CN113832046B - 一种双功能贝莱斯芽孢杆菌及其在红曲米发酵中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌及其在红曲米发酵中的应用，属于微生物菌株技术领域，所述的贝莱斯芽孢杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2021630。所述贝莱斯芽孢杆菌可以用于提高红曲米色价和抑制黄曲霉污染，提高色价的具体方法包括将红曲霉发酵液接种到待发酵的红曲米中，在32±1℃的条件下发酵1~7d后接种贝莱斯芽孢杆菌发酵液，发酵8~12d后可以显著提高红曲米的色价。本发明保藏的菌株既可以提高红曲米的色价，又可以抑制黄曲霉在红曲米中生长，贝莱斯芽孢杆菌菌株的特性独特，对红曲米发酵的辅助作用明显，可操作性强，成本低廉，市场前景好。
Description
技术领域
本发明属于红曲米发酵技术领域，具体涉及一种双功能贝莱斯芽孢杆菌及其在红曲米发酵中的应用。
背景技术
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)属厚壁菌门，芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属。是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，大部分芽孢杆菌具有抗菌谱广、生长迅速、易分离培养、抗逆性强和生物安全性高等优点，从而作为益生菌在农业、食品、工业、医学、冶金、林业、环保以及军事等方面被广泛研究。
红曲米又名红曲、赤曲、红米，为棕红色至紫红色的米粒，是以籼米、粳米、糯米等稻米为原料，用红曲霉菌发酵后烘干而成的。红曲中的色素是一种天然色素，安全性高，着色稳定性强，且具有防腐的功效，在中国及周边国家广泛地被应用于食品领域中，至今已有一千多年的食用历史。
黄曲霉是一种半知菌类腐生真菌，是自然环境中较为常见的霉菌，广泛存在于土壤中，孢子可扩散至空气中传播，在合适的条件下侵染寄生体，其菌丝生长速度较快，并且菌丝生长时会产生黄曲霉毒素。实践中发现，在用纯种红曲霉发酵红曲米的过程中容易污染黄曲霉，一旦被污染，红曲米的发酵便无法继续进行。李晓楼提出发酵红曲米的过程中要加强卫生管理，可加入种曲质量的0.2%的浓度99.5%的乙酸来减少黄曲霉毒素和其他杂菌毒素的产生。刘春梅指出红曲米生产中由菌种本身造成的污染率约为4.31%，由接种操作引起的污染率约为1.76%，因此发酵过程的每一步都要避免杂菌污染的风险。
实验中发现，在用市售红曲米作为曲种发酵的过程中很少出现污染的情况，并且市售红曲米的生产过程一般较为粗放，并非为绝对的无菌环境，这种开放式生产可能给红曲米的发酵过程引入了某种能抑制黄曲霉的菌种。为此，本发明从市售红曲米中分离筛选出一株能够抑制黄曲霉孢子生长，但是不影响红曲霉分泌色素的菌株，将其与红曲霉在红曲米发酵前期进行混菌发酵，可提高红曲米生产过程抗黄曲霉污染能力，这样，有助于提高红曲米大规模发酵生产过程的鲁棒性，即不要求严格的无菌操作，也能保证发酵的正常进行。此外，在红曲米发酵中后期加入该菌株进行混菌发酵，可显著提高红曲米色价。
发明内容
红曲霉是散囊菌目中的曲霉科真菌。黄曲霉是散囊菌目曲霉属真菌，其特性相似，之前有报道芽孢杆菌对真菌有一定的抑制作用，为广谱抑菌，目前还没有报道有一种菌株既可以抑制黄曲霉，又可以提升红曲米色价。
本发明提供一种双功能贝莱斯芽孢杆菌，该菌株的菌落特征为：菌落为圆形，质地湿润，表面有光泽，颜色呈白色，不透明，中间凹陷，周围一圈隆起，边缘有褶皱。
该菌株从红曲米中经过筛选得到的，不但可以抑制黄曲霉还可以提升红曲米色价的贝莱斯芽孢杆菌，已于2021年5月31日保藏于在中国典型培养物保藏中心，该贝莱斯芽孢杆菌的保藏号为：CCTCC M 2021630，拉丁名：
Bacillus velezensis，地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052。其菌落状态和显微形态见图1。
同时，本发明提供一种稳定的提高红曲米色价的方法，所述提高红曲米色价的方法包括将红曲霉发酵液接种到待发酵的红曲米中，在32±1℃的条件下发酵1~7d后接种贝莱斯芽孢杆菌发酵液，发酵8~12d后可以显著提高红曲米的色价。
其中，所述红曲霉发酵液的制备方法为：将活化的红曲霉孢子液接入红曲霉液体培养基中，置于32±1℃，30~300 r/min的条件下振荡培养1~7d，过滤得到孢子数为5.0×103~3.5×104个/mL的红曲霉发酵液。
其中，所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法为：将本发明保藏的贝莱斯芽孢杆菌接入芽孢杆菌培养基中扩大培养，在32±1℃的条件下振荡培养12~24h后，将发酵液在4000~12000 r/min下离心2~6 min，弃上清液，收集菌体，用生理盐水重悬后得到贝莱斯芽孢杆菌发酵液，所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液的菌液浊度（OD560）为1.2~1.8。
其中，所述待发酵的红曲米的制备过程为：将籼米在用盐酸调整的pH为3.0~4.0的酸性水中浸泡2~15h，，将籼米沥干，并置于高压灭菌锅中121℃灭菌20~25 min，灭菌处理后得到待发酵的红曲米。
其中，所述红曲霉发酵液：贝莱斯芽孢杆菌发酵液=5:1~10:1，红曲霉发酵液的添加量为按照发酵液与熟米粒的体积质量比10~15%。
其中，所述发酵期间每隔20~30 h加一次无菌水并搅拌。
有益效果
本发明团队从红曲米中首次筛选得到一株不但可以抑制黄曲霉生长还可以提高红曲米色价的贝莱斯芽孢杆菌，其在红曲米中不仅可以抑制了黄曲霉的生长，而且在红曲霉接入1~7d后接入可以促进红曲霉产生红色素，提高红曲的色价，提升了红曲米的质量。
此贝莱斯芽孢杆菌现保存在中国典型培养物保藏中心（菌株保藏号：CCTCC M2021630）。极大的保障了红曲米制作过程中的稳定性，并且能够用其提升红曲米的色价，提升了红曲米的质量。
经过研究发现，贝莱斯芽孢杆菌作为辅助菌株，其接种量过大可能会出现不利于主发酵菌红曲霉的生长情况，但接种量过小也不利于其发挥抑制黄曲霉污染的作用，贝莱斯芽孢杆菌与红曲霉同时接入籼米后，由于贝莱斯芽孢杆菌是细菌，繁殖速度快，导致红曲霉不能正常生长，从而阻碍红曲米的正常发酵。
本发明经过层层筛选，从不易感染黄曲霉的红曲米中筛选出一株红曲米发酵的辅助菌，通过贝莱斯芽孢杆菌作为辅助菌接入后，红曲米的黄曲霉感染率显著下降，在开放的自然环境中，申请人的实验没有被黄曲霉污染，而对照组则容易被黄曲霉污染。同时，本发明的保藏的贝莱斯芽孢杆菌在第1~2d接入红曲米的条件下，不影响红曲霉产色素，在第4~7d接入红曲米的条件下可以显著提高红曲米的色价。
附图说明
图1为本发明贝莱斯芽孢杆菌的菌落形态和显微形态图。
图2为本发明贝莱斯芽孢杆菌革兰氏染色图。
图3为黄曲霉侵染籼米图。
图4为正常红曲霉发酵的红曲米图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明进行详细说明。所有方法及技术，如无特别说明，均为常规方法和技术。本发明所用的红曲霉为制备市售红曲米的红曲霉，红曲霉的品种不影响本发明的实施。
①红曲色素的提取及测定方法如下：
根据GB 1886.19-2015中的方法提取红曲米粉中的色素并进行其色价的测定，根据以下公式计算红曲的色价：
X ＝ A×100/m×b
式中： X—红曲色素提取液的色价 μ/g；A—样品萃取稀释液吸光度；m—称取红曲米样品的质量 g；b—稀释倍数。
实施例1
本实施例提供一种贝莱斯芽孢杆菌，菌落特征为：菌落为圆形，质地湿润，表面有光泽，颜色呈白色，不透明，中间凹陷，周围一圈隆起，边缘有褶皱，如图1所示。
所述菌株在平板上的形态如图2所示，经过革兰氏染色，在显微镜下观察其被染成紫色，为革兰氏阳性菌。菌株Y5的16S rDNA序列使用Sanger测序，将所得序列用NCBI上BLAST软件进行比对，结果表明Y5菌株与贝莱斯芽孢杆菌（
Bacillus velezensis）菌株的序列相似度达99%，结合其形态学特征观察结果，鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌。
申请人已经于2021年5月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCM 2021630。保藏中心的地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052。
本菌株的筛选方法如下：
称取30 g籼米，在100 ml pH为3.5的自来水中浸泡10 h，然后将水沥干至水加籼米的重量为43.5 g，之后将其装入250 mL的烧杯中，用六层纱布和报纸封口置于高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min，灭菌结束后用无菌玻璃棒搅开蒸熟的米粒，待其冷却至室温后，接种经两层纱布过滤的红曲霉发酵液2 mL，用经过高压灭菌的玻璃棒搅拌均匀，在32 ℃下培养，每隔24 h加一次无菌水并搅拌，前2天加水量为2 mL，从第3天开始加水量为4 mL，得到红曲米。
称取10 g 以市售红曲米为曲种所制备的红曲，将其置于带有玻璃珠的90 mL无菌生理盐水中，在180 r/min下振荡30 min，在取0.5 mL稀释液与4.5 mL的无菌生理盐水混匀，得到浓度为10-2的稀释液，之后依次进行10倍梯度稀释，将不同浓度的稀释液300 μL均匀地涂布在各分离培养基平板上，在32 ℃条件下培养2-5 d，注意观察平板生长情况。重复上述步骤，之后再结合三区划线法，最终获得纯种。
挑取红曲米发酵过程中污染杂菌的黄绿色米粒，置于PDA平板上进行培养，待培养基上生长出菌丝和孢子，继续挑取该菌不断进行三区划线。待培养基上菌落形态和生长状态基本一致，在无菌条件下用生理盐水冲洗平板上的污染菌孢子，收集孢子液，振荡混匀。吸取0.5mL的孢子液与4.5 mL的无菌生理盐水混匀进行梯度稀释，将不同浓度的稀释液振荡均匀后各量取300 μL，均匀地涂布在PDA培养基上，在32 ℃条件下培养2-5 d，期间注意观察平板生长情况。采用形态学观察与分子生物学鉴定相结合的方式，确定该菌株的微生物学地位。
红曲霉孢子液按6%的接种量接入红曲霉液体培养基中，置于32°下150 r/min振荡培养5 d，经两层纱布过滤得1×104个/ml的孢子液备用。
将黄曲霉LQ菌株孢子液按2%的接种量接入PDA液体培养基中，在32°下以150 r/min振荡培养2 d，蘸取菌液在PDA平板上Z字划线，在32°下培养3 d后，用生理盐水冲洗平板上的孢子，制备浓度为1×101个/ml的孢子稀释液。
将待筛菌株以2%的接种量接入相应的培养基，在32℃下振荡培养18 h后，将发酵液在8000 r/min下离心5 min，弃上清液，收集菌体，用生理盐水重悬后，将菌悬液稀释20倍备用。
在冷却至室温的灭菌米粒中按以下方案加入如前所述制备的红曲霉孢子液和黄曲霉LQ孢子液。实验组为红曲霉：黄曲霉LQ：生理盐水的体积比依次为1:1:1、3:1:1、5:1:1、7:1:1、9:1:1，依次标记为A、B、C、D、E，对照组为红曲霉单菌发酵。每组菌液的总加入量为2mL，发酵期间每24 h加无菌水搅拌一次，持续观察发酵情况。
在冷却至室温的灭菌米粒中按以下方案加入如前所述制备的菌液。实验组分别为红曲霉+黄曲霉LQ+X菌株（17个待筛菌株中的一种）这三种菌液各1mL，混匀后取2ml菌液接种在籼米上；对照组①为1mL红曲霉菌液+2 mL生理盐水，混匀后取2 mL菌液接种在籼米上；对照组②为1 mL黄曲霉LQ菌液+2 mL生理盐水，混匀后取2 mL菌液接种在籼米上；对照组③为1mL黄曲霉LQ菌液+1 mL红曲霉菌液+1 mL生理盐水，混匀后取2 mL菌液接种在籼米上；对照组④为1 mL红曲霉菌液+1 mL X菌株菌液+1 mL生理盐水，混匀后取2 mL菌液接种在籼米上。每隔24 h向米中加入无菌水并搅拌，持续观察籼米中各菌的生长情况。
结果筛选出红曲霉+黄曲霉LQ+Y5菌株这三种菌液各1mL，混匀后取2ml菌液接种在籼米上的效果最佳。并将Y5菌株进行分离培养，对其的效果经行验证。Y5即为本发明保藏的贝莱斯芽孢杆菌。
实施例2
本实施例记载了贝莱斯芽孢杆菌提高红曲米发酵过程抗污染能力的验证实验，具体方法如下：
称取30 g籼米，在100 mL pH为3.5的自来水中浸泡10 h，然后将水沥干至水加籼米的重量为43.5 g，之后将其装入250 mL的烧杯中，用六层纱布和报纸封口置于高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min，灭菌结束后用无菌玻璃棒搅开蒸熟的米粒，待其冷却至室温后，在粗放条件下（即不在无菌条件下）接种经两层纱布过滤的红曲霉发酵液2 mL，所述红曲霉发酵液的孢子数为1×104个/mL的红曲霉发酵液。用经过高压灭菌的玻璃棒搅拌均匀，在32℃下培养，每隔24 h加一次无菌水并搅拌，前2天加水量为2 mL，从第3天开始加水量为4mL，得到对照组红曲米。实验组为待灭菌米粒冷却至室温后，在粗放条件下（即不在无菌条件下）加入红曲霉孢子液，间隔1 d后加入贝莱斯芽孢杆菌菌液，所述贝莱斯芽孢杆菌菌液的菌液浊度（OD560）为0.13~0.20，用经过高压灭菌的玻璃棒搅拌均匀，在32 ℃下培养，每隔24 h加一次无菌水并搅拌，前2天加水量为2 mL，从第3天开始加水量为4 mL，得到实验组红曲米。持续观察各批次中实验组与对照组发酵过程中的染菌情况，共进行100个批次的红曲米发酵验证实验，计算染菌率。
结果显示，在100个批次粗放条件下的红曲米发酵过程中，红曲霉与贝莱斯芽孢杆菌的混菌实验组均未出现染菌情况，而红曲霉单菌发酵组有23个批次出现染菌，如图3所示，被污染的一批红曲霉单菌发酵组在发酵第３d米粒上即出现明显的白色菌丝（图3左），在发酵第6d米粒上出现明显的黄绿色霉菌孢子（图3右）。
实验表明，实施例1保藏的贝莱斯芽孢杆菌的加入能够有效抑制粗放条件下红曲米发酵过程中污染黄曲霉。因此，接种了实施例1保藏的贝莱斯芽孢杆菌的红曲米在大规模发酵生产中不需要严格的无菌操作，也能保证红曲米发酵的正常进行。由此可以证明，本发明保藏的贝莱斯芽孢杆菌可以抑制红曲米发酵过程中黄曲霉污染。
实施例3
本实施例提供一种提高红曲米色价和发酵稳定性的方法，具体步骤如下：
1、将活化的红曲霉孢子液接入红曲霉液体培养基中，置于32℃，150 r/min的条件下振荡培养5 d，经两层纱布过滤得到孢子数为1×104个/mL的红曲霉发酵液。
2、将本发明保藏的贝莱斯芽孢杆菌接入芽孢杆菌培养基中扩大培养，在32℃下振荡培养18 h后，将发酵液在8000 r/min下离心5 min，弃上清液，收集菌体，用生理盐水重悬后得到贝莱斯芽孢杆菌发酵液，此时，菌液浊度（OD560）为1.6。
3、将籼米在pH为3.5的酸性水中浸泡10 h，用盐酸调整pH，将籼米沥干，并置于高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min，灭菌结束后用无菌玻璃棒搅开蒸熟的米粒。
4、待煮熟的米粒冷却至室温后，加入2 mL所述红曲霉发酵液，用经过高压灭菌的玻璃棒搅拌均匀，在32±1℃的条件下培养6d后加入0.25mL所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液，发酵期间每隔24 h加一次无菌水并搅拌，发酵10d后得到高色价红曲米。
红曲霉培养基是指适宜红曲霉生长的培养基，本实施例中，红曲霉培养基的成分为(g/L)：葡萄糖60，蛋白胨20，可溶性淀粉30；同理，芽孢杆菌培养基是指适宜贝莱斯芽孢杆菌生长的培养基，本发明中，芽孢杆菌培养基的组成为(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏15，氯化钠15。
用不接种贝莱斯芽孢杆菌发酵液的红曲米做对照，结果显示，本实施例制备的红曲米色价为2815±24U/g，而对照组的红曲米色价为2280±16 U/g，有显著的提升。
实施例4
本实施例提供一种提高红曲米色价和发酵稳定性的方法，具体步骤如下：
1、将活化的红曲霉孢子液接入红曲霉液体培养基中，置于32±1℃，30 r/min的条件下振荡培养8 d，过滤得到孢子数为5.0×103个/mL的红曲霉发酵液。
2、将本发明保藏的贝莱斯芽孢杆菌接入芽孢杆菌培养基中扩大培养，在32±1℃的条件下振荡培养12h后，将发酵液在12000 r/min下离心6 min，弃上清液，收集菌体，用生理盐水重悬后，得到贝莱斯芽孢杆菌发酵液，此时，菌液浊度（OD560）为1.8。
3、将籼米在用盐酸调整的pH为4.0的酸性水中浸泡15h，将籼米沥干，并置于高压灭菌锅中121℃灭菌21 min，灭菌结束后用无菌玻璃棒搅开蒸熟的米粒。
4、待煮熟的米粒冷却至室温后，加入所述红曲霉发酵液，用经过高压灭菌的玻璃棒搅拌均匀，在32±1℃的条件下培养1d后加入所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液，其中，所述红曲霉发酵液：贝莱斯芽孢杆菌发酵液=10:1，红曲霉发酵液的添加量为按照发酵液与熟米粒的体积质量比10%（mL：g），发酵期间每隔20h加一次无菌水并搅拌，发酵8d后得到稳定的高色价红曲米。经过检测，本实施例制备的红曲米不仅色价高于单一红曲霉发酵的对照组。该混菌工艺下所制备的红曲米色价可达3389 U/g，是红曲霉单菌发酵的1.54倍。
实施例5
本实施例提供一种提高红曲米色价和发酵稳定性的方法，具体步骤如下：
1、将活化的红曲霉孢子液接入红曲霉液体培养基中，置于32±1℃， 300 r/min的条件下振荡培养4 d，过滤得到孢子数为3.5×104个/mL的红曲霉发酵液。
2、将本发明保藏的贝莱斯芽孢杆菌接入芽孢杆菌培养基中扩大培养，在32±1℃的条件下振荡培养24h后，将发酵液在4000r/min下离心2 min，弃上清液，收集菌体，用生理盐水重悬后，得到贝莱斯芽孢杆菌发酵液，此时，菌液浊度（OD560）为1.2。
3、将籼米在用盐酸调整的pH为3.0的酸性水中浸泡2h，，将籼米沥干，并置于高压灭菌锅中121℃灭菌25 min，灭菌结束后用无菌玻璃棒搅开蒸熟的米粒。
4、待煮熟的米粒冷却至室温后，加入所述红曲霉发酵液，用经过高压灭菌的玻璃棒搅拌均匀，在32±1℃的条件下培养7d后加入所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液，其中，所述红曲霉发酵液：贝莱斯芽孢杆菌发酵液=5:1，红曲霉发酵液的添加量为按照发酵液与熟米粒的体积质量比15%（mL：g），发酵期间每隔30 h加一次无菌水并搅拌，发酵12d后得到稳定的高色价红曲米。
Claims (7)
1.一种双功能贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No:M2021630。
2.一种权利要求1所述的双功能贝莱斯芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌用于抑制红曲米发酵过程中黄曲霉污染。
3.一种稳定的提高红曲米色价的方法，其特征在于：所述提高红曲米色价的方法包括将红曲霉发酵液接种到待发酵的红曲米中，在32±1℃的条件下发酵1～7d后接种贝莱斯芽孢杆菌发酵液，发酵8～12d后可以显著提高红曲米的色价，其中，所述红曲霉发酵液：贝莱斯芽孢杆菌发酵液＝5:1～10:1，所述贝莱斯芽孢杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No:M2021630。
4.根据权利要求3所述的提高红曲米色价的方法，其特征在于：所述红曲霉发酵液的制备方法为：将活化的红曲霉孢子液接入红曲霉液体培养基中，置于32±1℃，30～300r/min的条件下振荡培养1～7d，过滤得到孢子数为5.0×103～3.5×104个/mL的红曲霉发酵液。
5.根据权利要求3所述的提高红曲米色价的方法，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法为：将所述贝莱斯芽孢杆菌接入芽孢杆菌培养基中扩大培养，在32±1℃的条件下振荡培养12～24h后，将发酵液在4000～12000r/min下离心2～6min，弃上清液，收集菌体，用生理盐水重悬后得到贝莱斯芽孢杆菌发酵液，所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液的菌液浊度OD560为1.2～1.8。
6.根据权利要求3所述的提高红曲米色价的方法，其特征在于：所述待发酵的红曲米的制备过程为：将籼米在用盐酸调整的pH为3.0～4.0的酸性水中浸泡2～15h，，将籼米沥干，并置于高压灭菌锅中121℃灭菌20～25min，灭菌处理后得到待发酵的红曲米。
7.根据权利要求3所述的提高红曲米色价的方法，其特征在于：所述发酵期间每隔20～30h加一次无菌水并搅拌。
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