CN116656719A - 一种禾谷镰刀菌FgPDA5基因的应用 - Google Patents
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- A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
- A01G7/00—Botany in general
- A01G7/06—Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
- A01P3/00—Fungicides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
本发明公开了一种禾谷镰刀菌FgPDA5基因的应用，属于生物技术和植物病害防控领域。本发明发现了禾谷镰刀菌FgPDA5基因在调控其致病能力方面的功能，通过试验验证将FgPDA5基因从禾谷镰刀菌野生型菌株PH‑1中成功敲除后，所得到的突变体Δfgpda5对小麦的致病性大幅度降低。由该基因编码的禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5与几丁质高度亲和，且能够使几丁质寡聚物脱乙酰化，抑制由几丁质引起的植物免疫。因此，破坏FgPDA5基因的正常表达或禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5的蛋白功能，可以有效地防控小麦赤霉病，本发明为小麦赤霉病的防治提供了新的药物靶点和研究方向。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和植物病害防控领域，特别是涉及一种禾谷镰刀菌FgPDA5基因的应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L.)是全世界主要的粮食作物之一。由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的赤霉病是影响全世界小麦和大麦的重要的疾病，感染后能使小麦苗枯、茎腐和穗枯，导致小麦的产量和品质严重下降，造成巨大的经济损失。同时，禾谷镰刀菌释放的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)毒素，也严重威胁着人类和动物的健康。
在植物和病原体的共同进化中，细胞壁是植物和病原体之间博弈的第一个战场。作为真菌细胞壁的主要成分，几丁质是β-1,4-连接的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的长链聚合物，能够形成坚硬的微纤维，保护真菌细胞壁不被水解。几丁质被植物细胞表面的受体识别后将诱导植物免疫。宿主植物分泌的几丁质酶能降解真菌细胞壁，以抑制病原体的定植。例如，在烟草中表达杜仲的几丁质酶基因EuCHIT2，可以增加宿主对白粉菌的抗性。在转基因小麦中过表达内切几丁质酶Ech42，外稃组织中的菌丝生长受到抑制，霉菌毒素的含量减少，最终对赤霉病的抗性提高。此外，几丁质被降解所产生的几丁质寡聚物可以作为一种诱导剂，被植物受体识别并激活植物免疫。
真菌病原体也会采取相应的策略来抑制植物免疫力。真菌的几丁质酶不仅是一种真菌致病因子，参与病原体的毒力，同时能够将几丁质进一步解离，避免被宿主受体识别。在稻瘟菌中发现的一种几丁质酶MoChi1，通过降解几丁质来逃避植物识别，从而抑制由几丁质诱导的植物免疫。在白粉菌中发现的某些效应物同样具有几丁质酶活性，可以降解几丁质寡聚物，抑制由几丁质引发的植物免疫。
由于小麦赤霉病的危害巨大，对小麦赤霉病的防治具有重要的经济价值，而目前小麦赤霉病菌(禾谷镰刀菌)致病关键基因发现的还不多，因此挖掘更多的禾谷镰刀菌侵染致病关键基因，并探索其与植物免疫之间的联系，可以为小麦赤霉病的防治提供药物靶点和研究方向，具有重要的科学意义及应用价值，最终实现小麦赤霉病的绿色生态防控。
发明内容
本发明的目的是提供一种禾谷镰刀菌FgPDA5基因的应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明发现敲除禾谷镰刀菌中的FgPDA5基因能够显著降低其对小麦的致病性，为小麦赤霉病的防治提供了新的药物靶点和研究方向。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种禾谷镰刀菌FgPDA5基因在以下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)减弱禾谷镰刀菌致病能力；
(2)防治禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病；
(3)制备抗小麦赤霉病的药剂；
(4)培育抗小麦赤霉病的转基因植物；
其中，所述禾谷镰刀菌FgPDA5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5在以下(1)-(3)任一项中的应用：
(1)减弱禾谷镰刀菌致病能力；
(2)防治禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病；
(3)制备抗小麦赤霉病的药剂；
其中，所述禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种减弱禾谷镰刀菌致病能力的方法，包括使所述的禾谷镰刀菌FgPDA5基因表达降低或不表达，或者抑制所述的禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5的活性的步骤。
本发明还提供一种防治禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病的方法，包括以下步骤：
在小麦生长过程中，外源喷施能够抑制所述的禾谷镰刀菌FgPDA5基因表达的物质或者外源喷施能够降低所述的禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5活性的物质。
本发明还提供一种培育抗小麦赤霉病转基因植物的方法，包括将靶向所述的禾谷镰刀菌FgPDA5基因且使所述禾谷镰刀菌FgPDA5基因表达下降或不表达的沉默靶基因片段转化至小麦中，获得抗小麦赤霉病的转基因植物的步骤。
本发明还提供一种抗小麦赤霉病的药剂，所述药剂中含有抑制所述的禾谷镰刀菌FgPDA5基因表达的物质；或者含有抑制所述的禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5的活性的物质。
本发明公开了以下技术效果：
本发明将FgPDA5基因从禾谷镰刀菌野生型菌株PH-1中成功敲除后，所得到的FgPDA5基因敲除突变体Δfgpda5的营养菌丝生长速度及菌落形态相较于野生型差异不显著，在小麦麦穗中的真菌生物量显著减少，对小麦的致病性大幅度降低。同时，本发明提供的禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5与几丁质高度亲和，且能够使几丁质寡聚物脱乙酰化，抑制由几丁质引起的植物免疫。因此，破坏FgPDA5基因的正常表达或抑制禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5的蛋白功能，可以有效地防控小麦赤霉病，本发明为小麦赤霉病的防治提供了新的药物靶点和研究方向。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为禾谷镰刀菌Δfgpda5突变体的菌落生长情况图，其中，(a)为Δfgpda5突变体菌落形态图，(b)为Δfgpda5突变体菌落直径统计图；
图2为禾谷镰刀菌Δfgpda5突变体对小麦穗的致病情况图，其中，(a)为Δfgpda5突变体接种小麦穗部发病表型图，(b)为Δfgpda5突变体接种小麦穗部发病等级统计，(c)为Δfgpda5突变体接种小麦穗部真菌生物量统计；
图3为禾谷镰刀菌Δfgpda5突变体对小麦胚芽鞘的侵染图，其中，(a)为Δfgpda5突变体接种小麦胚芽鞘侵染表型图，(b)为Δfgpda5突变体接种小麦胚芽鞘侵染病斑大小统计图；
图4为禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5对几丁质及其寡聚物的亲和情况图，其中，(a)为脱乙酰酶FgPDA5对几丁质，菌丝等结合检测图，(b)为利用ITC方法检测脱乙酰酶FgPDA5对底物乙酰壳六糖的结合能力的放热图，(c)为利用ITC方法检测脱乙酰酶FgPDA5对底物乙酰壳六糖的结合能力常数；
图5为禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5对几丁质寡聚物的脱乙酰化图，其中，(a)为对照组底物乙酰壳六糖的质谱图，(b)为脱乙酰酶FgPDA5处理底物乙酰壳六糖后的质谱图，(c)为突变体FgPDA5m处理底物乙酰壳六糖后的质谱图；
图6为几丁质寡聚物的脱乙酰化对植物免疫的影响，其中，(a)为脱乙酰酶FgPDA5处理底物乙酰壳六糖后，抑制植物活性氧的积累，(b)为脱乙酰酶FgPDA5处理底物乙酰壳六糖后，抑制植物MAPK级联反应，(c)为脱乙酰酶FgPDA5处理底物乙酰壳六糖后，抑制植物免疫相关基因的表达水平；
图7为禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5对几丁质诱导的植物免疫的影响，其中，(a)为瞬时过表达脱乙酰酶FgPDA5抑制几丁质诱导的胼胝质的表型图，(b)为瞬时过表达脱乙酰酶FgPDA5抑制几丁质诱导的胼胝质数量统计图，(c)为瞬时过表达脱乙酰酶FgPDA5抑制几丁质诱导植物免疫相关基因的表达水平；
图8为载体PET-28a的图谱；
图9为载体pCAMBIA1302的图谱。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明实施例中禾谷镰刀菌野生型菌株PH-1由江苏省农业科学院植物保护研究所提供，大肠杆菌BL21，DH5a菌株由上海唯地生物技术有限公司提供。
实施例1禾谷镰刀菌FgPDA5基因敲除突变体Δfgpda5的构建
登录Ensembl Fungi数据库，查找FgPDA5基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)和其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)，设计基因敲除和检测引物(表1)。
表1FgPDA5基因敲除引物和检测引物
SEQ ID NO.1：
ATGCGCGGCTTGATTATTCTGGCTTCCCTGAGCCATCTGGCGACAACCCTGACAATTCCAACCTACCCCAAGAAGAGAGCCCTGTCAGCTGGCATTGCCATCTACAGCTGCACCACGCCAGGAACTGTCGCACTCACTTTCGATGACGGTCCGTTTATATACACAGAGTCTGTGCTTGATCAACTTGCTTCCGCGGGGTTCAAGGCCACCTTCTTCCTCAATGGATATAACTTGGGCAACATCGAGGACTACCAATCCACGGTAGATAGAATGATCAATGAAGGACACCAGGTTGCTTCCCACACCTACGGTCACCCTGATCTTGCAGCCCTCAACGACTATGATGTCGAGCAACAGATGGTATTGTTGAGTAACCAGTTCACCCACATGATAGGTAAGGACCCTGTCTACATGCGTCCCCCTTACTTTAGCTTCAACGACCGAACACTTCAAGTACTTGGTCAGCTGGGGTATAAAGTAGTTATTGCTGATATCGACACCGACGATTGGCGCTATTCGTCTTTTGGCGGTGCCGAACCCTCTCTAGACTTGTACAACGCTGGCCTAAACCATGGAGGCTCGATTGTTCTCATGCATGACGTCCATCAAAACACCGTGCAGGACATACTACCCCGTATAATACAAGCGACACGTCAAAGCGGACGAAGAGGTAATTATATCGTTGATGGTTAA。
SEQ ID NO.2：
MRGLIILASLSHLATTLTIPTYPKKRALSAGIAIYSCTTPGTVALTFDDGPFIYTESVLDQLASAGFKATFFLNGYNLGNIEDYQSTVDRMINEGHQVASHTYGHPDLAALNDYDVEQQMVLLSNQFTHMIGKDPVYMRPPYFSFNDRTLQVLGQLGYKVVIADIDTDDWRYSSFGGAEPSLDLYNAGLNHGGSIVLMHDVHQNTVQDILPRIIQATRQSGRRGNYIVDG。
以禾谷镰刀菌野生型PH-1基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.3-4所示序列为引物，扩增FgPDA5基因的上游同源臂；以SEQ ID NO.5-6所示序列为引物，扩增FgPDA5基因的下游同源臂，构建至PRfu2载体(参考文献“The N-terminus of a Fusarium graminearum-secreted protein enhances broad-spectrum disease resistance in plants”)上。将重组质粒转化至农杆菌，在LB液体培养基与IM液体培养基中，28℃、180r/min诱导活化，使菌液OD600值为0.5。选择新鲜野生型PH-1孢子稀释液(1×105个/mL)与诱导后的菌液进行等比混合，涂布200μL至IM固体培养基中，25℃倒置培养4d。将IM固体培养基上长出明显菌丝在SNA固体培养基上(含50mM潮霉素、100mM硫酸链霉素和200mM氨噻肟头孢霉素)进行筛选培养。长出单菌落后，挑取单菌落至含50mM潮霉素的SNA固体培养基，进一步筛选含潮霉素抗性的突变体菌株。对突变体菌株进行阳性检测确认后，提取突变体孢子并进行10-3和10-4梯度稀释，吸取100μL稀释液涂布于含潮霉素抗性的SNA培养基上，25℃培养5d后挑取单菌落活化，最终获得由Δfgpda5突变体单孢子生长的菌株。
实施例2禾谷镰刀菌FgPDA5基因敲除突变体Δfgpda5的菌落生长情况
为了检测FgPDA5基因敲除后对菌丝生长的影响，将禾谷镰刀菌Δfgpda5突变体和野生型菌株PH-1分别在PDA培养基上25℃培养4天，对菌落进行表型观察和直径统计。
结果如图1所示，禾谷镰刀菌Δfgpda5突变体的菌落形态比野生型不显著。
实施例3禾谷镰刀菌FgPDA5基因敲除突变体Δfgpda5的致病力鉴定
为了检测禾谷镰刀菌FgPDA5基因敲除后对小麦的致病力，分别在麦穗和胚芽鞘中接种禾谷镰刀菌野生型菌株PH-1(WT)和突变体Δfgpda5进行鉴定。
接种穗部：利用提前稀释好的1×105个/mL禾谷镰刀菌Δfgpda5突变体与野生型PH-1的孢子悬浮液，选取扬花期的麦穗，在穗部从下往上第4或第5个小穗，分别接种10μL突变体和野生型的孢子悬浮液，将接种后的小麦置于高温高湿条件(27℃-29℃，80％-95％湿度)培养，并用保鲜膜包裹穗部保湿。待接种部位出现明显的赤霉病症状后，去除保鲜膜。在接菌后第5天，提取小麦麦穗总RNA和基因组DNA，通过RT-qPCR检测禾谷镰刀菌的真菌生物量和所产生的DON毒素含量。在接菌后第14天，观察麦穗发病表型，统计所侵染小穗数目。
结果如图2所示，Δfgpda5突变体在小麦穗部的致病性明显降低，所侵染小穗数比野生型降低了80％，麦穗中真菌的生物量显著减少，DON毒素含量无显著差异。
接种胚芽鞘：准备3日龄小麦幼苗，去掉胚层顶部1-2mm，将提前准备好的野生型PH-1以及Δfgpda5突变体孢子(1×106个/mL)添加2μL在剩余胚芽鞘顶部。在高温高湿条件(27℃-29℃，80％-95％湿度)下培养7d。观察胚芽鞘发病表型、统计腐生斑长度。
结果如图3所示，Δfgpda5突变体在小麦胚芽鞘中引起的损伤程度更低，损伤面积更小。
实施例4禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5对几丁质及其寡聚物的亲和作用
根据同源序列比对，对FgPDA5酶活中心的保守位点进行突变，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的突变体FgPDA5m，编码该突变体的基因序列如SEQ ID NO.12所示。
SEQ ID NO.11：
MRGLIILASLSHLATTLTIPTYPKKRALSAGIAIYSCTTPGTVALTFDGGPFIYTESVLDQLASAGFKATFFLNGYNLGNIEDYQSTVDRMINEGHQVASGTYGGPDLAALNDYDVEQQMVLLSNQFTHMIGKDPVYMRPPYFSFNDRTLQVLGQLGYKVVIADIDTDDWRYSSFGGAEPSLDLYNAGLNHGGSIVLMHDVHQNTVQDILPRIIQATRQSGRRGNYIVDG。
注：阴影加粗处代表突变的氨基酸序列。
SEQ ID NO.12：
ATGCGCGGCTTGATTATTCTGGCTTCCCTGAGCCATCTGGCGACAACCCTGACAATTCCAACCTACCCCAAGAAGAGAGCCCTGTCAGCTGGCATTGCCATCTACAGCTGCACCACGCCAGGAACTGTCGCACTCACTTTCGATGCCGGTCCGTTTATATACACAGAGTCTGTGCTTGATCAACTTGCTTCCGCGGGGTTCAAGGCCACCTTCTTCCTCAATGGATATAACTTGGGCAACATCGAGGACTACCAATCCACGGTAGATAGAATGATCAATGAAGGACACCAGGTTGCTTCCGCCACCTACGGTGCCCCTGATCTTGCAGCCCTCAACGACTATGATGTCGAGCAACAGATGGTATTGTTGAGTAACCAGTTCACCCACATGATAGGTAAGGACCCTGTCTACATGCGTCCCCCTTACTTTAGCTTCAACGACCGAACACTTCAAGTACTTGGTCAGCTGGGGTATAAAGTAGTTATTGCTGATATCGACACCGACGATTGGCGCTATTCGTCTTTTGGCGGTGCCGAACCCTCTCTAGACTTGTACAACGCTGGCCTAAACCATGGAGGCTCGATTGTTCTCATGCATGACGTCCATCAAAACACCGTGCAGGACATACTACCCCGTATAATACAAGCGACACGTCAAAGCGGACGAAGAGGTAATTATATCGTTGATGGTTAA。
注：阴影加粗处代表突变的核苷酸序列。
为了检测禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5与几丁质的亲和情况，将FgPDA5和FgPDA5m基因序列插入pET-28a载体(见图8，由四川农业大学小麦研究所提供)并转化到大肠杆菌BL21菌株中，采用Ni-chelating亲和层析法纯化带有His标签的FgPDA5和FgPDA5m蛋白。将0.1μg FgPDA5蛋白、FgPDA5m蛋白和GFP蛋白分别与几丁质、纤维素、壳聚糖和禾谷镰刀菌菌丝在5mL缓冲液(pH 7.5的50mM Tris/HCl、150mM NaCl)中4℃孵育4小时。孵育完成后，将混合物在12000×g的转速下离心5分钟，分别得到上清和沉淀，用缓冲液清洗沉淀，最后用His标签抗体进行Westernblot检测。
结果如图4中(a)所示，禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5对几丁质、纤维素、壳聚糖和菌丝均高亲和力，阴性对照GFP则不能结合。
实施例5等温滴定
为了进一步测定禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5与几丁质寡聚物结合力，选择含有六个GlcNAc分子的几丁质寡聚物Chi6，分别将1000mM FgPDA5和FgPDA5m蛋白滴定注入到800μM Chi6中，结合反应在缓冲液(200mM HEPES和150mM NaCl)中进行。25℃下用等温滴定量热仪MicroCalorimeter ITC200测定结合热量的变化情况。
结果如图4中(b)和(c)所示，几丁质寡聚物Chi6与GFP蛋白每次滴定释放的热量无明显变化，表明没有特异性结合；当几丁质寡聚物Chi6与FgPDA5和FgPDA5m蛋白结合时，热量变化显著，表明禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5对几丁质寡聚物有很高的亲和力。
实施例6禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5的脱乙酰化作用
分别构建重组载体FgPDA5:GFP和FgPDA5m:GFP，构建方法如下：
利用F正向引物(SEQ ID NO.13):CCCGCTTGAGCAGACATCACCCGGGATGCTGACAATTCCAACCTAC和R反向引物(SEQ ID NO.14):CACCATTAAGTCCTCAGCCCCGGGACCATCAACGATATAATTACCTCTT，扩增FgPDA5序列，使用同源重组酶(诺唯赞C115)将扩增出来的FgPDA5片段与线性化载体载体pCAMBIA1302(见图9，由四川农业大学小麦研究所提供)连接，连接片段转入大肠杆菌感受态DH5α，将感受态涂布在含50ug/ml kana LB培养基37℃过夜培养16h。通过PCR检测获得阳性单菌落，检测引物：F正向引物(SEQ ID NO.15):TTTCATTTGGAGAGAACACGG；R反向引物(SEQ ID NO.16):GCTGAACTTGTGGCCGTTT。选取阳性单菌落1-2个提取重组载体质粒。
为了系统地评估禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5的酶活性，将重组载体FgPDA5:GFP和FgPDA5m:GFP转化农杆菌，并培养到OD600值为0.5，用1毫升注射器将其瞬时表达到烟草叶片中。提取总蛋白，用GFP磁珠获得表达的FgPDA5和FgPDA5m蛋白，并分别与1mM Chi6在50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)中于37℃孵育30分钟，然后用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)测定产物。
结果如图5所示，酶活中心突变后的FgPDA5m能够将几丁质寡聚物Chi6进行部分脱乙酰化得到中间产物A5D1和A4D2；禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5也能对Chi6进行脱乙酰化，得到更多的中间产物A4D2、A1D5和A2D4；且与FgPDA5m相比，FgPDA5的脱乙酰化酶活性更高。
实施例7禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5对几丁质寡聚物脱乙酰化后植物免疫的影响
为了分析禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5将几丁质寡聚物Chi6脱乙酰化后，能否诱导植物免疫，用FgPDA5蛋白对Chi6进行过夜处理后，得到Chi6的脱乙酰化产物D-Chi6。将D-Chi6、Chi6和Chitin分别注射烟草，检测活性氧含量、磷酸化水平和防御相关基因的表达水平。
为了检测烟草叶片中活性氧的产生情况，用打孔器取各处理组叶片等量，收集到96孔板中，加入200μL ddH2O，避光孵育过夜，以消除物理损伤所产生的活性氧。加入含25μg/mL辣根过氧化物酶37.5μg/mL鲁米诺的工作液后，再加入1μM几丁质寡聚物或几丁质的反应液200μL处理叶子碎片。使用多扫描光谱(Varioskan LUX)在562nm处检测发光，每分钟检测1次信号。
结果如图6中(a)所示，Chi6与Chitin能够诱导烟草叶片中活性氧爆发，而D-Chi6则无法导致活性氧的积累。
为了检测MAPK的磷酸化水平，注射烟草后不同时间，分别取2g各处理组的烟草叶片，使用植物磷酸化蛋白提取试剂盒(HR0011，Baiaolaibo)提取总蛋白。用α-PERK1/2抗体(AF1891，Beyotime)进行Western blot检测烟草叶片中磷酸化情况。
结果如图6中(b)所示，Chi6与Chitin能够引起烟草叶片中MAPK磷酸化，而D-Chi6则不能诱导MAPK磷酸化。
同时对烟草防御相关基因进行RT-qPCR检测，结果如图6中(c)所示，Chi6与Chitin能够使烟草防御基因显著高表达，而D-Chi6处理后防御基因的表达无明显变化。
实施例8禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5抑制Chi6诱导的植物免疫
为了探究禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5能否抑制Chi6诱导的植物免疫，将分别含有FgPDA5:GFP、FgPDA5m:GFP和对照组GFP的农杆菌培养至OD600为0.6，分别注射烟草叶片进行瞬时表达，注射后48小时用10μM Chi6处理叶片。处理后12小时进行胼胝质染色观察和统计。通过RT-qPCR定量检测植物防御基因的表达情况。
结果如图7所示，与对照相比，表达FgPDA5m胼胝质无明显变化，表达FgPDA5的烟草叶片中胼胝质显著减少，表明FgPDA5m不能抑制Chi6诱导的胼胝质积累，FgPDA5可以抑制Chi6诱导的胼胝质积累。通过对烟草植物免疫的标志基因进行RT-qPCR检测发现，与对照相比，表达FgPDA5m基因的烟草叶片中防御基因表达水平无明显变化，表达FgPDA5基因的烟草叶片中防御基因表达水平显著降低，表明禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5抑制了Chi6诱导的植物免疫。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.一种禾谷镰刀菌FgPDA5基因在以下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)减弱禾谷镰刀菌致病能力；
(2)防治禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病；
(3)制备抗小麦赤霉病的药剂；
(4)培育抗小麦赤霉病的转基因植物；
其中，所述禾谷镰刀菌FgPDA5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5在以下(1)-(3)任一项中的应用：
(1)减弱禾谷镰刀菌致病能力；
(2)防治禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病；
(3)制备抗小麦赤霉病的药剂；
其中，所述禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种减弱禾谷镰刀菌致病能力的方法，其特征在于，包括使权利要求1中所述的禾谷镰刀菌FgPDA5基因表达降低或不表达，或者抑制权利要求2中所述的禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5的活性的步骤。
4.一种防治禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病的方法，其特征在于，包括以下步骤：
在小麦生长过程中，外源喷施能够抑制权利要求1中所述的禾谷镰刀菌FgPDA5基因表达的物质或者外源喷施能够降低权利要求2中所述的禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5活性的物质。
5.一种培育抗小麦赤霉病转基因植物的方法，其特征在于，包括将靶向权利要求1中所述的禾谷镰刀菌FgPDA5基因且使所述禾谷镰刀菌FgPDA5基因表达下降或不表达的沉默靶基因片段转化至小麦中，获得抗小麦赤霉病的转基因植物的步骤。
6.一种抗小麦赤霉病的药剂，其特征在于，所述药剂中含有抑制权利要求1中所述的禾谷镰刀菌FgPDA5基因表达的物质；或者含有抑制权利要求2中所述的禾谷镰刀菌脱乙酰酶FgPDA5的活性的物质。
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