CN116064595A - 一个调控禾谷镰刀菌致病性的基因FgTEM1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一个调控禾谷镰刀菌致病性的基因FgTEM1及其应用,属于植物病害防控领域。本发明在禾谷镰刀菌中发现一个新的调控致病性的基因FgTEM1,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明利用潮霉素磷酸转移酶基因同源重组替换禾谷镰刀菌FgTEM1基因,所得到的FgTEM1敲除突变体与野生型菌株PH‑1相比,营养菌丝生长轻微下降,而对小麦麦穗的致病性却大幅度降低,表明FgTEM1基因在调控禾谷镰刀菌的致病过程中起重要作用。本发明为进一步利用FgTEM1防治小麦赤霉病提供重要的资源和方向。
Description
技术领域
本发明属于植物病害防控领域,具体涉及一个调控禾谷镰刀菌致病性的基因
FgTEM1及其应用。
背景技术
小麦是我国重要的粮食作物,在栽培和生产的过程中会受到多种病原菌的侵袭,造成产量的下降及品质的降低,其中危害比较大的是赤霉病,在我国小麦种植区普遍发生。小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌侵染引起的。禾谷镰刀菌是一类主要侵染小麦、大麦、玉米等禾谷类经济作物的植物病原真菌,引起小麦赤霉病及玉米茎腐病,降低粮食作物的产量及品质(Chen Y, Kistler HC, Ma Z (2019)
Fusarium graminearum TrichotheceneMycotoxins: Biosynthesis, Regulation, and Management. Annu Rev Phytopathol57: 15-39.)。禾谷镰刀菌通过无性生殖产生分生孢子,是禾谷镰刀菌的主要初级侵染源。分生孢子通过风、雨水等进行传播,落到小麦叶片及麦穗上,可以侵染小麦的各个发育阶段,以侵染扬花期小麦麦穗危害最大,严重时造成小麦绝收(Francl L, Shaner G,Bergstrom G, Gilbert J, Pedersen W, et al. (1999) Daily inoculum levels of
Gibberella zeae on wheat spikes. Plant Disease 83: 662-666.)。
小麦赤霉病的危害巨大,对小麦赤霉病的防治具有重要的经济价值,而目前小麦赤霉病菌(禾谷镰刀菌)致病关键基因发现的还不多,因此挖掘和鉴定禾谷镰刀菌侵染致病关键基因可以为小麦赤霉病的防治提供药物靶点和研究方向,具有重要的科学意义及应用价值,最终实现小麦赤霉病的绿色生态防控。
在前期研究当中,我们对禾谷镰刀菌中小GTP酶家族基因进行敲除时,发现了一个对营养菌丝生长速度影响不大,却显著降低分生孢子的产量及小麦麦穗致病性的
FgTEM1突变体,我们将其命名为Δ
Fgtem1。因此,本发明公开了一个调控禾谷镰刀菌分生孢子产量和致病性的基因
FgTEM1及其敲除突变体。
发明内容
本发明的目的在于公开一个调控禾谷镰刀菌致病性的基因
FgTEM1及其应用,
FgTEM1基因只轻微影响禾谷镰刀菌正常的营养菌丝生长,不影响子囊壳及子囊孢子的产生,却大幅度降低分生孢子的产量及对小麦麦穗的致病性,从而说明
FgTEM1是禾谷镰刀菌致病过程中的一个重要基因。
FgTEM1基因对禾谷镰刀菌的传播和绿色生态防治具有重要的意义,也是研究禾谷镰刀菌致病机理的重要基因资源。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案是:
一个调控禾谷镰刀菌致病性的基因
FgTEM1,所述的
FgTEM1基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列,其编码的蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
一种禾谷镰刀菌
FgTEM1基因敲除突变体Δ
Fgtem1,所述突变体Δ
Fgtem1为通过潮霉素磷酸转移酶
HPH同源重组的方法从禾谷镰刀菌PH-1的基因组中敲除
FgTEM1基因获得;所述突变体Δ
Fgtem1具有如下特征:
(1)相比禾谷镰刀菌PH-1菌株,所述的Δ
Fgtem1突变体营养菌丝生长轻微下降;
(2)相比禾谷镰刀菌PH-1菌株,所述的Δ
Fgtem1突变体分生孢子产量显著下降;
(3)相比禾谷镰刀菌PH-1菌株,所述的Δ
Fgtem1突变体子囊壳及子囊孢子产生不受影响;
(4)相比禾谷镰刀菌PH-1菌株,所述的Δ
Fgtem1突变体对小麦麦穗的致病性显著下降。
上述一个调控禾谷镰刀菌致病性的基因
FgTEM1在防治小麦赤霉病过程中的应用。
上述一个调控禾谷镰刀菌致病性的基因
FgTEM1在研究禾谷镰刀菌致病机理中的应用。
本发明的有益之处在于:本发明将
FgTEM1基因从禾谷镰刀菌野生型菌株PH-1中成功敲除后,所得到的
FgTEM1基因敲除突变体Δ
Fgtem1的营养菌丝生长速度轻微下降,有性生殖子囊壳及子囊孢子形成不受影响,分生孢子产量显著下降,对小麦麦穗的致病性大幅度降低。上述结果表明,
FgTEM1基因主要调控禾谷镰刀菌分生孢子产生及对小麦麦穗的致病性,对禾谷镰刀菌的传播及小麦赤霉病防治具有重要的作用。
附图说明
图 1. 禾谷镰刀菌中
FgTEM1基因敲除的同源重组原理及其酶切位点图谱示意图(1A),Southern杂交图谱(1B)。用
HindⅢ 酶切基因组DNA,突变体Δ
Fgtem1得到2.48 kb大小的条带,野生型PH-1菌株得到2.12 kb大小的条带。
图 2. 野生型PH-1、
FgTEM1基因敲除突变体(Δ
Fgtem1)及回补菌株Δ
Fgtem1-C在完全培养基(CM)和基本培养基(MM)中的菌落形态(2A)及菌落直径(2B)。**表示Δ
Fgtem1突变体的直径与野生型相比,存在极显著性差异,p<0.01。
图 3.
FgTEM1基因敲除突变体的分生孢子产量。**表示Δ
Fgtem1突变体的产孢量与野生型相比,存在极显著性差异,p<0.01。
图 4.
FgTEM1基因敲除不影响有性生殖过程子囊壳及子囊孢子的形成。
图 5.
FgTEM1基因敲除降低禾谷镰刀菌对小麦麦穗的致病性(5A)及致病指数(5B)。**表示Δ
Fgtem1突变体的致病指数与野生型相比,存在极显著性差异,p<0.01。
图 6. FgTem1蛋白在禾谷镰刀菌中的亚细胞定位。
具体实施方式
实施例中所使用的部分培养基的配方及配置方法:
完全培养基(CM)/L:10 g蔗糖,6 g酵母提取物,6 g酸性水解酪蛋白,20 g琼脂粉,ddH2O定容至1 L。
基本培养基(MM)/L:10 g葡萄糖,6 g NaNO3,0,52 g KCl,1.52 g KH2PO4, 0.312g MgSO4·7H2O,0.01 g VB1,20 g琼脂粉,1 mL微量元素母液,ddH2O定容至1 L,pH 6.5。(微量元素母液配方/L:400 mg CuSO4·5H2O,8 g ZnSO4·7H2O,800 mg MnSO4·2H2O,1180 mgFeSO4·7H2O,800 mg Na2MoO4,40 mg Na2B4O7·10H2O)。
分生孢子诱导培养基(CMC)/L:1 g酵母提取物,1 g NH4NO3,1 g KH2PO4,0.5 gMgSO4·7H2O,15 g羧甲基纤维素钠,ddH2O定容至1 L。
上述培养基均121℃,高压灭菌20 min。
本专利中,禾谷镰刀菌
FgTEM1基因用斜体
FgTEM1表示,蛋白用正体FgTem1表示,
FgTEM1基因敲除突变体用Δ
Fgtem1表示,回补菌株用Δ
Fgtem1-C表示,野生型禾谷镰刀菌菌株为PH-1。本发明首先对小GTP酶家族基因进行基因敲除,鉴定到一个调控禾谷镰刀菌致病性的突变体Δ
Fgtem1,对应的基因为
FgTEM1,其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1,编码的蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。
为进一步阐述一个调控禾谷镰刀菌致病性的基因
FgTEM1及其应用,举例如下:
实施例1:禾谷镰刀菌中
FgTEM1基因的敲除及回补菌株的获得
首先,用下述引物FgTEM1-AF/FgTEM1-AR、FgTEM1-BF/FgTEM1-BR分别从禾谷镰刀菌PH-1菌株基因组DNA中扩增目的片段A和B,用引物HYG-F/HY-R、YG-F/HYG-R分别从pCB1003质粒中扩增潮霉素磷酸转移酶基因片段H1和H2,H1和H2有315个碱基重叠。然后,利用重叠延伸基因扩增技术(SOE-PCR)的方法将获得的敲除片段A片段与H1片段连接起来,H2片段与B片段连接起来,分别获得AH和HB片段。接着采用酶解法制备禾谷镰刀菌PH-1的原生质体,利用聚乙二醇PEG3350介导的原生质体转化的方法,将片段AH和HB(各2 μg左右)同时加入制备好的原生质体中混匀,复苏,倒板。培养3-5天,挑取单菌落,粗提DNA,用下述引物FgTEM1-OF/FgTEM1-OR、FgTEM1-UA/H853验证候选转化子,挑取得到的阳性转化子,进一步用Southern杂交验证单拷贝突变体,原理如图1A所示,实验结果表明挑选的四个转化子Δ
Fgtem1-1/3/33/34均为正确的单拷贝插入突变体(图1B),选取Δ
Fgtem1-1/3突变体用于后续研究。
回补菌株的获得:用下述引物FgTEM1-CF/FgTEM1-CR从禾谷镰刀菌PH-1菌株基因组DNA中扩增回补片段,然后连接至pKNTG2载体,大肠杆菌转化,挑取阳性转化子测序,序列正确的载体转入Δ
Fgtem1突变体的原生质体中,获得回补的菌株Δ
Fgtem1-C。
所用到的引物序列为:
FgTEM1-AF:5’-CATTTCACGCATAAGCAG-3’
FgTEM1-AR:5’-TTGACCTCCACTAGCTCCAGCCAAGCCGGTTGAGTCGTCCAGTTT-3’
FgTEM1-BF:5’-GAATAGAGTAGATGCCGACCGCGGGTTGACACGGCCATTTACGAG-3’
FgTEM1-BR:5’-TGCTCCGCTGTCTACCTT-3’
FgTEM1-OF:5’-AGGCATACAACGACTACCG-3’
FgTEM1-OR:5’-GAACTGGCATACCTGATTT-3’
FgTEM1-UA:5’-GACAACACGCAAACGAAC-3’
H853:5’-GACAGACGTCGCGGTGAGTT-3’
HYG-F:5’-GGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAA-3’
HY-R:5’-GTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAA-3’
YG-F:5’-GATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCT-3’
HYG-R:5’-AACCCGCGGTCGGCATCTACTCTATTC-3’
FgTEM1-CF:5’-AGGGAACAAAAGCTGGGTACCGAAGCTATTAAGACGCACGA-3’
FgTEM1-CR:5’-GCCCTTGCTCACCATAAGCTTACAGACTGATATAACAGGA-3’
实施例2:禾谷镰刀菌中Δ
Fgtem1敲除突变体的菌落生长分析
分别将野生型PH-1、
FgTEM1敲除突变体(Δ
Fgtem1)及回补菌株(Δ
Fgtem1-C)转接至完全培养基(CM)和基本培养基(MM)中,28℃倒置培养3天,观察菌落形态并测量菌落直径。如图2A所示,与PH-1及Δ
Fgtem1-C菌株相比,Δ
Fgtem1突变体的菌落形态无明显差别,在MM培养基中,Δ
Fgtem1突变体的菌落直径无显著变化,而在CM培养基中有轻微下降,表明
FgTEM1敲除只轻微影响禾谷镰刀菌的菌落生长。
实施例3:禾谷镰刀菌中Δ
Fgtem1敲除突变体分生孢子产量分析
将野生型PH-1、
FgTEM1敲除突变体(Δ
Fgtem1)及回补菌株(Δ
Fgtem1-C)分别转接至CMC产孢培养基中,28℃,180 rpm摇床培养3天。吸取600 μL孢子液,用灭菌的ddH2O将其稀释3倍,单层擦镜纸过滤,滤液充分混匀,血球计数板统计分生孢子产量。如图3所示,与野生型PH-1和Δ
Fgtem1-C菌株的分生孢子产量相比,Δ
Fgtem1突变体的产孢量显著下降,减少了三分之一左右,说明
FgTEM1基因对禾谷镰刀菌的分生孢子产量起重要调控作用。
实施例4:禾谷镰刀菌中Δ
Fgtem1的有性生殖过程分析
为了研究
FgTEM1基因敲除是否影响禾谷镰刀菌的有性生殖过程,首先将PH-1、Δ
Fgtem1突变体及回补菌株Δ
Fgtem1-C分别转接至胡萝卜培养基中,28℃倒置培养5天至菌丝长满整个培养皿。然后取出置于超净工作台中,加入2.5%的吐温60,压实菌丝,随后置于22℃,黑光灯中培养7天,观察子囊壳形成情况。如图4A所示,Δ
Fgtem1突变体产生与野生型和回补菌株一样大小的子囊壳,说明FgTem1不影响禾谷镰刀菌子囊壳的形成。进一步挑取培养基表面的子囊壳,置于载玻片中央水滴处,压片处理,显微镜观察子囊及子囊孢子形态。我们发现Δ
Fgtem1突变体与PH-1及回补菌株Δ
Fgtem1-C的子囊及子囊孢子形态无明显差异(图4B)。综上所述,我们的结果表明FgTem1不影响禾谷镰刀菌有性生殖过程。
实施例5:禾谷镰刀菌中Δ
Fgtem1敲除突变体的致病性分析
为了探究FgTem1是否参与禾谷镰刀菌的致病性,将野生型、Δ
Fgtem1突变体及回补菌株Δ
Fgtem1-C分别接种至扬花期小麦麦穗的中部,用黑色记号笔标记接种点(图5A中黑色点),套袋保湿,14天后拍照并统计不同菌株的发病情况。结果如图5A和图5B所示,敲除
FgTEM1基因后禾谷镰刀菌对小麦麦穗的致病性显著下降,与野生型PH-1相比下降了80%左右。以上结果表明FgTem1对禾谷镰刀菌的致病性起着至关重要的作用。
实施例6:禾谷镰刀菌中FgTem1蛋白的亚细胞定位
为了观察FgTem1蛋白定位于禾谷镰刀菌的哪个部位,我们将含有绿色荧光蛋白(GFP)的回补菌株Δ
Fgtem1-C接种CMC和CM培养基,发现在营养菌丝、分生孢子梗及分生孢子等不同发育阶段中,FgTem1-GFP均主要以点状形式定位于细胞质中(图6)。为了明确其具体亚细胞定位,进一步共转纺锤体标记蛋白FgAlp6-mCherry,结果显示FgTem1-GFP与FgAlp6-mCherry共定位于营养菌丝、分生孢子梗及分生孢子中,说明FgTem1-GFP主要定位于纺锤体中,可能参与细胞分裂相关过程,进而调控禾谷镰刀菌的侵染致病过程。
Claims (6)
1.一个调控禾谷镰刀菌致病性的基因FgTEM1,其特征在于,所述FgTEM1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一个调控禾谷镰刀菌致病性的基因FgTEM1,其特征在于,所述FgTEM1基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种禾谷镰刀菌FgTEM1基因敲除突变体ΔFgtem1,其特征在于,所述突变体ΔFgtem1为通过潮霉素磷酸转移酶HPH同源重组的方法从禾谷镰刀菌PH-1的基因组中敲除FgTEM1基因获得。
4.根据权利要求3所述的禾谷镰刀菌FgTEM1基因敲除突变体ΔFgtem1,其特征在于,所述突变体ΔFgtem1对小麦麦穗致病性较野生型PH-1菌株显著下降。
5.权利要求1所述的调控禾谷镰刀菌致病性的基因FgTEM1在防治小麦赤霉病过程中的应用。
6.权利要求1所述的调控禾谷镰刀菌致病性的基因FgTEM1在研究禾谷镰刀菌致病机理中的应用。
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CN202211183426.6A CN116064595A (zh) | 2022-09-27 | 2022-09-27 | 一个调控禾谷镰刀菌致病性的基因FgTEM1及其应用 |
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CN116656719A (zh) * | 2023-06-06 | 2023-08-29 | 四川农业大学 | 一种禾谷镰刀菌FgPDA5基因的应用 |
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- 2022-09-27 CN CN202211183426.6A patent/CN116064595A/zh active Pending
Cited By (2)
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CN116656719B (zh) * | 2023-06-06 | 2024-03-15 | 四川农业大学 | 一种禾谷镰刀菌FgPDA5基因的应用 |
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