、Anophelesgambiae、Apis mellifera、Mamestra configurata、Helicoverpa armigera、Trichoplusia ni、Triboliumcastaneum、等，昆虫体内都有CDA的存在。

利用几丁质脱乙酰酶代替现在普遍采用的浓碱热解法生产高质量的壳聚糖，这既可以解决目前壳聚糖生产中的环境污染问题，又可以生产出高质量的壳聚糖产品，如乙酰化程度均匀、分子量分布范围窄的壳聚糖产品，以及具有特定乙酰化位置的壳聚寡糖等，因此该酶还有重要的工业应用和生物医学等领域的应用价值。且目前尚未有报道应用于工业化的几丁质脱乙酰酶，其主要原因在于目前已经报道的几丁质脱乙酰酶热稳定差，PH耐受范围小，蛋白表达量低等特点。而本发明制备的酿酒酵母菌几丁质脱乙酰酶(ScCDA₂)表达量高，热稳定好，PH耐受范围广，脱乙酰基能力强，且具有专一的脱乙酰基模式，因此可以应用于特定脱乙酰度特定脱乙酰位点的壳寡糖或壳聚糖的生产。

嗜热酶不仅具有化学催化剂无法比拟的优点,如催化效率高和底物专一性强,而且酶在高温条件下的稳定性极好[Reth M B,Walter A B,David B W,etal.Biochemistry,1999,38:2570～2576]。因而它可以克服中温酶(20℃～55℃)及低温酶(-2℃～20℃)在应用过程中常常出现的生物学性质不稳定的现象,从而使很多高温化学反应过程得以实现,这将极大地促进生物技术产业的发展,从而带动技术水平和生活质量的提高。目前,对嗜热酶的研究还处于初期阶段，尚未有人报道具有超嗜热耐高温特性的几丁质脱乙酰酶。由于其良好的热稳定性在高温工业过程中具有潜在应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的是发现一种重组几丁质脱乙酰酶，酶的编码基因是SEQ IDNO.1，由其编码产生的几丁质脱乙酰酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2具有超嗜热耐高温，PH适应范围广的特点。

本发明的第二个目的是提供一种具有超嗜热耐高温，PH适应范围广，专一脱乙酰模式的特点的几丁质脱乙酰酶ScCDA₂。

本本发明的第三个目的是异源表达生产的几丁质脱乙酰酶ScCDA₂在几丁质，几丁寡糖降解中的应用：

1)用于来源于虾、蟹、鱿鱼、蚝和墨鱼等甲壳类动物外壳，藻类的细胞壁、无脊椎动物的外骨骼及表皮中的几丁质来生产壳聚糖，壳寡糖，氨基葡萄糖等脱乙酰产物。

2)用于脱去几丁质或几丁寡糖的乙酰基，获得壳聚糖，壳寡糖，氨基葡萄糖等几丁质脱乙酰产物

此外该几丁质脱乙酰酶ScCDA₂可以与其他几丁质降解酶或脱乙酰酶混合后，用于协同断裂几丁质、壳寡糖的糖苷键方面的应用。

该几丁质脱乙酰酶ScCDA₂用来生产特定脱乙酰度，特定脱乙酰位点的壳寡糖或壳聚糖的产物。

本发明的几丁质脱乙酰酶ScCDA₂的基因序列是通过PCR技术从酿酒酵母基因组中克隆得到。该基因编码区长861bp，编码了287个氨基酸，分子量为34kDa，属于多糖裂解酶第4家族。异源表达制备的几丁质脱乙酰酶ScCDA2，ScCDA₂具有超嗜热耐高温，PH适应范围广，具有专一脱乙酰模式的特点。能作用于虾蟹壳等不同来源的几丁质和几丁寡糖。以几丁质、几丁寡糖为底物时，在50℃、pH8.0的条件下具有最高酶活性，比活为0.625U/mg。相对于几丁质，聚合度为2-6的几丁寡糖有更高的降解活性。

本发明的几丁质脱乙酰酶ScCDA₂可广泛应用农业、食品、饲料添加剂、医药及食品科学等领域。

本发明利用基因工程的技术方法，将该几丁质脱乙酰酶的基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZα上，获得可异源表达该酶的毕赤酵母重组菌株，用该菌株异源表达制备的几丁质脱乙酰酶ScCDA2，ScCDA₂具有超嗜热耐高温，PH适应范围广，具有专一脱乙酰模式的特点。能作用于虾蟹壳等不同来源的几丁质和几丁寡糖。本发明提供的几丁质脱乙酰酶可广泛应用于食品科学、生物医药、化工材料等方面。

附图说明

图1：几丁质脱乙酰酶ScCDA2基因的电泳检测图。

图2：重组几丁质脱乙酰酶ScCDA2纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)。左图：M预染蛋白分子量标准；泳道1-x-33/pPICZα-CDA2诱导表达离心上清，右图：泳道1-纯化后的蛋白10μM,泳道2纯化后的蛋白5μM，泳道3纯化后的蛋白2μM，泳道4预染蛋白分子量标准。

图3：几丁质脱乙酰酶在毕赤酵母中表达纯化后切除糖苷键的电泳图。

图4：pH值对几丁质脱乙酰酶活性影响的曲线图。

图5：温度对几丁质脱乙酰酶ScCDA2的影响曲线图,，底物几丁六糖(A6)。

图6：几丁质脱乙酰酶ScCDA2的底物偏好性曲线图。

图7：几丁质脱乙酰酶ScCDA2催化几丁四糖(A4)的质谱分析，A3D1代表底物脱去一个乙酰基，A2D2代表底物脱去两个乙酰基，A1D3代表底物脱去三个乙酰基。

图8:圆二色谱法鉴定酿酒酵母几丁质脱乙酰酶的热稳定性图。

图9：圆二色谱法检测不同温度下蛋白二级结构的变化图。

图10为A3D1衍生化后一级质谱图。

图11为A2D2衍生化后一级质谱图。

图12为A1D3衍生化后一级质谱图。

图13为A3D1衍生化后二级质谱图。

图14为A2D2衍生化后二级质谱图。

图15为A1D3衍生化后二级质谱图。

具体实施方式

实施例1几丁质脱乙酰酶基因全长克隆。

从NCBI上调取目的基因，将该目的基因在中美泰和生物技术(北京)有限公司进行基因合成。通过对糖酯酶第4家族(carbohydrate esterase family 4，CE4)的几丁质脱乙酰酶进行多序列比对分析后，设计引物CDA-F:5’-CCATGG GAAGCTAATAGGGAAGATTTA-3’；CDA-R5’-CCGCTCGAGGGACAAGAATTCTTTTATGT AATC-3’。以合成的DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃ 5min，1个循环；94℃ 30s，45℃ 30s，72℃ 1min 30s，30个循环；72℃10min，1个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后，切胶回收目的片段，连接到pMD19-T载体后测序。

实施例2几丁质脱乙酰酶基因全序列分析

测序的结果采用GenBank数据库中的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)分析，Vector NTI Suite 8.0软件进行多序列比对，分析其同源性。采用SimpleModular Architecture Research Tool(SMART)在线工具分析序列的结构域。

获得的几丁质脱乙酰酶(命名为ScCDA₂)编码区长861bp，其核苷酸序列如SEQ IDNO 1所示。ScCDA2的核苷酸序列与来源于Saccharomyces cerevisiae strainY12chromosome XII sequence的脱乙酰蛋白的基因(登录号CP020202.1)有最高一致性(100％)。cCDA2编码287个氨基酸和一个终止密码子，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，蛋白质分子量为34kDa，预测等电点为7.0。SMART分析表明，ScCDA2的蛋白的结构域特征与多糖裂解酶4族成员更为相似，由此表明ScCDA₂为CH4家族的一名成员。

实施例3ScCDA₂基因在毕赤酵母菌中的重组表达以合成的DNA为模板，利用设计的设计引物CDA-F:5’-CCATGGGAAGCTAATAGGGAAGATTTA-3’；CDA-R5’-CCGCTCGAGGGACAAGAATTCTTTTATGTAATC-3’扩增目的基因序列。将目的基因构建到PMD-19T克隆载体上，涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养14h，挑取单克隆；将单克隆接入含有100μg/mL氨苄西林的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；将质粒用正向引物ScCDA-F和反向引物ScCDA-R进行菌落PCR验证，结果得到大小正确的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒送去英潍捷基公司测序，结果表明，在PMD-19T载体上Nco I和Xho I位点之间插入SEQ ID NO 1所示的ScCDA₂序列和方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为PMD-19T-ScCDA₂。

将PMD-19T-ScCDA2构建至pPICZα质粒中，转化至毕赤酵母x-33菌株(购自美国Novagen公司)，然后按照该公司提供的操作步骤进行几丁质脱乙酰酶的表达及纯化。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测几丁质脱乙酰酶的纯化情况，结果如图2(左图)所示，纯化后的几丁质脱乙酰酶在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。酵母中表达的几丁质脱乙酰酶为糖基化的酶，用PNGF酶切除糖苷键以后分子量发生了下降如图三所示。

实施例4几丁质脱乙酰酶的酶学性质分析

(1)几丁质脱乙酰酶活力的测定

醋酸试剂盒测定酶活，酶活力单位定义为:每分钟释放1μmol醋酸所需的酶量为一个酶活力单位(U)。发酵液酶活力单位定义为每毫升发酵液含酶活单位(U/mL)。使用博彩蛋白质定量测定试剂盒进行测定，以牛血清白蛋白为标准蛋白。

(2)pH对酶ScCDA₂的影响

将底物、重组酶液以及50mmol/L不同pH的缓冲液(pH3-11)在37℃下反应30min，按标准方法测定酶活。以最高酶活100％计算相对酶活。结果如图4所示，ScCDA₂的最适PH值为8.0。

(3)温度对酶ScCDA₂的影响

将底物、重组酶液以及50mmol/L(Tris-cl,PH＝8.0,5mMCoCl₂)冲液(pH8.0)分别在37℃，50℃，65℃条件下的酶活。以最高酶活力为100％计算相对酶活。结果如图5所示，ScCDA₂的最适反应温度是50℃。

(4)重组酶ScCDA₂的底物偏好性

将重组酶分别与水溶性几丁质，N-乙酰壳二糖，N-乙酰壳三塘，N-乙酰壳四糖，N-乙酰壳五糖，N-乙酰壳六糖。在37℃，pH7.0条件下反应。用荧光酶标仪记录不同反应时间产物在340nm处的吸收值。根据紫外法测几丁质脱乙酰酶的原理进行活性检测(Martinou A,Koutsioulis D,Bouriotis V.Enzyme&Microbial Technology,2003,32(6):757-763.)，结果如图6所示。

(5)质谱检测酶反应产物

将底物、重组酶液以及50mmol/L(Tris-cl,PH＝8.0,5mMCoCl2)缓冲液(pH8.0)分别在37℃，50℃，65℃条件下反应10min，质谱检测酶反应产物。如图7所示。

实施例5超嗜热耐高温几丁质脱乙酰酶的鉴定。

将纯化后的蛋白0.05mg/ml，放入1cm的矩形石英比色皿中，在190-250nm进行扫描，数据间隔0.5nm,每分钟扫描100次，从室温20摄氏度进行程序升温，并在室温，30℃，60℃，75℃和120℃不同温度条件下稳定3分钟后开始检查二级结构的变化。结果显示在不同温度条件下蛋白二级结构具有稳定性。且蛋白Tm值在100℃以内并未出现。说明蛋白在100℃内并没有失活，具有超嗜热耐高温的特性。如图8，图9所示。

实施例6几丁质脱乙酰酶专一催化机制的研究

将ScCDA2和几丁四糖反应的产物用2-α氨基亚丁酮衍生化后二级质谱分析脱乙酰酶的专一性催化机制。衍生化具体步骤如下：

1)配冰乙酸：二甲基亚砜按体积比为3：17配制50μl即为缓冲液1。

取0.4mg的2-α氨基亚丁酮，溶于40μl缓冲液中。

2)取分离的冷冻干燥的产物越2μg，溶于10μl的2-α氨基亚丁酮溶液中。

3)手动摇晃30S左右。

4)再加入10μl的1M氰基硼氢钠，氰基硼氢钠溶于三次水中。

4)混合液放在PCR小管中，90℃反应30min，反应后冷却至-2 0℃

5)将反应后的产物冷冻干燥，用1:1的甲醇和水溶液(100-500μL)充分溶解，取10μl样品用含30％乙腈溶解的DHB基质进行一级质谱鉴定是否发生了衍生化。

6)衍生化的寡糖按照自己预期的分子量进行二级质谱鉴定。如图10-15所示。

序列表：

SEQ ID NO.1(酿酒酵母来源的CDA目的基因序列)

GAAGCTAATAGGGAAGATTTAAAGCAGATAGACTTTCAATTTCCTGTATTGGAAAGGGCAGCTACAAAAACGCCTTTTCCGGATTGGCTTAGTGCATTTACCGGGTTAAAAGAATGGCCTGGGTTAGATCCACCTTATATACCTTTAGATTTCATTGATTTCAGTCAAATTCCAGATTATAAGGAATATGATCAAAACCATTGCGACAGTGTTCCAAGGGACTCGTGCTCTTTCGATTGCCATCACTGCACCGAACACGATGATGTGTACACATGTTCCAAACTTTCCCAGACATTTGACGATGGTCCTTCTGCTTCCACTACTAAATTATTGGACCGGTTGAAGCATAATTCCACCTTCTTCAATTTAGGTGTCAATATAGTTCAACATCCAGATATCTATCAAAGAATGCAAA

AGGAGGGACACTTAATCGGCTCACATACCTGGTCTCACGTATATTTGCCAAATGTATCGAATGAAAAAATTATAGCTCAAATTGAATGGTCCATCTGGGCGATGAATGCTACTGGCAACCATACCCCCAAATGGTTCAGACCTCCATATGGCGGAATAGATAATAGAGTAAGAGCAATAACAAGGCAATTTGGCTTACAAGCCGTCTTATGGGATCACGATACTTTTGATTGGAGCCTCCTTCTCAATGATTCTGTCATAACTGAACAAGAAATTCTTCAAAATGTAATAAACTGGAACAAGTCAGGAACCGGATTAATATTAGAACACGATTCAACGGAAAAAACTGTC

GATCTTGCCATTAAAATAAATAAGTTGATAGGTGATGATCAATCAACAGTTTCTCATTGTGTCGGCGGAA

TTGATTACATAAAAGAATTCTTGTCC

SEQ ID NO.2(酿酒酵母来源的CDA氨基酸序列)

EANREDLKQIDFQFPVLERAATKTPFPDWLSAFTGLKEWPGLDPPYIPLDFIDFSQIPDYKEYDQNHCDSVPRDSCSFDCHHCTEHDDVYTCSKLSQTFDDGPSASTTKLLDRLKHNSTFFNLGVNIVQHPDIYQRMQKEGHLIGSHTWSHVYLPNVSNEKIIAQIEWSIWAMNATGNHTPKWFRPPYGGIDNRVRAITRQFGLQAVLWDHDTFDWSLLLNDSVITEQEILQNVINWNKSGTGLILEHDSTEKTVDLAIKINKLIGDDQSTVSHCVGGIDYIKEFLS

序列表

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 来源于酿酒酵母中几丁质脱乙酰酶及编码基因与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 861

<212> DNA

<213> gene

<220>

<221> gene

<222> (1)..(861)

<400> 1

gaagctaata gggaagattt aaagcagata gactttcaat ttcctgtatt ggaaagggca 60

gctacaaaaa cgccttttcc ggattggctt agtgcattta ccgggttaaa agaatggcct 120

gggttagatc caccttatat acctttagat ttcattgatt tcagtcaaat tccagattat 180

aaggaatatg atcaaaacca ttgcgacagt gttccaaggg actcgtgctc tttcgattgc 240

catcactgca ccgaacacga tgatgtgtac acatgttcca aactttccca gacatttgac 300

gatggtcctt ctgcttccac tactaaatta ttggaccggt tgaagcataa ttccaccttc 360

ttcaatttag gtgtcaatat agttcaacat ccagatatct atcaaagaat gcaaaaggag 420

ggacacttaa tcggctcaca tacctggtct cacgtatatt tgccaaatgt atcgaatgaa 480

aaaattatag ctcaaattga atggtccatc tgggcgatga atgctactgg caaccatacc 540

cccaaatggt tcagacctcc atatggcgga atagataata gagtaagagc aataacaagg 600

caatttggct tacaagccgt cttatgggat cacgatactt ttgattggag cctccttctc 660

aatgattctg tcataactga acaagaaatt cttcaaaatg taataaactg gaacaagtca 720

ggaaccggat taatattaga acacgattca acggaaaaaa ctgtcgatct tgccattaaa 780

ataaataagt tgataggtga tgatcaatca acagtttctc attgtgtcgg cggaattgat 840

tacataaaag aattcttgtc c 861

<210> 3

<211> 287

<212> PRT

<213> 酿酒酵母来源的CDA氨基酸序列(aminoacid)

<400> 3

Glu Ala Asn Arg Glu Asp Leu Lys Gln Ile Asp Phe Gln Phe Pro Val

1 5 10 15

Leu Glu Arg Ala Ala Thr Lys Thr Pro Phe Pro Asp Trp Leu Ser Ala

20 25 30

Phe Thr Gly Leu Lys Glu Trp Pro Gly Leu Asp Pro Pro Tyr Ile Pro

35 40 45

Leu Asp Phe Ile Asp Phe Ser Gln Ile Pro Asp Tyr Lys Glu Tyr Asp

50 55 60

Gln Asn His Cys Asp Ser Val Pro Arg Asp Ser Cys Ser Phe Asp Cys

65 70 75 80

His His Cys Thr Glu His Asp Asp Val Tyr Thr Cys Ser Lys Leu Ser

85 90 95

Gln Thr Phe Asp Asp Gly Pro Ser Ala Ser Thr Thr Lys Leu Leu Asp

100 105 110

Arg Leu Lys His Asn Ser Thr Phe Phe Asn Leu Gly Val Asn Ile Val

115 120 125

Gln His Pro Asp Ile Tyr Gln Arg Met Gln Lys Glu Gly His Leu Ile

130 135 140

Gly Ser His Thr Trp Ser His Val Tyr Leu Pro Asn Val Ser Asn Glu

145 150 155 160

Lys Ile Ile Ala Gln Ile Glu Trp Ser Ile Trp Ala Met Asn Ala Thr

165 170 175

Gly Asn His Thr Pro Lys Trp Phe Arg Pro Pro Tyr Gly Gly Ile Asp

180 185 190

Asn Arg Val Arg Ala Ile Thr Arg Gln Phe Gly Leu Gln Ala Val Leu

195 200 205

Trp Asp His Asp Thr Phe Asp Trp Ser Leu Leu Leu Asn Asp Ser Val

210 215 220

Ile Thr Glu Gln Glu Ile Leu Gln Asn Val Ile Asn Trp Asn Lys Ser

225 230 235 240

Gly Thr Gly Leu Ile Leu Glu His Asp Ser Thr Glu Lys Thr Val Asp

245 250 255

Leu Ala Ile Lys Ile Asn Lys Leu Ile Gly Asp Asp Gln Ser Thr Val

260 265 270

Ser His Cys Val Gly Gly Ile Asp Tyr Ile Lys Glu Phe Leu Ser

275 280 285

Claims (7)

1.来源于酿酒酵母的几丁质脱乙酰酶，

其特征在于：其具有SEQ ID NO.2所示序列。

2.根据权利要求1所述的几丁质脱乙酰酶，其特征在于：具有超嗜热耐高温的特点；几丁质脱乙酰酶ScCDA2在120℃条件下仍具有活性。

3.一种权利要求1所述的几丁质脱乙酰酶编码基因，其特征在于：所述酶的编码基因具有SEQ ID NO.1所示序列，由其编码产生的几丁质脱乙酰酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

4.一种权利要求1或2所述的几丁质脱乙酰酶的应用，其特征在于：几丁质脱乙酰酶ScCDA₂的基因序列是通过PCR技术从酿酒酵母基因组中克隆得到；异源表达生产的几丁质脱乙酰酶ScCDA2可用于几丁质、几丁寡糖降解过程中。

5.根据权利要求4所述的的应用，其特征在于：具有如下用途之一或二种以上；

1)用于来源于虾、蟹、鱿鱼、蚝和墨鱼上等中的一种或二种以甲壳类动物外壳、藻类的细胞壁、无脊椎动物的外骨骼及表皮中的一种或二种以上中的几丁质来生产壳聚糖，壳寡糖，氨基葡萄糖等脱乙酰产物中的一种或二种以上；

2)用于脱去几丁质或几丁寡糖的乙酰基，获得壳聚糖，壳寡糖，氨基葡萄糖等中的一种或二种以上的几丁质脱乙酰产物。

6.一种权利要求1或2所述的几丁质脱乙酰酶的应用，其特征在于：所述几丁质脱乙酰酶ScCDA2与除其本身之外的其他几丁质降解酶或脱乙酰酶混合后，用于协同断裂几丁质和/或壳寡糖的糖苷键方面的应用。

7.一种权利要求1或2所述的几丁质脱乙酰酶的应用，其特征在于：所述几丁质脱乙酰酶ScCDA2用来生产完全定义(脱乙酰度范围确定，脱乙酰位点确定)的壳寡糖或壳聚糖的产物。