CN117025420A - 一株不产毒素的黄曲霉菌、菌剂、制剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株不产毒素的黄曲霉菌、菌剂、制剂及应用。本发明提供了一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉(Aspergillusflavus)EXY1A109，其保藏号为：CCTCC No:M 20221465，该菌株能够有效抑制产毒黄曲霉菌株产生黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2。实施例结果表明：当黄曲霉菌EXY1A109孢子液和CGMCC 3.4408的孢子液等体积混合，黄曲霉菌EXY1A109孢子液和CGMCC 3.4408的孢子液浓度均为1×106，EXY1A109对CGMCC 3.4408的抑制产毒率达到99.71％。该菌株应用效果好。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株不产毒素的黄曲霉菌、菌剂、制剂及应用。
背景技术
目前，通常采用化学法、物理法等来抑制黄曲霉毒素产生，其基本原理就是把毒素转变成无毒化合物或复合物，或者把其降解为无毒小分子碎片，从而达到降解毒素的目的。但是，物理法会导致营养物质丧失，而化学法大部分是可逆的。
国内外对相关生物降解法进行了研究探讨了生物防治。由于土壤中微生物众多，生物防治中应用的生防菌在自然界中普遍存在，包括细菌、酵母菌、藻类等。
目前现有技术中也报道了不产毒素的黄曲霉菌菌株，如中国专利CN103509723B中的菌株当不产毒菌GZ-17和产毒菌GD-1孢子浓度比为105:105时共培养，该GZ-17对GD-1的抑制产毒率为64.76％，当不产毒菌GZ-17和产毒菌GD-1孢子浓度比为106:105时共培养(不产毒菌GZ-17的孢子浓度为产毒菌GD-1孢子浓度的10倍)，该GZ-17对GD-1的抑制产毒率为96.39％以上。但是，该黄曲霉菌GZ-17对产黄曲霉毒素的黄曲霉菌菌株的抑制产毒率仍较低。
发明内容
本发明的目的提供一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉(Aspergillus flavus)EXY1A109，EXY1A109对黄曲霉产毒菌的抑制产毒率高。
为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一株不产毒素的黄曲霉(Aspergillus flavus)EXY1A109，其保藏号为：CCTCC No:M 20221465。
本发明提供了一种含有上述技术方案所述的黄曲霉菌EXY1A109的菌剂。
优选的，所述菌剂包括黄曲霉菌EXY1A109菌悬液、黄曲霉菌EXY1A109发酵液或黄曲霉菌EXY1A109。
本发明提供了一种上述技术方案所述的黄曲霉菌EXY1A109或上述技术方案所述的菌剂在制备抑制黄曲霉菌株产毒素的制剂中的应用。
优选的，所述制剂中黄曲霉菌EXY1A109的孢子浓度为≥1×105CFU/mL。
本发明提供了一种用于抑制黄曲霉菌株产毒素的制剂，有效成分包括上述技术方案所述的黄曲霉菌EXY1A109和/或上述技术方案所述的菌剂。
优选的，所述制剂的孢子浓度为≥1×105CFU/mL。
优选的，所述毒素包括黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2中的一种或多种。
本发明提供了一种抑制黄曲霉毒素产生的方法，将上述技术方案所述的黄曲霉菌EXY1A109与产生黄曲霉毒素的样品混合后进行共生培养。
优选的，所述产生黄曲霉毒素的样品包括产毒素的黄曲霉菌株制备而成的生物样品或者含有能够产毒素黄曲霉菌株的土壤样品。
本发明的有益效果：本发明提供了一株不产毒素的黄曲霉(Aspergillus flavus)EXY1A109，其保藏号为：CCTCC No:M 20221465，该菌株能够有效抑制产毒黄曲霉菌株产生黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2。实施例结果表明：当黄曲霉菌EXY1A109孢子液和黄曲霉标准产毒菌株CGMCC 3.4408的孢子液等体积混合，黄曲霉菌EXY1A109孢子液和CGMCC 3.4408的孢子液浓度均为1×105CFU/mL，EXY1A109对CGMCC3.4408的抑制产毒率为92.94％；当黄曲霉菌EXY1A109孢子液和CGMCC 3.4408的孢子液等体积混合，黄曲霉菌EXY1A109孢子液和CGMCC 3.4408的孢子液浓度均为1×106CFU/mL，EXY1A109对CGMCC 3.4408的抑制产毒率达到近99.71％。该菌株对于抑制产毒黄曲霉侵染农产品、降低农产品中黄曲霉毒素污染具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为产毒株和非产毒株的拮抗实验DG18图和对照图，其中S代表SZ；
图2为黄曲霉菌EXY1A109在DG18培养基上的菌落形态和分生孢子形态，其中，左图是培养基上的正面图，右图是培养基上的反面图；
图3为黄曲霉菌EXY1A109在AFPA培养基上菌落背面的颜色；
图4为黄曲霉菌EXY1A109在显微镜下的孢子形态(200×)；
图5为四种黄曲霉毒素混标的液相标准图谱；
图6为产毒株和非产毒株菌共生菌丝球状态
图7为菌株抑制效果HPLC图。
具体实施方式
本发明提供了一种不产毒素的黄曲霉(Aspergillus flavus)EXY1A109，其保藏号为：CCTCC No:M 20221465。本发明所述黄曲霉(Aspergillus flavus)EXY1A109的钙调蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
现有开发较多的为细菌类生防菌，如乳酸菌类、杆菌类等可以降低黄曲霉毒素的污染，但容易受不同地域土壤环境的影响，应用效果不甚理想。
因此，从土壤中筛选出一株高抑制性能力非产毒黄曲霉菌株十分必要。竞争性抑制田间产毒黄曲霉菌生长，用来调节控制土壤中高产毒力黄曲霉菌的生长，还可以用来防治不同粮食或油料作物黄曲霉素污染，具有较好的应用前景。本发明从襄阳市花生主产区土壤样品中分离得到一株非产毒黄曲霉菌株EXY1A109，具备良好的土壤环境适应性，用来抑制田间产毒黄曲霉菌生长。
本发明所述黄曲霉菌株EXY1A109菌落形态为致密丝状，分生孢子结构多，孢子大小为直径200～500μm。
本发明利用EXY1A109的钙调蛋白序列与NCBI数据库中的数据进行比对，初步确定菌株的分类信息，鉴定结果表明菌株EXY1A109为黄曲霉(Aspergillus flavus)菌株。
本发明提供了一种含有上述技术方案所述的黄曲霉菌EXY1A109的菌剂。
本发明所述菌剂优选包括黄曲霉菌EXY1A109菌悬液或黄曲霉菌EXY1A109发酵液。
本发明所述黄曲霉菌EXY1A109菌悬液的制备方法优选包括：将所述黄曲霉菌EXY1A109接种在DG18培养基上培养之后得到孢子，用质量浓度为0.1％的吐温80洗脱孢子，制备成黄曲霉菌分生孢子悬液。用光学显微镜计数，本发明优选调整孢子浓度≥1×105CFU/mL，4℃冰箱保存备用。
本发明所述黄曲霉菌EXY1A109发酵液的制备方法优选包括：将1mL黄曲霉菌株菌液接种于30mL液体沙氏培养基中，28℃，200rpm中避光摇床共生培养，培养7天。本发明所述黄曲霉菌株菌液的孢子浓度优选为≥1×105CFU/mL。
本发明提供了上述技术方案所述的黄曲霉菌EXY1A109或上述技术方案所述的菌剂在制备抑制黄曲霉菌株产毒素的制剂中的应用。
本发明，所述制剂中黄曲霉菌EXY1A109的孢子浓度≥1×105CFU/mL，进一步优选为≥4×105CFU/mL，更优选为1×106CFU/mL。
本发明所述制剂优选还包括常规的制剂组分，不作具体限定。
本发明提供了一种用于抑制黄曲霉菌株产毒素的制剂，有效成分包括上述技术方案所述的黄曲霉菌EXY1A109和/或上述技术方案所述的菌剂。
本发明所述制剂的工作温度优选为25～30℃，进一步优选为26～19℃，更优选为28℃。
本发明所述制剂的黄曲霉菌EXY1A109的孢子浓度优选为≥1×105CFU/mL，更优选为1×106CFU/mL。
本发明黄曲霉菌EXY1A109抑制产生的毒素优选包括黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2中的一种或多种，更优选为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2。
本发明提供了一种抑制黄曲霉毒素产生的方法，将上述技术方案所述的黄曲霉菌EXY1A109与产生黄曲霉毒素的样品混合后进行共生培养。本发明所述产生黄曲霉毒素的样品优选包括产毒素的黄曲霉菌株制备而成的生物样品或者含有产毒素的黄曲霉菌株的土壤样品。在本发明中，所述生物样品优选包括孢子液。在本发明中，所述混合的方法没有特殊限定，采用常规的方法即可。
在本发明中，优选将黄曲霉菌EXY1A109与产毒素的黄曲霉菌株制备而成的生物样品混合后进行共生培养，进一步优选为黄曲霉菌EXY1A109与产毒素的黄曲霉菌株制备而成的孢子液混合后进行共生培养，更优选为黄曲霉菌EXY1A109孢子液与产毒素的黄曲霉菌株制备而成的孢子液混合后进行共生培养。
本发明优选将所述黄曲霉菌EXY1A109孢子液和产毒素的黄曲霉菌株制备而成的孢子液按照等孢子浓度和等体积混合。
在本发明中，所述共生培养优选包括将黄曲霉菌EXY1A109孢子液和产毒素的黄曲霉菌株制备而成的孢子液接种于培养基中进行共生培养。本发明所述黄曲霉菌EXY1A109孢子液的孢子浓度优选为≥1×105CFU/mL，更优选为1×106CFU/mL。本发明所述产生黄曲霉毒素的黄曲霉菌株制备而成的孢子液的孢子浓度优选为≥1×105CFU/mL，更优选为1×106CFU/mL。
本发明所述共生培养的温度优选为25～30℃，更优选为28℃；共生培养的时间优选为6～8d，更优选为7d；共生培养的转速优选为180～220r/min，更优选为200r/min。本发明所述接种时黄曲霉菌EXY1A109孢子液、产生黄曲霉毒素的黄曲霉菌株制备而成的孢子液和培养基的体积比优选为(1～2):(1～2):30，更优选为1:1:30。
本发明所述共生培养应用的培养基优选为液体沙氏培养基。本发明所述液体沙氏培养基优选为市售产品。在本发明实施例中，所述液体沙氏培养基优选购买自青岛海博生物技术有限公司。
本发明不产毒素的黄曲霉菌EXY1A109能够抑制任意产毒素的黄曲霉菌产生黄曲霉毒素。在本发明实施例中，产生黄曲霉毒素的黄曲霉菌株为黄曲霉标准产毒菌株CGMCC3.4408。当黄曲霉菌EXY1A109孢子液和CGMCC3.4408孢子液等体积混合，黄曲霉菌EXY1A109孢子液和CGMCC 3.4408孢子液浓度均为1×105CFU/mL，EXY1A109对CGMCC3.4408的抑制产毒率为92.94％；当黄曲霉菌EXY1A109孢子液和CGMCC3.4408孢子液等体积混合，黄曲霉菌EXY1A109孢子液和CGMCC3.4408的孢子液浓度均为1×106CFU/mL，EXY1A109对CGMCC3.4408的抑制产毒率达到99.71％。
本发明提供了一种抑制黄曲霉毒素产生的方法，将上述技术方案所述的黄曲霉菌EXY1A109与含有产毒素黄曲霉菌株的土壤样品混合后进行共生培养，更优选为所述黄曲霉菌EXY1A109制备成菌悬液或发酵液后与含有产毒素黄曲霉菌株的土壤样品混合后进行共生培养；本发明所述黄曲霉菌EXY1A109菌悬液或发酵液的孢子浓度优选为≥1×105CFU/mL，更优选为1×106CFU/mL。
在本发明中，所述共生培养的温度优选为25～37℃，进一步优选为29～32℃，更优选为28℃。本发明所述共生培养的时间优选为2～15d，进一步优选为5～7d，更优选为7d。
在本发明中，所述土壤样品中的黄曲霉产生的黄曲霉毒素质量浓度优选为≤1077μg/kg。本发明所述黄曲霉毒素质量浓度1077μg/kg是指黄曲霉毒素G2、G1、B2和B1的总浓度。
本发明公开了一种不产毒素的黄曲霉菌株，该菌株为黄曲霉(Aspergillusflavus)EXY1A109，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNo:M20221465。实验证明，本发明所提供的菌株对产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株产毒有抑制作用，且当不产毒菌EXY1A109与标准产毒菌CGMCC 3.4408的孢子浓度比为1×106:1×106时，该不产毒菌株对产毒菌的抑制产毒率达到99.71％，该菌株在抑制产毒黄曲霉生长，以及抑制黄曲霉毒素代谢产物的产生方面具有很大的应用潜力，该菌株对于抑制产毒黄曲霉侵染农产品、降低农产品中黄曲霉毒素污染具有重要意义。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例中应用的培养基
DG18培养基购买自青岛海博生物技术有限公司；
AFPA培养基购买自青岛海博生物技术有限公司；
沙氏液体培养基购买自青岛海博生物技术有限公司。
实施例1
1土壤样品采集及处理
襄阳市花生主产区土壤分为沙壤土、砂石地及黄黏土三类，在花生成熟期分别抽取襄阳市襄州、枣阳、宜城、谷城、南漳和高新区等10个县市区花生主产区，共计20余份土壤样品，低温4℃冰箱暂存备用。土壤经研磨后，每个样品称10.0g加入三角瓶中，加90mL无菌水，摇床混匀5min，制备成100mL样品基础液，备用。
2菌种分离培养
取基础液100μL，用灭菌涂布棒均匀涂布在DG18培养基平板上，4个重复，置于28℃避光培养5d，再挑取黄绿色菌斑，接种于AFPA培养基上，同样条件分离培养3d，保证一个平板上长出单个菌落。通过菌落形态鉴定，从20份土壤样品分离纯化出200余株菌株。
3菌种鉴定
将筛选出的菌株在AFPA培养基上培养长出菌落后，将正面白色、背面橙色的菌斑初步认定为黄曲霉菌。再将黄曲霉菌株转入DG18培养基上，28℃±1℃避光分离培养5d，分离纯化直到长出单个菌落，将单一菌落平板测序鉴定。粗提基因组DNA，选择相应引物扩增特异片段，送北京擎科生物武汉分公司测序鉴定，测序结果经BLAST软件进行同源性比较，对比实验所用菌株均鉴定为黄曲霉菌株，且与黄曲霉菌的同源性均为98％以上。
实施例2非产毒菌筛选
1非产毒菌筛选
对实施例1的襄阳花生主产区土壤中分离出的菌株进行筛选，采用液相荧光检测(GB5009.22-2016)菌株产毒力，结果发现，襄阳不同区域花生产区土壤黄曲霉菌以AFB1(黄曲霉毒素B1)毒素为主，AFB1>AFB2(黄曲霉毒素B2)>AFG2(黄曲霉毒素G2)>AFG1(黄曲霉毒素G1)，也对后期花生果实的污染危害较大。而高产毒菌株产毒最高达到每克土壤中AFB1含量为1407.9μg/kg，该地区种植花生出现污染风险较大。其中，筛选出不产毒菌株49株，其中两株菌株命名为ZY11和YC10。
2不产毒菌株YC10拮抗性初筛
将筛选出的不产毒菌株YC10与黄曲霉标准产毒菌株CGMCC 3.4408(简称SZ)平板共培养，设置4个平行平板，菌株YC10发现有明显的抑菌带，且抑菌带超过0.5cm，见图1，其中左边的图为YC10和SZ的拮抗图，右边的图为单独培养SZ的对照图。
在紫外灯下继续观察菌株YC10和CGMCC 3.4408的共生特性，发现菌株YC10对产毒菌株CGMCC 3.4408有明显的抑制性，在荧光下黄曲霉毒素荧光斑有明显减弱。
根据图1可知，菌株YC10对CGMCC 3.4408产毒素有抑制作用。
粗提菌株YC10基因组DNA，选择相应引物扩增特异片段，PCR扩增时应用的引物为：ITS1序列5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'(SEQ ID NO:2)；ITS4序列5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(SEQ ID NO:3)；PCR体系组成见表1。
PCR程序见表2；98℃，10s；58℃，10s；72℃，20s三个步骤循环35次。
PCR扩增产物送北京擎科生物武汉分公司测序鉴定，测序结果经BLAST软件进行同源性比较，与Aspergillus flavus的同源性为99.80％。
表1 PCR体系组成
菌株YC10的钙调蛋白的PCR扩增测序结果如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1：GCGGGATCTATGCCTTCGAGTTAGTATGCTTTGGACCAAGGAACTCCTCAAAAGCATGATCTCGGATGTGTCCTGTTATATCTGCCACATGTTTGCTAACAACTTTGCAGGCAAACCATCTCTGGCGAGCACGGCCTTGACGGCTCCGGTGTGTAAGTACAGCCTGTATACACCTCGAACGAACGACGACCATATGGCATTAGAAGTTGGAATGGATCTGACGGCAAGGATAGTTACAATGGCTCCTCCGATCTCCAGCTGGAGCGTATGAACGTCTACTTCAACGAGGTGCGTACCTCAAAATTTCAGCATCTATGAAAACGCTTTGCAACTCCTGACCGCTTCTCCAGGCCAGCGGAAACAAGTATGTCCCTCGTGCCGTCCTCGTTGATCTTGAGCCTGGTACCATGGACGCCGTCCGTGCCGGTCCCTTCGGTCAGCTCTTCCGTCCCGACAACTTCGTTTTCGGCCAGTCCGGTGCTGGTAACAACTGGGCCAAGGGTCACTAACCTTGGAGGGTAACAAA。
菌株YC10生物保藏时命名为黄曲霉菌EXY1A109。
3菌株的形态鉴定
黄曲霉菌EXY1A109在DG18培养基上的菌落形态和分生孢子形态见图2，黄曲霉菌EXY1A109在AFPA培养基上菌落背面的颜色图见图3，图3中的两个图是同一培养时间的正面图和反面图；黄曲霉菌EXY1A109在显微镜下的孢子形态(200×)见图4。
实施例3菌株抑制产毒率测定
1标准曲线绘制
以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒G2混标品作为标准品进行高效液相色谱串联柱后光化学衍生法检测。
高效液相色谱串联柱后光化学衍生法检测的参数为：
色谱条件：色谱柱为C18(5μm，4.6mm×150mm)，柱温35℃；流动相为甲醇∶水(45∶55，V∶V)；流速0.9mL/min；检测条件：光化学衍生器254nm；以荧光检测器检测，激发波长360nm，发射波长440nm，进样量10μL。
结果见图5，根据图5可知，黄曲霉毒素(AFT)混标出峰时间依次为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒G2，分离度很好，黄曲霉毒素标准品中AFB1的出峰时间为11.3min，AFB2的出峰时间为9.5min，AFG1的出峰时间为8min，AFG2的出峰时间为7min。四种物质出峰结束时间为13min，根据色谱面积(Y)和浓度(X，μg/L)绘制标准曲线，得到线性回归方程(表3)，4种标准品的线性关系很好。
表3黄曲霉毒素标准曲线
2抑制产毒率
挑选出的不产毒黄曲霉菌株中的黄曲霉菌EXY1A109、ZY11和黄曲霉标准产毒菌株CGMCC 3.4408(简称SZ)进行共生培养，见处理1～处理3。黄曲霉标准产毒菌株CGMCC3.4408，购于中国农业科学院油料研究所。
将黄曲霉菌EXY1A109单菌落接种在DG18培养基上，所得的孢子用质量浓度为0.1％的吐温80水溶液洗脱下来，制备成分生孢子悬液。
将CGMCC 3.4408单菌落接种在DG18培养基上，所得的孢子用质量浓度为0.1％的吐温80水溶液洗脱下来，制备成分生孢子悬液。
处理1：共生培养：将黄曲霉菌EXY1A109与菌株CGMCC 3.4408，在显微镜下准确数好孢子数量，将2种孢子液浓度调整为105CFU/mL，将1mL非产毒菌孢子液和1mL菌株CGMCC3.4408孢子液接种于30mL液体沙氏培养基中，28℃，200r/min中避光摇床共生培养7d，每天观察生长状态获得共生培养液。黄曲霉菌EXY1A109和菌株CGMCC 3.4408(简称SZ)孢子浓度为105:105进行共生培养时，共生培养状态如图6，CGMCC 3.4408的菌丝球生长明显得到抑制。
处理2：将2种孢子液浓度调整为106CFU/mL，将黄曲霉菌EXY1A109与菌株CGMCC3.4408共生培养，黄曲霉菌EXY1A109和黄曲霉标准产毒菌株CGMCC 3.4408(简称SZ)孢子浓度为106:106进行共生培养时，其余条件同处理1。
处理3：ZY11和黄曲霉标准产毒菌株CGMCC 3.4408(简称SZ)进行共生培养的条件同处理1。
分别将处理1～处理3所得培养液破壁粉碎后，过滤得粗提液，切忌交叉污染，取1mL过免疫亲和柱，用1mL甲醇洗脱，收集洗脱液上机测AFT产毒力。
将步骤1的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒G2混标品用甲醇稀释制备成浓度分别为1、5、10、50、100、500μg/L共6个梯度的黄曲霉毒素(AFT)标准溶液，采用高效液相色谱串联柱后光化学衍生法测定发酵液中黄曲霉毒素。
具体参数为：色谱柱为C18(5μm，4.6mm×150mm)，柱温35℃；流动相为甲醇∶水(45∶55，V∶V)；流速0.9mL/min；检测条件：光化学衍生器254nm；以荧光检测器检测，激发波长360nm，发射波长440nm，进样量10μL。
经高效液相色谱-柱后光化学衍生检测，取3个平行结果平均值，见表4。黄曲霉标准产毒菌株CGMCC 3.4408的AFT均值为1072.95μg/g。孢子浓度为1×105CFU/mL时，非产毒黄曲霉菌株EXY1A109对菌株CGMCC 3.4408的抑制产毒率达到92.94％；孢子浓度为1×106CFU/mL时，非产毒黄曲霉菌株EXY1A109对菌株CGMCC 3.4408的抑制产毒率达到99.71％。产生抑菌效果一种可能性是不产毒菌株竞争性抑制产毒菌株生长，另一种可能性是液体发酵过程中产生了某种生物酶，抑制黄曲霉毒素产生。
表4选取的黄曲霉菌株对产毒菌的抑制效果
注：表4中的不同字母代表在P<0.05水平差异显著。
3.菌株抑制效果HPLC图
(1)共生培养：将非产毒菌株EXY1A109与菌株CGMCC 3.4408，在显微镜下准确数好孢子数量，将2种孢子液浓度调整为105CFU/mL，分别将1mLEXY1A109孢子液和1mL菌株CGMCC3.4408孢子液接种于30mL液体沙氏培养基中，28℃，200r/min中避光摇床共生培养7d，每天观察生长状态获得共生培养液。
将孢子浓度为105CFU/mL的菌株CGMCC 3.4408孢子液1mL和无菌水1mL接种于30mL液体沙氏培养基中作空白对照，获得对照培养液。
(2)提取纯化：将共生培养液和对照培养液做破壁处理后，用灭菌纱布过滤，切勿交叉污染，离心取上清液，取1mL上清液过免疫亲和柱纯化，2mL甲醇洗脱置换溶剂，过0.22μm微孔滤膜过滤后，取1mL上液相色谱检测，高效液相色谱串联柱后光化学衍生法同上。
黄曲霉菌EXY1A109的HPLC图谱如图7所示，根据图7可知，共培养组的黄曲霉毒素产量低。图7中的粉色线(峰面积大的)为对照组，蓝色线(峰面积小的)为共培养组。
综上，本发明所提供的黄曲霉菌EXY1A109对产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株产毒有抑制作用，且当黄曲霉菌EXY1A109与标准产毒菌株CGMCC 3.4408的孢子浓度比为1×106:1×106时，该不产毒菌株对产毒菌的抑制产毒率达到近99.71％，该菌株在抑制产毒黄曲霉生长，以及代谢产物抑制黄曲霉毒素产生方面具有个很大的应用潜力，该菌株对于抑制产毒黄曲霉侵染农产品、降低农产品中黄曲霉毒素污染具有重要意义。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一株不产毒素的黄曲霉(Aspergillusflavus)EXY1A109，其保藏号为：CCTCC No:M20221465。
2.一种含有权利要求1所述的黄曲霉菌EXY1A109的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂包括黄曲霉菌EXY1A109菌悬液、黄曲霉菌EXY1A109发酵液或黄曲霉菌EXY1A109。
4.权利要求1所述的黄曲霉菌EXY1A109或权利要求2或3所述的菌剂在制备抑制黄曲霉菌株产毒素的制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述制剂中黄曲霉菌EXY1A109的孢子浓度为≥1×105CFU/mL。
6.一种用于抑制黄曲霉菌株产毒素的制剂，其特征在于，有效成分包括权利要求1所述的黄曲霉菌EXY1A109和/或权利要求2～3任一项所述的菌剂。
7.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述制剂的孢子浓度为≥1×105CFU/mL。
8.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述毒素包括黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2中的一种或多种。
9.一种抑制黄曲霉毒素产生的方法，其特征在于，将权利要求1所述的黄曲霉菌EXY1A109与产生黄曲霉毒素的样品混合后进行共生培养。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述产生黄曲霉毒素的样品包括产毒素黄曲霉菌株制备而成的生物样品或者含有能够产毒素黄曲霉菌株的土壤样品。
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