CN108102934A

CN108102934A - 一种高产果胶裂解酶的黑曲霉菌株

Info

Publication number: CN108102934A
Application number: CN201711281159.5A
Authority: CN
Inventors: 徐晓东; 徐娟; 刘文瑶
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: WEIFANG KDN BIOTECH Co.,Ltd.; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2017-12-07
Filing date: 2017-12-07
Publication date: 2018-06-01
Anticipated expiration: 2037-12-07
Also published as: CN108102934B

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产果胶裂解酶的黑曲霉菌株。申请人首先敲除了黑曲霉（Aspergillus niger）中糖化酶、α淀粉酶、高峰淀粉酶和葡聚糖酶四个基因，得到新的宿主菌黑曲霉Su‑4，然后在该菌株中过表达果胶裂解酶基因，并进一步通过紫外诱变的方法筛选获得一株高产果胶裂解酶的突变菌株，保藏编号为CCTCC NO:M2017748，能大幅度提高果胶裂解酶的表达量，有利于该酶的广泛应用。

Description

一种高产果胶裂解酶的黑曲霉菌株

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体内容涉及一株高产果胶裂解酶的黑曲霉菌株及其应用。

技术背景

果胶酶(pectinase)是分解果胶物质的一类酶，它可以将果胶质降解为聚半乳糖醛酸等物质。果胶酶广泛分布于微生物与植物中，而在某些昆虫及原生动物中也有发现。目前国际上公认的果胶酶分类是将果胶酶分为果胶醋酶(pectinesterase)、原果胶酶(protopectinase)、聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)以及果胶裂解酶(lyase)。

果胶裂解酶又称为反式消去酶，是果胶酶的重要组成部分，能催化聚半乳糖醛酸α-1，4 键的断裂，是一种能降解植物细胞壁，导致植物组织软化甚至死亡的解聚酶。果胶裂解酶作用于半乳糖醛酸的第5位β-碳原子，使β-碳原子上的氢原子转移到糖苷键的氧原子上，糖苷键断裂，在半乳糖醛酸的C-4和C-5之间形成双键。果胶裂解酶在果汁澄清、酶法浸解、酶法提取果汁技术方面的应用广泛，特别是在食品行业中果汁、果酒的澄清及提高水果出汁率等方面具有重要作用。近期研究发现，果胶裂解酶还可以用于植物病毒的纯化、纸浆漂白剂纺织品的生物精炼等，为果胶裂解酶在减少环境污染和降低能源消耗方面的研究指明了新方向。

一直以来，果胶酶的工业化生产采用的都是微生物发酵的方法。产果胶酶的真菌主要囊括了Aspergillus，Fusarium，Kluyvermyoes，Penicillum，Geotricbum，Rhizopus等。其中，常用于工业生产的是曲霉属的菌种，主要有Aspergillus niger，Aspergillusnidulans，Aspergillus ustus，Aspergillusflavipes，Aspergillussydowii等。产果胶酶的细菌主要囊括了Pseudomaonas， Ervinia，Xanthomonas，Bacillus，Clostridium等。

黑曲霉(Aspergillus niger)是国际公认的安全菌株，可广泛应用于食品用酶制剂的生产。目前已有的黑曲霉菌株中果胶裂解酶的产量仍不高，导致用酶成本偏高，因此如何通过现有技术改造黑曲霉生产菌株，提高果胶裂解酶的产量，以促进酶工业和食品工业的进一步发展是本领域的研究重点。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一株高产果胶裂解酶的黑曲霉菌株。申请人首先敲除了黑曲霉(Aspergillus niger)中糖化酶、α淀粉酶、高峰淀粉酶和葡聚糖酶四个基因，得到新的宿主菌黑曲霉Su-4，然后在该菌株中过表达果胶裂解酶基因，并进一步通过紫外诱变的方法筛选获得一株高产果胶裂解酶的突变菌株，能大幅度提高果胶裂解酶的表达量，有利于该酶的广泛应用。

本发明一方面涉及一种新的宿主细胞黑曲霉Su-4(Aspergillus niger Su-4)，其缺失了糖化酶、α淀粉酶、高峰淀粉酶和葡聚糖酶四个基因。

所述糖化酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3；

所述α淀粉酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:4；

所述高峰淀粉酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:5；

所述葡聚糖酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:6；

本发明另一方面涉及一种重组菌株，是将携带有果胶裂解酶基因的表达载体转化入上述宿主细胞获得的。

所述果胶裂解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明还涉及一种突变菌株黑曲霉Su4-PL111(Aspergillus niger Su4-PL111)，已于2017 年11月30日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017748。

所述突变菌株黑曲霉Su4-PL111在生产果胶裂解酶中的应用。

本发明还提供了一种生产果胶裂解酶的发酵方法，是以所述突变菌株黑曲霉Su4-PL111 为发酵菌株。

本发明通过基因敲除的方法获得了缺失4个基因(Δglucoamylase、Δα-amylase、Δ TAKA-amylase、Δendoglucanase)的宿主菌黑曲霉Su-4，并在该菌株中过量表达了果胶裂解酶，获得一株高效表达果胶裂解酶的黑曲霉工程菌Su4-PL。进一步地，申请人以黑曲霉工程菌Su4-PL为出发菌株，通过紫外诱变的方法筛选获得一株突变菌株黑曲霉S4-PL111，能大幅度提高果胶裂解酶的表达量，摇瓶发酵上清液中果胶裂解酶酶活为260u/ml，比出发菌株提高了57.6％，20L罐发酵140h后，其发酵上清液中果胶裂解酶酶活达到1367u/ml，比出发菌株提高了57.3％，取得了意料不到的技术效果。所述黑曲霉菌株可广泛应用于果胶裂解酶的生产，从而有利于降低果胶裂解酶的生产成本，促进其在果汁加工领域中的推广与应用。

附图说明

图1为质粒pGAU图谱；

图2为黑曲霉菌株S4-PL、Su4-PL111 20L罐发酵曲线；

图3为SDS-PAGE蛋白电泳图：其中：M为蛋白分子量Marker，泳道1、2分别为黑曲霉S4-PL111和黑曲霉Su4-PL发酵上清液。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1 糖化酶(glucoamylase，简称GA)基因敲除

以黑曲霉(Aspergillus niger)基因组为模板，利用引物GAU-F、GAU-R扩增糖化酶基因上游序列，利用引物GAD-F、GAD-R扩增糖化酶基因下游序列。糖化酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

PCR引物和反应条件如下：

引物GAU-F：GACTATCTCAATGCGGCA

引物GAU-R：TGCGGTGGGGGAGTAACG

引物GAD-F：GGCGACCACCACCTACGG

引物GAD-R：ATGAAGAGGAAGTTGGGC

扩增条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，上游序列GAU大小为1427bp，下游序列 GAD大小为1332bp。

将上述获得的上下游序列GAU、GAD片段分别通过KpnI、SphI与敲除载体pMD18T-pyrG 连接，构建敲除载体pQC-GA，其中上下游序列GAU、GAD分别位于筛选标记pyrG两侧。

原生质体制备：接种宿主菌黑曲霉于PDA+U(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％；琼脂粉1.5％)平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine1％)培养基中，30℃培养24h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。

转化：将上述获得的黑曲霉原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到10⁸个/ml；每200ul原生质体中加入10ul准备好的敲除载体 pQC-GA，加入50ul 25％的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25％的PEG6000，室温放置5min；加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。

转化子筛选：培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养 2d。扣取少量菌丝体，提取基因组，通过引物GAYZ-F1、GAYZ-R1、GAYZ-F2、GAYZ-R2 进行PCR验证。引物GAYZ-F1、GAYZ-R1为糖化酶基因内部引物，如果糖化酶基因被敲除掉则PCR扩增无条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为472bp的条带；引物 GAYZ-F2、GAYZ-R2为上下游两端的验证引物，如果基因被敲除掉则PCR扩增出大小为 2421bp的条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为2590bp的条带。

引物GAYZ-F1：GGCTCGTCCTTCTTCACTA

引物GAYZ-R1：ACCCCTGCTTGTCCCACT

引物GAYZ-F2：AAGCGATGTTGCATTGCA

引物GAYZ-R2：GAGTTAATCAGGGACTGT

通过上述PCR验证，申请人筛选到糖化酶(GA)基因被敲除的黑曲霉菌株，并将其命名为黑曲霉Su-1(Aspergillus niger Su-1)。

实施例2 黑曲霉Su-1尿嘧啶营养缺陷型筛选

2.1原理：

5-氟乳清酸可以诱导菌体缺失尿嘧啶核苷酸合成途径中的乳清核苷酸转移酶或乳清苷单磷酸脱羧酶，从而使5-氟乳清酸无法形成有毒的物质5-氟尿嘧啶核苷酸，从而产生了对5- 氟乳清酸的抗性，其嘧啶核苷酸营养可以通过向培养基中添加尿嘧啶进行补充，因此利用5- 氟乳清酸诱导形成的尿嘧啶营养缺陷型菌株可以在含有5-氟乳清酸和尿嘧啶的培养基中生长；而野生型菌株因不具备对5-氟乳清酸的抗性，无法在含有5-氟乳清酸的培养条件下生长。因此常用5-氟乳清酸来筛选尿嘧啶缺陷型的突变株。

2.2筛选方法

分别将实施例1筛选到的黑曲霉Su-1的孢子用浓度为0.1％的吐温-20溶液稀释至约 1×10⁷个/mL；然后将孢子悬液均匀涂布于含有1.5g/mL 5-氟乳清酸和1.87g/mL尿嘧啶核苷 (Uridine)的基本固体培养基(2％葡萄糖，0.5％(NH₄)₂SO₄,1.5％KH₂PO₄,0.06％MgSO₄, 0.06％CaCl₂，1.5％琼脂)平板上，避光30℃培养7d以上。结果显示，平板上都有一定数量的菌落长出，说明这些菌落有可能是黑曲霉Su-1的尿嘧啶缺陷型菌株。

分别挑取平板上长出的菌落，将每个菌落分别涂布于基本培养基平板和含有1.87g/mL Uridine的基本培养基平板进行验证。真正的尿嘧啶缺陷型菌株只能在含有Uridine的基本培养基平板上生长，而在缺少Uridine的基本培养基平板上无法生长。最终，申请人筛选到1 株生长状态相对最好的尿嘧啶缺陷型菌株，命名为黑曲霉Su-1-1(Aspergillus niger Su-1-1)。

实施例3 α-淀粉酶(α-Amylase，简称AA)基因敲除

以尿嘧啶缺陷型菌株黑曲霉Su-1-1(Aspergillus niger Su-1-1)基因组为模板，利用引物 AAU-F、AAU-R扩增α-淀粉酶基因上游序列，利用引物AAD-F、AAD-R扩增α-淀粉酶基因下游序列。α-淀粉酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

PCR引物和反应条件如下：

引物AAU-F：TACTCTTCAGCTTCGCCA

引物AAU-R：AGTTCCGTATTAATGTCT

引物AAD-F：ATTGGTTTTACGTCATGG

引物AAD-R：CTCGGCACACCACGAAGC

反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，上游序列PLU大小为1380bp，下游序列 PLD大小为1248bp。

将上述获得的上下游序列AAU、AAD片段分别通过KpnI、SphI与敲除载体pMD18T-pyrG 连接，构建敲除载体pQC-AA，其中上下游序列AAU、AAD分别位于筛选标记pyrG两侧。

原生质体制备：接种黑曲霉Su-1-1(Aspergillus niger Su-1-1)于PDA+U(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％；琼脂粉1.5％)平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％)培养基中，30℃培养24h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。

转化：将上述获得的黑曲霉原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到10⁸个/ml；每200ul原生质体中加入10ul准备好的敲除载体 pQC-AA，加入50ul 25％的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25％的PEG6000，室温放置5min；加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。

转化子筛选：培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养 2d。扣取少量菌丝体，提取基因组，通过引物AAYZ-F1、AAYZ-R1、AAYZ-F2、AAYZ-R2 进行PCR验证。引物AAYZ-F1、AAYZ-R1为α-淀粉酶基因内部引物，如果α-淀粉酶基因被敲除掉则PCR扩增无条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为434bp的条带；引物AAYZ-F2、AAYZ-R2为上下游两端的验证引物，如果基因被敲除掉则PCR扩增出大小为2421bp的条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为2677bp的条带。

引物AAYZ-F1：GATCTGAACACCACGGAA

引物AAYZ-R1：GCCAGCGACTGCTCCGAT

引物AAYZ-F2：GGTTGATCTGCCTTGCAA

引物AAYZ-R2：CAATGGCTAATTAGATTT

通过上述PCR验证，申请人筛选到α-淀粉酶(AA)基因被敲除的黑曲霉菌株，并将其命名为黑曲霉Su-2(Aspergillus niger Su-2)。

实施例4 TAKA淀粉酶(TAKA-amylase，简称TA)基因敲除

采用实施例2所述方法将黑曲霉Su-2菌株通过5-氟乳清酸筛选，获得尿嘧啶缺陷型菌株，命名为黑曲霉Su-2-2(Aspergillus niger Su-2-2)。

以尿嘧啶缺陷型菌株黑曲霉Su-2-2基因组为模板，利用引物TAU-F、TAU-R扩增TAKA 淀粉酶基因上游序列，利用引物TAD-F、TAD-R扩增TAKA淀粉酶基因下游序列。TAKA淀粉酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:5。

PCR引物和反应条件如下：

引物TAU-F：TAGATGGTGGGTCTGCGG

引物TAU-R：AAATGCCTTCTGTGGGGT

引物TAD-F：CGCTTCGTAAGTCTTCCC

引物TAD-R：ATTCCAGCAAGAGTATCC

反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，上游序列TAU大小为1394bp，下游序列 TAD大小为1382bp。

将上述获得的上下游序列TAU、TAD片段分别通过KpnI、SphI与敲除载体pMD18T-pyrG 连接，构建敲除载体pQC-TA，其中上下游序列TAU、TAD分别位于筛选标记pyrG两侧。

原生质体制备：接种黑曲霉Su-2-2于PDA+U(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％；琼脂粉1.5％)平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine1％)培养基中，30℃培养24h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。

转化：将上述获得的黑曲霉原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到10⁸个/ml；每200ul原生质体中加入10ul准备好的敲除载体 pQC-TA，加入50ul 25％的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25％的PEG6000，室温放置5min；加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。

转化子筛选：培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养 2d。扣取少量菌丝体，提取基因组，通过引物TAYZ-F1、TAYZ-R1、TAYZ-F2、TAYZ-R2进行PCR验证。引物TAYZ-F1、TAYZ-R1为TAKA淀粉酶基因内部引物，如果基因被敲除掉则PCR扩增无条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为440bp的条带；引物TAYZ-F2、 TAYZ-R2为上下游两端的验证引物，如果基因被敲除掉则PCR扩增出大小为2421bp的条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为2243bp的条带。

引物TAYZ-F1：CACCGCATATGGAGATGC

引物TAYZ-R1：AAGGAGACAGTGTTATCT

引物TAYZ-F2：AGGGATGCCATGCTTGGA

引物TAYZ-R2：CAATCAAAGAGTATAAGG

通过上述PCR验证，申请人筛选到TAKA淀粉酶基因被敲除的黑曲霉菌株，并将其命名为黑曲霉Su-3(Aspergillus niger Su-3)。

实施例5 葡聚糖酶基因(endoglucanase，简称EG)敲除

采用实施例2所述方法将黑曲霉Su-3菌株通过5-氟乳清酸筛选，获得尿嘧啶缺陷型菌株，命名为黑曲霉Su-3-3(Aspergillus niger Su-3-3)。首先设计引物EGU-F、EGU-R扩增葡聚糖酶基因上游序列，引物EGD-F、EGD-R扩增葡聚糖酶基因下游序列。葡聚糖酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:6。

PCR引物和反应条件如下：

引物EGU-F：TCAAAATCTCGGAAGGAC

引物EGU-R：GGACGAAGTAAGCCAACTA

引物EGD-F：TTAAATTCCGAGCCAGTC

引物EGD-R：AACAAGAAATACGCACCC

反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，上游序列EGU大小为1434bp，下游序列 EGD大小为1506bp。

将上述获得的上下游序列EGU、EGD片段分别通过KpnI、SphI与敲除载体pMD18T-pyrG (核苷酸序列为SEQ ID NO：3)连接，构建敲除载体pQC-EG，其中上下游序列EGU、EGD分别位于筛选标记pyrG两侧。

原生质体制备：接种黑曲霉(Aspergillus niger)宿主Su-3-3菌于PDA+U(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％；琼脂粉1.5％)平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％)培养基中，30℃培养24h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。

转化：将上述获得的黑曲霉原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到10⁸个/ml；每200ul原生质体中加入10ul准备好的敲除载体 pQC-EG，加入50ul 25％的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25％的PEG6000，室温放置5min；加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。

转化子筛选：培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养 2d。扣取少量菌丝体，提取基因组，通过引物EGYZ-F1、EGYZ-R1、EGYZ-F2、EGYZ-R2 进行PCR验证。引物EGYZ-F1、EGYZ-R1为葡聚糖酶基因内部引物，如果基因敲除掉则PCR 扩增无条带，如果基因未敲除掉则PCR扩增出大小为441bp的条带；引物EGYZ-F2、EGYZ-R2 为上下游两端的验证引物，如果基因敲除掉则PCR扩增出大小为2421bp的条带，如果基因未敲除掉则PCR扩增出大小为1311bp的条带。

引物EGYZ-F1：GAGGGAACAGTGAAAAGC

引物EGYZ-R1：CTGGGTGAGATAGTTGAAGA

引物EGYZ-F2：ATGGCGCAACCTGCTATAGC

引物EGYZ-R2：GGATTACCTTTCAAGGAAAG

通过PCR验证，筛选到葡聚糖酶基因敲除的菌株，命名为黑曲霉Su-4(Aspergillusniger Su-4)。

实施例6 果胶裂解酶(pectin lyase，简称PL)基因的克隆

以黑曲霉基因组为模板，利用引物1和引物2扩增出果胶裂解酶基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

PCR引物和反应条件如下：

引物1(F)：ATGAAGTACGCTGCTGCT

引物2(R)：TTACAGGTTACCCTGACC

反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸70s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，扩增得到的PL基因大小为1369bp。

实施例7 重组载体的构建

PCR扩增上述果胶裂解酶基因，引物两端引入XbaI位点。引物序列如下：

引物3(F)：GCTCTAGA ATGAAGTACGCTGCTGCT

引物4(R)：GCTCTAGA TTACAGGTTACCCTGACC

PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸70s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，PL基因为大小1369bp的片段。

将上述获得的果胶裂解酶PL基因片段与表达载体pGAU分别进行限制性内切酶XbaI单酶切，酶切条件如下：

37℃水浴酶切处理2h，电泳后分别回收两个目的片段，溶于20ul ddH₂O。用T4DNA连接酶进行连接，连接体系如下：

22℃连接1h，转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布LB+AAP平板，37℃培养过夜后长出单菌落，菌落PCR验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到含有果胶裂解酶PL的重组载体pGAU-PL。

实施例8 果胶裂解酶PL的重组表达

采用实施例2所述方法将黑曲霉Su-4菌株通过5-氟乳清酸筛选，获得尿嘧啶缺陷型菌株，命名为黑曲霉Su-4-4(Aspergillus niger Su-4-4)。

1、原生质体制备：

接种宿主菌黑曲霉Su-4-4于PDA+U(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％；琼脂粉1.5％)平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％) 培养基中，30℃培养24h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。

2、转化：

将上述获得的黑曲霉Su-4-4原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到10⁸个/ml；每200ul原生质体中分别加入10ul准备好的重组载体pGAU-PL，加入50ul 25％的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25％的PEG6000，室温放置5min；加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。

3、转化子筛选：

培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养2d。将正常生长的转化子分别接种到新鲜的PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种50ml液体摇瓶培养基(麦芽糖12％；豆饼粉0.85％；玉米浆1％；硫酸铵0.5％；磷酸二氢钾0.35％；磷酸氢二钾0.75％；七水硫酸镁0.03％)中发酵，32℃培养5d，每天加入适量氨水，控制pH在4.5左右。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，进行SDS-PAGE 蛋白电泳检测及果胶裂解酶酶活力检测。

检测阳性转化子发酵上清液中果胶裂解酶酶活力，筛选出酶活最高的阳性转化子，命名为黑曲霉Su4-PL(Aspergillus niger Su4-PL)。

实施例9 诱变筛选

确定致死率：接种黑曲霉工程菌Su4-PL于PDA平板，30℃培养5-7d。待菌落表面变黑，产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×10⁷)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射120s时，致死率为95％，选取该照射时间进行后续诱变实验。

诱变筛选：取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×10⁷)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射120s后稀释1000倍，取100ul涂布PDA平板， 30℃培养2-3d。

共涂布200块PDA平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出30-50个菌落，先通过菌落形态，筛选短分枝的突变体，挑取菌落形态较小、菌丝致密、菌落周围绒毛较短的突变体139个接种到PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种50ml 液体摇瓶培养基中发酵，32℃培养5d，每天加入适量氨水，控制pH在4.5左右。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行果胶裂解酶酶活力检测，同时出发菌株黑曲霉 Su4-PL作为对照组。

(1)果胶裂解酶酶活单位的定义

在40℃、pH值为4.5的条件下，每分钟水解甲酯化果胶产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量，定义为一个酶活力单位U。

(2)酶活测定方法

0.25％果胶底物：秤取柑橘类果胶(DE>69％，GA>65％或等同)2.50g，将约800ml的水加热到约40℃，强烈搅拌下缓慢加入秤取的柑橘类果胶溶解。将悬浊液加热到60℃，搅拌直到果胶全部溶解，保持搅拌直至溶液冷却到室温。然后用10％盐酸调节pH到4.8.将溶液转移到1000ml的容量瓶中定容备用。

酶液：用0.05mol/L的醋酸钠缓冲液稀释至适当倍数，控制酶活约为0.1U/ml，控制吸光值在0.2-0.4范围。

半乳糖醛酸标准曲线的绘制：分别配好的1％半乳糖醛酸标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，用0.05mol/L的醋酸缓冲液定容至10ml，作为标准点溶液。取上述标准点溶液各0.5ml，加入0.5ml聚半乳糖醛酸底物溶液，再加入2ml DNS终止液，混合均匀后将所有试管置于沸水浴中煮沸5min，然后取出水浴冷至室温；向所有试管中加入5ml水，混合均匀，将试管溶液转移至10ml离心管，4000rpm离心10min，取上清用分光光度计在540nm下读取吸光值，以吸光值为纵坐标(y)、半乳糖醛酸浓度(umol/ml)为横坐标(x)，绘制标准曲线y＝kx+b。

测定：取0.5ml已经稀释好的待测样品加入反应管和空白管，并将反应管和空白管放入 40℃水浴中，预热2min，然后按照一定的时间间隔向反应试管中加入0.5ml已经预热的0.25％果胶底物，混合均匀，计时反应10min。最后按照同样的时间间隔向所有反应管中加入2ml DNS 溶液终止反应，在空白管中加入0.5ml果胶底物。

所有试管置于沸水中煮沸5min，然后取出冷却至室温；向所有试管中加入5ml水，混合均匀，将试管溶液转移到10ml离心管中，4000rpm离心10min，取上清用分光光度计在540nm 下读取吸光值。

酶活计算公式：A＝(△OD-b)×n/(k×t)

式中：

A——样品的酶活力，单位为U/ml；

△OD——样品空白吸光值之差；

k——标准曲线的斜率；

b——标准曲线的截距；

n——稀释倍数；

t——反应时间，min；

酶活检测结果显示，出发菌株黑曲霉Su4-PL摇瓶发酵上清液中果胶裂解酶活力为165u/ml，而通过诱变筛选获得的突变菌株中果胶裂解酶产量最高达到260u/ml，比出发菌株提高了57.6％。将该果胶裂解酶产量最高的突变菌株命名为黑曲霉Su4-PL111(Aspergillus niger Su4-PL111)。

进一步地，申请人将出发菌株黑曲霉Su4-PL(Aspergillus niger Su4-PL)和突变菌株黑曲霉Su4-PL111(Aspergillus niger Su4-PL111)分别在20L罐中进行发酵，发酵曲线如图2所示，发酵140h后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行蛋白电泳检测及果胶裂解酶酶活力检测。

电泳检测结果如图3所示，箭头所指处即为果胶裂解酶，说明出发菌株黑曲霉Su4-PL和突变菌株黑曲霉Su4-PL111均能有效表达果胶裂解酶PL。酶活检测结果显示，出发菌株黑曲霉Su4-PL发酵上清液中果胶裂解酶酶活为869u/ml，而突变菌株黑曲霉Su4-PL111的发酵上清液中果胶裂解酶酶活高达1367u/ml，比出发菌株提高了57.3％，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2017年11月30日将突变菌株黑曲霉Su4-PL111(Aspergillus nigerSu4-PL111) 保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山（武汉大学），中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017748。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种高产果胶裂解酶的黑曲霉菌株

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 373

<212> PRT

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 1

Met Lys Tyr Ala Ala Ala Leu Thr Ala Val Ala Ala Leu Ala Ala Arg

1 5 10 15

Ala Ala Ala Val Gly Val Ser Gly Thr Pro Glu Gly Phe Ala Ser Ser

20 25 30

Ala Thr Gly Gly Gly Asp Ala Thr Ala Val Tyr Pro Thr Thr Thr Asp

35 40 45

Glu Leu Val Ser Tyr Leu Gly Asp Asp Glu Ala Arg Val Ile Val Leu

50 55 60

Ser Lys Thr Phe Asp Phe Thr Asp Thr Glu Gly Thr Thr Thr Thr Thr

65 70 75 80

Gly Cys Ala Pro Trp Gly Thr Ala Ser Gly Cys Gln Leu Ala Ile Asn

85 90 95

Lys Asp Asp Trp Cys Thr Asn Tyr Glu Pro Asp Ala Pro Thr Thr Thr

100 105 110

Val Thr Tyr Asn Thr Ala Gly Glu Leu Gly Ile Thr Val Asn Ser Asn

115 120 125

Lys Ser Leu Ile Gly Glu Gly Thr Ser Gly Val Ile Lys Gly Arg Gly

130 135 140

Leu Arg Met Val Ser Gly Val Ser Asn Ile Ile Ile Gln Asn Ile Ala

145 150 155 160

Val Thr Asp Ile Asn Pro Glu Tyr Val Trp Gly Gly Asp Ala Ile Thr

165 170 175

Leu Asp Asp Ala Asp Leu Val Trp Ile Asp His Val Thr Thr Ala Arg

180 185 190

Ile Gly Arg Gln His Tyr Val Leu Gly Thr Glu Ala Asp Asn Arg Val

195 200 205

Ser Ile Thr Asn Asn Tyr Ile Asn Gly Glu Ser Asp Tyr Ser Ala Thr

210 215 220

Cys Asp Gly His His Tyr Trp Asn Val Tyr Leu Asp Gly Ala Ser Asp

225 230 235 240

Lys Val Thr Phe Lys Gly Asn Tyr Leu Tyr Lys Thr Ser Gly Arg Ala

245 250 255

Pro Lys Val Gln Asp Asn Thr Tyr Leu His Ile Leu Asn Asn Tyr Trp

260 265 270

Glu Asn Asn Ser Gly His Ala Phe Glu Ile Gly Ser Gly Gly Tyr Val

275 280 285

Leu Ala Glu Gly Asn Tyr Phe Ser Asn Val Asp Thr Val Leu Glu Ser

290 295 300

Asp Ser Phe Glu Gly Ala Leu Phe Ser Ser Asp Ser Ala Ser Ser Thr

305 310 315 320

Cys Glu Ser Tyr Ile Gly Arg Ser Cys Val Ala Asn Val Asn Gly Gly

325 330 335

Asp Leu Thr Gly Ser Ser Thr Thr Val Leu Ser Asn Leu Ser Ser Asp

340 345 350

Thr Leu Pro Ser Ala Asp Ala Ala Ser Thr Ser Pro Ala Ser Ser Ala

355 360 365

Gly Gln Gly Asn Leu

370

<210> 2

<211> 1122

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 2

atgaagtacg ctgctgctct tacggctgtt gccgccctcg ctgcccgcgc cgctgctgtc 60

ggtgtctccg gcactcccga gggtttcgct tcctccgcca ctggtggtgg tgatgccact 120

gccgtctacc ctaccaccac cgatgagctg gtctcttacc tcggtgacga cgaggcccgt 180

gtcattgtcc tgtccaagac tttcgacttc actgacactg agggtaccac caccaccacc 240

ggctgtgctc cctggggtac tgcctccggc tgccagctgg ccatcaacaa ggacgactgg 300

tgcaccaact acgagcccga tgctcccacc accaccgtca cctacaacac tgctggtgaa 360

ctcggtatca ccgtcaactc caacaagtcc ctgatcggtg agggtaccag cggtgtcatc 420

aagggccgtg gtctccgcat ggtcagcggt gtctccaaca tcatcatcca gaacattgct 480

gtcaccgaca tcaaccccga gtacgtctgg ggtggtgacg ccatcactct cgacgacgct 540

gacttggtct ggattgacca cgttaccact gcccgcatcg gtcgccagca ctacgtcctc 600

ggtaccgagg ccgacaaccg tgtctccatc accaacaact acatcaacgg cgagtctgac 660

tactctgcta cttgcgacgg ccaccactac tggaacgtgt acctcgacgg tgctagcgac 720

aaggtcacct tcaagggcaa ctacctgtac aagacctccg gccgtgcccc caaggtccag 780

gacaacacct acctccacat cctcaacaac tactgggaga acaactcggg ccacgctttc 840

gagatcggct ccggtggcta tgtcctcgct gagggtaact acttctccaa cgttgacacc 900

gtcctcgagt ccgactcctt cgagggtgct ctcttctcct ctgacagcgc ctcctccacc 960

tgcgagtcct acattggccg ctcttgcgtt gccaacgtca acggcggtga cctcaccggc 1020

agctccacca ccgtcctctc caacctcagc agcgacaccc tcccctctgc tgatgctgcc 1080

agcaccagcc ccgcctccag cgctggtcag ggtaacctgt aa 1122

<210> 3

<211> 2169

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 3

atgtcgttcc gatctcttct cgccctgagc ggccttgtct gctctgggtt ggcaagtgtg 60

atttccaagc gcgcgacctt ggattcgtgg ttgagcaacg aagcgaccgt ggctcgtact 120

gcgatcctga ataacatcgg ggcggacggt gcttgggtgt cgggcgcgga ctctggcatt 180

gtcgttgcca gtcccagcac cgataacccg gactgtatgt tttgagttcg gattatgaat 240

gtgtcttggt tgattgatgc tgactggcgt gtcttttgat gattgtagac ttctacacct 300

ggactcgcga ctctggtctc gtcatcaaga ccctcgtcga cctcttccgc aatggagata 360

ctgatctcct ttccaccatt gagcactaca tctcctctca ggcaattatt cagggtgtca 420

gtaacccctc tggtgatctg tccagcggtg gtcttggtga gcccaagttc aatgtcgatg 480

agactgccta caccggttct tggggacggc cgcagcgtga tggtcctgcc ctgagagcaa 540

ctgctatgat cggctttggg cagtggctgc ttgtatgttc tccaccccct tgcgtctgat 600

ctgcaacata tgtagctgac tggtcaggac aatggctaca ccagcgctgc aacagagatt 660

gtttggcccc tcgttaggaa cgacctgtcg tatgtggctc agtactggaa ccagacggga 720

tatggtgtgt ttgattgatc ggggttcaag ggtgtttgtg catcggagct aacttcgcgg 780

tcgcagatct ctgggaagaa gttaatggct cgtccttctt cactattgcc gtgcaacacc 840

gcgccctcgt cgaaggtagt gccttcgcga cggccgtcgg ctcgtcctgc tcctggtgtg 900

attcgcaggc acctcagatt ctctgttact tgcagtcctt ctggaccggc agctacatcc 960

tggccaactt tgacagcagc cgttccggca aggacacaaa caccctcctg ggaagcatcc 1020

acacctttga tcctgaggct ggatgcgacg actccacctt ccagccctgc tccccgcgtg 1080

cgctcgccaa ccataaggag gttgtagact ctttccgctc gatctatact ctcaacgatg 1140

gtctcagtga cagtgaggcg gttgcggtcg gtcggtaccc tgaggatagc tactacaacg 1200

gcaacccgtg gttcctgtgc accttggctg ccgcggaaca gctgtacgat gctctgtacc 1260

agtgggacaa gcaggggtcg ttggagatca cagacgtgtc acttgacttc ttcaaggctc 1320

tgtacagtgg tgctgccacc ggcacgtact cttcgtccag ctcgacctat agcagcattg 1380

tgagtgccgt caagactttc gctgatggtt ttgtttctat tgtggtaagt ctacgctaga 1440

cgagcgctca tatttacaga gggtgcgtac taacaggatt aggaaactca cgccgcaagc 1500

aacggctctc tgtctgagca attcgacaag tctgatggcg acgagctttc tgctcgcgat 1560

ctgacctggt cttacgctgc tctgctgacc gccaacaacc gtcgtaattc tgtcgtgccc 1620

ccgtcttggg gtgagacctc tgccagcagc gtgcccggca cctgtgcggc tacctctgcc 1680

tctggtacct acagcagtgt gaccgtcacc tcgtggccga gcatcgtggc tactggtggc 1740

accactacga cggctactac cactggatcg ggcggcgtga cctcgaccag caagaccacc 1800

acaactgcta gtaagaccag caccactacg tcctcgacct cctgcaccac ccccactgcc 1860

gtagctgtga cctttgatct gacggcgacc accacctacg gcgagaacat ctacctggtc 1920

gggtcgatct ctcagctcgg tgactgggag accagcgatg gcatagctct gagcgctgac 1980

aagtacactt ccagtaaccc gctttggtat gtaactgtga ctctgccggc tggtgagtca 2040

tttgagtaca agttcatccg cgttgagagc gatgactccg tggagtggga gagcgacccg 2100

aaccgggaat acaccgttcc tcaggcgtgc ggcgagtcga ccgcgacggt gaccgacacc 2160

tggcggtag 2169

<210> 4

<211> 2361

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 4

atgagagtgt cgacttcaag tattgccctt gctgtgtccc tttttgggaa gctggccctt 60

gggctgtcag ctgcagaatg gcgcactcaa tccatctact tccttttgac ggatcggttc 120

ggtaggacgg acaattcgac tacagctacg tgcaatacgg gtgaccaagt atggtattgc 180

tgtacttccg tcattcatct gctgacttgg atagatctac tgtggtggaa gttggcaagg 240

aattatcaac catgttcgta tctcacttca taccatccat gctgggcgct tctgactatt 300

gctccagctg gactatatcc agggcatggg attcacagct atctggatct cgcctatcac 360

tgagcagcta ccccaggata cttcggatgg tgaagcctac catggatact ggcagcagaa 420

gatgtatgcc ctcattgcat tcatatttta tgcttactcg cagactgcag ctgacttggc 480

agatacaatg tgaactccaa cttcggcacg gcagatgatc tgaagtccct ctccgatgct 540

cttcacgccc gcggaatgta cctcatggtc gacgtcgtcc ctaaccacat ggtaagtact 600

gctttacctc tatattagta aacccaatgc gaacaatgac tgtatcaggg ctacgcaggt 660

aacggcaacg atgtggatta cagcgtcttc gaccccttcg actcctcctc ctacttccat 720

ccatactgcc tcatcacaga ttgggacaac ttgaccatgg tccaagactg ttgggagggt 780

gacaccatcg tgtctctgcc agatctgaac accacggaaa ccgccgtgag aaccatttgg 840

tacgattggg tagccgacct ggtatccaac tactcaggtg cgaccccaac ccactaaaac 900

aagccacata ctaaaaaatt gctcagtcga cggcctccgt atcgacagtg tcgaagaagt 960

cgaacccgac ttcttcccgg gctaccaaga agcagcagga gtctactgcg tcggtgaagt 1020

cgacaacggc aaccctgctc tcgactgccc ataccaaaaa tatctagatg gtgttctcaa 1080

ctatcccatg tacatacccc cttctacctt ctcgaaccca tcactaactc aattgctgca 1140

gctactggca actcctctac gcctttgaat cctccagcgg cagcatcagc aacctctaca 1200

acatgatcaa atccgtcgcc agcgactgct ccgatccgac cctcctgggc aactttatcg 1260

aaaaccacga caacccccgc ttcgcctcgt atgtcccttc catcactgcc cccttttaaa 1320

gtaaacccca ctgacaggca aagctacaca tccgactact cccaagccaa aaacgtcctc 1380

agctacatct tcctctccga cggcatcccc atcgtctacg ccggcgaaga acagcactac 1440

tccggcggcg acgtgcccta caaccgcgaa gctacctggc tatcaggcta cgacacctcc 1500

gcggagctct acacctggat agccaccaca aacgcgatcc ggaaactagc tatctcagca 1560

gactcggact acattactta cgcggtttgc cctttccctt ccccccaccc agagctcaac 1620

ccccattcta acaaaatatt tcaatggtag aacgacccaa tctacacaga cagcaacacc 1680

atcgcgatgc gcaaaggcac ctccggctcc caaatcatca ccgtcctctc caacaaaggc 1740

tcctccggaa gcagctacac cctcaccctc agcggaagcg gctacacgtc cggcacgaag 1800

ctcatcgaag cgtacacctg cacgtccgtg acggtggact cgaacgggga tatccctgtg 1860

ccgatggctt cgggattacc tagagttctc ctccctgctt cggtggttga tagttcttcg 1920

ctttgtgggg ggagtggtaa cacaaccacg accacaactg ctgctacctc cacatccaaa 1980

gccaccacct cctcttcttc ttcttctgct gctgctacta cttcttcatc atgcaccgca 2040

acaagcacca ccctccccat caccttcgaa gaactcgtca ccactaccta cggggaagaa 2100

gtctacctca gcggatctat ctcccagctc ggagagtggg atacgagtga cgcggtgaag 2160

ttgtccgcgg atgattatac ctcgagtaac cccgagtggt ctgttactgt gtcgttgccg 2220

gtggggacga ccttcgagta taagtttatt aaggtcgatg agggtggaag tgtgacttgg 2280

gaaagtgatc cgaataggga gtatactgtg cctgaatgtg ggagtgggag tggggagacg 2340

gtggttgata cgtggaggta g 2361

<210> 5

<211> 2044

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 5

atgatggtcg cgtggtggtc tctatttctg tacggccttc aggtcgcggc acctgctttg 60

gctgcaacgc ctgcggactg gcgatcgcaa tccatttatt tccttctcac ggatcgattt 120

gcaaggacgg atgggtcgac gactgcgact tgtaatactg cggatcaggt gtgttgttac 180

ctactagctt tcagaaagag gaatgtaaac tgacttgata tagaaatact gtggtggaac 240

atggcagggc atcatcgaca aggtaaattg cccctttatc aaaaaaaaag aaggaaaagc 300

agaagaaaaa taaaataaaa agaactctag tcctaaccat cacatagttg gactatatcc 360

agggaatggg cttcacagcc atctggatca cccccgttac agcccagctg ccccagacca 420

ccgcatatgg agatgcctac catggctact ggcagcagga tatgtaagtc gatttcttta 480

aatatctacc tgtcatcttt tacatcaata tgaactaact tgatggtttt agatactctc 540

tgaacgaaaa ctacggcact gcagatgact tgaaggcgct ctcttcggcc cttcatgaga 600

gggggatgta tcttatggtc gatgtggttg ctaaccatat ggttcgtggt cctttgcaac 660

tgacttcgcg gatatggttc atttcagtac tgacaatgag taatatcagg gctatgatgg 720

agcgggtagc tcagtcgatt acagtgtgtt taaaccgttc agttcccaag actacttcca 780

cccgttctgt ttcattcaaa actatgaaga tcagactcag gttgaggatt gctggctagg 840

agataacact gtctccttgc ctgatctcga taccaccaag gatgtggtca agaatgaatg 900

gtacgactgg gtgggatcat tggtatcgaa ctactccagt aagatatttc tccctcattc 960

tacaacttgg ctgatcgatg atacttacga aatcagttga cggcctccgt atcgacacag 1020

taaaacacgt ccagaaggac ttctggcccg ggtacaacaa agccgcaggc gtgtactgta 1080

tcggcgaggt gctcgacggt gatccggcct acacttgtcc ctaccagaac gtcatggacg 1140

gcgtactgaa ctatcccatg tatggttcct ccaaccatga gccttcttgc aagtctcatc 1200

tcctaacgaa acggctaaaa ccagttacta tccactcctc aacgccttca agtcaacctc 1260

cggcagcatg gacgacctct acaacatgat caacaccgtc aaatccgact gtccagactc 1320

aacactcctg ggcacattcg tcgagaacca cgacaaccca cggttcgctt cgtaagtctt 1380

cccttttatt ttccgttccc aatttccaca cagaacccca cctaacaaga gcaaagttac 1440

accaacgaca tagccctcgc caagaacgtc gcagcattca tcatcctcaa cgacggaatc 1500

cccatcatct acgccggcca agaacagcac tacgccggcg gaaacgaccc cgcgaaccgc 1560

gaagcaacct ggctctcggg ctacccgacc gacagcgagc tgtacaagtt aattgcctcc 1620

gcgaacgcaa tccggaacta tgccattagc aaagatacag gattcgtgac ctacaaggta 1680

agcacaacct ctaagcatac cctaatggcc tatcttcaga gtatctgaca caagagacta 1740

atcactggca atacagaact ggcccatcta caaagacgac acaacgatcg ccatgcgcaa 1800

gggcacagat gggtcgcaga tcgtgactat cttgtccaac aagggtgctt cgggtgattc 1860

gtataccctc tccttgagtg gtgcgggtta cacagccggc cagcaattga cggaggtcat 1920

tggctgcacg accgtgacgg ttggttcgga tggaaatgtg cctgttccta tggcaggtgg 1980

gctacctagg gtattgtatc cgactgagaa gttggcaggt agcaagatct gtagtagctc 2040

gtga 2044

<210> 6

<211> 834

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 6

atgaagctct ccatgacact ttccctgttt gcggccaccg ccatgggcca gacgatgtgc 60

tctcagtatg acagtgcctc gagcccccca tactcggtga accagaacct ctggggcgaa 120

taccaaggca ctggcagcca gtgtgtctac gtcgacaagc ttagcagcag tggtgcctca 180

tggcatacca aatggacctg gagtggtggc gagggaacag tgaaaagcta ctctaactcc 240

ggccttacgt ttgacaagaa gctagtcagc gatgtgtcaa gcattcccac ctcggtgaca 300

tggagccagg acgacaccaa tgtccaagcc gatgtctcat atgatctgtt caccgcggcg 360

aatgcggatc atgccacttc cagcggtgac tatgagctta tgatttggta tgtggcgtcg 420

tgaacaagat agatggagga ggctaacgta accaggcttg cccgctacgg ctcagtccag 480

cctattggca agcagattgc cacggccact gtgggaggca agtcctggga ggtgtggtat 540

ggtaccagca cccaggccgg tgcggagcag aagacatata gcttcgtggc aggatctcct 600

atcaattcgt ggagtgggga catcaaggac ttcttcaact atctcaccca gaaccaaggc 660

ttcccggcta gctctcagca tttgatcagt gagttttcct gattctacta ccgagcgcca 720

caatgaaacg gtcactaaca gaaatgatca ctagccctgc aatttggaac tgagccgttc 780

accggtggcc cggcaacctt cacggttgac aactggaccg ctagtgtcaa ctaa 834

Claims

1.一种黑曲霉（Aspergillus niger），其特征在于，所述的黑曲霉缺失了糖化酶、α淀粉酶、高峰淀粉酶和葡聚糖酶四个基因。

2.如权利要求1所述的黑曲霉，其特征在于，所述的糖化酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

3.如权利要求1所述的黑曲霉，其特征在于，所述的α淀粉酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

4.如权利要求1所述的黑曲霉，其特征在于，所述的高峰淀粉酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:5。

5.如权利要求1所述的黑曲霉，其特征在于，所述的葡聚糖酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:6。

6.一种黑曲霉重组菌株，其特征在于，所述的重组菌株是通过将携带有果胶裂解酶基因的表达载体转化入权利要求1-5任一所述的黑曲霉获得的。

7.如权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述的果胶裂解酶的氨基酸序列为SEQID NO：1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

8.一种黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述突变菌株的保藏编号为CCTCC NO:M2017748。

9.权利要求8所述的黑曲霉突变菌株在生产果胶裂解酶中的应用。

10.一种生产果胶裂解酶的发酵方法，其特征在于，所述的方法是以权利要求8所述的黑曲霉突变菌株为发酵菌株。