CN111849948A

CN111849948A - 拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111849948A
Application number: CN202010788325.6A
Authority: CN
Inventors: 任立世; 冯翠; 张毓宸; 焦思明; 王颖; 程功; 孙明; 杜昱光
Original assignee: Zhongke Runxin Suzhou Biological Technology Co ltd
Current assignee: Zhongke Runxin Suzhou Biological Technology Co ltd
Priority date: 2020-08-07
Filing date: 2020-08-07
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-08-07
Also published as: CN111849948B

Abstract

本发明公开了一种拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用。本发明根据毕赤酵母密码子偏爱性，优化后的核酸序列如SEQ ID NO.2所示，利用全基因合成方法获得拟盘多毛孢属真菌的几丁质脱乙酰酶编码基因序列。进一步利用毕赤酵母表达系统对所述优化的几丁质脱乙酰酶编码基因进行分泌表达，获得几丁质脱乙酰酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明获得的几丁质脱乙酰酶可对几丁质、壳聚糖及壳寡糖中的乙酰基进行脱除，从而获得特定结构的壳聚糖或壳寡糖。这些特定结构的壳聚糖或壳寡糖可具有新的或更高的生物活性。因此，该拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶及其脱乙酰产物均具有良好的工业应用前景。

Description

拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于壳聚糖或壳寡糖制备技术领域，具体涉及一种拟盘多毛孢属真菌(Pestalotiopsis sp.)几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用。

背景技术

壳聚糖具有抗菌及激发动植物免疫等一系列生物活性。目前，主要通过化学法使用强碱对几丁质进行化学脱乙酰获得，容易造成环境污染。直接使用几丁质脱乙酰酶对几丁质进行脱乙酰有可能获得乙酰基位点分布可控的壳聚糖，且对环境友好。壳寡糖是甲壳素或者其脱乙酰产物壳聚糖经物理、化学或酶学等方法降解产生的寡聚物，由氨基葡萄糖(Glucosamine，GlcN)、N-乙酰氨基葡萄糖(N-Acetylglucosamine，GlcNAc)或者二者的组合通过β-1,4糖苷键连接而成，通常聚合度(degree of polymerization，DP)<20。壳寡糖具有抗炎、抗肿瘤及激活植物免疫等一系列生物活性。研究发现，壳寡糖生物活性的发挥与其结构，如DP及脱乙酰度(Degree of deacetylation,DDA)甚至乙酰基在寡糖链上的分布等密切相关。因此，制备结构可控的壳寡糖是该领域多功能及高活性新产品研发的新方向。利用不同底物识别类型的几丁质脱乙酰酶对几丁质、壳聚糖或壳寡糖进行脱乙酰，可以获得特定脱乙酰度及乙酰基位点分布的壳聚糖或壳寡糖，从而得到可能具有更高或更新生物活性的新产品。目前，尚缺乏工业用的几丁质脱乙酰酶制剂，限制了该领域的发展。

发明内容

本发明的目的是，提供一种拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用，旨在提供一种经济高效的几丁质脱乙酰酶。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

一种拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶，所述拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶的氨基酸序列选自以下其中一种：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰且具有相同功能的氨基酸序列；

(3)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。

作为优选实施方案，所述拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶的氨基酸序列选自与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列；更优选地，具有95％以上的同源性。

作为优选实施方案，所述拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶的氨基酸序列选自与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有98％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列；更优选地，具有99％以上的同源性。

本发明还提供一种拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶基因，其编码上述的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶。

作为优选实施方案，所述拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶基因。

作为优选实施方案，所述表达载体为pGBG1，表达载体pGBG1通过如下方式获得：

将表达载体pPIC9中如SEQ ID NO.4所示的信号肽序列进行密码子优化，获得适合在毕赤酵母中表达的信号肽序列如SEQ ID NO.5所示；

利用Nsi I/Xho I双酶切，将表达载体pPIC9中如SEQ ID NO.4所示的序列替换为如SEQ ID NO.5所示的信号肽序列，得到表达载体pGBG1。

本发明还提供所述的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶的制备方法，该方法为：将上述的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶基因构建至表达载体中，然后导入毕赤酵母细胞，诱导并获得分泌表达的几丁质脱乙酰酶。

作为优选实施方案，所述毕赤酵母为GS115。

作为优选实施方案，所述拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶的制备方法包括如下步骤：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶壳聚糖酶基因进行全合成并构建至表达载体pGBG1中；

(2)对前述构建的表达载体pGBG1进行酶切线性化后，舍弃含有抗性基因的片段，回收含有几丁质脱乙酰酶基因的片段；

(3)将获得的含有几丁质脱乙酰酶基因的表达载体导入毕赤酵母细胞GS115中，诱导培养，获得分泌表达的几丁质脱乙酰酶。

本发明还提供了所述的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶在几丁质、壳聚糖或壳寡糖脱乙酰中的应用。所述拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶还可与其他酶类，如几丁质脱乙酰酶、几丁质酶或壳聚糖酶等混合使用，协同制备特定结构壳聚糖或壳寡糖。

利用诱导表达的粗酶上清对壳聚糖或壳寡糖底物进行水解并使用质谱方法对产物的组成进行分析。结果表明，本发明所述的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶可用于壳聚糖或壳寡糖的脱乙酰。这些经脱乙酰后的壳聚糖或壳寡糖与调控前相比，可具有新的或更高的生物活性。因此，该酶及其脱乙酰产物均具有良好的工业应用前景。

其中，表达载体pPIC9和毕赤酵母细胞GS115均为商业化产品。

在本发明的研发过程中，发明人对多种细菌及真菌来源的几丁质脱乙酰酶进行了序列优化并试图在毕赤酵母中进行分泌表达，真菌包括构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的五个脱乙酰酶基因(氨基酸序列号：XP_659456.1，ACF22099.1，XP_660066.1，XP_662427，XP_657764)；细菌包括根瘤菌属细菌(Rhizobium sp.GRH2)脱乙酰酶NodB(氨基酸序列号：AJW76244.1)；以及霍乱弧菌(Vibrio cholerae O1 biovar El Tor str.N16961)脱乙酰酶VcCDA(氨基酸序列号：AAF94439.1)；但是这些优化后的几丁质脱乙酰酶基因均未能够在毕赤酵母中成功表达。经过大量实验探索发现拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶成功在毕赤酵母中实现分泌表达。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.本发明的几丁质脱乙酰酶基因来源于拟盘多毛孢属真菌，使用巴斯德毕赤酵母表达系统分泌表达。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统也已被用于乳糖酶及磷脂酶C等食品级酶制剂的表达，其自身也被用于木聚糖酶的生产(GB2760-2014)。因此，使用拟盘多毛孢属真菌来源的几丁质脱乙酰酶基因在毕赤酵母中分泌表达，其产物几丁质脱乙酰酶可用于壳聚糖或壳寡糖的生产。

2.目前尚无商品化的几丁质脱乙酰酶，本发明可能填补该项空白，在新结构壳聚糖及壳寡糖制备领域取得较广泛应用。

附图说明

图1为本发明实施例2中的重组表达载体pescda-pGBG1及其酶切产物凝胶电泳图谱。

图2为本发明实施例3中含拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶基因的毕赤酵母工程菌发酵液上清的SDS-PAGE图谱。

图3为本发明实施例4中低脱乙酰度壳寡糖(几丁寡糖，NACOS)的质谱图。

图4为本发明实施例4中低脱乙酰度壳寡糖(几丁寡糖，NACOS)经几丁质脱乙酰酶Pescda水解后获得产物的质谱图。

图5为本发明实施例5中低脱乙酰度壳聚糖(DA70)经壳聚糖酶CSN水解后产物的质谱图。

图6为本发明实施例5中低脱乙酰度壳聚糖(DA70)经脱乙酰酶Pescda作用后再经壳聚糖酶CSN水解后的产物质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

实施例1几丁质脱乙酰酶基因的密码子优化及全基因合成

在不改变氨基酸序列的前提下，使用毕赤酵母的偏爱密码子，人工设计了拟盘多毛孢属真菌的几丁质脱乙酰酶(如序列SEQ ID NO.1所示，GenBank accession number:APH81274.1)的编码基因，具体核苷酸序列见SEQ ID NO.2。优化后的核苷酸序列与原始编码基因序列(如序列SEQ ID NO.3所示，GenBank accession number:XM_677557.1)同源性为82％。优化后的基因序列委托北京擎科新业生物技术有限公司进行全合成，合成获得的基因序列命名为几丁质脱乙酰酶基因pescda。

实施例2几丁质脱乙酰酶基因pescda的表达载体构建

将表达载体pPIC9中如SEQ ID NO.4所示的信号肽序列进行密码子优化，获得适合在毕赤酵母中表达的信号肽序列如SEQ ID NO.5所示；利用Nsi I/XhoI双酶切，将表达载体pPIC9中如SEQ ID NO.4所示的序列替换为如SEQ ID NO.5所示的信号肽序列，得到表达载体pGBG1。

使用限制性内切酶Xho I及Not I对含有几丁质脱乙酰酶基因pescda的克隆载体进行双酶切，获得目的基因片段，同时使用相同的内切酶对表达载体pGBG1进行双酶切，回收大片段。两个回收产物进行连接，获得重组载体，命名为pescda-pGBG1。为确定目标几丁质脱乙酰酶基因已经构建至载体中，使用Xho I/Not I对该重组载体进行双酶切，并对产物进行琼脂糖凝胶电泳，参见图1，为重组表达载体pescda-pGBG1及其酶切产物凝胶电泳图谱。从图1可以看出：经双酶切后，在750bp-1000bp附近出现了目的基因片段，与几丁质脱乙酰酶基因pescda的片段882bp相符。

实施例3几丁质脱乙酰酶毕赤酵母工程菌的筛选及几丁质脱乙酰酶制备

将获得的重组质粒pescda-pGBG1经限制性内切酶Bgl I线性化后，凝胶电泳回收含有目的基因的核酸片段，电击导入毕赤酵母GS115中，通过组氨酸营养缺陷MD平板上筛选得到重组子。挑取单菌落接种于25mL BMGY培养基中，30℃及250rpm下培养48小时，离心弃上清，加入等量的BMMY进行诱导表达。24h后补加甲醇至其终浓度为1％，以后每隔24h补加一次，共计诱导72h后离心，使用SDS-PAGE检测发酵液上清中的目标蛋白表达情况。参见图2，为发酵液上清的SDS-PAGE图谱，将图中对应的目标蛋白记为几丁质脱乙酰酶PesCDA，用于后期脱乙酰及产物结构鉴定。上述的MD琼脂平板、BMMY琼脂平板、BMGY培养基、BMMY培养基为酵母表达系统常用的培养基，可直接购买或者按照现有文献技术配制均可。

实施例4几丁质脱乙酰酶PesCDA水解低脱乙酰度壳寡糖及其产物质谱分析

称取1g前期通过化学乙酰化制备的低脱乙酰度壳寡糖(NACOS)，加水溶解并定容至100mL，调节至pH 8。加入1mL发酵的PesCDA粗酶液，40℃下搅拌反应48小时。反应结束后，离心去除少量不容物，上清记为NACOS-PesCDA。使用质谱对NACOS及其脱乙酰产物NACOS-PesCDA进行分析，结果如图3和图4所示。图3为低脱乙酰度壳寡糖(NACOS)的质谱图。图4为低脱乙酰度壳寡糖(NACOS)经几丁质脱乙酰酶PesCDA水解后获得产物的质谱图。在图3和图4中，A代表N-乙酰氨基葡萄糖，D代表氨基葡萄糖，随后的数字代表含有该单糖的个数，二者加和为寡糖的聚合度。例如，图3中的A3D1表示该谱峰对应的分子结构为3个N-乙酰氨基葡萄糖和1个氨基葡萄糖组成聚合度为4的壳寡糖。从图3和图4的结果来看，NACOS主要为聚合度3-5，全乙酰及缺少1个乙酰基的壳寡糖；经PesCDA酶处理后的NACOS-PesCDA中，全乙酰化壳寡糖明显较少，进一步脱乙酰的壳寡糖产物比重增加，表明几丁质脱乙酰酶PesCDA的加入使NACOS发生了脱乙酰反应。

实施例5几丁质脱乙酰酶PesCDA与壳聚糖酶协同水解低脱乙酰度壳聚糖及其产物质谱分析

称取1g前期制备的脱乙酰度为70％的低脱乙酰度壳聚糖(DA70)，加乙酸水溶液溶解并定容至100mL，使用NaOH调节至pH 8。加入1mL发酵的PesCDA粗酶液，40℃下搅拌反应48小时。反应结束后，重新使用乙酸调节至pH 6，加入壳聚糖酶CSN继续在40℃下搅拌反应48小时，离心去除少量不容物，上清记为DA70-PesCDA-CSN。同时使用壳聚糖酶CSN酶对pH 6的壳聚糖底物进行水解，作为未加脱乙酰酶PesCDA的对照，进行相同的反应，上清记为DA70-CSN。使用质谱对DA70-CSN及DA70-PesCDA-CSN进行分析，结果如图5和图6所示，图5为低脱乙酰度壳聚糖(DA70)经壳聚糖酶CSN水解后产物的质谱图。图6为低脱乙酰度壳聚糖(DA70)经脱乙酰酶PesCDA作用后再经壳聚糖酶CSN水解后的产物质谱图。在图5和图6中，A代表N-乙酰氨基葡萄糖，D代表氨基葡萄糖，随后的数字代表含有该单糖的个数，二者加和为寡糖的聚合度。例如，图6中的A1D2表示该谱峰对应的分子结构为1个N-乙酰氨基葡萄糖和2个氨基葡萄糖组成聚合度为3的壳寡糖。从结果来看，DA70-CSN主要为聚合度3-5，不同脱乙酰度的壳寡糖；经PesCDA酶处理后，产物中高脱乙酰度壳寡糖相对含量明显升高，说明在PesCDA酶的作用下，发生了进一步的脱乙酰反应。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 中科荣信（苏州）生物科技有限公司

<120> 拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 290

<212> PRT

<213> 拟盘多毛孢属真菌(Pestalotiopsis sp)

<400> 1

Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ser Pro Ile Gln Glu Arg Gln Ser

1 5 10 15

Ser Val Pro Val Gly Thr Ile Ile Thr Ala Cys Thr Val Pro Asn Thr

20 25 30

Phe Ala Leu Thr Phe Asp Asp Gly Pro Phe Ala Tyr Thr Ser Glu Leu

35 40 45

Leu Asp Leu Leu Ser Ser Asn Gly Val Lys Ala Thr Phe Phe Leu Asn

50 55 60

Gly Gln Asn Trp Gly Ser Ile Tyr Asp Tyr Thr Ser Val Val Thr Arg

65 70 75 80

Met Asp Ala Glu Gly His Gln Ile Gly Ser His Thr Trp Ser His Ala

85 90 95

Asp Leu Ala Thr Leu Asp Ala Ala Gly Ile Thr Ser Gln Met Thr Gln

100 105 110

Leu Glu Thr Ala Leu Thr Ser Ile Leu Gly Lys Val Pro Thr Tyr Met

115 120 125

Arg Pro Pro Tyr Phe Ser Thr Asn Ala Leu Ala Leu Ser Thr Leu Gly

130 135 140

Gly Leu Gly Tyr His Val Ile Asn Ala Asn Ile Asp Thr Leu Asp Tyr

145 150 155 160

Glu His Asp Asp Asp Thr Ile Gly Val Ala Phe Thr Asn Phe Gln Asn

165 170 175

Gly Leu Ala Ser Gly Gly Thr Val Ser Leu Met His Asp Val His Ala

180 185 190

Gln Thr Val His Val Leu Val Gln Glu Ala Ile Asn Ala Ile Lys Ala

195 200 205

Lys Gly Leu Thr Pro Val Thr Val Gly Thr Cys Leu Gly Asp Ala Ser

210 215 220

Ala Asn Trp Tyr Lys Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Thr Pro Pro Pro

225 230 235 240

Ala Thr Gly Gly Pro Ser Pro Asp Asp Thr Cys Gly Gly Ser Asn Gly

245 250 255

Tyr Val Cys Gln Asn Ser Gln Cys Cys Ser Gln Trp Gly Trp Cys Gly

260 265 270

Thr Thr Ser Glu Tyr Cys Ala Ala Gly Cys Gln Ala Ala Tyr Gly Pro

275 280 285

Cys Thr

290

<210> 2

<211> 882

<212> DNA

<213> 拟盘多毛孢属真菌(Pestalotiopsis sp)

<400> 2

ctcgagaaga gagaggctga ggcttctcca atccaagaga gacaatcctc cgttccagtc 60

ggtaccatca tcaccgcttg taccgttcca aataccttcg ctctgacctt cgacgacggc 120

ccattcgctt acacctccga gctgttggac ctgttgtctt ccaacggtgt caaggctacc 180

ttcttcttga acggtcaaaa ctggggttcc atctacgact acacctctgt cgttacccgt 240

atggacgctg agggtcacca aatcggttct cacacctggt ctcacgctga cctggccacc 300

ttggacgccg ctggtatcac ctctcaaatg acccaattgg agaccgccct gacctccatc 360

ttgggtaagg ttccaaccta catgagacca ccatacttct ccaccaacgc tctggctttg 420

tctaccttgg gtggtttggg ttaccacgtc atcaacgcta acatcgacac cttggactac 480

gagcacgacg acgacaccat cggtgtcgct ttcaccaact tccaaaacgg tttggcttct 540

ggtggtaccg tctccttgat gcacgacgtc cacgctcaaa ccgtccacgt cctggtccaa 600

gaggctatca acgctatcaa ggctaagggt ctgaccccag tcactgtcgg aacttgtctg 660

ggtgacgcta gcgctaactg gtacaagtct ggtggtggtt ccggaactac tccaccacct 720

gccactggtg gtccatcccc agatgatact tgtggtggtt ccaacggtta cgtttgtcaa 780

aactctcaat gttgttctca atggggatgg tgtggtacca cctccgagta ctgtgccgct 840

ggttgtcaag ccgcttacgg tccatgtact taagcggccg cg 882

<210> 3

<211> 849

<212> DNA

<213> 拟盘多毛孢属真菌(Pestalotiopsis sp)

<400> 3

tcgcccatcc aagagcggca gagctccgtt cccgtcggca ccatcatcac ggcctgtacc 60

gtgccgaata cgtttgccct gacgtttgac gacgggccct ttgcctacac gtccgagctg 120

ctcgacctgc tctcgagcaa cggcgtcaag gccaccttct tcctcaacgg ccagaactgg 180

ggttccatct acgactacac ctcggtcgtg acgaggatgg acgccgaggg ccaccagatc 240

ggctcgcaca cgtggtcgca cgccgacctg gcgacgctcg acgcggccgg catcacctcg 300

cagatgacgc agctcgagac ggcgctgacc agcatcctcg gcaaggtgcc gacctacatg 360

cggcccccgt acttcagcac caacgccctg gccctctcga ccctcggcgg cctcggctac 420

cacgtcatca acgccaacat cgacaccctc gactacgagc acgacgacga caccatcggc 480

gtcgccttca ccaacttcca gaacggcctc gcctcgggcg gcaccgtcag cctcatgcac 540

gacgtccacg cccagaccgt ccacgtcctg gtccaggagg ccatcaacgc catcaaggcc 600

aagggtctga cccccgtcac tgtcggaaca tgtctgggcg acgcctctgc caactggtac 660

aagtcgggcg gcggctccgg aactacaccg ccgcctgcga ctggcggccc cagcccggat 720

gatacttgtg gtggcagcaa cggctacgtg tgccaaaact cgcagtgctg ctcgcaatgg 780

ggatggtgtg gtaccacgtc cgagtactgt gctgccggtt gccaggcagc ctacggtccc 840

tgcacttaa 849

<210> 4

<211> 525

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgcattgtc tccacattgt atgcttccaa gattctggtg ggaatactgc tgatagccta 60

acgttcatga tcaaaattta actgttctaa cccctacttg acagcaatat ataaacagaa 120

ggaagctgcc ctgtcttaaa cctttttttt tatcatcatt attagcttac tttcataatt 180

gcgactggtt ccaattgaca agcttttgat tttaacgact tttaacgaca acttgagaag 240

atcaaaaaac aactaattat tcgaaggatc caaacgatga gatttccttc aatttttact 300

gcagttttat tcgcagcatc ctccgcatta gctgctccag tcaacactac aacagaagat 360

gaaacggcac aaattccggc tgaagctgtc atcggttact cagatttaga aggggatttc 420

gatgttgctg ttttgccatt ttccaacagc acaaataacg ggttattgtt tataaatact 480

actattgcca gcattgctgc taaagaagaa ggggtatctc tcgag 525

<210> 5

<211> 526

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgcattgtc tccacattgt atgcttccaa gattctggtg ggaatactgc tgatagccta 60

acgttcatga tcaaaattta actgttctaa cccctacttg acagcaatat ataaacagaa 120

ggaagctgcc ctgtcttaaa cctttttttt tatcatcatt attagcttac tttcataatt 180

gcgactggtt ccaattgaca agcttttgat tttaacgact tttaacgaca acttgagaag 240

atcaaaaaac aactaattat tcgaaacgat ggctatccca agattcccat ccatcttcac 300

tgctgttttg ttcgctgctt cctccgcttt ggctgctcca gttaacacta ctactgagga 360

cgagactgct caaatcccag ctgaggctgt tatcggttac tccgacttgg agggtgactt 420

cgacgttgct gttttgccat tctccaactc cactaacaac ggtttgttgt tcatcaacac 480

tactatcgct tccatcgctg ctaaggagga gggtgtttcc ctcgag 526

Claims

1.一种拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶，其特征在于：所述拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶的氨基酸序列选自以下其中一种：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

2.如权利要求1所述的一种拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶，其特征在于：所述拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶的氨基酸序列选自与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列；更优选地，具有95％以上的同源性。

3.一种拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶基因，其特征在于：编码权利要求1所述的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶。

4.如权利要求3所述的一种拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包含权利要求3或4所述的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶基因。

6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述表达载体为pGBG1，表达载体pGBG1通过如下方式获得：

利用Nsi I/Xho I双酶切，将表达载体pPIC9中如SEQ ID NO.4所示的序列替换为如SEQID NO.5所示的信号肽序列，得到表达载体pGBG1。

7.权利要求1所述的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶的制备方法，该方法为：将权利要求3或4所述的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶基因构建至表达载体中，然后导入毕赤酵母细胞，诱导并获得分泌表达的几丁质脱乙酰酶。

8.如权利要求7所述的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶的制备方法，其特征在于：所述毕赤酵母为GS115。

9.如权利要求7所述的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

10.权利要求1所述的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶在几丁质、壳聚糖或壳寡糖脱乙酰中的应用。