CN111454846B

CN111454846B - 一种高产苯甲醛类化合物的冠突曲霉菌菌株及其应用

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Publication number: CN111454846B
Application number: CN202010278432.4A
Authority: CN
Inventors: 郭晓晓; 周有祥; 陈福生; 刘姣; 邵彦春; 彭立军
Original assignee: Huazhong Agricultural University; Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Huazhong Agricultural University; Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-04-10
Filing date: 2020-04-10
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2040-04-10
Also published as: CN111454846A

Abstract

本发明公开一种高产苯甲醛类化合物的冠突曲霉菌突变株，该菌株命名为冠突曲霉菌ΔA2490，已于2019年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:M 2019835。所述菌株是以冠突曲霉E1为出发菌株，通过基因敲除技术筛选得到的，以高产灰绿曲霉黄色素(Flavoglaucin,FG)类化合物为特征，适用于FG类化合物的开发。本发明利用该菌株制备FG类化合物的固态发酵法，其固态发酵物中的含量高达129.7mg/g。

Description

一种高产苯甲醛类化合物的冠突曲霉菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学与生物技术领域，涉及一种高产苯甲醛类化合物的冠突曲霉菌(Aspergillus cristatus)工程菌及其生产苯甲醛类化合物的方法。

背景技术

冠突曲霉菌(Aspergillus cristatus)又称为冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)，是我国传统黑茶——茯砖茶关键制作“发花”工艺中发酵微生物的优势菌群。由于该菌可产生大量金黄色闭囊壳，形似“金花”，故也俗称“金花菌”，其数量是判断茯茶品质的重要评价指标之一。在GB 32719.5-2018《黑茶第五部分：茯茶》中明确规定每克茯砖茶中冠突散囊菌的数量不得少于2×10⁵CFU。

冠突曲霉菌与其它丝状真菌类似，可产生丰富的次生代谢产物(Secondarymetabolites，SMs)。冠突曲霉菌中SMs的研究起始于19世纪末，研究发现该菌主要可分泌四类化合物，蒽醌类(Anthraquinone derivatives)、吲哚类(Indole derivatives)、苯甲醛类(Benzaldehyde derivatives)以及其它类化合物，其中苯甲醛类化合物(Benzaldehydederivatives,Bds)包括：灰绿曲霉黄色素(Flavoglaucin,FG)、四氢金色灰绿曲霉素(Tetrahydroauroglaucin,TAG)、二氢金色灰绿曲霉素(Dihydroauroglaucin,DAG)、金色灰绿曲霉素(Auroglaucin,AG)、异二氢金色灰绿曲霉素(Isodihydroauroglaucin,IDAG)等。目前，人们发现这类化合物具有着色、抗氧化、抗炎、人体阿片受体的良好结合剂等功能，在预防和治疗蛋白质酪氨酸磷酸酶介导的肥胖、糖尿病以及肿瘤等疾病方面也显现出良好的应用前景，潜在经济价值大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一株高产苯甲醛类化合物的冠突曲霉菌(Aspergillus cristatus)工程菌及其生产苯甲醛类化合物的方法，为FG类化合物的开发和应用提供理论基础。

本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：

一株高产苯甲醛类化合物的冠突曲霉菌菌株，命名为冠突曲霉菌(Aspergilluscristatus)ΔA2490，已于2019年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:M 2019835。

本发明上述的冠突曲霉菌ΔA2490的形态学特征为：菌株ΔA2490在PDA培养基中28℃培养3d即可见清晰的金黄色菌落，菌落扁平开展，无褶皱，气生菌丝极少。

本发明上述的冠突曲霉菌ΔA2490是以茯砖茶中直接分离的冠突曲霉菌E1为出发菌株，利用根癌农杆菌介导的转化，通过基因敲除技术，敲除了蒽醌类化合物合成基因簇中的聚酮合酶编码基因，筛选得到的一株高产FG类化合物的突变株ΔA2490。具体方法如下：通过Double-joint PCR方法得到的A2490基因序列同源臂和筛选标记hph(潮霉素B抗性基因)的重组片段，其中A2490基因序列的同源臂位于筛选标记hph两侧，即为A2490敲除盒重组片段；然后通过根瘤农杆菌介导，将A2490敲除盒重组片段转入到冠突曲霉菌E1的分生孢子中，A2490敲除盒两段同源臂与基因组上目的基因A2490相对应的同源序列发生双交换重组，使抗性基因hph置换原有的基因编码区，在筛选敲除子过程中，筛选到一株形态特征变化明显的突变株，即本发明所述菌株冠突曲霉菌ΔA2490。

本发明上述的冠突曲霉菌ΔA2490分泌的苯甲醛类化合物为灰绿曲霉黄色素(Flavoglaucin,FG)类化合物。进一步地，所述FG类化合物包括：灰绿曲霉黄色素(Flavoglaucin,FG)、曲霉素(Tetrahydroauroglaucin,TAG)、二氢金色灰绿曲霉素(Dihydroauroglaucin,DAG)、金色灰绿曲霉素(Auroglaucin,AG)、Isotetrahydroauroglaucin(ITAG)、异二氢金色灰绿曲霉素(Isodihydroauroglaucin,IDAG)等中的一种或几种。

本发明上述的冠突曲霉菌ΔA2490生产苯甲醛类化合物的方法，采用固态发酵，将冠突曲霉菌菌株的孢子溶液(10⁵cfu/mL)200μL的接种量接入土豆琼脂(PDA)平板中，28℃倒置培养7-11d。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明利用分子生物学技术获得并公开了工程菌株冠突曲霉菌ΔA2490，以高产FG类化合物为特征，适用于FG类化合物的开发和应用。该菌株的产物FG类化合物在固态发酵菌丝体中的产量最高可达129.7mg/g。

附图说明

图1冠突曲霉菌突变株ΔA2490的PCR鉴定结果。泳道1是以E1基因组为模板的PCR产物；泳道2是以ΔA2490基因组为模板的PCR产物；M:Trans 2K plus II marker。

图2冠突曲霉菌E1及突变株ΔA2490的单菌落形态。

图3冠突曲霉菌E1及突变株ΔA2490的超高效液相色谱图。注：1，二氢金(色)灰绿曲霉素；2，金色灰绿曲霉素；3，曲霉素；4，异二氢金(色)灰绿曲霉素；5，Isotetrahydroauroglaucin；6，灰绿曲霉黄色素。

图4本发明所述高产苯甲醛类化合物突变株ΔA2490的产物灰绿曲霉黄色素(Flavoglaucin,FG)类化合物的化学结构式。

图5本发明所述冠突曲霉菌(Aspergillus cristatus)ΔA2490与出发菌株冠突曲霉菌E1在PDA固态发酵培养条件下菌丝体中FG类化合物的含量差异。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。

实施例

1、微生物来源：实施例中的出发菌株冠突曲霉菌(Aspergillus cristatus)E1由从茯砖茶中直接分离得到。

2、转化培养基包括以下组份：

1)10×常量元素溶液(1L)：NH₄NO₃,5g；(这里逗号建议用分号，这样各个化合物之间层次区分更开，下同)NaCl,3g；CaCl₂·2H₂O,0.1g；MgSO₄·7H₂O,6g；KH₂PO₄,1.36g。4℃保存。

2)200×微量元素溶液(100mL)：CuSO₄·5H₂O,10mg；ZnSO₄·7H₂O,10mg；H₃BO₃,10mg；Na₂MoO₄·2H₂O,10mg。4℃保存。

3)1000×铁盐溶液(100mL)：Na₂-EDTA·2H₂O,0.130g；FeSO₄·7H₂O,0.100g。4℃保存。

4)1mol/L 2-N-吗啉基乙磺酸(MES)溶液：MES 9.8g，用去离子水溶解，以2mol/LNaOH调pH至5.5，定容至50mL，过滤除菌，分装至无菌离心管，-20℃保存。

5)0.1mol/L乙酰丁香酮(AS)溶液：AS 0.196g，用10mL二甲基亚砜溶解，分装至无菌离心管，-20℃保存。

6)20％葡萄糖溶液：2g葡萄糖溶于去离子水中，定容至10mL，过滤除菌，分装至无菌离心管，-20℃保存。

3、诱导培养基(Induction medium，IM)(100mL)：10×IM大量元素溶液，10mL；200×微量元素溶液，0.5mL；1000×铁盐溶液，0.1mL；50％甘油，1mL；121℃灭菌20min。使用前补加如下试剂：1mol/L MES，1mL；20％葡萄糖，1ml；0.1mol/L AS，0.2mL。

4、共培养培养基Cocultivation medium(Co-IM)(100mL)：10×IM常量元素溶液，10mL；200×微量元素溶液，0.5mL；1000×铁盐溶液，0.1mL；50％甘油，1mL；琼脂粉，2g；121℃灭菌20min。使用前补加如下试剂：1mol/L MES，1mL；20％葡萄糖，0.5mL；0.1mol/L AS，0.4mL。

5、抗性筛选培养基：

100g/L头孢霉素(Cefalothin Sodium，CS)：2.5g CS溶于25mL去离子水中，过滤除菌，分装至无菌离心管，现配现用。

MYA培养基(1L)：麦芽浸粉20g，酵母浸粉5g，蔗糖30g，琼脂20g，121℃灭菌20min。使用前加入潮霉素B溶液和头孢霉素溶液，使其终浓度分别为60mg/L和0.5g/L。

6、发酵培养基：

1)土豆固态(PDA)培养基(1L)：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，121℃灭菌20min。

2)M40Y培养基(1L)：麦芽浸粉20g，酵母浸粉5g，蔗糖400g，琼脂20g，121℃灭菌20min。

7、冠突曲霉菌基因组DNA的提取：

1)取1～2g培养3～4d的冠突曲霉菌菌丝，放入-80℃预冷研钵中加液氮迅速研磨成粉末，在粉末融化前按0.2g/mL的比例加入65℃预热的5％CTAB提取缓冲液，继续研磨至完全融化，转入已灭菌的离心管，65℃水浴30min，其间每10min取出摇匀一次。其中，5％CTAB提取缓冲液(100mL)：CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)5g，PVP(polyvinylpyrrolidone)40.2g，NaCl，8.2g，0.5mol/L EDTA(pH8.0)，4mL，1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，10mL。

2)取出步骤1)所得样品后，冷却至室温，加入等体积的苯酚/氯仿(1:1)，充分混匀，12000r/min离心10min。

3)转移步骤2)所得上清液于新的1.5mL离心管中，加入等体积氯仿，充分混匀，12000r/min离心10min。

4)转移步骤3)所得上清液于新的1.5mL离心管中，加入1/10体积3mol/L的NaAc和0.6倍体积的异丙醇，充分混匀后，-20℃沉淀30min以上，12000r/min离心10min。

5)弃步骤4)所得上清液，沉淀用500μL 75％乙醇洗涤，12000r/min离心5min，再次弃上清液。重复洗涤一次。

6)步骤5)所得沉淀晾干后加入50μL Tris-EDTA(TE)溶液溶解，加5μL RNase(10mg/mL)37℃处理2h，得到冠突曲霉菌基因组DNA，以备后续试验使用。凝胶电泳检测其质量，4℃短期保存，或-20℃长期保存。

8、高产FG类化合物菌株ΔA2490的筛选及验证：以潮霉素B为筛选标记，包括敲除盒的构建、敲除载体的构建、根癌农杆菌介导的冠突曲霉菌转化三个步骤。

[1]敲除盒的构建：

采用Double-joint PCR技术，将A2490的ORF区域的5’-同源臂(5’-UTR)和3’-同源臂(3’-UTR)分别连接在hph基因的两端。

从冠突曲霉菌E1基因组中克隆A2490基因的5’-同源臂和3’-同源臂，从质粒pSKH中克隆hph，采用Double-joint PCR融合3个片段，获得A2490敲除盒，融合体系是：2.5μL 10×Easy Taq BufferⅠ，1μL 10mmol/L dNTPs，0.2μL 5U/μL Easy Taq DNA Polymerase，5’-同源臂、hph、3’-同源臂纯化产物共600ng，按1:2:1(摩尔比)的比例加入融合体系，补水至25μL。Double-joint PCR程序是：94℃4min；(94℃30s，58℃2min，72℃4min)×15cycles；72℃7min。以融合PCR产物(敲除盒)为模板，敲除盒两端的引物5F/3R进行敲除盒的富集。PCR程序是：94℃4min；(94℃30s，55℃30s，72℃4min)×30cycles；72℃7min。0.8％(g/v)琼脂糖凝胶分离PCR产物，切胶回收敲除盒。引物序列表1所示：

表1构建ΔA2490敲除盒所用引物

f：正向引物；r：反向引物；下划线标注的是部分hph序列。

[2]敲除载体的构建：

将构建的敲除盒连接到质粒pCAMBIA3300多克隆位点之间，构建目的基因的敲除载体。具体步骤如下：采用KpnI和HindIII分别双酶切敲除盒和双元载体pCAMBIA3300，0.8％(g/v)琼脂糖凝胶电泳分离后使用凝胶回收试剂盒纯化酶切产物，纯化的酶切产物在T4 DNA连接酶作用下16℃过夜连接。取5μL连接产物加入大肠杆菌感受态细胞中，在含有50mg/L Kan的LB固态培养基上37℃过夜培养大肠杆菌。随机挑取克隆子，采用5f/3r进行PCR验证。提取质粒进行酶切验证，采用KpnI和HindIII双酶切质粒，酶切结果正确的质粒即为A2490敲除载体pCAMBIA3300-A2490。

[3]根癌农杆菌介导的冠突曲霉菌转化：

采用冻融法将敲除载体转入农杆菌感受态细胞中，再借助于农杆菌介导的T-DNA转化技术实现出发菌株E1中目的基因的敲除。

根癌农杆菌感受态细胞的制备及转化

试剂及配制：1)0.1mol/L CaCl₂：取1.1g CaCl₂，加入少量去离子水溶解后定容至100mL；121℃灭菌30min，冷却至室温后，-4℃保存备用。2)甘油CaCl₂：取1.1g CaCl₂，加入少量去离子水溶解，加入15mL甘油，定容至100mL；121℃灭菌30min，冷却至室温后，-4℃保存备用。

根癌农杆菌感受态细胞的制备方法：1)在LB液体培养基中按1:100的体积比接种农杆菌，28℃培养过夜至OD_600nm＝0.5～0.6。2)将菌液冰上预冷10min，3mL菌液分次装入1.5mL无菌的离心管中，4℃5000r/min离心5min，弃上清。3)加入1mL预冷0.1mol/L CaCl₂，轻轻吹洗悬浮菌体，冰上静置20min，4℃5000r/min离心5min，弃上清。4)加入100μL预冷的甘油CaCl₂重悬沉淀，-70℃保存。

转化方法：1)取一支感受态细胞，冰上融化，加入5μL质粒(构建的载体)，轻弹混匀，冰上放置30min。2)将混合物置于液氮中5min，然后迅速放入水浴锅中37℃水浴5min，随后迅速放在冰上2min。3)加入800μL LB液体培养基，28℃120r/min复苏3-5h。5000r/min离心5min，移去600μL上清后混匀，涂相应的抗性平板，28℃培养24h-36h可长出菌落。

根癌农杆菌介导的冠突曲霉菌转化：

1)冠突曲霉菌孢子液的制备：将冠突曲霉菌接种到M40Y或17％NaCl MYA平板37℃培养7d。用无菌水洗下孢子，用两层无菌的擦镜纸过滤，得到孢子悬液，血球板计数，离心去上清，孢子备用。

2)根癌农杆菌的活化及诱导培养：挑取含重组质粒的农杆菌在含50mg/L的卡那霉素的LB培养基上划线培养两天，将长出的单菌落挑到5mL含50mg/L卡那霉素的液体LB培养基中，28℃，220r/min摇床过夜振荡培养(OD_600nm约为0.8-1.2)，收集菌体，并用IM培养基稀释农杆菌至OD_600nm为0.5，再在相同条件下培养6h，得农杆菌液，备用。

3)冠突曲霉菌孢子与根癌农杆菌的共培养：用2)中制得的农杆菌液将冠突曲霉菌孢子稀释至10⁵个/mL，然后吸取200μL涂布于铺有玻璃纸Co-IM平板上，28℃共培养3d。

4)冠突曲霉菌转化子的筛选及验证：共培养3d后，将玻璃纸揭起放入空的无菌培养皿中，然后倒入约20mL含有60mg/L潮霉素B和0.5g/L头孢霉素的MYA培养基，28℃培养，从第2d开始观察，将长出的菌落挑至含60mg/L潮霉素B的MYA培养基上，28℃培养。如果在培养基上仍然能生长，即推定为转化子，转接到铺有玻璃纸的PDA平板上，提取基因组DNA，经PCR验证得到阳性转化子。用牙签将阳性转化子点接到装有PDA培养基的1.5mL离心管中，28℃培养7d，转置室温保存。

由图1可知，经PCR验证，得到正确的阳性转化子，冠突曲霉菌ΔA2490。

9、本实施例发明公开的工程菌冠突曲霉菌ΔA2490已于2019年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:M 2019835，菌株保藏名为冠突曲霉菌ΔA2490。

冠突曲霉菌E1及突变株冠突曲霉菌ΔA2490的单菌落形态观察及次级代谢产物分析：

1)孢子液的制备：将冠突曲霉菌接种到PDA平板28℃培养7d。用无菌水洗下孢子，用两层无菌的擦镜纸过滤，置于28℃摇床以120rpm/min振荡30min，将孢子打散，得到孢子悬液，血球板计数，稀释至10⁵个/mL，孢子液备用。

2)单菌落形态观察：分别取1.5uL孢子液于PDA及M40Y平板上，28℃倒置培养，分别于11d及9d时观察菌落形态。

图2为原始菌株冠突曲霉菌E1和突变株冠突曲霉菌ΔA2490在PDA(28℃倒置培养11d)及M40Y(28℃倒置培养9d)平板上的单菌落形态。由图2可知，与原始菌株E1相比，ΔA2490在PDA及M40Y平板上菌落发生明显变化，菌落颜色呈黄色，色素未渗入到培养基。

3)次级代谢产物分析：取200μL孢子液涂布于铺有玻璃纸的PDA平板上，28℃倒置培养，分别于3d、5d、7d、9d、11d时取样，菌丝体采用真空冷冻干燥至恒重，培养基于37℃烘箱中烘干至恒重。将冻干的菌丝体和烘干的培养基称取20mg左右，加入1mL 80％甲醇，超声提取10min，12000r/min离心2min，取上清液，过膜，通过反相超高效液相色谱UPLC的外标定量法，在计算时假设FG类化合物与FG的最大摩尔吸光系数相同。

其中，UPLC分析条件如下：ACQUITY UPLC^@BEH C18 1.7μm 2.1*100mm；流动相为0.1％甲酸水(流动相A)/乙腈(流动相B)，流速为0.3mL/min，柱温为40℃，采取梯度洗脱，程序为起始流动相比例为40％A/60％B，4min时开始调整为50％A/50％B(在6min内完成)，14min内调整为20％A/80％B，然后3min内调整为起始流动相后再运行2min，FG的保留时间为14.776min，检测波长为390nm。

由图3可知，原始菌株冠突曲霉菌E1与突变株ΔA2490都可产生的苯甲醛类化合物即灰绿曲霉黄色素(Flavoglaucin,FG)类化合物，包括：1，二氢金色灰绿曲霉素(Dihydroauroglaucin,DAG)、2，金色灰绿曲霉素(Auroglaucin,AG)、3，曲霉素(Tetrahydroauroglaucin,TAG)、4，异二氢金色灰绿曲霉素(Isodihydroauroglaucin,IDAG)、5，Isotetrahydroauroglaucin(ITAG)、6，灰绿曲霉黄色素(Flavoglaucin,FG)。这类化合物的化学结构式如图4所示。

所述冠突曲霉菌Aspergillus cristatusΔA2490与出发菌株冠突曲霉菌E1在PDA固态发酵培养条件下，灰绿曲霉黄色素FG类化合物的含量差异。图5分析了冠突曲霉菌E1和ΔA2490菌丝体中FG类化合物的含量，结果说明在出发菌株冠突曲霉菌E1中FG类化合物的含量在整个发酵周期变化较小，而在所述菌株Aspergillus cristatusΔA2490中随着培养时间的增加大量积累，其最高含量是出发菌株最高含量的1.63倍，通过固态发酵，UPLC测定该类化合物的含量最高可达129.7mg/g。

本发明利用生物工程技术获得并公开了冠突曲霉菌工程菌株(ΔA2490，CCTCCNO:M2019835)，与初始菌株冠突曲霉菌E1相比，该突变株可以大量分泌苯甲醛类化合物-灰绿曲霉黄色素类化合物，其固态发酵产量最高可达129.7mg/g。FG类化合物为苯甲醛类化合物，是冠突曲霉菌重要的代谢产物之一，该菌株高产FG类化合物的特征,适用于此类化合物的开发，具有良好的商业和科研价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。

Claims

1. 一种冠突曲霉菌菌株，其特征在于：所述菌株命名为冠突曲霉菌ΔA2490，已于2019年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO: M 2019835。

2.根据权利要求1所述的一种冠突曲霉菌菌株，其特征在于：所述冠突曲霉菌ΔA2490分泌灰绿曲霉黄色素类化合物；所述的灰绿曲霉黄色素类化合物主要包括：灰绿曲霉黄色素、曲霉素、二氢金色灰绿曲霉素、金色灰绿曲霉素、ITAG、异二氢金色灰绿曲霉素。

3.权利要求1所述冠突曲霉菌菌株在生产灰绿曲霉黄色素类化合物方面的应用，其特征在于：所述灰绿曲霉黄色素类化合物主要包括：灰绿曲霉黄色素、曲霉素、二氢金色灰绿曲霉素、金色灰绿曲霉素、ITAG、异二氢金色灰绿曲霉素。

4.权利要求1所述冠突曲霉菌菌株生产灰绿曲霉黄色素类化合物的方法，其特征在于：采用固态发酵，将权利要求1所述的冠突曲霉菌菌株的孢子溶液接入培养基中进行培养即可；所述灰绿曲霉黄色素类化合物主要包括：灰绿曲霉黄色素、曲霉素、二氢金色灰绿曲霉素、金色灰绿曲霉素、ITAG、异二氢金色灰绿曲霉素。