CN103436454B - 高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌株，所述基因工程菌株的宿主菌为黑曲霉（Aspergillus？niger），该基因工程菌株包含α-葡萄糖转苷酶基因表达盒。本发明基因工程菌不仅能高效表达α-葡萄糖转苷酶，而且调高了α-葡萄糖转苷酶的分泌效率。同时，α-葡萄糖转苷酶分泌到胞外，降低了对α-葡萄糖转苷酶提取纯化的成本，节约了工业用料，降低了生产成本，具有明显的社会效益。而且，菌株经发酵后获得的粗酶液的酶活力比出发菌株酶活力提高了4.0~12.1倍，为α-葡萄糖转苷酶在食品工业中的应用及工业化生产奠定了基础，也打破了α-葡萄糖转苷酶依赖于进口的瓶颈，具有巨大的经济效益和社会效益，具有广阔市场开发前景。<!--1-->

Description

高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌及其构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及基因工程菌株及其构建方法，尤其是一种高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌株及其构建方法。

背景技术

α-葡萄糖转苷酶（α-transglucosidase，EC2.4.1.24），又称α-葡萄糖苷酶、转移葡萄糖苷酶，它可以从低聚糖类底物的非还原性末端切开α-1，4糖苷键，释放出葡萄糖，或将游离出的葡萄糖残基转移到另一个糖类底物形成α-1，6糖苷键，从而得到非发酵性的功能低聚异麦芽糖（IMO）、糖脂或糖肽等。α-葡萄糖转苷酶是一种重要的工业用酶，在食品、饲料、化工、医药等领域显示了广阔的应用前景，特别是在IMO生产中的巨大应用潜力早已引起国内外食品工业界的重视。

目前，我国还没有规模化生产α-葡萄糖转苷酶的能力，工业上所用的α-葡萄糖转苷酶主要依赖于进口，价格昂贵。国内关于α-葡萄糖转苷酶的研究也主要集中于产α-葡萄糖转苷酶菌株的筛选、诱变及培养条件优化等方面，效果均不太理想，诱变株的稳定性较差，酶产量还是偏低，并且难以纯化。近几年来，随着基因工程技术的迅猛发展，构建和利用基因工程菌作为大规模生产α-葡萄糖转苷酶的宿主，进一步提高酶活及酶的产量，降低生产成本，成为研究该酶制剂的一种新途径，并在世界范围内得到越来越广泛的重视及应用。1997年，AkiraN等从黑曲霉工业菌株GN-3中克隆出α-葡萄糖转苷酶基因，并将该基因引入到Emericellanidulans中表达，表达量为0.96U/mg蛋白。1999年，GalichetA等从ThermococcushydrothermalisAL662菌株中，通过建立基因文库，克隆了α-葡萄糖转苷酶基因，将该基因克隆到Sulfolobussolfataricus突变株TCY70中，但其表达量较低。2001年，MartinoA等以硫磺矿硫化叶菌MT-4总DNA为模板，通过PCR将α-葡萄糖转苷酶基因克隆到E.coli中表达，其表达量达到87.5U/g湿菌体。2004年，苏艳利用大肠杆菌表达系统表达黑曲霉α-葡萄糖转苷酶基因，经IPTG诱导，酶活高达226.8U/mL。2008年，杨捷琳等从阪崎肠杆菌中克隆α-葡萄糖苷酶基因，重组到pET22b（+）质粒在大肠杆菌中进行表达及活性研究，目标蛋白量约占菌体总蛋白量的18%。2009年，童星等以毕赤酵母KM71为宿主菌表达黑曲霉SG136α-葡萄糖转苷酶基因，并对表达产物的转苷活性进行测定，制备的粗酶液在最适pH和温度下反应24h时，低聚异麦芽糖的总含量达到最大为26.0%。

我国关于α-葡萄糖转苷酶的研究起步较晚，为了改变依赖于进口这一现状，寻求一条国产化的道路，本发明利用基因工程技术构建基因工程菌株，进一步提高酶的产量及活性，为其工业化生产奠定基础。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种增加了α-葡萄糖转苷酶基因的拷贝数，有效提高了酶的表达量，为其工业化生产奠定了基础的高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌及其构建方法，该构建方法易于操作、方法简单，而且可以构建含有不同基因拷贝数和在基因组位置不同的工程菌。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌株，所述基因工程菌株的宿主菌为黑曲霉（Aspergillusniger），该基因工程菌株包含α-葡萄糖转苷酶基因表达盒。

而且，所述α-葡萄糖转苷酶基因表达盒中的α-葡萄糖转苷酶基因的来源为黑曲霉。

而且，所述α-葡萄糖转苷酶基因表达盒中含有糖化酶启动子、糖化酶信号肽、α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因和色氨酸终止子。

而且，所述α-葡萄糖转苷酶基因表达盒中的α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因的N-末端融合了糖化酶信号肽。

如上所述的高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌的构建方法，步骤如下：

⑴根据GenBank中已报道的糖化酶启动子序列为依据，设计引物，以黑曲霉基因组DNA为模板扩增糖化酶启动子序列；

⑵根据GenBank中已报道的α-葡萄糖转苷酶mRNA序列、糖化酶信号肽序列为依据，设计引物，以黑曲霉总RNA为模板，利用RT-PCR扩增得到含有糖化酶信号肽的α-葡萄糖转苷酶的成熟肽基因；

⑶根据GenBank中已报道的色氨酸终止子序列为依据，设计引物，以质粒pBI-hph为模板扩增得到色氨酸终止子序列；

⑷将步骤⑴中糖化酶启动子序列、步骤⑵中α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因和步骤⑶中色氨酸终止子序列经酶切后依次与载体pT-Z连接，构建完整的α-葡萄糖转苷酶基因表达盒，随后将其插入到pBI-hph的HindIII和XbaI位点之间，鉴定正确后，获得双元载体为pBI-Glu；

⑸双元载体pBI-Glu转化到农杆菌LBA4404中，利用农杆菌阳性克隆子对黑曲霉进行介导转化，构建基因工程菌，黑曲霉转化子经鉴定正确后，测定黑曲霉转化子的产α-葡萄糖转苷酶的活力，筛选产酶活力比出发菌株活力提高了4.0~12.1倍的菌株即得高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌。

而且，所述步骤⑷的具体步骤为：

糖化酶启动子序列的PCR产物经KpnI与NcoI酶切后，切胶回收该启动子片段，插入经连接酶连接pUCm-T质粒后形成的闭合环状的pT-Z质粒的KpnI与NcoI位点之间，获得重组质粒pT-P；

PCR扩增的色氨酸终止子序列电泳回收后，用XbaI与BgIII进行酶切回收并连接到同样酶切的pT-P质粒的相应位点上，获得重组质粒pT-P-C；

把连接到T载体上含有糖化酶信号肽的α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因利用BgIII与NcoI酶切并电泳回收后，插入到pT-P-C质粒的BgIII与NcoI位点之间，获得重组质粒pT-P-α-C；

质粒pT-P-α-C经HindIII/XbaI双酶切，获得α-葡萄糖转苷酶基因表达盒，将该基因片段插入质粒pBI-hph的HindIII和XbaI位点之间，构建双元载体pBI-Glu。

而且，所述高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌经发酵所测粗酶液酶活力比出发菌株酶活力提高了12.1倍。

本发明的优点和积极效果如下：

1、本发明基因工程菌不仅能高效表达α-葡萄糖转苷酶，而且提高了α-葡萄糖转苷酶的分泌效率。同时，α-葡萄糖转苷酶分泌到胞外，降低了对α-葡萄糖转苷酶提取纯化的成本，节约了工业用料，降低了生产成本，具有明显的社会效益。而且，菌株经发酵后获得的粗酶液的酶活力比出发菌株酶活力提高了4.0~12.1倍，为α-葡萄糖转苷酶在食品工业中的应用及工业化生产奠定了基础，也打破了α-葡萄糖转苷酶依赖于进口的瓶颈，具有巨大的经济效益和社会效益，具有广阔市场开发前景。

2、本发明方法首次利用基因工程技术，将糖化酶的信号肽融合到α-葡萄糖转苷酶成熟肽的N-末-端，构建了高效分泌表达α-葡萄糖转苷酶的黑曲霉基因工程菌；该方法采用根瘤农杆菌介导的转化方法将α-葡萄糖转苷酶基因表达盒插入到黑曲霉基因组中，不仅转化方法简单，易于操作，而且可以构建含有不同基因拷贝数和在基因组位置不同的工程菌，证明了插入位点（即在黑曲霉基因组中的位置）和基因拷贝数是影响α-葡萄糖转苷酶高效表达的原因之一，为进一步构建高产的α-葡萄糖转苷酶工程菌奠定了理论基础。

附图说明

图1为本发明的扩增电泳图，其中：A为糖化酶启动子序列PCR扩增结果图，其中，M：1kbDNAMarker，1：PCR获得的糖化酶启动子序列；B为α-葡萄糖转苷酶基因PCR扩增结果图，其中，M：1kbDNAMarker，1：PCR获得的α-葡萄糖转苷酶基因；C为色氨酸终止子序列PCR扩增结果图，其中，M：1kbDNAMarker，1：PCR获得的色氨酸终止子序列；

图2为本发明双元载体pBI-Glu的结构图；

图3为本发明双元载体pBI-Glu的酶切验证图，其中，M：1.5kbDNAladder；1：pBI-Glu/HindIII酶切产物；2：pBI-Glu/XbaI酶切产物；3：pBI-Glu/HindIII+XbaI酶切产物；4：pT-P-α-C/HindIII+XbaI酶切回收产物；5：pBI-hph/HindIII+XbaI酶切回收产物；

图4为本发明黑曲霉基因工程菌PCR验证图，其中，M：1kbDNAladder；1：野生型菌株PCR结果；2-14：转化子PCR结果；

图5为黑曲霉工程菌的产α-葡萄糖转苷酶的活力，其中，A：黑曲霉野生型菌株，A-1——A-13：黑曲霉转化子；

图6为本发明黑曲霉基因工程菌Southernblot鉴定图，其中，A-1--A-13：转化子杂交结果；A：野生型菌株杂交结果。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明的主要思想为：α-葡萄糖转苷酶基因克隆出来放到其他宿主菌株进行异源表达，因为糖基化的关系，转苷酶的性质会发生改变，影响IMO的转化率，同时异源表达还存在密码子偏爱性问题，只有把它导入自身的宿主菌种，在原菌株中进行同源表达，才能既提高其产量，又不改变其性质。黑曲霉（Aspergillusniger）作为α-葡萄糖转苷酶生产菌株，不仅是优良的表达系统，还是食品级安全生产菌，具有很强的蛋白分泌能力。因此，通过基因工程的方法构建黑曲霉的高产α-葡萄糖转苷酶工程菌在学术和应用上都具有重要的价值和意义。

本发明以大量生产α-葡萄糖转苷酶为目的，利用基因工程技术构建重组菌株，实现α-葡萄糖转苷酶的大量分泌表达。本发明所用的α-葡萄糖转苷酶基因来源是黑曲霉，本发明中的宿主细胞也为黑曲霉。

本发明将糖化酶启动子、融合有糖化酶信号肽的α-葡萄糖转苷酶基因和色氨酸终止子构建成分泌表达α-葡萄糖转苷酶基因的表达盒并将其插入到质粒pBI-hph中构建双元载体pBI-Glu，以农杆菌介导转化的方法转化黑曲霉菌株，构建高产α-葡萄糖转苷酶的生产菌株，并能有效分泌表达α-葡萄糖转苷酶。

一种高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌株，所述基因工程菌株的宿主菌为黑曲霉（Aspergillusniger），该基因工程菌株包含α-葡萄糖转苷酶基因表达盒，所述α-葡萄糖转苷酶基因表达盒中含有糖化酶启动子序列、α-葡萄糖转苷酶基因和色氨酸终止子序列，所述α-葡萄糖转苷酶基因表达盒中的α-葡萄糖转苷酶基因的来源为黑曲霉，该α-葡萄糖转苷酶基因表达盒中的α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因前引入了糖化酶信号肽序列。

一种高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌的构建方法，步骤如下：

1、糖化酶启动子序列的扩增

根据GenBank中已报道的糖化酶启动子序列为依据，设计引物，以黑曲霉基因组DNA为模板对糖化酶启动子序列进行扩增：

上游引物PgF：

5’-GGGGGTACCAAGCTTGGATCCGAACTCCAACCGGGG-3’，酶切位点为HindIII和KpnI；

下游引物PgR：5’-CCGGCCATGGCTGAGGTGTAATGATGCTGGGG-3’，酶切位点为NcoI。

以提取黑曲霉基因组为模板，以上下游引物进行PCR扩增，反应体系和扩增条件如下：

PCR扩增体系（20μL）：

PCR反应条件：

PCR结果如图1（A）所示，可以看到在约820bp处出现一条特异性条带，其大小与目的基因大小完全吻合，提交测序可知扩增得到糖化酶启动子的DNA序列如序列3。本方法所得到的糖化酶启动子序列与已报道的该启动子序列同源性达98%，且该片段含有高等真核生物基因启动子共有序列CAAT框及TATA框。

2、α-葡萄糖转苷酶基因的扩增

根据NCBI上报道的糖化酶信号肽基因序列、α-葡萄糖转苷酶基因mRNA序列设计引物TGF1、TGF2、TGR，以黑曲霉总RNA合成的cDNA为模板对α-葡萄糖转苷酶基因进行扩增：

上游引物TGF1：5’-CTGAGCGGCCTCGTCTGCACAGGGTTGGCATCCACCACTGCCCCTTCGCA，-5’加粗部分为糖化酶信号肽部分基因序列；

上游引物TGF2：5’-TTAACCATGGCGTTCCGATCTCTACTCGCCCTGA

GCGGCCTCGTCTGCACAGG-3’，酶切位点为NcoI，加粗部分为糖化酶信号肽部分基因序列；

下游引物TGR：5’-GAAGATCTCTACCATTCCAATACCCAGTTTTC-3’酶切位点为BgIII。

提取黑曲霉总RNA，以olig(dT)为引物，合成cDNA。再以合成的cDNA为模板，TGF1与TGR为引物扩增含有部分糖化酶信号肽的α-葡萄糖转苷酶基因。PCR反应体系和条件如下：

PCR扩增体系（20μL）：

PCR反应条件：

然后以上述的PCR产物为模板，TGF2与TGR为引物扩增含有完整糖化酶信号肽的α-葡萄糖转苷酶基因，PCR反应体系和条件如下：

PCR扩增体系（20μL）：

PCR反应条件：

PCR结果如图1（B）所示，可以看到在约3.0kb处出现一条特异性条带，其大小与目的基因大小完全吻合，提交测序可知扩增得到α-葡萄糖转苷酶基因的DNA序列如序列9。本方法所得到并表达的α-葡萄糖转苷酶基因与已报道的该酶基因同源性达99.8%，α-葡萄糖转苷酶基因成熟肽2883bp，编码960氨基酸；糖化酶的信号肽54bp，编码18个氨基酸，从糖化酶信号肽至α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因为一个完整的开放阅读框。

3、色氨酸终止子序列的扩增

根据NCBI上报道的色氨酸终止子（TrpC）序列设计引物TrF（5’-GAAGATCTGGGCCCATGTCAACAAGAATA-3’酶切位点为BgIII）、TrR（TrR：5’-GGGTCTAGAAAGAAGGATTACCTCTAAACAAGTG-3’酶切位点为XbaI），以质粒pBI-hph（将pAN7-1上的hph片段用XbaI和EocRI酶切出来并连接到pBI121的相应酶切位点而获得）为模板扩增出色氨酸终止子序列。PCR反应体系和条件如下：

PCR扩增体系（20μL）：

PCR反应条件：

PCR结果如图1（C）所示，可以看到在约570bp处出现一条特异性条带，其大小与目的基因大小完全吻合，提交测序可知扩增得到的色氨酸终止子序列与已报道的该终止子序列同源性达99.2%。

4、双元载体pBI-Glu的构建

糖化酶启动子序列的PCR产物经KpnI与NcoI酶切后，切胶回收该基因片段，插入经连接酶连接pUCm-T质粒后形成的闭合环状的pT-Z质粒的KpnI与NcoI位点之间，获得重组质粒pT-P。

PCR扩增的色氨酸终止子序列电泳回收后，用XbaI与BgIII进行酶切回收并连接到同样酶切的pT-P质粒的相应位点上，获得重组质粒pT-P-C。

把前面鉴定正确的含有糖化酶信号肽和α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因序列的PCR片段利用BgIII与NcoI酶切并电泳回收后，插入到pT-P-C质粒的BgIII与NcoI位点之间，获得重组质粒pT-P-α-C。

质粒pT-P-α-C经HindIII/XbaI双酶切获得α-葡萄糖转苷酶基因表达盒，将该基因片段插入质粒pBI-hph的HindIII和XbaI位点之间，构建双元载体pBI-Glu。

重组质粒的构建流程见图2，酶切验证结果见图3。结果表明：通过一系列的酶切连接反应，成功地构建出双元载体pBI-Glu。

5、基因工程菌株的构建

⑴农杆菌介导黑曲霉转化

将鉴定正确的双元载体pBI-Glu转化农杆菌LBA4404。挑起阳性农杆菌单菌落接到5mLYEB液体培养基中（含Rif（利福平）50μg/mL，Kan（卡那霉素）50μg/mL，Str（链霉素）20μg/mL），180r/min，28℃培养20~24h后，将培养液5000r/min离心10min收集菌体，沉淀用1mLIM液体培养基（含AS（乙酰丁香酮））重悬。将重悬液以2%（V/V，体积百分数）的接种量接入到50mLIM（含200μmol/L的AS）液体培养基中，使其初始浓度约为OD₆₀₀=0.15，28℃，180r/min继续培养至OD₆₀₀等于0.8，备用。

将黑曲霉接种于PDA斜面培养基，28℃恒温培养3~5d，待孢子成熟后，用无菌水洗下分生孢子，血球计数板计数，再用无菌水调节孢子悬液至浓度为10⁷个/mL。

取100μL新鲜的黑曲霉孢子悬液（10⁷个/mL）与等体积浓度为OD₆₀₀=0.8的农杆菌菌液混匀，涂布在IM培养基（pH5.8，含AS200μmol/L）表面的滤纸上，24℃下避光共培养2d。然后将滤纸反向贴于PDA（含潮霉素B100μg/mL，头孢霉素20μg/mL）筛选培养基上28℃培养3-5d，即有转化子长出。转化子转接于含有相同浓度潮霉素筛选培养基上保存。

⑵黑曲霉转化子的PCR鉴定

提取转化子黑曲霉基因组DNA，使用引物PgF与TrR进行PCR扩增α-葡萄糖转苷酶基因表达盒，DNA模板为随机选取的转化子基因组DNA，并以出发菌株黑曲霉的基因组DNA作为对照。PCR反应体系和条件如下：

PCR扩增体系（20μL）：

PCR反应条件：

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4，表明表达盒插入黑曲霉基因组中，工程菌构建成功。

⑶黑曲霉转化子稳定性分析

从筛选平板上随机挑选PCR验证正确的转化子至不含潮霉素抗性的PDA培养基上传代培养，培养10代后（3~5d一代），重新转接到含有潮霉素B的PDA培养基中观测其生长状况，并提取菌体基因组进行PCR鉴定，以此来检测转化子抗性的稳定性，结果与图4一致，表明工程菌是稳定的。

6、高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌的筛选

将筛选得到的具有遗传稳定性的黑曲霉转化子接种到PDA斜面培养至孢子萌发，用无菌水冲洗斜面制得孢子悬浮液（107个/mL），取500μL孢子悬液接种到装有50mL发酵培养基（麸皮30g，可溶性淀粉30g。麸皮煮沸30min后纱布过滤。待冷却后加入可溶性淀粉，煮沸溶解后加水补足1L。）的250mL三角瓶中，于28℃，180r/min振荡培养3d。

分别提取转化子与野生型菌株的发酵粗酶液，利用国标法检测各菌株α-葡萄糖转苷酶产量情况，将筛选得到的酶产量明显提高的转化子进行二次筛选，最终从203株转化子中获得了13株α-葡萄糖转苷酶产量提高的菌株，分别命名为A-1——A-13。如图5所示，在这13株菌株中，A-8的产酶活力最高，可达25.02U/mL，约为野生型菌株的12.1倍；其余从A到A-13的产酶活力分别为2.06U/mL、12.26U/mL、11.82U/mL、17.51U/mL、20.81U/mL、9.12U/mL、11.75U/mL、14.99U/mL、11.09U/mL、21.89U/mL、8.26U/mL、10.01U/mL和15.98U/mL。

7、黑曲霉工程菌的Southernblot鉴定

提取黑曲霉出发菌株及工程菌A-1——A-13基因组DNA，分别用HindIII酶切后转移到尼龙膜（Hybond-N+）上，利用来自pBI-Glu质粒长度为4.4kb的α-葡萄糖转苷酶基因表达盒的完整基因片段为探针，按照DIGhighprimeDNAlabelinganddetectionstarterkitI（Roche公司）说明书进行核酸Southernblot杂交，结果如图6，说明工程菌不仅是稳定的，而且α-葡萄糖转苷酶基因表达盒在黑曲霉基因组中位置和拷贝数也是不一致的。其中A-8为双拷贝插入，其余均为单拷贝插入；A-1,A-2,A-6和A-9的插入位点基本相似，其余各转化子中基因的插入位点均不相同。

由上述酶活测定与Southernblot杂交的实验结果分析可知，含有双拷贝插入的转化子A-8具有最高的酶活（25.02U/mL）；A-1,A-2,A-6和A-9具有相近的插入位点，其酶活也相差不大；其余各转化子的的插入位点和酶活均有较大差异。因此，可以推断出T-DNA区域的随机插入及插入基因的拷贝数对转苷酶基因的表达产生了一定影响。

序列3：糖化酶启动子序列：

GGTACCAAGCTTGGATCCGAACTCCAACCGGGGGGAGTACATTGAGTGGCCGCAGTGGAA60

GGAATCGCGGCAGTTGATGAATTTCGGAGCGAACGACGCCAGTCTCCTTACGGATGATTT120

CCGCAACGGGACATATGAGTTCATCCTGCAGAATACCGCGGCGTTCCACATCTGATGCCA180

TTGGCGGAGGGGTCCGGACGGTCAGGAACTTAGCCTTATGAGATGAATGATGGACGTGTC240

TGGCCTCGGAAAAGGATATATGGGGATCATGATAGTACTAGCCATATTAATGAAGGGCAT300

ATACCACGCGTTGGACCTGCGTTATAGCTTCCCGTTAGTTATAGTACCATCGTTATACCA360

GCCAATCAAGTCACCACGCACGACCGGGGACGGCGAATCCCCGGGAATTGAAAGAAATTG420

CATCCCAGGCCAGTGAGGCCAGCGATTGGCCACCTCTCCAAGGCACAGGGCCATTCTGCA480

GCGCTGGTGGATTCATCGCAATTTCCCCCGGCCCGGCCCGACACCGCTATAGGCTGGTTC540

TCCCACACCATCGGAGATTCGTCGCCTAATGTCTCGTCCGTTCACAAGCTGAAGAGCTTG600

AAGTGGCGAGATGTCTCTGCAGGAATTCAAGCTAGATGCTAAGCGATATTGCATGGCAAT660

ATGTGTTGATGCATGTGCTTCTTCCTTCAGCTTCCCCTCGTGCAGATGAGGTTTGGCTAT720

AAATTGAAGTGGTTGGTCGGGGTTCCGTGAGGGGCTGAAGTGCTTCCTCCCTTTTAGACG780

CAACTGAGAGCCTGAGCTTCATCCCCAGCATCATTACACCTCAGCCATGG830

序列9：α-葡萄糖转苷酶基因：

CCATGGCGTTCCGATCTCTACTCGCCCTGAGCGGCCTCGTCTGCACAGGGTTGGCAGTGG60

TGAAGTTGACGCATCTCCTTGCCAGAGCATGGCTTGTCCCTCTGGCTTATGGAGCGAGCC120

AGTCACTCTTATCCACCACTGCCCCTTCGCAGCCGCAGTTTACCATTCCTGCTTCCGCAG180

ATGTCGGTGCGCAGCTGATTGCCAACATCGATGATCCTCAGGCTGCCGACGCGCAGTCGG240

TTTGTCCGGGCTACAAGGCTTCAAAAGTGCAGCACAATTCACGTGGATTCACTGCCAGTC300

TTCAGCTCGCGGGCAGGCCATGTAACGTATACGGCACAGATGTTGAGTCCTTGACACTGT360

CTGTGGAGTACCAGGATTCGGATCGACTGAATATTCAGATTCTCCCCACTCATGTTGACT420

CCACAAACGCTTCTTGGTACTTTCTTTCGGAAAACCTGGTCTCCAGACCCAAGGCTTCCC480

TCAATGCATCTGTATCCCAGAGCGACCTTTTTGTGTCATGGTCAAATGAGCCGTCGTTCA540

ATTTCAAGGTGATCCGAAAGGCTACAGGCGACGCGCTTTTCAGTACAGAAGGCACTGTGC600

TCGTATATGAGAATCAGTTCATCGAGTTTGTGACCGCGCTCCCTGAAGAATATAACTTGT660

ATGGCCTTGGGGAGCATATCACGCAATTCCGCCTCCAGAGAAATGCTAATCTGACCATAT720

ATCCTTCGGATGATGGAACACCTATTGACCAAAACCTCTACGGCCAACATCCCTTCTATC780

TGGATACAAGATATTACAAAGGAGATAGGCAGAATGGGTCTTATATTCCCGTCAAAAGCA840

GCGAGGCTGATGCCTCGCAAGATTATGTCTCCCTCTCTCATGGCGTGTTTCTGAGGAACT900

CTCATGGACTTGAGATACTCCTCCGGTCCCAAAAATTGATCTGGCGGACCCTAGGTGGAG960

GAATCGATCTCACCTTCTACTCAGGCCCCGCCCCGGCCGATGTTACCAGGCAATATCTTA1020

CCAGCACTGTGGGATTACCGGCCATGCAGCAATACAACACTCTTGGATTCCACCAATGTC1080

GTTGGGGCTACAACAACTGGTCGGATCTGGCGGACGTTGTTGCGAACTTTGAGAAGTTTG1140

AGATCCCGTTGGAATATATCTGGACCGATATTGACTACATGCACGGATATCGCAACTTTG1200

ACAACGATCAACATCGCTTTTCCTACAGTGAGGGCGATGAATTTCTCAGCAAGCTACATG1260

AGAGTGGACGCTACTATGTACCCATTGTTGATGCGGCGCTCTACATTCCTAATCCCGAAA1320

ATGCCTCTGATGCATACGCTACGTATGACAGAGGAGCTGCGGACGACGTCTTCCTCAAGA1380

ATCCCGATGGTAGCCTCTATATTGGAGCCGTTTGGCCAGGATATACAGTCTTCCCCGATT1440

GGCATCATCCCAAGGCAGTTGACTTCTGGGCTAACGAGCTTGTTATCTGGTCGAAGAAAG1500

TGGCGTTCGATGGTGTGTGGTACGACATGTCTGAAGTTTCATCCTTCTGTGTCGGGAGCT1560

GTGGCACAGGTAACCTGACTCTGAACCCGGTACACCCATCGTTTCTTCTCCCCGGTGAGC1620

CTGGTGATATCATATATGATTACCCAGAGGCTTTCAATATCACCAACGCTACAGAGGCGG1680

CGTCAGCTTCGGCGGGAGCTTCCAGTCAGGCTGCAGCAACCGCGACCACCACGTCGACTT1740

CGGTATCATATCTGCGGACAACGCCCACGCCTGGTGTCCGCAATGTTGAGCACCCACCCT1800

ATGTGATCAACCATGACCAAGAAGGCCATGATCTCAGTGTCCATGCGGTGTCGCCGAATG1860

CAACGCATGTTGATGGTGTTGAGGAGTATGATGTGCACGGTCTCTACGGACATCAAGGAT1920

TGAACGCTACCTACCAAGGTATGCTTGAGGTCTGGTCTCATAAGCGGCGGCCATTTATTA1980

TTGGCCGCTCAACCTTCGCTGGCTCTGGCAAATGGGCAGGCCACTGGGGCGGCGACAACT2040

ATTCCAAATGGTGGTCCATGTACTACTCCATCTCGCAAGCCCTCTCCTTCTCACTTTTCG2100

GCATTCCGATGTTTGGTGCGGACACCTGTGGGTTTAACGGAAACTCCGATGAGGAGCTCT2160

GCAACCGATGGATGCAACTGTCCGCATTCTTCCCATTCTACCGAAACCACAATGAGCTCT2220

CCGCAATCCCACAGGAGCCTTATCGGTGGGCTTCTGTTATTGAAGCAACCAAGTCCGCCA2280

TGAGAATTCGGTACGCCATCCTACCTTACTTTTATACGTTGTTTGACCTGGCCCACACCA2340

CGGGCTCCACTGTAATGCGCGCACTTTCCTGGGAATTCCCTAATGACCCAACATTGGCTG2400

CGGTTGAGACTCAATTCATGGTTGGGCCGGCCATCATGGTGGTCCCGGTATTGGAGCCTC2460

TGGTCAATACGGTCAAGGGCGTATTCCCAGGAGTTGGACATGGCGAAGTGTGGTACGATT2520

GGTACACCCAGGCTGCAGTTGATGCGAAGCCCGGGGTCAACACGACCATTTCGGCACCAT2580

TGGGCCACATCCCAGTTTATGTACGAGGTGGAAACATCTTGCCGATGCAAGAGCCGGCAT2640

TGACCACTCGTGAAGCCCGGCAAACCCCGTGGGCTTTGCTAGCTGCACTAGGAAGCAATG2700

GAACCGCGTCGGGGCAGCTCTATCTCGATGATGGAGAGAGCATCTACCCCAATGCCACCC2760

TCCATGTGGACTTCACGGCATCGCGGTCAAGCCTGCGCTCGTCGGCTCAAGGAAGATGGA2820

AAGAGAGGAACCCGCTTGCTAATGTGACGGTGCTCGGAGTGAACAAGGAGCCCTCTGCGG2880

TGACCCTGAATGGACAGGCCGTATTTCCCGGGTCTGTCACGTACAATTCTACGTCCCAGG2940

TTCTCTTTGTTGGGGGGCTGCAAAACTTGACGAAGGGCGGCGCATGGGCGGAAAACTGGG3000

TATTGGAATGGTAGAGATCT3020

Claims (4)

1.一种高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株的宿主菌为黑曲霉(Aspergillusniger)，该基因工程菌株包含α-葡萄糖转苷酶基因表达盒；

所述α-葡萄糖转苷酶基因表达盒中的α-葡萄糖转苷酶基因的来源为黑曲霉；

所述α-葡萄糖转苷酶基因表达盒中含有糖化酶启动子、糖化酶信号肽、α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因和色氨酸终止子。

2.根据权利要求1所述的高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌，其特征在于：所述α-葡萄糖转苷酶基因表达盒中的α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因的N-末端融合了糖化酶信号肽。

3.一种如权利要求1或2所述的高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤如下：

⑴根据GenBank中已报道的糖化酶启动子序列为依据，设计引物，以黑曲霉基因组DNA为模板扩增糖化酶启动子序列；

⑵根据GenBank中已报道的α-葡萄糖转苷酶mRNA序列、糖化酶信号肽序列为依据，设计引物，以黑曲霉总RNA为模板，利用RT-PCR扩增得到含有糖化酶信号肽的α-葡萄糖转苷酶的成熟肽基因；

⑶根据GenBank中已报道的色氨酸终止子序列为依据，设计引物，以质粒pBI-hph为模板扩增得到色氨酸终止子序列；

⑷将步骤⑴中糖化酶启动子序列、步骤⑵中α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因和步骤⑶中色氨酸终止子序列经酶切后依次与载体pT-Z连接，构建完整的α-葡萄糖转苷酶基因表达盒，随后将其插入到pBI-hph的HindIII和XbaI位点之间，鉴定正确后，获得双元载体为pBI-Glu；

⑸双元载体pBI-Glu转化到农杆菌LBA4404中，利用农杆菌阳性克隆子对黑曲霉进行介导转化，构建基因工程菌，黑曲霉转化子经鉴定正确后，测定黑曲霉转化子的产α-葡萄糖转苷酶的活力，筛选产酶活力比出发菌株活力提高了4.0～12.1倍的菌株即得高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌；

所述步骤⑷的具体步骤为：

将线状的pUCm-T载体用连接酶进行自我连接，形成一个闭合环状的pUCm-T载体，命名为载体pT-Z；

糖化酶启动子序列的PCR产物经KpnI与NcoI酶切后，切胶回收该启动子片段，插入pT-Z载体的KpnI与NcoI位点之间，获得重组质粒pT-P；

PCR扩增的色氨酸终止子序列电泳回收后，用XbaI与BgIII进行酶切回收并连接到同样酶切的pT-P质粒的相应位点上，获得重组质粒pT-P-C；

把连接到T载体上含有糖化酶信号肽的α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因利用BgIII与NcoI酶切并电泳回收后，插入到pT-P-C质粒的BgIII与NcoI位点之间，获得重组质粒pT-P-α-C；

质粒pT-P-α-C经HindIII/XbaI双酶切，获得α-葡萄糖转苷酶基因表达盒，将该基因片段插入质粒pBI-hph的HindIII和XbaI位点之间，构建双元载体pBI-Glu。

4.根据权利要求3所述的高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌经发酵所测粗酶液酶活力比出发菌株酶活力提高了12.1倍。