CN108004153B - 一株高产果胶裂解酶的里氏木霉菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产果胶裂解酶的里氏木霉菌株。申请人将黑曲霉（Aspergillus niger）的果胶裂解酶基因在里氏木霉（Trichoderma reesei）宿主中进行过表达，构建得到重组表达菌株，并进一步通过紫外诱变的方法筛选获得一株高产果胶裂解酶的突变菌株，保藏编号为CCTCC NO:M2017750，能大幅度提高果胶裂解酶的表达量，有利于该酶的广泛应用。

Description

一株高产果胶裂解酶的里氏木霉菌株及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体内容涉及一株高产果胶裂解酶的里氏木霉菌株及其应用。

技术背景

果胶裂解酶(pectinlyase)能够特异地催化高酯化度果胶降解。通过反式消去方式在果胶C-4位置处断裂糖苷键，同时从C-5处消去一个氢原子，生成含不饱和键的产物。果胶裂解酶是果胶酶中唯一一种能够降解高酯化度果胶且不产生甲醇的酶类，根据酶作用底物环境的酸碱性，可分为酸性果胶裂解酶和碱性果胶裂解酶两类。其广泛地应用于食品工业、纺织工业、造纸业、含果胶类物质的污水处理等。

果汁中含有丰富的维生素、酸分和无机盐等人体所必须的营养物质。但是在果汁生产中，由于水果富含大量的果胶和纤维素等物质，经压榨后的果浆非常粘稠，导致果汁的压榨率低且所得果汁难以澄清，是阻碍果汁生产的一大难题。近年来人们通过使用酶处理法，添加果胶酶来解决果汁生产中的问题。在果汁生产过程中添加果胶酶能够有效的降低果浆粘稠度，果汁的产量会大幅增加，比传统的机械方法相比不仅所得果汁产量增加，果汁的感官得到改善而且更多水果中的营养物质得以保留。果胶裂解酶作为果胶酶的一种也被应用在果汁的生产中。将真菌PenicilliumexpansumF16来源的果胶裂解酶纯化后，用来处理苹果汁、葡萄汁等，其能够有效地澄清这些果汁，提高果汁光穿透率，并对其处理的果汁进行甲醇检测，没有测到甲醇等有害物质的存在。

在纺织业中所用的果胶裂解酶为碱性果胶酶，主要用于棉麻纺织品的脱胶。传统碱法处理过程中产生的废水中含有高COD、高BOD、高pH、高盐分等，产生高能耗、二次污染等不利因素，但经酶处理所得的纺织品往往能够避免这些缺陷，且其产品吸水率高、易染色、手感更好。有报道用果胶酸裂解酶来处理棉纤维，并对酶处理后的棉纤维的物理化学性质做了研究，所得纤维可湿润性强、洁白度更好、结晶度指数高、易染色，其优于碱处理所得纤维。

在饲料中果胶裂解酶也被使用，非淀粉多糖是由果胶、纤维素、半纤维素和抗性淀粉等组成的，在动物饲料中存在许多的非淀粉多糖。非淀粉多糖是一种抗营养因子，影响肠胃内消化酶的活性，不利于肠胃对营养成分的吸收和利用。单胃动物，自身缺乏降解非淀粉多糖的酶系，故而不能够利用这些物质，就会造成动物食欲不佳等状态。果胶裂解酶能够降解这些非淀粉多糖，酶解得到的产物，能够作为其他酶的反应底物，从而促进动物肠胃对饲料的消化吸收。目前，主要将果胶酶与其他酶类配成复合酶用于饲料中，来提高动物对饲料的利用率，提高其生产性能。

果胶裂解酶来源广泛，细菌、真菌和放线菌都已产生果胶裂解酶，已有研究表明黑曲霉、链霉菌、酵母菌为合成果胶裂解酶的理想菌株，但目前已有的生产菌株中果胶裂解酶的产量仍不高，导致用酶成本偏高，因此如何通过现有技术改造果胶裂解酶生产菌株，提高该酶的产量，以促进酶工业和食品工业的进一步发展是本领域的研究重点。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一株高产果胶裂解酶的里氏木霉菌株及其应用。申请人将黑曲霉(Aspergillus niger)的果胶裂解酶基因在里氏木霉(Trichodermareesei)宿中进行过表达，构建得到重组表达菌株，并进一步通过紫外诱变的方法筛选获得一株高产果胶裂解酶的突变菌株，能大幅度提高果胶裂解酶的表达量，有利于该酶的广泛应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

本发明一方面提供了一种里氏木霉工程菌，其携带有表达果胶裂解酶基因的重组载体。

所述的果胶裂解酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码基因的序列为SEQ IDNO:2。

本发明一方面提供了一株突变菌里氏木霉O11-PL27(Trichoderma reesei O11-PL27)，已于2017年11月30日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017750。

本发明还提供了所述里氏木霉菌株在发酵生产果胶裂解酶中的应用。

本发明还提供了一种生产果胶裂解酶的发酵方法，是以所述里氏木霉为发酵菌株。

申请人通过紫外诱变的方法筛选获得一株高产果胶裂解酶的突变菌株里氏木霉O11-PL27，能大幅度提高果胶裂解酶的表达量，摇瓶发酵上清液中果胶裂解酶酶活为286u/ml，比出发菌株提高了97％，20L罐发酵160h后，其发酵上清液中果胶裂解酶酶活达到3536u/ml，比出发菌株提高了72％，取得了意料不到的技术效果。所述里氏木霉菌株可广泛应用于果胶裂解酶的生产，从而有利于降低果胶裂解酶的生产成本，促进其在果汁加工领域中的推广与应用。

附图说明

图1为质粒pTG图谱；

图2为里氏木霉O11-PL27和里氏木霉O11-PL 20L罐发酵曲线；

图3为SDS-PAGE蛋白电泳图：其中：M为蛋白分子量Marker，泳道1、2分别为里氏木霉O11-PL27、里氏木霉O11-PL发酵上清液。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1果胶裂解酶(pectin lyase，简称PL)基因的克隆

以黑曲霉(Aspergillus niger)基因组为模板，利用引物1和引物2扩增出果胶裂解酶基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

PCR引物和反应条件如下：

引物1(F)：ATGAAGTACGCTGCTGCT

引物2(R)：TTACAGGTTACCCTGACC

反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸70s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，扩增得到的PL基因大小为1369bp。

实施例2重组载体的构建

PCR扩增上述果胶裂解酶基因，引物两端引入XbaI位点。引物序列如下：

引物3(F)：GCTCTAGA ATGAAGTACGCTGCTGCT

引物4(R)：GCTCTAGA TTACAGGTTACCCTGACC

PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸70s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，PL基因为大小1369bp的片段。

将上述获得的果胶裂解酶PL基因片段与表达载体pTG分别进行限制性内切酶XbaI单酶切，酶切条件如下：

37℃水浴酶切处理2h，电泳后分别回收两个目的片段，溶于20ul ddH₂O。用T4 DNA连接酶进行连接，连接体系如下：

22℃连接1h，转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布LB+AAP平板，37℃培养过夜后长出单菌落，菌落PCR验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到含有果胶裂解酶PL的重组载体pTG-PL。

实施例3果胶裂解酶PL的重组表达

1、原生质体制备：

接种里氏木霉宿主菌(该宿主菌已于2016年12月7日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016726)于PDA+U(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％；琼脂粉1.5％)平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％)培养基中，30℃培养16h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。

2、转化：

将上述获得的里氏木霉原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到10⁸个/ml；每200ul原生质体中分别加入10ul准备好的重组载体pTG-PL，加入50ul 25％的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25％的PEG6000，室温放置5min；加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。

3、转化子筛选：

培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养3d。将正常生长的转化子分别接种到新鲜的PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种50ml液体摇瓶培养基(葡萄糖1％；乳糖2％；玉米浆1.5％；硫酸铵0.9％；硫酸镁0.15％；柠檬酸0.073％；氯化钙0.1125％；微量元素0.1％)中发酵，28℃培养5d。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，进行SDS-PAGE蛋白电泳检测及果胶裂解酶酶活力检测。

检测阳性转化子发酵上清液中果胶裂解酶酶活力，筛选出酶活最高的阳性转化子，命名为里氏木霉O11-PL(Trichoderma reesei O11-PL)。

实施例4诱变筛选

确定致死率：接种里氏木霉工程菌O11-PL于PDA平板，30℃培养5-7d。待菌落表面产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×10⁷)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射90s时，致死率为95％，选取该照射时间进行后续诱变实验。

诱变筛选：取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×10⁷)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射90s后稀释1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d。

共涂布200块PDA平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出30-50个菌落，先通过菌落形态，筛选短分枝的突变体，挑取菌落形态较小、菌丝致密、菌落周围绒毛较短的突变体85个接种到PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种于50ml液体摇瓶培养基中发酵，28℃培养5d。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行果胶裂解酶酶活力检测，同时出发菌株里氏木霉工程菌O11-PL作为对照组。

(1)果胶裂解酶酶活单位的定义

在40℃、pH值为4.5的条件下，每分钟水解甲酯化果胶产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量，定义为一个酶活力单位U。

(2)酶活测定方法

0.25％果胶底物：秤取柑橘类果胶(DE>69％，GA>65％或等同)2.50g，将约800ml的水加热到约40℃，强烈搅拌下缓慢加入秤取的柑橘类果胶溶解。将悬浊液加热到60℃，搅拌直到果胶全部溶解，保持搅拌直至溶液冷却到室温。然后用10％盐酸调节pH到4.8.将溶液转移到1000ml的容量瓶中定容备用。

酶液：用0.05mol/L的醋酸钠缓冲液稀释至适当倍数，控制酶活约为0.1U/ml，控制吸光值在0.2-0.4范围。

半乳糖醛酸标准曲线的绘制：分别配好的1％半乳糖醛酸标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，用0.05mol/L的醋酸缓冲液定容至10ml，作为标准点溶液。取上述标准点溶液各0.5ml，加入0.5ml聚半乳糖醛酸底物溶液，再加入2ml DNS终止液，混合均匀后将所有试管置于沸水浴中煮沸5min，然后取出水浴冷至室温；向所有试管中加入5ml水，混合均匀，将试管溶液转移至10ml离心管，4000rpm离心10min，取上清用分光光度计在540nm下读取吸光值，以吸光值为纵坐标(y)、半乳糖醛酸浓度(umol/ml)为横坐标(x)，绘制标准曲线y＝kx+b。

测定：取0.5ml已经稀释好的待测样品加入反应管和空白管，并将反应管和空白管放入40℃水浴中，预热2min，然后按照一定的时间间隔向反应试管中加入0.5ml已经预热的0.25％果胶底物，混合均匀，计时反应10min。最后按照同样的时间间隔向所有反应管中加入2ml DNS溶液终止反应，在空白管中加入0.5ml果胶底物。

所有试管置于沸水中煮沸5min，然后取出冷却至室温；向所有试管中加入5ml水，混合均匀，将试管溶液转移到10ml离心管中，4000rpm离心10min，取上清用分光光度计在540nm下读取吸光值。

酶活计算公式：

A＝(△OD-b)×n/(k×t)

式中：

A——样品的酶活力，单位为U/ml；

△OD——样品空白吸光值之差；

k——标准曲线的斜率；

b——标准曲线的截距；

n——稀释倍数；

t——反应时间，min；

酶活检测结果显示，出发菌株里氏木霉O11-PL摇瓶发酵上清液中果胶裂解酶活力为145u/ml，而通过诱变筛选获得的突变菌株中果胶裂解酶产量最高达到286u/ml，比出发菌株提高了97％。将该果胶裂解酶产量最高的突变菌株命名为里氏木霉O11-PL27(Trichoderma reesei O11-PL27)。

进一步地，申请人将出发菌株里氏木霉O11-PL(Trichoderma reesei O11-PL)和突变菌株里氏木霉O11-PL27(Trichoderma reesei O11-PL27)分别在20L罐中进行发酵，发酵曲线如图2所示，发酵160h后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行蛋白电泳检测及果胶裂解酶酶活力检测。

电泳检测结果如图3所示，箭头所指处即为果胶裂解酶，说明里氏木霉O11-PL和里氏木霉O11-PL27均能有效表达果胶裂解酶PL。酶活检测结果显示，出发菌株里氏木霉O11-PL发酵上清液中果胶裂解酶酶活为2053u/ml，而突变菌株里氏木霉O11-PL27的发酵上清液中果胶裂解酶酶活高达3536u/ml，比出发菌株提高了72％，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2017年11月30日将突变菌株里氏木霉O11-PL27(Trichoderma reeseiO11-PL27)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017750。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一株高产果胶裂解酶的里氏木霉菌株及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 373

<212> PRT

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 1

Met Lys Tyr Ala Ala Ala Leu Thr Ala Val Ala Ala Leu Ala Ala Arg

1 5 10 15

Ala Ala Ala Val Gly Val Ser Gly Thr Pro Glu Gly Phe Ala Ser Ser

20 25 30

Ala Thr Gly Gly Gly Asp Ala Thr Ala Val Tyr Pro Thr Thr Thr Asp

35 40 45

Glu Leu Val Ser Tyr Leu Gly Asp Asp Glu Ala Arg Val Ile Val Leu

50 55 60

Ser Lys Thr Phe Asp Phe Thr Asp Thr Glu Gly Thr Thr Thr Thr Thr

65 70 75 80

Gly Cys Ala Pro Trp Gly Thr Ala Ser Gly Cys Gln Leu Ala Ile Asn

85 90 95

Lys Asp Asp Trp Cys Thr Asn Tyr Glu Pro Asp Ala Pro Thr Thr Thr

100 105 110

Val Thr Tyr Asn Thr Ala Gly Glu Leu Gly Ile Thr Val Asn Ser Asn

115 120 125

Lys Ser Leu Ile Gly Glu Gly Thr Ser Gly Val Ile Lys Gly Arg Gly

130 135 140

Leu Arg Met Val Ser Gly Val Ser Asn Ile Ile Ile Gln Asn Ile Ala

145 150 155 160

Val Thr Asp Ile Asn Pro Glu Tyr Val Trp Gly Gly Asp Ala Ile Thr

165 170 175

Leu Asp Asp Ala Asp Leu Val Trp Ile Asp His Val Thr Thr Ala Arg

180 185 190

Ile Gly Arg Gln His Tyr Val Leu Gly Thr Glu Ala Asp Asn Arg Val

195 200 205

Ser Ile Thr Asn Asn Tyr Ile Asn Gly Glu Ser Asp Tyr Ser Ala Thr

210 215 220

Cys Asp Gly His His Tyr Trp Asn Val Tyr Leu Asp Gly Ala Ser Asp

225 230 235 240

Lys Val Thr Phe Lys Gly Asn Tyr Leu Tyr Lys Thr Ser Gly Arg Ala

245 250 255

Pro Lys Val Gln Asp Asn Thr Tyr Leu His Ile Leu Asn Asn Tyr Trp

260 265 270

Glu Asn Asn Ser Gly His Ala Phe Glu Ile Gly Ser Gly Gly Tyr Val

275 280 285

Leu Ala Glu Gly Asn Tyr Phe Ser Asn Val Asp Thr Val Leu Glu Ser

290 295 300

Asp Ser Phe Glu Gly Ala Leu Phe Ser Ser Asp Ser Ala Ser Ser Thr

305 310 315 320

Cys Glu Ser Tyr Ile Gly Arg Ser Cys Val Ala Asn Val Asn Gly Gly

325 330 335

Asp Leu Thr Gly Ser Ser Thr Thr Val Leu Ser Asn Leu Ser Ser Asp

340 345 350

Thr Leu Pro Ser Ala Asp Ala Ala Ser Thr Ser Pro Ala Ser Ser Ala

355 360 365

Gly Gln Gly Asn Leu

370

<210> 2

<211> 1122

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 2

atgaagtacg ctgctgctct tacggctgtt gccgccctcg ctgcccgcgc cgctgctgtc 60

ggtgtctccg gcactcccga gggtttcgct tcctccgcca ctggtggtgg tgatgccact 120

gccgtctacc ctaccaccac cgatgagctg gtctcttacc tcggtgacga cgaggcccgt 180

gtcattgtcc tgtccaagac tttcgacttc actgacactg agggtaccac caccaccacc 240

ggctgtgctc cctggggtac tgcctccggc tgccagctgg ccatcaacaa ggacgactgg 300

tgcaccaact acgagcccga tgctcccacc accaccgtca cctacaacac tgctggtgaa 360

ctcggtatca ccgtcaactc caacaagtcc ctgatcggtg agggtaccag cggtgtcatc 420

aagggccgtg gtctccgcat ggtcagcggt gtctccaaca tcatcatcca gaacattgct 480

gtcaccgaca tcaaccccga gtacgtctgg ggtggtgacg ccatcactct cgacgacgct 540

gacttggtct ggattgacca cgttaccact gcccgcatcg gtcgccagca ctacgtcctc 600

ggtaccgagg ccgacaaccg tgtctccatc accaacaact acatcaacgg cgagtctgac 660

tactctgcta cttgcgacgg ccaccactac tggaacgtgt acctcgacgg tgctagcgac 720

aaggtcacct tcaagggcaa ctacctgtac aagacctccg gccgtgcccc caaggtccag 780

gacaacacct acctccacat cctcaacaac tactgggaga acaactcggg ccacgctttc 840

gagatcggct ccggtggcta tgtcctcgct gagggtaact acttctccaa cgttgacacc 900

gtcctcgagt ccgactcctt cgagggtgct ctcttctcct ctgacagcgc ctcctccacc 960

tgcgagtcct acattggccg ctcttgcgtt gccaacgtca acggcggtga cctcaccggc 1020

agctccacca ccgtcctctc caacctcagc agcgacaccc tcccctctgc tgatgctgcc 1080

agcaccagcc ccgcctccag cgctggtcag ggtaacctgt aa 1122

Claims (3)

1.一种里氏木霉突变菌株，其特征在于，所述突变菌株的保藏编号为CCTCC NO:M2017750。

2.权利要求1所述的里氏木霉突变菌株在发酵生产果胶裂解酶中的应用。

3.一种生产果胶裂解酶的发酵方法，其特征在于，所述方法是以权利要求1所述的里氏木霉突变菌株为发酵菌株。

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