CN113817652A - 一株地衣芽孢杆菌cpl618及其筛选和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株地衣芽孢杆菌CPL618及其筛选和应用，该菌株CPL618经鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，已保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏时间为2021年09月13日，保藏编号为CCTCC NO:M20211158。本发明地衣芽孢杆菌CPL618具有广谱抑菌性，能够拮抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性球菌以及真菌的生长；本发明提供一种优化的工业培养基使其能以较低成本提高杆菌肽A产量，最高产量能达到2.3g/L。本发明地衣芽孢菌在制备抗菌剂与杆菌肽A生产方面具有广阔的利用前景。

Description

一株地衣芽孢杆菌CPL618及其筛选和应用
技术领域
本发明属于微生物，具体涉及一株地衣芽孢杆菌CPL618及其筛选和应用。
背景技术
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为革兰氏阳性嗜热菌，是典型的兼性厌氧微生物，能发酵葡萄糖等速效碳源生成乙酸等溢流代谢产物。细胞形态呈杆状、单生。在肉汁培养基中培养时，菌落表现为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙，多皱褶。地衣芽孢杆菌能产生肽类、磷脂类等多种抗生素，能对人类病原菌起到良好的抑制作用。由于地衣芽孢杆菌不具有致病性，而且能将蛋白质和一些酶分泌到细胞外，使其在工业生产中被广泛应用。
地衣芽孢杆菌是一类具有重要使用价值以及经济价值的微生物，其种类丰富，分布广泛，产生多种生物活性物质。地衣芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，能够产生静止的芽孢以度过恶劣的环境。由于芽孢具有非常强的抗逆性，使其在运输或储藏过程中不容易失活，因而地衣芽孢杆菌是一种较为理想的生物农药。其次，地衣芽孢杆菌营养需求简单、生长速度快，这使得其生产发酵的成本较低，有利于开发成生防菌剂。最为重要的是，地衣芽孢杆菌还能够产生多种次级代谢产物，是抗菌活性物质的重要来源。地衣芽孢杆菌的生态适应性良好，可以和多种微生物竞争，有助于控制病原菌，其效果持久、争对性强，展现出良好的应用前景。
杆菌肽是由12个氨基酸组成的含有噻唑环的多肽复合体，是类白色或淡黄色的粉末。无臭，味苦，有引湿性，易被氧化剂破坏,在溶液中能被多种重金属盐类沉淀。临床上抗菌谱与青霉素相似，对革兰阳性细菌和阴性球菌、肺炎双球菌、葡萄球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌及螺旋体等均有杀菌作用。相对于传统的抗生素，杆菌肽对多种耐药性细菌比如金黄色葡萄球菌具有更高的抑制活性和更低的细胞毒性。与其他抗生素相比,杆菌肽的稳定性更强,而杆菌肽(锌)具有更高的稳定性和活性。当杆菌肽在生产发酵过程中达到最高的效价时，直接在培养基中添加硫酸锌或氯化锌,可产生更稳定的杆菌肽锌络合物，即杆菌肽(锌)。杆菌肽(锌)可以形成三元复合物,抑制细菌细胞壁的合成,也可以结合敏感菌的细胞膜，导致多种内膜离子、氨基酸、嘌呤和其他重要物质流出,从而干扰敏感原浆在细菌蛋白质的合成,进而抑制G+细菌。杆菌肽由于其具有效率高、无毒副作用、无残留、无交叉耐药性等优势而被广泛应用于畜禽养殖业、水产业。由于杆菌肽特殊的环形结构，采用化学合成的方法存在较大的难度，因此目前杆菌肽主要是通过芽孢杆菌发酵的方法制备，文献报道杆菌肽A产量在1g/L左右。目前文献及专利所述的发酵方法一般是由多种碳源、氮源混合发酵，如CN109439581A、CN113234631A等的发酵培养基，均由2种或两种以上的氮源，成本相对较高，并且无法高产杆菌肽A。现有技术中公开了一种高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌基因改组菌株及应用(CN107904198A)，其中以地衣芽孢杆菌基因改组菌株产量可达到1.7g/L。一般基因突变的菌株比普通的菌株能力强，所以有必要进一步筛选高产杆菌肽A的菌株，同时以一种较低成本的发酵培养基配方，低成本的同时能增加杆菌肽A的产量。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一株地衣芽孢杆菌CPL618具有广谱抑菌性，能够拮抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性球菌、短密青霉与真菌的生长。利用本发明的发酵培养基配方，通过优化发酵条件，该菌株可以低成本高效生产杆菌肽A。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述的一株地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)CPL618，已保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏地址：中国.武汉，邮编：430072，保藏时间为2021年09月13日，保藏编号为CCTCC NO:M20211158。该菌株CPL618来源于淮安市麦田土壤中，无菌操作观察培养基上单个菌落的形态，菌株CPL618在LB培养基上为圆形，扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙，多皱褶。
其中，所述地衣芽孢杆菌CPL618具有广谱抑菌性，能够拮抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性球菌以及真菌的生长。
作为优选，所述地衣芽孢杆菌CPL618对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、短密青霉、酵母菌有明显的抑制作用。
本发明所述的地衣芽孢杆菌CPL618的筛选，包括如下步骤：
将所取土壤样品浸泡在无菌水中，取土壤悬液用无菌水稀释，取稀释后的试液滴加在LB固体培养基上，涂抹均匀，倒置过夜培养得到初筛菌株，以分离筛选得到的初筛菌株为供试菌，以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用牛津杯法筛选出具有金黄色葡萄球菌拮抗效果最好的地衣芽孢杆菌CPL618。
本发明所述的地衣芽孢杆菌CPL618在生产杆菌肽A中的应用。
其中，所述地衣芽孢杆菌CPL618接种于培养基中进行发酵，从发酵液中分离获得所述的杆菌肽A。
作为优选，所述地衣芽孢杆菌CPL618接种于培养基中进行发酵，以质量百分数计，所述培养基包括黄豆饼粉3％-4％，玉米粉1.5％-2.5％，大豆油0.5％-0.7％，碳酸钙0.7％-0.9％，硫酸铵0.1％-0.2％，硫酸镁0.001％-0.003％，硫酸锰0.001％-0.003％，pH7.2～7.4。
作为优选，所述地衣芽孢杆菌CPL618接种于培养基中进行发酵，其发酵条件为：：在种子液到达对数期时，按照3-10％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制温度维持在32-37℃，摇床转速150-180r/min，发酵36-48小时。
作为优选，按照5％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制温度维持在37℃，摇床转速180r/min，发酵48小时。
本发明所述的地衣芽孢杆菌CPL618在生产抗菌剂中的应用。
其中，所述抗菌剂包括为拮抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性球菌以及真菌的生长的菌剂。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明提供一株可以以价格低廉的黄豆粉、玉米粉等作为氮源、碳源，能以较低成本生产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌CPL618，同时产量明显提高，经所述条件发酵后，杆菌肽A产量可达到2.3g/L，适用于大规模发酵生产杆菌肽A，也为后期高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌的改造提供新的菌株。
附图说明
图1为地衣芽孢杆菌CPL618形态示意图，左图为在LB培养基37℃下培养24h的菌落图，右图为菌落形态图；
图2为用牛津杯法对地衣芽孢杆菌CPL618对金黄色葡萄球菌抑菌活性的测定图；
图3为基于CPL618及近缘种16srDNA片段基因构建进化树；
图4为CPL618基因测序及其次级代谢产物合成基因簇所在位点分析图；
图5为涂布法对地衣芽孢杆菌CPL618抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、短密青霉、酵母菌活性；
图6为地衣芽孢杆菌CPL618在不同发酵条件下产杆菌肽A的高效液相色谱分析。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。其中使用的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、短密青霉菌、酵母菌均为普通菌株由淮阴工学院提供，也可以使用其他野生型的菌株均可。
实施例1
土壤中地衣芽孢杆菌CPL618的分离筛选和抑菌活性的测定：
从淮安市麦田土壤中分离获得，分离过程如下：选取10～20cm深处的土壤约10g，加入100ml生理盐水混匀。在80℃条件下水浴1h，再加入4g NaCl，37℃水浴2h。将水浴后的土壤约18g充分浸泡在50mL无菌水中，取1mL土壤悬液用无菌水10倍稀释，取100uL稀释后的试液滴加在LB固体培养基上，涂抹均匀，倒置37℃过夜培养。通过无菌操作观察培养基上单个菌落的形态，包括菌落的颜色、大小、菌落边缘以及表面粗糙情况，获得53株初筛菌株。将培养的初筛菌株为供试菌，以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用牛津杯法筛选出对金黄色葡萄球菌具有良好拮抗效果的菌株，将该菌株命名为CPL618。无菌操作观察培养基上单个菌落的形态，菌株CPL618在LB培养基上为圆形，扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙，多皱褶，如图1所示。
采用牛津杯法进行抑菌活性的测定，具体步骤包括：取菌株单菌落于LB液体培养基中于37℃，180r/min条件下培养至OD值为0.8-0.9，取金黄色葡萄球菌单菌落于LB培养基内37℃，180r/min条件下培养至对数期后，将以金黄色葡萄球菌为指示菌平板三等分，无菌操作夹取3个牛津杯垂直放置在平板上，分别取0.2mL的菌株CPL618菌液打入到牛津杯中，进行实验对比，37℃条件下培养24h，观察牛津杯周围抑菌圈，抑菌圈直径/mm＝总直径/mm-牛津杯直径/mm，结果如图2所示，菌株CPL618对金黄色葡萄球菌有良好的抑制效果，抑菌圈直径为14.7±0.3mm。
实施例2
菌株CPL618的鉴定和全基因组测序：
将筛选出的菌株CPL618培养至对数生长期，提取其基因组DNA。利用细菌的通用引物扩增出它的16srDNA片段，进行测序，通过序列比对，采用BLAST分析法，对该基因的16srDNA片段进行比对，序列全长为1555bp见序列表SEQ ID NO.1。将本发明菌株CPL618的序列与NCBI注册的地衣芽孢杆菌A4-3等序列比较，同源性为100％，基因构建进化树如图3所示，结合菌株CPL618生理生化实验结果，鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CPL618，已保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏时间为2021年09月13日，保藏编号为CCTCC NO:M20211158。
将筛选出的菌株CPL618送至北京基因组研究所(BGI，中国深圳)使用PacBio RSII平台和Illumina HiSeq 4000平台对基因组进行测序。用anti-SMASH对菌株CPL618基因组进行次级代谢产物分析，测序结果如图4显示：CPL618序列全长4447938bp，得到5个次级代谢产物：丰原素(Fengycin)、杆菌肽(Bacitracin)、儿茶酚型嗜铁素(Bacillibactin)、地衣素(Lichenysin)和丁胺菌素(butirosin A/butirosin B)。其中，测序报告显示：Cluster1与BGC0001095 c1来源的Fengycin合成基因簇相似性为86％；Cluster 4与BGC0000310 c1来源的Bacitracin合成基因簇相似性为100％；Cluster 7与BGC0000309 c1来源的Bacillibactin合成基因簇相似性为53％；Cluster 10与BGC0000381 c1来源的Lichenysin合成基因簇相似性为100％；而butirosin A/butirosin B与菌株BGC0000693 c1来源的基因簇相似性仅为7％，说明该基因簇可能合成新的抑菌物质。
实施例3
地衣芽孢杆菌CPL618对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、短密青霉及酵母菌的抑菌效果：
培养基的制备及指示菌活化：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以LB培养基为生长培养基；短密青霉菌以PDA培养基为生长培养基；酵母菌以MRS培养基为生长培养基。将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、短密青霉及酵母菌单菌落于对应液体培养基中培养至对数期。
采用涂布法进行抑菌活性的测定，具体步骤包括：取CPL618菌株单菌落于LB液体培养基中于37℃条件下培养至OD值为0.8-0.9后，以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、短密青霉及酵母菌为指示菌，取0.2ml指示菌菌液均匀涂布于对应生长平板上，将平板二等分，分别取0.2mL的CPL618菌液均匀涂布于一侧，进行实验对比，37℃条件下培养24h，观察CPL618菌液涂布周围抑菌效果。结果如图5所示，左上为金黄色葡萄球菌，右上为大肠杆菌，左下为短密青霉菌，右下为酵母菌。结果表明，涂有CPL618菌液的一侧，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、短密青霉及酵母菌的生长效果不佳，说明CPL618对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、短密青霉及酵母菌有明显抑菌效果。
实施例4
利用工业发酵培养基进行地衣芽孢杆菌CPL618发酵培养：
(1)种子培养：取在甘油保存的地衣芽孢杆菌CPL618一环，划线接种在LB培养基(胰蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl 0.5％，琼脂2％，余量为水，pH 7.0)的平皿中，过夜培养后取单菌落接种于5ml LB试管培养基中，37℃，180r/min，培养至对数期后，制成种子液。
(2)发酵培养：将种子液按体积比5％的量接种至1L工业发酵培养基中，发酵培养条件：37℃，180rpm恒温培养，发酵时间为48h。其中发酵培养基的组成质量百分比为：黄豆饼粉3％，玉米粉1.5％，大豆油0.5％，碳酸钙0.7％，硫酸铵0.1％，硫酸镁0.001％，硫酸锰0.001％，pH为7.4，121℃灭菌20分钟。
(3)粗提物制备：将发酵液10000rpm/min离心5min，收集上清，再经0.22μm滤膜过滤，所得清液即为粗提物。
(4)通过液相分析系统，杆菌肽A检测条件：色谱柱为C18(规格：4.6×250mm，粒径：5μm)；柱温30℃；进样量为20uL；流动相：甲醇：磷酸盐缓冲液(100mL的50mM磷酸氢二钾溶液与500mL50 mM磷酸氢二钾混合，调pH至6.0，0.22μm滤膜抽滤)＝70：30；流速为1ml/min；检测波长为254nm。对比4g/L的标准样品峰面积，分析得到发酵产物中，杆菌肽A含量为2.1g/L。通过浊度法测得发酵培养基中地衣芽孢杆菌CPL618菌体量为7.5×109cfu/mL。
实施例5
利用工业发酵培养基进行地衣芽孢杆菌CPL618发酵培养：
(1)种子培养：取在甘油保存的地衣芽孢杆菌CPL618一环，划线接种在LB培养基(胰蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl 0.5％，琼脂2％，余量为水，pH 7.0)的平皿中，过夜培养后取单菌落接种于5ml LB试管培养基中，37℃，180r/min，培养至对数期后，制成种子液。
(2)发酵培养：将种子液按体积比5％的量接种至1L工业发酵培养基中，发酵培养条件：37℃，180rpm恒温培养，发酵时间为48h。其中发酵培养基的组成质量百分比为：黄豆饼粉3.5％，玉米粉2％，大豆油0.6％，碳酸钙0.8％，硫酸铵0.1％，硫酸镁0.002％，硫酸锰0.001％，pH为7.4，121℃灭菌20分钟。
(3)粗提物制备：将发酵液10000rpm/min离心5min，收集上清，再经0.22μm滤膜过滤，所得清液即为粗提物。
(4)通过液相分析系统(检测条件同实施例4)，对比4g/L的标准样品峰面积，分析得到发酵产物中，杆菌肽A含量为2.3g/L。通过浊度法测得发酵培养基中地衣芽孢杆菌CPL618菌体量为8×109cfu/mL。
实施例6
利用工业发酵培养基进行地衣芽孢杆菌CPL618发酵培养：
(1)种子培养：取在甘油保存的地衣芽孢杆菌CPL618一环，划线接种在LB培养基(胰蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl 0.5％，琼脂2％，余量为水，pH 7.0)的平皿中，过夜培养后取单菌落接种于5ml LB试管培养基中，37℃，180r/min，培养至对数期后，制成种子液。
(2)发酵培养：将种子液按体积比5％的量接种至1L工业发酵培养基中，发酵培养条件：37℃，180rpm恒温培养，发酵时间为48h。其中发酵培养基的组成质量百分比为：黄豆饼粉4％，玉米粉2.5％，大豆油0.7％，碳酸钙0.9％，硫酸铵0.2％，硫酸镁0.003％，硫酸锰0.003％，pH为7.4，121℃灭菌20分钟。
(3)粗提物制备：将发酵液10000rpm/min离心5min，收集上清，再经0.22μm滤膜过滤，所得清液即为粗提物。
(4)通过液相分析系统(检测条件同实施例4)，对比4g/L的标准样品峰面积，分析得到发酵产物中，杆菌肽A含量为2.16g/L。通过浊度法测得发酵培养基中地衣芽孢杆菌CPL618菌体量为7.8×109cfu/mL。
对比例1
利用LB发酵培养基进行地衣芽孢杆菌CPL618发酵培养
(1)种子培养：取在甘油保存的地衣芽孢杆菌CPL618一环，划线接种在LB培养基(胰蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl 0.5％，琼脂2％，余量为水，pH 7.0)的平皿中，过夜培养后取单菌落接种于5ml LB试管培养基中，37℃，180r/min，培养至对数期后，制成种子液。
(2)发酵培养：将种子液按体积比5％的量接种至1L LB发酵培养基中，发酵培养条件：37℃，180rpm恒温培养，发酵时间为48h。
(3)粗提物制备同实施例4。(上述步骤实际均与实施例4相同，不同之处在于培养基换成了普通LB培养基)。
(4)通过液相分析系统(检测条件同实施例4)，对比4g/L的标准样品峰面积，分析得到发酵产物中，杆菌肽A含量为2.0g/L。通过浊度法测得发酵培养基中地衣芽孢杆菌CPL618菌体量为7×109cfu/ml。
对比例2
利用CN113234631A中的发酵培养基进行地衣芽孢杆菌CPL618发酵培养
(1)种子培养：取在甘油保存的地衣芽孢杆菌CPL618一环，划线接种在LB培养基(胰蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl 0.5％，琼脂2％，余量为水，pH 7.0)的平皿中，过夜培养后取单菌落接种于5ml LB试管培养基中，37℃，180r/min，培养至对数期后，制成种子液。
(2)发酵培养：将种子液按体积比5％的量接种至1L工业发酵培养基中，发酵培养条件：37℃，180rpm恒温培养，发酵时间为48h。其中发酵培养基的组成质量百分比为：玉米淀35g/L、糖蜜12g/L、豆粕粉6g/L、蛋白胨6g/L、氯化钠3g/L、磷酸二氢0.8g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸镁0.8g/L、消泡剂3g/L，121℃灭菌20分钟。
(3)粗提物制备同实施例4(上述步骤实际均与实施例4相同，不同之处在于培养基换成了CN113234631A中的发酵培养基)。
(4)通过液相分析系统(检测条件同实施例4)，对比4g/L的标准样品峰面积，分析得到发酵产物中，杆菌肽A含量为1.9g/L。通过浊度法测得发酵培养基中地衣芽孢杆菌CPL618菌体量为8×108cfu/ml。
对比例3
对比例3与对比例2方法相同，不同之处在于：将发酵培养基替换成100g/L豆粕、20g/L玉米淀粉、6g/L CaCO3和1.5g/L(NH4)2SO4。通过液相分析系统(检测条件同实施例4)，对比4g/L的标准样品峰面积，分析得到发酵产物中，杆菌肽A含量为1.83g/L。通过浊度法测得发酵培养基中地衣芽孢杆菌CPL618菌体量为7.8×108cfu/ml。
对比例4
对比例4与对比例2方法相同，不同之处在于：玉米淀粉200.0克、葡萄糖50.0克、棉籽蛋白粉150.0克、酵母粉100.0克、硫酸铵10.0克、玉米浆15.0克、磷酸二氢钾5.0克、氯化钠15.0克、七水硫酸镁5.0克，加自来水定容至5L，pH7.0，121℃灭菌30min；取1L进行发酵。
通过液相分析系统(检测条件同实施例4)，对比4g/L的标准样品峰面积，分析得到发酵产物中，杆菌肽A含量为1.95g/L。通过浊度法测得发酵培养基中地衣芽孢杆菌CPL618菌体量为8.8×108cfu/ml。
由对比例1-4和实施例4、实施例5、实施例6比较，本发明提供的工业培养基能大大提高地衣芽孢杆菌CPL618的菌体量和杆菌肽A的产量，液相分析图如图6所示，从上而下分别为杆菌肽A标准样品(4g/L)、实施例4、实施例5对比例1，其中最优培养基的组成为：黄豆饼粉3.5％，玉米粉2％，大豆油0.6％，碳酸钙0.8％，硫酸铵0.1％，硫酸镁0.002％，硫酸锰0.001％，pH为7.4，地衣芽孢杆菌CPL618菌体量达到8×109cfu/ml，产杆菌肽A含量最高，杆菌肽A含量为2.3g/L。实际上本发明分离筛选的菌株在LB培养基下就可以达到杆菌肽A产量为2.0g/L，通过本发明的培养基优化最终实现了杆菌肽A产量为2.3g/L，而利用现有技术中一些复杂的地衣芽孢杆菌的培养基的对本发明的菌株进行发酵培养，反而不如普通的LB培养基并且明显低于本发明优化后的培养基，但是其产量也明显高于现有的地衣芽孢杆菌杆菌肽A产量，进一步说明本发明菌株的特殊性。
序列表
<110> 淮阴工学院
江苏省农业科学院
<120> 一株地衣芽孢杆菌CPL618及其筛选和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1555
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60
ggaccgacgg gagcttgctc ccttaggtca gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120
cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat gcttgattga 180
accgcatggt ttaattataa aaggtggctt ttagctacca cttacagatg gacccgcggc 240
gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga 300
gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag 360
ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt 420
tcggatcgta aaactctgtt gttagggaag aacaagtacc gttcgaatag ggcggtacct 480
tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 540
ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagcgcg cgcaggcggt ttcttaagtc 600
tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc 660
agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac 720
cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc 780
gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg 840
gtttccgccc tttagtgctg cagcaaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg 900
caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 960
attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaac cctagagata 1020
gggcttcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt 1080
gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc cagcattcag 1140
ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat 1200
catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tgggcagaac aaagggcagc 1260
gaagccgcga ggctaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa 1320
ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg 1380
ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg 1440
tgaggtaacc ttttggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500
acaaggtagc cgtatcggaa ggtgcggctg gatcacctcc tttctaagga tatta 1555

Claims (10)

1.一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CPL618，已保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏时间为2021年09月13日，保藏编号为CCTCC NO:M20211158。
2.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌CPL618，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌CPL618具有广谱抑菌性，能够拮抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性球菌以及真菌的生长。
3.根据权利要求2所述的地衣芽孢杆菌CPL618，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌CPL618优选对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、短密青霉、酵母菌有抑制作用。
4.一种权利要求1所述的地衣芽孢杆菌CPL618的筛选，其特征在于，包括如下步骤：
将所取土壤样品浸泡在无菌水中，取土壤悬液用无菌水稀释，取稀释后的试液滴加在LB固体培养基上，涂抹均匀，倒置过夜培养得到初筛菌株，以分离筛选得到的初筛菌株为供试菌，以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用牛津杯法筛选出具有金黄色葡萄球菌拮抗效果最好的地衣芽孢杆菌CPL618。
5.一种权利要求1所述的地衣芽孢杆菌CPL618在生产杆菌肽A中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌CPL618接种于培养基中进行发酵，从发酵液中分离获得所述的杆菌肽A。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌CPL618接种于培养基中进行发酵，以质量百分数计，所述培养基包括黄豆饼粉3％-4％，玉米粉1.5％-2.5％，大豆油0.5％-0.7％，碳酸钙0.7％-0.9％，硫酸铵0.1％-0.2％，硫酸镁0.001％-0.003％，硫酸锰0.001％-0.003％，pH 7.2～7.4。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌CPL618接种于培养基中进行发酵，其发酵条件为：在种子液到达对数期时，按照3-10％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制温度维持在32-37℃，摇床转速150-180r/min，发酵36-48小时。
9.一种权利要求1所述的地衣芽孢杆菌CPL618在生产抗菌剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗菌剂包括为拮抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性球菌以及真菌的生长的菌剂。
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Application publication date: 20211221

Assignee: Nanjing Baiskai Technology Co.,Ltd.

Assignor: HUAIYIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY

Contract record no.: X2023980041333

Denomination of invention: A strain of Bacillus licheniformis CPL618 and its screening and application

Granted publication date: 20230530

License type: Common License

Record date: 20230907