CN110029068A - 一种低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉基因工程菌株及应用 - Google Patents

一种低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉基因工程菌株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株，所述基因工程菌株的构建步骤如下：步骤1，构建异源表达vhb基因质粒；所述基因vhb序列片段由黑曲霉3‑磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA控制；步骤2，异源表达vhb基因菌株的获得，即得低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株。本发明基于黑曲霉产生有机酸的天然特性，通过遗传重组改造黑曲霉的生理特性，获得了一种黑曲霉基因工程菌株，经过实验证实，该黑曲霉基因工程菌株在低溶氧情况下生产有机酸的能力显著提升，为微生物发酵法制备有机酸提供了优良菌种。

Description

一种低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉基因工程菌株及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其是一种耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株及应用。
背景技术
黑曲霉作为重要的细胞工厂用于有机酸的发酵生产已有100多年的历史，不仅是GRAS(generally regarded safe)菌株，而且能够利用廉价的碳源。柠檬酸和L-苹果酸是当前在食品、医药等行业最为重要的两种有机酸。在所有有机酸的市场中，柠檬酸市场占有率70％以上，可用作调味剂，也可用作食用油的抗氧化剂。同时改善食品的感官性状，增强食欲和促进体内钙、磷物质的消化吸收。在医药行业，柠檬酸主要被用于输血或化验室血样抗凝时，用作体外抗凝药。由于L-苹果酸味道柔和、酸度大，且不损害口腔牙齿、不积累脂肪，成为一种低热量的国际食品界公认的安全性食品酸味剂，是目前世界食品行业中用量最大和发展前景较好的有机酸之一。在医药行业，L-苹果酸被用于治疗肝病、贫血、尿毒症等多种疾病。而且由于L-苹果酸在代谢上利于氨基酸的吸收，常被配入复合氨基酸注射液中。因此，国际市场上对L-苹果酸的需求量与日俱增。
透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin，VHb)，是透明颤菌在低氧环境中产生的一种可溶性蛋白，能够高效的吸附氧。由于透明颤菌是一种专性好氧的革兰氏阴性丝状菌，最早在河底沉积物以及牛粪中分离得到，当其处于这种缺氧环境中时，就会合成可溶性的血红蛋白VHb，机制有利于其适应低氧环境。Holmberg等首次将VHb蛋白基因vgb导入烟草细胞中，VHb基因大大提高了植物的氧代谢，使得烟草的生长发育变快，发芽开花的时间也提前了，并且烟叶中叶绿素液和尼古丁的含量也得到了提高。DeModena等发现产黄青霉菌在常规氧气条件下，头孢菌素C的总合成率显著降低，氧源供应减少会导致头孢菌素C前体青霉素N的积累，于是通过将VHb基因整合到产黄青霉菌中，通过提高氧气通量，提高内部氧气浓度，从而提高头孢菌素C的产量。在地中海拟分枝酸菌中，当培养到固定阶段时，地中好拟分枝酸菌黏度增高，大大降低溶氧水平，而此时开始二级代谢，需要更大的溶氧量，于是将vgb导入到地中海拟分枝酸菌中，可以更有效地吸收氧气，从而可以提高利福霉素的产量。在历年报道中，VHb基因的作用只在于提高氧传递能力，暂未有研究指出别的功能作用。
当前，黑曲霉发酵生产有机酸需要高转速及高通气量来维持足够溶氧，而低溶氧的情况对发酵产酸造成不可逆转的破坏。因此，构建一种异源表达vhb基因的黑曲霉基因工程菌株，能够有效解决发酵过程因低溶氧造成的破坏问题。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株及应用，本发明基于黑曲霉产生有机酸的天然特性，通过遗传重组改造黑曲霉的生理特性，获得了一种黑曲霉基因工程菌株，经过实验证实，该黑曲霉基因工程菌株在低溶氧情况下生产有机酸的能力显著提升，为微生物发酵法制备有机酸提供了优良菌种。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株，所述基因工程菌株的构建步骤如下：
步骤1，构建异源表达vhb基因质粒：首先由北京华大基因公司合成经过密码子优化的vhb基因序列片段，所述基因vhb序列片段的核苷酸序列为SEQ NO.1，长度为456bp。然后将该片段经过EcoR I和Kpn I双酶切回收克隆到载体pLH454，构建基因vhb异源表达质粒pLH577；所述基因vhb序列片段由黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA控制，所述启动子PgpdA序列为SEQ NO.2，长度为932bp；
步骤2，异源表达vhb基因菌株的获得：将所述质粒pLH577转化至黑曲霉宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得异源表达vhb基因菌株S743，即得低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株。
而且，所述载体pLH454的构建步骤如下：
分别以黑曲霉和构巢曲霉基因组为模板，经PCR扩增黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA和构巢曲霉色氨酸合成基因C终止子Ttrpc序列片段，将所述启动子、终止子序列片段克隆到载体pLH419，构建基因表达质粒pLH454；所述启动子PgpdA序列为SEQNO.2，长度为932bp；所述终止子Ttrpc序列为SEQ NO.3，长度为719bp。
而且，所述载体pLH419的构建步骤如下：
以pLH331质粒为模板，以包含多克隆位点序列的P1055、P1056为引物进行PCR扩增loxP-hph-loxP片段，然后将该片段经Xho I和HindIII双酶切后和经相同双酶切处理得到的不包含loxP-hph-loxP序列的pLH331质粒线性化片段用T4DNA酶连接，连接产物经转化于大肠杆菌JM109感受态细胞，最终得到质粒pLH419。
而且，所述黑曲霉宿主菌株为出发菌株S575。
如上所述的耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株在制备有机酸方面中的应用。
利用如上所述的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株发酵产生苹果酸的方法，具体步骤如下：
首先，将黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株接种在PDA培养平板上，在28℃培养6天直至产生分生孢子；
然后，将孢子粉接种至含有发酵培养基的250mL容量的摇瓶中，孢子的终浓度为2×106孢子/mL，在28℃，200rpm发酵7天，即得苹果酸；其中，所述发酵培养基的组成为：100g/L葡萄糖,80g/L CaCO3,6g/L蛋白胨,150mg/L KH2PO4,150mg/L K2HPO4,100mg/LMgSO·7H2O,100mg/L CaCl2·2H2O,5mg/L FeSO4·7H2O,5mg/LNaCl。
如上所述的低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株在制备柠檬酸方面中的应用。
利用如上所述的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株发酵产生柠檬酸的方法，具体步骤如下：
首先，将菌株接种在PDA培养平板上，在28℃培养6天直至产生分生孢子；
然后，将孢子粉接种至含有发酵培养基的250mL容量的摇瓶中，孢子的终浓度为2×106孢子/mL，在28℃，200rpm发酵7天，即得柠檬酸；
其中，所述发酵培养基的组成为：100g/L蔗糖,2.5g/LNH4NO3,1g/L MgSO·7H2O,1g/L KH2PO4,500mg/L酵母提取物。
本发明取得的优点和积极效果是：
1、本发明基于黑曲霉产生有机酸的天然特性，通过遗传重组改造黑曲霉的生理特性，获得了一种黑曲霉基因工程菌株，经过实验证实，该黑曲霉基因工程菌株在低溶氧情况下生产有机酸的能力显著提升，为微生物发酵法制备有机酸提供了优良菌种。经过7天低溶氧摇瓶发酵，可将100g/L的葡萄糖转化成115g/L L-苹果酸，苹果酸对葡萄糖的转化率达到1.54mol/mol。经过3天低溶氧摇瓶发酵，柠檬酸的产量可达到11.4g/L。为有机酸的工业化生产提供了优良的菌株。
2、本发明克服了现有技术中的不足，现有黑曲霉发酵生产有机酸的过程中需要维持足够高的溶氧，较低溶氧会对其发酵造成不可逆的破坏。本发明提供了一种低溶氧状态下高产有机酸的黑曲霉基因工程菌株，通过合成透明颤菌血红蛋白基因vhb(已对其进行黑曲霉密码子优化)，构建包含该基因的异源表达载体，转化到宿主菌株S575，经筛选获得低溶氧下高产苹果酸及柠檬酸的工程菌株S743。
3、本发明所用的宿主菌株是构建的能够高产L-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株S575，所述S575菌株是在基因组内整合了外源cre基因，该基因受Tet-on系统的调控表达，当以所述菌株S575为出发菌进行遗传改造，并以loxP-hph-loxP为筛选标记时，可通过强力霉素启动Tet-on系统表达Cre重组酶，实现对loxP-hph-loxP元件的重组，从而实现应用一个hph marker进行连续的基因过表达且实现最终目的工程菌株基因组内无外源抗性基因的残留。
附图说明
图1为本发明中构建的基因表达质粒pLH454图谱；
图2为本发明中对基因表达质粒pLH454双酶切验证图，其中M为DNA Marker，1为Xba I和SpeI双酶切验证质粒；
图3为本发明中构建的vhb异源表达质粒pLH577图谱；
图4为本发明中对vhb异源表达质粒pLH577双酶切验证图，其中M为DNA Marker，1为EcoR I和Kpn I双酶切验证质粒；
图5为本发明中异源表达vhb基因菌株S743的RT-PCR验证图，其中N为阴性对照S575，P为阳性对照，1为异源表达vhb基因菌株S743；
图6为本发明中各工程菌株分别在72h、120h、168h时的苹果酸产量图；其中S575为出发菌株，S743为异源表达vhb基因菌株；
图7为本发明中各工程菌株在第3天的柠檬酸产量图；其中S575为出发菌株，S743为异源表达vhb基因菌株；
图8为本发明中初步筛选获得的20个转化子，在低溶氧条件下进行苹果酸发酵培养基摇瓶发酵筛选的检测结果图；
图9为本发明中构建的基础质粒pLH419图谱；
图10为本发明中对基础质粒pLH419双酶切验证图,其中M为DNA Marker，1为Xho I和HindⅢ双酶切验证质粒。
具体实施方式
下面结合通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株，所述基因工程菌株的构建步骤如下：
步骤1，构建异源表达vhb基因质粒：首先由北京华大基因公司合成经过密码子优化的vhb基因序列片段，所述基因vhb序列片段的核苷酸序列为SEQ NO.1，长度为456bp。然后将该片段经过EcoR I和Kpn I双酶切回收克隆到载体pLH454，构建基因vhb异源表达质粒pLH577；
步骤2，异源表达vhb基因菌株的获得：将所述质粒pLH577转化至黑曲霉宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得异源表达vhb基因菌株S743，即得低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株。
较优地，所述载体pLH454的构建步骤如下：
分别以黑曲霉和构巢曲霉基因组为模板，经PCR扩增黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA和构巢曲霉色氨酸合成基因C终止子Ttrpc序列片段，将所述启动子、终止子序列片段克隆到载体pLH419，构建基因表达质粒pLH454；所述启动子PgpdA序列为SEQNO.2，长度为932bp；所述终止子Ttrpc序列为SEQ NO.3，长度为719bp。
较优地，所述载体pLH419的构建步骤如下：
以pLH331质粒为模板，P1055(包含多克隆位点序列)、P1056为引物进行PCR扩增loxP-hph-loxP片段，然后将该片段经Xho I和Hind III双酶切后和经相同双酶切处理得到的pLH331质粒线性化片段(不包含loxP-hph-loxP序列)用T4DNA酶连接，连接产物经转化于大肠杆菌JM109感受态细胞，最终得到质粒pLH419(pLH331已公开)。
较优地，所述黑曲霉宿主菌株为出发菌株S575。
如上所述的低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株在制备有机酸方面中的应用。
利用如上所述的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株发酵产生苹果酸的方法，具体步骤如下：
首先，将黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株接种在PDA培养平板上，在28℃培养6天直至产生分生孢子；
然后，将孢子粉接种至含有发酵培养基的250mL容量的摇瓶中，孢子的终浓度为2×106孢子/mL，在28℃，200rpm发酵7天，即得苹果酸；
其中，所述发酵培养基的组成为：100g/L葡萄糖,80g/L CaCO3,6g/L蛋白胨,150mg/L KH2PO4,150mg/L K2HPO4,100mg/L MgSO·7H2O,100mg/L CaCl2·2H2O,5mg/LFeSO4·7H2O,5mg/LNaCl。
如上所述的耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株在制备柠檬酸方面中的应用。
利用如上所述的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株发酵产生柠檬酸的方法，具体步骤如下：
首先，将菌株接种在PDA培养平板上，在28℃培养6天直至产生分生孢子；
然后，将孢子粉接种至含有发酵培养基的250mL容量的摇瓶中，孢子的终浓度为2×106孢子/mL，在28℃，200rpm发酵7天，得柠檬酸；
其中，所述发酵培养基的组成为：100g/L蔗糖,2.5g/LNH4NO3,1g/L MgSO·7H2O,1g/L KH2PO4,500mg/L酵母提取物。
具体地，所述耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株的构建步骤如下：
一、质粒的构建
基础质粒的构建：
步骤1，质粒pLH419(如图9所示)是由pLH331载体经改造而来，改造后的pLH419只含有一个多克隆位点。改造过程如下：以pLH331质粒.(pLH331已公开)为模板，P1055(包含多克隆位点序列)、P1056为引物进行PCR扩增loxP-hph-loxP片段，然后将该片段经Xho I和HindIII双酶切后与经相同双酶切处理得到的pLH331质粒线性化片段(不包含loxP-hph-loxP序列)使用T4DNA酶进行连接，连接产物经转化于大肠杆菌JM109感受态细胞，最终得到质粒pLH419.pLH419的双酶切验证如图10所示。为扩增loxP-hph-loxP片段，设计上游引物P1055和下游引物P1056(如表1所示).
步骤2，构建基因表达质粒：分别以黑曲霉和构巢曲霉基因组为模板，经PCR扩增黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA和构巢曲霉色氨酸合成基因C终止子Ttrpc序列(引物见表1)。然后应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将PgpdA启动子和Ttrpc终止子序列同时与经Xba I/Xho I双酶切线性化后的出发载体pLH419进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞获得质粒pLH454，pLH454的双酶切验证如图2所示。为扩增黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA和构巢曲霉色氨酸合成基因C终止子Ttrpc序列，设计上游引物PgpdA-F和下游引物PgpdA-R，及上游引物Ttrpc-F和下游引物Ttrpc-R(如表1所示)。
vhb表达质粒的构建：
vhb基因序列由北京华大基因公司合成并进行了黑曲霉密码子优化，经EcoR I和Kpn I双酶切回收后得到vhb基因序列片段，然后与同样内酶切处理的质粒片段pLH454进行连接，将连接产物转化于大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(如图4所示)，获得vhb表达质粒pLH577(如图3所示)。为扩增验证vhb基因序列，设计上游引物vhb-F和下游引物vhb-R(如表1所示)。
表1所用引物序列
所述基因vhb序列起始于起始密码子ATG，包含该基因编码序列和自身终止子，为序列表中的SEQ NO.1，长度为456bp。
其中，上述LB培养基组分为：
胰蛋白胨10.0g/L，酵母浸出物5.0g/L，NaCl 10.0g/L，pH调至7.0-7.2，固体培养基加1.5％(W/T)的琼脂粉。121℃灭菌20min。灭菌完毕冷却至60℃左右时加入卡那霉素至终浓度100μg/mL。
二、农杆菌介导黑曲霉转化及克隆筛选
本发明所述异源表达，是将相关基因整合到黑曲霉基因组进行表达。本发明所述表达基因的转化方法为农杆菌介导法。所述农杆菌为AGL-1菌株。本发明所述表达基因在农杆菌介导转化黑曲霉之前，需将所述表达质粒和敲除质粒首先电转化至农杆菌。所述电转条件是：Capacitnce:25uF，Voltage:2.5kV，Resistance:200Ω，Pulse：5msec，即电容：25uF，电压：2.5kV，电阻：200Ω，脉冲：5msec。
(1)异源表达vhb基因菌株的获得
将质粒pLH577电转至农杆菌，然后将含有质粒pLH577的农杆菌与黑曲霉宿主菌株S575在IM平板共培养进行农杆菌介导转化，共培养两天后将转化子转接于含有200μM头孢噻肟，100μg/mL氨苄青霉素，100μg/mL链霉素，250μg/mL潮霉素B的CM平板中进行筛选直至转化子长出菌丝，然后随机挑取20个转化子，在低溶氧条件下进行摇瓶发酵筛选，选取产量最高的转化子(如图8所示)进行hph marker诱导重组，获得潮霉素敏感的异源表达vhb基因菌株S743。
所述诱导重组方法为：将约300个转化子孢子均匀涂布与含有10μg/mL多西环素的MM平板中至长出克隆，然后随机挑取100个克隆同时转接至PDA平板和含有潮霉素的PDA平板中，在含潮霉素的PDA平板中不能生长而在PDA能正常生长的克隆即为hph marker诱导重组，表现为潮霉素敏感，该菌株即为vhb基因异源表达菌株S743。
将筛选获得vhb基因异源表达菌株S743进行苹果酸发酵培养基摇瓶发酵3天后，提取RNA，经过RT-PCR验证，vhb基因已成功表达(如图5所示)。
(2)上述PDA培养基组分为:马铃薯200g，切成小块，加1000mL水煮沸30min，用双层纱布滤成清液。然后加入20g葡萄糖完全溶解，加水定容至1L。固体培养基加琼脂20g。121℃，20min高压灭菌。
(3)上述IM培养基组分为:
15g琼脂，加水至905.7mL，121℃灭菌20min，微波加热待琼脂完全溶解后，加入：Kbuffer 0.8mL，MN buffer 20mL，1％CaCl2·2H2O 1mL，0.01％FeSO4 10mL，IM Traceelements 5mL，20％NH4NO3 2.5mL，50％甘油10mL，1M MES 40mL，20％葡萄糖5mL。
所述IM培养基中所需试剂的配制：
1)Kbuffer：将1.25M K2HPO4加入到1.25M KH2PO4使得pH为4.8。
(a)：1.25M KH2PO4：K2HPO4 17.01g，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。
(b)：1.25M K2HPO4：K2HPO4 21.77g，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。
2)MNbuffer：MgSO4·7H2O 3g，NaCl 1.5g，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。
3)1％CaCl2：CaCl2·2H2O 1g，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。
4)0.01％FeSO4：FeSO4·7H2O 0.01g，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。
5)IM Trace elements：ZnSO4·7H2O 10mg，CuSO4·5H2O 10mg，H3BO310mg，MnSO4·H2O 10mg，Na2MoO4·2H2O 10mg，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。
6)20％NH4NO3：加入NH4NO3 20g，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。
7)50％甘油：甘油50mL，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。
8)1M MES：MES 19.524g，加入去离子水定容至100mL，加入NaOH调节pH为5.5，过滤除菌。黑暗下保存一个月，或分装后与-20℃下保存。
9)20％葡萄糖：葡萄糖20g，加入ddH2O定容至100mL，115℃灭菌20min。
(4)上述CM培养基组分为:
20g琼脂，加水到897mL，121℃灭菌20min。微波加热待琼脂完全溶解后，加入：ASP+N 20mL，50％葡萄糖20mL，1M MgSO42mL，CM Trace elements 1mL，10％酪蛋白水解物10mL，10％酵母浸出物50mL。
所述CM培养基中所需试剂的配制：
1)ASP+N：KCl(350mM)2.61g，KH2PO4(550mM)7.48g，NaNO3(3.5M)29.75g，加入去离子水定容至100mL，pH 5.5(5M KOH)，121℃灭菌20min。
2)50％葡萄糖：葡萄糖50g，加入ddH2O定容至100mL，115℃灭菌20min。
3)1M MgSO4：MgSO4 24.648g，加入ddH2O定容至100mL，121℃灭菌20min。
4)CM Trace elements：ZnSO4·7H2O(76mM)2.1g，H3BO3(178mM)1.1g，MnCl2·4H2O(25mM)0.5g，FeSO4·7H2O(18mM)0.5g，CoCl2·6H2O(7.1mM)0.17g，CuSO4·5H2O(6.4mM)0.16g，Na2MoO4·2H2O(6.2mM)0.15g，EDTA(174mM)5.1g，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。
5)10％酪蛋白水解物：酪蛋白水解物10g，加入ddH2O定容至100mL，121℃灭菌20min。
6)10％酵母浸出物：酵母浸出物10g，加入ddH2O定容至100mL，121℃灭菌20min。
(5)上述MM培养基组分:Vogel's Salts 20mL，葡萄糖15g，琼脂15g，蒸馏水溶解并定容至1000mL。121℃灭菌20min。
所述MM培养基中所需试剂的配制：
1)Vogel's 50X salts：柠檬酸钠150g，KH2PO4250g，NH4NO3100gMgSO4·7H20 10g，CaCl2·2H20 5g。微量元素溶液5mL，生物素溶液2.5mL，蒸馏水溶解并定容至1000mL，加0.2mL氯仿作为防腐剂，室温下保存。
2)微量元素溶液：柠檬酸·H205.00g，ZnSO4·7H20 5.00g，Fe(NH4)2(SO4)2·6H201.00g，CuSO4·5H20 0.25g，MnSO4·H20 0.05g，H3BO3 0.05g，Na2MoO4·2H20 0.05g，蒸馏水溶解并定容至100mL，加1mL氯仿作为防腐剂，室温下保存。
3)生物素溶液：生物素5.0mg，蒸馏水溶解并定容至50mL，-20℃保存。
本发明低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株的相关应用检测：
异源表达vhb黑曲霉基因工程菌株发酵生产L-苹果酸及柠檬酸：
苹果酸样品制备：摇匀发酵悬液，取1mL发酵液加入等体积的2M HCl溶解有机酸钙沉淀及残留的CaCO3，离心后再稀释50倍，经0.22μm滤膜过滤后滤液用于HPLC检测。
柠檬酸样品制备：摇匀发酵液，取1mL发酵液离心取上清，稀释50倍，经0.22μm滤膜过滤后滤液用于HPLC检测。
苹果酸及柠檬酸的测定方法：Aminex HPX-87H柱(300mm×7.8mm)，UV检测器。流动相：5mM H2SO4。流速0.6mL/min，柱温65℃，波长210nm，进样体积为20μL。
分别将宿主菌株S575和获得的黑曲霉基因工程菌株S743的分生孢子接种于250mL容量的摇瓶中，在28℃，200rpm进行发酵测试。装液量分为两组：50mL和100mL，100mL的装液量溶氧相对较低从而模拟低氧环境发酵。经过7天苹果酸摇瓶发酵，50mL装液量中苹果酸产量无变化，而100mL装液量中出发菌S575苹果酸产量为99.2g/L，工程菌株S743苹果酸产量为115g/L(如图6所示)，提高15.9％。
同样的发酵测试条件，经过3天柠檬酸摇瓶发酵，50mL装液量中柠檬酸产量几乎无变化，而100mL装液量中出发菌S575柠檬酸产量为10.6g/L，工程菌株S743柠檬酸产量为12.4g/L(如图7所示)，提高17％。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
1.vhb基因密码子优化后的核苷酸序列
atgctggatcagcagaccatcaacatcatcaaggccaccgtccccgttttgaaagaacacggcgtcactatcaccaccaccttctacaagaacctgttcgccaagcatcctgaagtccgccctctgttcgatatgggtcgccaggagtccctggaacaacctaaggctctggccatgactgttttggctgctgcccagaacattgaaaacctgcccgccattctgcccgccgtcaagaaaatcgccgtcaagcactgtcaagctggtgttgctgctgcccactatcctatcgtcggccaagaactgctgggcgccattaaagaggtcctgggcgatgctgccaccgatgatattctggatgcctggggcaaagcttatggtgtcatcgccgatgtcttcatccaggtcgaggccgatttgtatgctcaggccgtcgaataaggtaccctgcagaa
2.黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA的核苷酸序列932bp
ggactaacattattccagcaccgggatcacgggccgaaagcggcaaggccgcgcactgcccctctttttgggtgaaagagctggcagtaactaaactgtactttctggagtgaataatactactactatgaaagaccgcgatgggccgatagtagtagttacttccattacatcatctcatccgcccggttcctcgcctccgcggcagtctacgggtaggatcgtagcaaaaacccgggggatagacccgtcgtcccgagctggagttccgtataacctaggtagaaggtatcaattgaacccgaacaactggcaaaacattctcgagatcgtaggagtgagtacccggcgtgatggagggggagcacgctcattggtccgtacggcagctgccgagggggagcaggagatccaaatatcgtgagtctcctgctttgcccggtgtatgaaaccggaaaggactgctggggaactggggagcggcgcaagccgggaatcccagctgacaattgacccatcctcatgccgtggcagagcttgaggtagcttttgccccgtctgtctccccggtgtgcgcattcgactgggcgcggcatctgtgcctcctccaggagcggaggacccagtagtaagtaggcctgacctggtcgttgcgtcagtccagaggttccctcccctaccctttttctacttcccctcccccgccgctcaacttttctttcccttttactttctctctctcttcctcttcatccatcctctcttcatcacttccctcttcccttcatccaattcatcttccaagtgagtcttcctccccatctgtccctccatctttcccatcatcatctcccttcccagctcctcccctcctctcgtctcctcacgaagcttgactaaccattaccccgccacatagacacatctaaaca。
3.色氨酸合成基因C终止子Ttrpc的核苷酸序列719bp
cttaacgttactgaaatcatcaaacagcttgacgaatctggatataagatcgttggtgtcgatgtcagctccggagttgagacaaatggtgttcaggatctcgataagatacgttcatttgtccaagcagcaaagagtgccttctagtgatttaatagctccatgtcaacaagaataaaacgcgttttcgggtttacctcttccagatacagctcatctgcaatgcattaatgcattgactgcaacctagtaacgccttncaggctccggcgaagagaagaatagcttagcagagctattttcattttcgggagacgagatcaagcagatcaacggtcgtcaagagacctacgagactgaggaatccgctcttggctccacgcgactatatatttgtctctaattgtactttgacatgctcctcttctttactctgatagcttgactatgaaaattccgtcaccagcncctgggttcgcaaagataattgcatgtttcttccttgaactctcaagcctacaggacacacattcatcgtaggtataaacctcgaaatcanttcctactaagatggtatacaatagtaaccatgcatggttgcctagtgaatgctccgtaacacccaatacgccggccgaaacttttttacaactctcctatgagtcgtttacccagaatgcacaggtacacttgtttagaggtaatccttctttctagac。
序列表
<110> 天津科技大学，南京师范大学
<120> 一种低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉基因工程菌株及应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 455
<212> DNA/RNA
<213> 基因vhb序列片段的核苷酸序列(Unknown)
<400> 1
atgctggatc agcagaccat caacatcatc aaggccaccg tccccgtttt gaaagaacac 60
ggcgtcacta tcaccaccac cttctacaag aacctgttcg ccaagcatcc tgaagtccgc 120
cctctgttcg atatgggtcg ccaggagtcc ctggaacaac ctaaggctct ggccatgact 180
gttttggctg ctgcccagaa cattgaaaac ctgcccgcca ttctgcccgc cgtcaagaaa 240
atcgccgtca agcactgtca agctggtgtt gctgctgccc actatcctat cgtcggccaa 300
gaactgctgg gcgccattaa agaggtcctg ggcgatgctg ccaccgatga tattctggat 360
gcctggggca aagcttatgg tgtcatcgcc gatgtcttca tccaggtcga ggccgatttg 420
tatgctcagg ccgtcgaata aggtaccctg cagaa 455
<210> 2
<211> 932
<212> DNA/RNA
<213> 启动子PgpdA序列(Unknown)
<400> 2
ggactaacat tattccagca ccgggatcac gggccgaaag cggcaaggcc gcgcactgcc 60
cctctttttg ggtgaaagag ctggcagtaa ctaaactgta ctttctggag tgaataatac 120
tactactatg aaagaccgcg atgggccgat agtagtagtt acttccatta catcatctca 180
tccgcccggt tcctcgcctc cgcggcagtc tacgggtagg atcgtagcaa aaacccgggg 240
gatagacccg tcgtcccgag ctggagttcc gtataaccta ggtagaaggt atcaattgaa 300
cccgaacaac tggcaaaaca ttctcgagat cgtaggagtg agtacccggc gtgatggagg 360
gggagcacgc tcattggtcc gtacggcagc tgccgagggg gagcaggaga tccaaatatc 420
gtgagtctcc tgctttgccc ggtgtatgaa accggaaagg actgctgggg aactggggag 480
cggcgcaagc cgggaatccc agctgacaat tgacccatcc tcatgccgtg gcagagcttg 540
aggtagcttt tgccccgtct gtctccccgg tgtgcgcatt cgactgggcg cggcatctgt 600
gcctcctcca ggagcggagg acccagtagt aagtaggcct gacctggtcg ttgcgtcagt 660
ccagaggttc cctcccctac cctttttcta cttcccctcc cccgccgctc aacttttctt 720
tcccttttac tttctctctc tcttcctctt catccatcct ctcttcatca cttccctctt 780
cccttcatcc aattcatctt ccaagtgagt cttcctcccc atctgtccct ccatctttcc 840
catcatcatc tcccttccca gctcctcccc tcctctcgtc tcctcacgaa gcttgactaa 900
ccattacccc gccacataga cacatctaaa ca 932
<210> 3
<211> 719
<212> DNA/RNA
<213> 终止子Ttrpc序列(Unknown)
<400> 3
cttaacgtta ctgaaatcat caaacagctt gacgaatctg gatataagat cgttggtgtc 60
gatgtcagct ccggagttga gacaaatggt gttcaggatc tcgataagat acgttcattt 120
gtccaagcag caaagagtgc cttctagtga tttaatagct ccatgtcaac aagaataaaa 180
cgcgttttcg ggtttacctc ttccagatac agctcatctg caatgcatta atgcattgac 240
tgcaacctag taacgccttn caggctccgg cgaagagaag aatagcttag cagagctatt 300
ttcattttcg ggagacgaga tcaagcagat caacggtcgt caagagacct acgagactga 360
ggaatccgct cttggctcca cgcgactata tatttgtctc taattgtact ttgacatgct 420
cctcttcttt actctgatag cttgactatg aaaattccgt caccagcncc tgggttcgca 480
aagataattg catgtttctt ccttgaactc tcaagcctac aggacacaca ttcatcgtag 540
gtataaacct cgaaatcant tcctactaag atggtataca atagtaacca tgcatggttg 600
cctagtgaat gctccgtaac acccaatacg ccggccgaaa cttttttaca actctcctat 660
gagtcgttta cccagaatgc acaggtacac ttgtttagag gtaatccttc tttctagac 719
<210> 4
<211> 50
<212> DNA/RNA
<213> 引物PgpdA-F(Unknown)
<400> 4
attattatgg agaaactcga gactagtgga ctaacattat tccagcaccg 50
<210> 5
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> 引物PgpdA-R(Unknown)
<400> 5
ccgagctcga attccattgt ttagatgtgt ctatgtggcg g 41
<210> 6
<211> 58
<212> DNA/RNA
<213> 引物Ttrpc-F(Unknown)
<400> 6
acaatggaat tcgagctcgg taccctgcag ggatccactt aacgttactg aaatcatc 58
<210> 7
<211> 60
<212> DNA/RNA
<213> 引物Ttrpc-R(Unknown)
<400> 7
gtagggcccc ccgggtctag aaagaaggat tacctctaaa caagtgtacc ctggatcagc 60
<210> 8
<211> 12
<212> DNA/RNA
<213> 引物vhb-F(Unknown)
<400> 8
agaccatcaa ca 12
<210> 9
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 引物vhb-R(Unknown)
<400> 9
taccttattc gacggcctga g 21
<210> 10
<211> 71
<212> DNA/RNA
<213> 引物P1055(Unknown)
<400> 10
ccgctcgaga ggcctagatc tgaattctct agacccgggg ggccctacgt atccataact 60
tcgtataatg t 71
<210> 11
<211> 71
<212> DNA/RNA
<213> 引物P1056(Unknown)
<400> 11
cccaagctta taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tattcgacgt taactggttc 60
ccggtcggca t 71

Claims (8)

1.一种耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株的构建步骤如下：
步骤1，构建异源表达vhb基因质粒：首先由北京华大基因公司合成经过密码子优化的vhb基因序列片段，所述基因vhb序列片段的核苷酸序列为SEQ NO.1，长度为456bp。然后将该片段经过EcoR I和Kpn I双酶切回收克隆到载体pLH454，构建基因vhb异源表达质粒pLH577；所述基因vhb序列片段由黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA控制，所述启动子PgpdA序列为SEQ NO.2，长度为932bp；
步骤2，异源表达vhb基因菌株的获得：将所述质粒pLH577转化至黑曲霉宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得异源表达vhb基因菌株S743，即得低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株。
2.根据权利要求1所述的耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株，其特征在于：所述载体pLH454的构建步骤如下：
分别以黑曲霉和构巢曲霉基因组为模板，经PCR扩增黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA和构巢曲霉色氨酸合成基因C终止子Ttrpc序列片段，将所述启动子、终止子序列片段克隆到载体pLH419，构建基因表达质粒pLH454；所述启动子PgpdA序列为SEQ NO.2，长度为932bp；所述终止子Ttrpc序列为SEQ NO.3，长度为719bp。
3.根据权利要求2所述的耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株，其特征在于：所述载体pLH419的构建步骤如下：
以pLH331质粒为模板，以包含多克隆位点序列的P1055、P1056为引物进行PCR扩增loxP-hph-loxP片段，然后将该片段经Xho I和HindIII双酶切后和经相同双酶切处理得到的不包含loxP-hph-loxP序列的pLH331质粒线性化片段用T4 DNA酶连接，连接产物经转化于大肠杆菌JM109感受态细胞，最终得到质粒pLH419。
4.根据权利要求1至3任一项所述的耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillusniger)基因工程菌株，其特征在于：所述黑曲霉宿主菌株为出发菌株S575。
5.如权利要求1至4任一项所述的耐低溶氧条件高产有机酸的黑曲霉(Aspergillusniger)基因工程菌株在制备有机酸方面中的应用。
6.利用如权利要求1至4任一项所述的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株发酵产生苹果酸的方法，其特征在于：具体步骤如下：
首先，将黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株接种在PDA培养平板上，在28℃培养6天直至产生分生孢子；
然后，将孢子粉接种至含有发酵培养基的250mL容量的摇瓶中，孢子的终浓度为2×106孢子/ml，在28℃，200rpm发酵7天，即得苹果酸；
其中，所述发酵培养基的组成为：100g/L葡萄糖,80g/L CaCO3,6g/L蛋白胨,150mg/LKH2PO4,150mg/L K2HPO4,100mg/L MgSO·7H2O,100mg/L CaCl2·2H2O,5mg/L FeSO4·7H2O,5mg/LNaCl。
7.如权利要求1至4任一项所述的低溶氧条件下高产有机酸的黑曲霉(Aspergillusniger)基因工程菌株在制备柠檬酸方面中的应用。
8.利用如权利要求1至4任一项所述的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株发酵产生柠檬酸的方法，其特征在于：具体步骤如下：
首先，将菌株接种在PDA培养平板上，在28℃培养6天直至产生分生孢子；
然后，将孢子粉接种至含有发酵培养基的250mL容量的摇瓶中，孢子的终浓度为2×106孢子/ml，在28℃，200rpm培养7天，即得柠檬酸；
其中，所述发酵培养基的组成为：100g/L蔗糖,2.5g/LNH4NO3,1g/L MgSO·7H2O,1g/LKH2PO4,500mg/L酵母提取物。
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