CN114574368B

CN114574368B - 一种金花菌及其在茯茶加工中的应用

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Publication number: CN114574368B
Application number: CN202111472693.0A
Authority: CN
Inventors: 朱洺志; 王坤波; 冉莉莎; 李娟�; 李勤; 傅冬和; 刘仲华
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2021-12-06
Filing date: 2021-12-06
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2041-12-06
Also published as: CN114574368A

Abstract

本发明公开了一种金花菌及其在茯茶加工中的应用，该金花菌为冠突曲霉菌(Aspergillus cristatum)GTQM2021‑02，于2021年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20211326；其在茯茶发酵过程中能在茶叶表面形成金花颗粒，改善茯茶的品质。本发明从茯砖茶中分离获得的金花菌GTQM2021‑02为冠突曲霉，其形态特征与以往报道的冠突曲霉存在较大差异，在特定工艺下，利用金花菌GTQM2021‑02能在茶叶表面形成金花颗粒，明显改善茯茶的品质特征，同时，金花菌GTQM2021‑02可能与普通冠突曲霉有不同功能，因此具有极大的开发利用价值。

Description

一种金花菌及其在茯茶加工中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，更具体地，涉及一种金花菌及其在茯茶加工中的应用。

背景技术

茯茶是一种特殊的黑茶，“发花”是茯茶特有的加工工艺。具体而言，“发花”是通过控制一定的温湿条件，促使“金花”菌在茯茶中生长繁殖，并在后期成为唯一的优势微生物，最终在茯茶内部产生大量俗称“金花”的金黄色颗粒。

金花菌的数量多少是判断茯茶品质优劣的重要指标，金花菌具有分泌多种酶功能，能有效促进茯茶中多种物质的转化，产生多种代谢产物，能明显改善茯茶因原料粗老所带来的滋味苦涩和色泽黄褐欠润等问题，并使茯砖茶具有降脂减肥、抗氧化多种保健功效。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

鉴于此，本发明提供了一种金花菌及其在茯茶加工中的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种金花菌，所述金花菌为冠突曲霉菌 (Aspergillus cristatum)GTQM2021-02，于2021年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20211326。

具体地，该金花菌GTQM2021-02为申请人从湖南安化茯砖茶中分离获得。

金花菌GTQM2021-02的菌落特征及形态特征如下：

金花菌GTQM2021-02在察氏培养基上生长较为缓慢，28℃下培养7天直径为7-12mm，菌落中间菌丝较为致密，且金黄色颗粒状闭囊壳，菌落边缘辐射菌丝，菌落表面干燥，菌落背面呈浅黄色； 28℃下培养14天菌落直径20-30mm，菌落呈橘红色偏褐色且为颗粒状，背面黄褐色，闭囊壳大量。

金花菌GTQM2021-02在20％察氏培养基上生长较快，28℃下培养7天直径为20-25mm，菌落呈金黄色，菌落中间菌丝致密有金黄色颗粒状闭囊壳，菌落边缘辐射菌丝，菌落表面干燥，菌落背面呈浅黄色；28℃下培养14天长满培养皿，菌落呈橘红色偏褐色且为颗粒状，背面黄褐色，闭囊壳大量。

金花菌GTQM2021-02在40％麦芽酵母琼脂培养基上，菌落生长迅速，28℃下培养7天长满培养皿，菌落中间金黄色边缘淡黄色至白色，菌落表面干燥粗糙，菌丝向上生长松散呈絮状。

在37℃条件下，金花菌GTQM2021-02可在20％察氏培养基和 40％麦芽酵母琼脂培养基上成长。具体地，在20％察氏培养基生长缓慢，7天直径为2-5mm，菌落表面呈灰白色至橄榄绿，菌丝致密；在40％麦芽酵母琼脂培养基，7天直径为生长满平板，菌落颜色金黄色至土黄色，14天时菌落呈现橘黄色。

金花菌GTQM2021-02的子囊孢子与普通金花菌的子囊孢子相比，两者的子囊孢子并无明显差别，子囊孢子都呈双凸镜状，表面粗糙具有疣状突起，具有明显的赤道沟。

综上菌落特征和形态特征等，将金花菌GTQM2021-02归入曲霉属，具体为冠突曲霉，该菌于2021年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M20211326。

本发明还提供了含有上述金花菌的菌剂。

本发明另一方面还提供了上述金花菌或上述菌剂在茯茶加工中的应用。

具体地，在上述茯茶加工的应用中，所述金花菌在茯茶发酵过程中在茶叶表面形成金花颗粒，改善茯茶的品质。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

(1)本发明从湖南安化茯砖茶中分离获得的金花菌GTQM 2021-02为冠突曲霉；

(2)本发明所提供的金花菌GTQM 2021-02的形态特征与以往报道的冠突曲霉存在较大差异，在特定工艺下，利用金花菌GTQM 2021-02能在茶叶表面形成金花颗粒，明显改善茯茶的品质特征；

(3)本发明所提供的金花菌GTQM2021-02可能与普通冠突曲霉有不同功能，因此具有极大的开发利用价值。

附图说明

图1为本发明实施例中金花菌GTQM2021-02在28℃下培养 7d后的菌落形态图(a为金花菌在察氏培养基生长后的菌落形态，b为金花菌在20％察氏培养基生长后的菌落形态)；

图2为本发明实施例中金花菌GTQM2021-02在37℃下培养 7d后的菌落形态图(a为金花菌在20％察氏培养基生长7d后的菌落形态，b为金花菌在40％麦芽酵母琼脂培养基生长7d后的菌落形态)；

图3为本发明实施例中金花菌GTQM2021-02的子囊孢子形态特征图；

图4为现有技术中普通金花菌(冠突曲霉Aspergillus cristatum ACF-202101)的子囊孢子形态特征图；

图5为本发明实施例中金花菌GTQM2021-02与冠突曲霉模式菌株NRRL4222的钙调蛋白基因的序列比对分析结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中，如无特别说明，所用手段均为本领域常规的手段。

本文中所用的术语“包含”、“包括”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

若无特殊说明，本发明实施例中所用的原料均为市售产品。

为了有助于进一步理解本发明，现结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1金花菌GTQM2021-02的分离与鉴定

本发明实施例的金花菌GTQM2021-02是从湖南安化茯砖茶中分离获得，具体过程如下：

在超净工作台上，将茯砖茶的茶砖小心掰开，用无菌接种环挑取茶叶上黄色闭囊壳接入PDA培养基中，将培养基放置恒温培养箱 28℃培养5-7天，待菌株生长旺盛，菌落呈金黄色，菌落表面出现金黄色闭囊壳时，将菌株转接至新的PDA，进一步纯化后，接种于20％PDA培养基上，28℃下培养7天直径20-25mm，菌落中间菌丝致密菌落边缘辐射菌丝，菌落呈金黄色，背面呈浅黄色；肉眼可见大量颗粒状闭囊壳，即为茶叶上“金花”菌。

1、菌落特征与形态特征

图1为本发明实施例中金花菌GTQM2021-02在28℃下培养7d后的菌落形态图。

如图1a所示为金花菌GTQM2021-02在察氏培养基中在28℃ 下生长7d后的菌落形态；金花菌GTQM2021-02在察氏培养基上生长较为缓慢，28℃下培养7天菌落直径为7-12mm，菌落中间菌丝较为致密，且金黄色颗粒状闭囊壳，菌落边缘辐射菌丝，菌落表面干燥，菌落背面呈浅黄色；28℃下培养14天菌落直径20-30mm，菌落呈橘红色偏褐色且为颗粒状，背面黄褐色，闭囊壳大量。

如图1b所示为金花菌GTQM2021-02在20％察氏培养基中在 28℃下生长7d后的菌落形态；金花菌GTQM2021-02在20％察氏培养基上菌落生长较快，28℃下培养7天直径20-25mm，菌落呈金黄色，菌落中间菌丝致密有金黄色颗粒状闭囊壳，菌落边缘辐射菌丝，菌落表面干燥，菌落背面呈浅黄色；28℃下培养14天长满培养皿，菌落呈橘红色偏褐色且为颗粒状，背面黄褐色，闭囊壳大量。

图2为本发明实施例中金花菌GTQM2021-02在37℃下培养 7d后的菌落形态图。

如图2a和2b所示分别为金花菌GTQM2021-02在20％察氏培养基和40％麦芽酵母琼脂培养基中在37℃下生长7d后的菌落形态；金花菌GTQM2021-02在37℃条件下，可在20％察氏培养基和 40％麦芽酵母琼脂培养基上成长，在20％察氏培养基生长缓慢，培养7天的直径为2-5mm，菌落表面呈灰白色至橄榄绿，菌丝致密；在40％麦芽酵母琼脂培养基，培养7天直径为生长满平板，菌落颜色金黄色，14天时菌落呈现橘黄色。

图3和图4分别为本发明实施例中金花菌GTQM2021-02和现有技术中普通金花菌(冠突曲霉Aspergillus cristatum ACF-202101) 的子囊孢子形态特征图；金花菌GTQM2021-02的子囊孢子与普通金花菌(冠突曲霉Aspergillus cristatum ACF-202101)的子囊孢子相比，两者的子囊孢子并无明显差别，子囊孢子都呈双凸镜状，表面粗糙具有疣状突起，具有明显的赤道沟。

2、分子分类地位的确定

钙调蛋白基因(caMgen)：采用常规方法提取金花菌 GTQM2021-02的钙调蛋白基因，并进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在GenBank数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/) 将测得序列经过Blastn方法比对，检索该序列同源性最高的物种，检索结果显示，该金花菌与冠突曲霉具有99％以上同源性。

普通金花菌(冠突曲霉Aspergillus cristatum ACF-202101)的钙调蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，冠突曲霉模式菌株 NRRL 4222的钙调蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

金花菌GTQM2021-02与冠突曲霉模式菌株NRRL4222的钙调蛋白基因的序列比对分析结果如图5所示。

本发明实施例中的金花菌GTQM2021-02与普通金花菌(冠突曲霉Aspergilluscristatum ACF-202101)的主要区别在：

1、金花菌GTQM2021-02在察氏培养基、20％察氏培养基、麦芽酵母琼脂培养基、40％麦芽酵母琼脂培养基等培养基上的菌落形态与普通金花菌存在明显差异；

2、金花菌GTQM2021-02在37℃下察氏培养基不生长；

3、金花菌GTQM2021-02接种至灭菌黑毛茶表面进行发酵，发酵茶叶颜色呈金黄色；体式显微镜下闭囊壳形态橘黄色，普通闭囊壳呈金黄色；闭囊壳直径小于普通闭囊壳。

因此，本发明的金花菌GTQM2021-02是一种特殊的金花菌。

综合以上的菌落特征、形态特征和分子分类学特征，本发明实施例的菌株确定为一株特殊的金花菌，将其归入曲霉属，被鉴定为冠突曲霉菌(Aspergillus cristatum)，该菌于2021年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20211326。

实施例2金花菌GTQM2021-02在茯茶发酵中的应用

取渥堆后的黑毛茶，置于玻璃培养皿中，加入少量的水，密封后于121℃高温湿热灭菌25min左右，取出置于超净工作台中冷却，冷却后，接种金花菌GTQM2021-02孢子悬浮液，接种浓度为1×10⁴- 1×10⁵个/ml的孢子悬液，按照黑毛茶质量的5wt％比例均匀喷洒于茶叶表面，置于28℃黑暗培养。

7-10天后，在茶叶表面观察到黄色闭囊壳，即是茶叶上生长的 “金花”菌，在70℃烘箱中干燥4h，即制得散状茯茶。

实施例3金花菌GTQM2021-02在茯茶发酵中的应用

取渥堆后的黑毛茶，置于玻璃培养皿中，加入少量的水，密封后于121℃高温湿热灭菌25min左右，取出置于超净工作台中冷却，冷却后，接种金花菌GTQM2021-02孢子悬浮液，接种浓度为1×10⁴- 1×10⁵个/ml的孢子悬液，按照黑毛茶质量的4wt％比例均匀喷洒于茶叶表面，置于28℃黑暗培养。

实施例4金花菌GTQM2021-02在茯茶发酵中的应用

取渥堆后的黑毛茶，置于玻璃培养皿中，加入少量的水，密封后于121℃高温湿热灭菌25min左右，取出置于超净工作台中冷却，冷却后，接种金花菌GTQM2021-02孢子悬浮液，接种浓度为1×10⁴- 1×10⁵个/ml的孢子悬液，按照黑毛茶质量的6wt％比例均匀喷洒于茶叶表面，置于28℃黑暗培养。

对比例1

本发明对比例提供了一种散状茯茶的加工方法，其具体步骤与实施例2类似，区别仅在于，

所接种的并不是金花菌GTQM2021-02孢子悬浮液，而是普通金花菌(冠突曲霉Aspergillus cristatum ACF-202101)，接种量和其它工艺参数等均与实施例2相同。

参照国标GB/T 32719.5和GB/T 23776提供的方法对本发明实施例2-4和对比例1所制备的茯茶进行感官评价，结果如下表1所示。

表1茯茶感官评价结果

通过GC-MS方法对本发明实施例2-4所制备的茯茶和对比例1 制备的茯茶进行香气成分鉴定，结果如下表2所示。

表2香气成分鉴定结果(μg/L)

通过液相色谱仪串联四级杆飞行时间质谱仪(LC-QTOF-MS) 对本发明实施例2-4所制备的茯茶和对比例1制备的茯茶进行非挥发成分鉴定，结果如下表3所示。

表3茯茶非挥发性成分分析结果

注：将对比例1茯茶中化合物的峰面积设置为1。

分析表2中的结果可以看出，在本发明所提供的金花菌 GTQM2021-02的参与下，本发明实施例2-4所制备的茯茶中香气及风味物质含量显著增加，如呈现花果香的芳樟醇、β-环柠檬醛、苯甲醛、苯乙酮、α-紫罗酮和β-紫罗酮，呈现木香与陈香的(+)-雪松醇、 1，2，3-三甲氧基苯和1，2，4-三甲氧基苯；同时，在发酵过程中呈现青气的正已醛、(E)-2-已烯醛、(Z)-3-已烯-1-醇和香叶醇的含量明显减少，呈现油脂味、辛辣味等不愉快香气的(E，E)-2，4-庚二烯醛和6-甲基-3，5-庚二烯-2-酮含量明显减少；这些香气化合物共同作用使得本发明实施例的茯茶中青气与不愉快气味消失，菌花香浓郁、持久，茯茶风味品质明显提升。

研究表明，酯型儿茶素苦涩味较强，而简单儿茶素苦涩味较弱，给茶汤带来的收敛性较小。如表3所示，相比于对比例1制备的茯茶，本发明实施例2-4制备的茯茶中表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(ECG)等酯型儿茶素含量明显降低，简单儿茶素及衍生物含量明显升高，如表没食子儿茶素 (EGC)、表儿茶素(EC)、儿茶素(C)和没食子儿茶素(GC) 等。由于本发明新发现的金花菌的参与，茯茶发酵后会形成酚酸、黄酮等丰富的次生代谢产物。与对比例1制备的茯茶相比，本发明实施例2-4制备的茯茶中对香豆酰奎宁酸、没食子酸、鞣花酸等酚酸化合物的含量升高，金丝桃苷、槲皮素-3-O-鼠李糖半乳糖苷、山奈酚-7-O-半乳糖苷等黄酮类化合物含量显著升高，这些次生代谢产物与茶叶中的氨基酸、咖啡碱等相互作用，使得本发明实施制备的茯茶滋味更加醇厚甘甜。

应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 一种金花菌及其在茯茶加工中的应用

<130> QH211144

<141> 2021-12-06

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagagcaagt ctccgagtac aaggaggcgt tctccctctt cgtaagtgcg ctggccatct 60

ccatgtggca ttttccccgt cgggcgttga ggacagtaaa ctgaccacga ttttcgcatt 120

tctacaggac aaggatggcg atggttagtg atcccgctct actctgcatc caatgcctct 180

tttaccccac cattcgattg gttccgaccg tgatatcata ttcgttgttg aaataatacc 240

tttccggtta acgacataat actgatggat ctccgcgatt acaggccaga tcaccaccaa 300

ggagctgggt accgttatgc gctcgctggg ccagaacccg tccgagtcgg agttgcagga 360

catgatcaac gaggttgacg ctgacaacaa cggcaccatc gatttccctg gtatgcgatc 420

gtcccgacat aaaaggaccc gtaacaagat aggcgattct gatcatacta gaattcctta 480

ccatgatggc acggaagatg aaagacaccg actccgagga ggagatccgg gaagctttca 540

aggtcttcga tcgcgacaac aacggtttca tttccgctgc ggagttgcgc cacgttatga 600

cctccattgg cgagaagctc accgatgacg aagttgacga gatgattcgc gaggctgacc 660

aggacggtga cggccgtatt gactgtatgt ggacctgggc ctttttctcg gtcgtatgtg 720

aagaagctaa tcgttaccag acaacgaatt cgttca 756

<210> 2

<211> 760

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaagagcaag tctccgagta caaggaggcg ttctccctct tcgtaagtgc gctggccatc 60

tccatgtggc attttccccg tcgggcgttg aggacagtaa actgaccacg attttcgcat 120

ttctacagga caaggatggc gatggttagt gatcccgctc tactctgcat ccaatgcctc 180

ttttacccca ccattcgatt ggttccgacc gtgatatcat attcgttgtt gaaataatac 240

ctttccggtt aacgacataa tactgatgga tctccgcgat tacaggccag atcaccacca 300

aggagctggg taccgttatg cgctcgctgg gccagaaccc gtccgagtcg gagttgcagg 360

acatgatcaa cgaggttgac gctgacaaca acggcaccat cgatttccct ggtatgcgat 420

cgtcccgaca taaaaggacc cgtaacaaga taggcgattc tgatcatact agaattcctt 480

accatgatgg cacggaagat gaaagacacc gactccgagg aggagatccg ggaagctttc 540

aaggtcttcg atcgcgacaa caacggtttc atttccgctg cggagttgcg ccacgttatg 600

acctccattg gcgagaagct caccgatgac gaagttgacg agatgattcg cgaggctgac 660

caggacggtg acggccgtat tgactgtatg tggacctggc cttttttctc ggtcgtatgt 720

gaagaagcta atcgttacca gacaacgaat tcgttcagct 760

<210> 3

<211> 745

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caagtctccg agtacaagga ggcgttctcc ctcttcgtaa gtgcgctggc catctccatg 60

tggcattttc cccgtcgggc gttgaggaca gtaaactgac cacgattttc gcatttctac 120

aggacaagga tggcgatggt tagtgatccc gctctactct gcatccaatg cctcttttac 180

cccaccattc gattggttcc gaccgtgata tcatattcgc tgttgaaata atacctttcc 240

ggttaacgac ataatactga tggatctccg cgattacagg ccagatcacc accaaggagc 300

tgggtaccgt tatgcgctcg ctgggccaga acccgtccga gtcggagttg caggacatga 360

tcaacgaggt tgacgctgac aacaacggca ccatcgattt ccctggtatg cgatcgtccc 420

gacataaaag gacccgtaac aagataggcg attctgatca tactagaatt ccttaccatg 480

atggcacgga agatgaaaga caccgactcc gaggaggaga tccgggaagc tttcaaggtc 540

ttcgatcgcg acaacaacgg tttcatttcc gctgcggagt tgcgccacgt tatgacctcc 600

attggcgaga agctcactga tgacgaagtt gacgagatga ttcgcgaggc tgaccaggac 660

ggtgacggcc gtattgactg tatgtggacc tggccttttt ctcggtcgta tgtgaagaag 720

ctaatcgtta ccagacaacg aattc 745

Claims

1.一种金花菌，其特征在于，

所述金花菌为冠突曲霉菌(Aspergillus cristatum)GTQM2021-02，于2021年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20211326。

2.一种含有权利要求1所述的金花菌的菌剂。

3.权利要求1所述的金花菌或权利要求2所述的菌剂在茯茶加工中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，

所述金花菌在茯茶发酵过程中在茶叶表面形成金花颗粒，改善茯茶的品质。