CN114606143A

CN114606143A - 一种高产鼠李糖苷酶的里氏木霉突变菌株及其应用

Info

Publication number: CN114606143A
Application number: CN202011420944.6A
Authority: CN
Inventors: 徐晓东; 李�瑞
Original assignee: Qingdao Ulan Kangcheng Biological Technology Co ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Ulan Kangcheng Biological Technology Co ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2020-12-08
Filing date: 2020-12-08
Publication date: 2022-06-10

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体提供了一株高产鼠李糖苷酶的里氏木霉突变菌株及其应用。申请人首先将来源于棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）的鼠李糖苷酶基因，在里氏木霉（Trichoderma reesei）宿主中过表达，构建得到重组表达该酶的基因工程菌株，然后进一步通过紫外诱变方法，筛选获得一株鼠李糖苷酶产量显著提高的突变菌，保藏编号为CCTCC NO:M2020700。该突变菌可广泛应用于鼠李糖苷酶的生产，有利于降低该酶的生产成本。

Description

一种高产鼠李糖苷酶的里氏木霉突变菌株及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物改造技术领域，具体内容涉及一种高产鼠李糖苷酶的里氏木霉突变菌株及其应用。

技术背景

黄酮类化合物是以2-苯基色原酮为母核，以C6-C3-C6为基本骨架的化合物，黄酮类化合物具有多个酚羟基，具有清除自由基、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤等药理活性。但是黄酮苷化合物普遍水溶性低，利用效率低。目前可以利用去糖基化对黄酮类化合物进行结构修饰，当黄酮苷的末端鼠李糖苷被水解后，其水溶性大幅度增加，利用效率高，可以大大提高药理活性。黄酮类化合物的去糖基化主要有传统的化学水解和生物酶催化。化学水解采用稀硫酸或盐酸对黄酮类化合物进行水解，但该方法反应激烈，对仪器设备要求高，副产物多，产率低，不利于工业化生产。利用酶催化水解黄酮类化合物末端鼠李糖苷，该方法具有高效专一、产率高、副产物少等优点，对黄酮类化合物的结构修饰具有非常重要的意义。

α-L-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)广泛分布于自然界中，包括动植物组织细胞，细菌，真菌。据文献报道，α-L-鼠李糖苷酶可以水解芦丁、橙皮苷、柚皮苷、淫羊藿苷等黄酮类化合物的末端鼠李糖。国内对菌株代谢分泌α-L-鼠李糖苷酶的研究主要集中在黑曲霉等真菌上，而国外对代谢分泌α-L-鼠李糖苷酶的菌株研究相对广泛，除了对黑曲霉产α-L-鼠李糖苷酶的研究外，还对白曲霉、棘孢曲霉、青霉菌、拟杆菌等菌株进行产α-L-鼠李糖苷酶的研究。α-L-鼠李糖苷酶在现实生活中，具有巨大的应用价值，在食品工艺上，主要利用α-L-鼠李糖苷酶改善酒的风味，对一些柑橘或柚子饮料进行脱苦；在医药行业的应用，催化合成重要化合物，例如利用α-L-鼠李糖苷酶合成薯蓣皂苷，该化合物是合成甾体激素的重要原料。

α-L-鼠李糖苷酶具有相当广泛的来源，例如在哺乳动物组织器官中发现了α-L-鼠李糖苷酶，Qian等从动物肝脏中分离获得α-L-鼠李糖苷酶，Richard在荞麦、芹菜、葡萄籽等植物分离得到α-L-鼠李糖苷酶，在乳杆菌中、黑曲霉、青霉菌、土曲霉等微生物都已经发现了α-L-鼠李糖苷酶。但是无论是从植物或者动物组织中都难以大量提取、分离纯化得到α-L-鼠李糖苷酶，因此很难实现生产工业化。

近年来，诸多研究者通过微生物发酵代谢产物中分离得到α-L-鼠李糖苷酶。到目前为止，产α-L-鼠李糖苷酶的菌株将近有1000种不同来源的微生物。典型的有黑曲霉菌、棘孢曲霉、土曲霉菌、青霉菌和黄曲霉，其所产α-L-鼠李糖苷酶酶活力相对较高。例如，2015年张涛等发现了一株产α-L-鼠李糖苷酶的菌株，其分类命名为互隔交链孢(Alternariaalternata)SK37.002，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2015309，可高效地生产α-L-鼠李糖苷酶，适于进行大规模生产。2019年徐晓东等提供了一株产鼠李糖苷酶的黑曲霉突变菌株，保藏编号为CCTCC NO:M2019432，该菌株可提高鼠李糖苷酶的产量。2020年肖敏等提供了一种细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶FjRha，该α-L-鼠李糖苷酶来源于约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)可应用于高效生产橙皮素-7-O-葡萄糖苷。

本发明提供了一株高效生产鼠李糖苷酶的里氏木霉菌株，可适用于大规模的工业生产中。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产鼠李糖苷酶的里氏木霉突变菌株及其应用。申请人将来源于棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的鼠李糖苷酶基因，在里氏木霉(Trichoderma reesei)宿主中过表达，构建得到重组表达菌株；然后以该菌株为出发菌进行紫外诱变，筛选获得一株能大幅度提高鼠李糖苷酶表达量的突变菌。该突变菌可以广泛应用于鼠李糖苷酶的生产，有利于降低该酶的生产成本。

本发明一方面提供了一种里氏木霉工程菌，其携带有重组表达鼠李糖苷酶基因的表达载体。

所述鼠李糖苷酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明一方面提供了一种里氏木霉突变菌株，是以上述里氏木霉工程菌为出发菌，通过紫外诱变方法获得的。

所述里氏木霉突变菌株命名为里氏木霉LR10239(Trichoderma reeseiLR10239)，已于2020年11月6日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020700。

本发明还提供了上述里氏木霉突变菌株在鼠李糖苷酶生产中的应用。

本发明将鼠李糖苷酶基因在里氏木霉(Trichoderma reesei)宿主4Q中过表达，构建得到重组表达菌株里氏木霉4Q10239，20L罐发酵160h后，发酵上清液中鼠李糖苷酶酶活达到3486u/ml。

为了提高鼠李糖苷酶的产量，申请人以里氏木霉4Q10239为出发菌，通过紫外诱变的方法筛选获得一株高产突变菌株里氏木霉LR10239。该突变菌能大幅度提高鼠李糖苷酶的表达量，20L罐发酵160h后，发酵上清液中鼠李糖苷酶酶活达到5604u/ml，比出发菌提高了60.8％，取得了意料不到的技术效果。

里氏木霉LR10239重组表达的鼠李糖苷酶最适作用pH为5.0-6.0，最适作用温度为80℃，耐热性较好，80℃处理3min后仍能保持80％以上的残余酶活。重组表达的鼠李糖苷酶能够大大提高朝藿定C到淫羊藿苷的转化率，可广泛应用于淫羊藿苷的生产。

所述里氏木霉突变菌株可广泛应用于鼠李糖苷酶的生产，有效降低鼠李糖苷酶的生产成本，促进其在食品、医药等领域的推广与应用。

附图说明

图1为质粒pTG图谱；

图2为里氏木霉4Q10239和里氏木霉LR10239的20L罐发酵曲线；

图3为pH-相对酶活曲线；

图4为温度-相对酶活曲线；

图5为温度耐受曲线。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1鼠李糖苷酶基因的克隆

以棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)ACU基因组为模板，利用引物1和引物2扩增出鼠李糖苷酶基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

PCR引物和反应条件如下：

引物1(F)：ATGCACATTATCACTCCTTTGCT；

引物2(R)：TCAGTCGGCTGACTCAATCAGCT。

反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸120s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，扩增得到的鼠李糖苷酶基因大小为1968bp。

实施例2重组表达载体的构建

PCR扩增上述鼠李糖苷酶基因，引物两端引入XbaI位点。引物序列如下：

引物3(F)：GCTCTAGA ATGCACATTATCACTCCTTTGCT；

引物4(R)：GCTCTAGA TCAGTCGGCTGACTCAATCAGCT。

PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸120s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，鼠李糖苷酶基因为大小1968bp的片段。

将上述获得的鼠李糖苷酶基因片段与表达载体pTG分别进行限制性内切酶XbaI单酶切，酶切条件如下：

37℃水浴酶切处理2h，电泳后分别回收两个目的片段，溶于20ul ddH₂O。用T4 DNA连接酶进行连接，连接体系如下：

22℃连接1h，转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布LB+AAP平板，37℃培养过夜后长出单菌落，菌落PCR验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到含有鼠李糖苷酶基因的重组载体pTG-10239。

实施例3重组表达鼠李糖苷酶的基因工程菌的构建

1、原生质体制备：

接种里氏木霉宿主菌4Q于PDA+U(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％；琼脂粉1.5％)平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％)培养基中，30℃培养16h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。

2、转化：

将上述获得的里氏木霉4Q原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到10⁸个/ml；每200ul原生质体中分别加入10ul准备好的重组载体pTG-10239，加入50ul 25％的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25％的PEG6000，室温放置5min；加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。

3、转化子筛选：

培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养3d。将正常生长的转化子分别接种到新鲜的PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种50ml液体摇瓶培养基(葡萄糖1％；乳糖2％；玉米浆1.5％；硫酸铵0.9％；硫酸镁0.15％；柠檬酸0.073％；氯化钙0.1125％；微量元素0.1％)中发酵，28℃培养5d。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，进行SDS-PAGE蛋白电泳检测及鼠李糖苷酶酶活力检测。

分别检测上述获得的阳性转化子发酵上清液中鼠李糖苷酶活力，筛选出酶活最高的阳性转化子，在摇瓶发酵条件下其鼠李糖苷酶酶活力达到318u/ml。将该阳性转化子命名为里氏木霉4Q10239(Trichoderma reesei 4Q10239)。

酶活检测方法

(1)鼠李糖苷酶酶活单位的定义

在50℃、pH值为4.8的条件下，每分钟从浓度为5mmol/L的4-硝基苯基α-L-阿拉伯呋喃糖苷的溶液中降解释放1微摩尔对硝基酚所需要的酶量为一个酶活力单位U。

(2)酶活测定方法

5mmol/L 4-硝基苯基α-L-阿拉伯呋喃糖苷溶液：准确称取4-硝基苯基α-L-阿拉伯呋喃糖苷0.0713g,精确到0.0001g，缓缓加入相应的缓冲液接近50ml，磁力搅拌约10min，用2mol/L的柠檬酸或者氢氧化钠调相应的pH值，最后定容到50ml，现用现配。

酶液：用pH4.8的柠檬酸钠缓冲液稀释至适当倍数，控制吸光值在0.2-0.4范围。

标准曲线的绘制：将5mmol/L对硝基苯酚溶液精确稀释10倍，再分别稀释2、4、6、8、10、12、16倍。

取0.5mL上述对硝基苯酚稀释液(空白对照取缓冲液)，加入碳酸钠溶液2mL，加入底物溶液0.5mL，混合均匀，以空白对照调零，以在410nm测定吸光值。

以体系中对硝基苯酚的含量为横坐标(X)，吸光值为纵坐标(y)，绘制标准曲线y＝kA+b。

测定：取适量底物，50℃预热5min；

取四支15*150试管(一支空白管，三支样品管)，分别向四支管中，准确加入用已稀释好的酶液0.5mL；

将四支试管同时置于50±0.1℃水浴中，预热2min；

准确向样品试管中加入0.5mL底物溶液，准确计时15min；

迅速、准确地向各管中加入碳酸钠溶液2.0mL，于空白管中准确加入底物溶液0.50mL,摇匀。

以空白管调零，在分光光度计波长410nm下，用10mm比色杯，分别测量。

三支样品管中样液的吸光度，取平均值。

通过查标准曲线或用线性回归方程求出对硝基苯酚的含量。

酶活计算公式：A＝X×1/0.5×n/15

式中：

A—鼠李糖苷酶酶活力，u/g(或u/mL)；

X—吸光度在标准曲线上查得(或计算出)的对硝基苯酚含量，μmol；

1/0.5—所加入的酶液体积；

n—酶样的稀释倍数；

15—时间换算系数。

实施例4诱变筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以里氏木霉4Q10239为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其鼠李糖苷酶的产量。

1、确定致死率：

接种出发菌里氏木霉4Q10239于PDA平板，30℃培养5-7d。待菌落表面产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×10⁷)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射90s时，致死率为95％，选取该照射时间进行后续诱变实验。

2、诱变筛选：

取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×10⁷)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射90s后稀释1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d。

共涂布300块PDA平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出30-50个菌落，先通过菌落形态，筛选短分枝的突变体。申请人挑取菌落形态较小、菌丝致密、菌落周围绒毛较短的突变菌共162个，分别接种到PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种50ml液体摇瓶培养基中发酵，28℃培养5d。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行蛋白电泳检测及鼠李糖苷酶酶活力检测。

结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的162株突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液中鼠李糖苷酶的酶活高于出发菌。申请人按照上述方法继续进行了17轮诱变筛选，最终获得1株鼠李糖苷酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为里氏木霉LR10239(Trichoderma reesei LR10239)。该突变菌在摇瓶条件下发酵，其发酵上清液中鼠李糖苷酶酶活力达到493u/ml。

申请人进一步将出发菌里氏木霉4Q10239和突变菌里氏木霉LR10239分别进行20L罐发酵。发酵曲线如图2所示，发酵160h后，出发菌发酵上清液中鼠李糖苷酶酶活达到3486u/ml，而突变菌里氏木霉LR10239发酵上清液中鼠李糖苷酶酶活高达5604u/ml，取得了意料不到的技术效果。

实施例5鼠李糖苷酶的酶学性质分析

1、最适作用pH值

采用pH值分别为2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的缓冲液，将里氏木霉LR10239发酵上清液进行稀释测定，鼠李糖苷酶底物也分别用对应pH值的缓冲液配制，在50℃下进行鼠李糖苷酶活力测定，计算酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线，结果如图3所示，里氏木霉LR10239发酵上清液中重组鼠李糖苷酶的最适作用pH为5.0-6.0。

2、最适作用温度

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃，pH4.8条件下，测定里氏木霉LR10239发酵上清液的鼠李糖苷酶活力，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线，结果如图4所示，里氏木霉LR10239发酵上清液中重组鼠李糖苷酶最适作用温度为80℃。

3、温度耐受性

先用pH4.8的缓冲液将里氏木霉LR10239发酵上清液稀释至酶活为100U/ml，再用预热10min的pH4.8的缓冲液将样品稀释10倍，混合均匀，60℃、65℃、70℃、75℃、80℃分别处理3min，结束时取样并冷却至室温，然后测定稀释后的鼠李糖苷酶酶活力，并计算残余酶活。以未处理样品为100％，绘制曲线，结果如图5所示，里氏木霉LR10239发酵上清液中重组鼠李糖苷酶的耐热性较好，80℃处理3min后仍能保持80％以上的残余酶活。

实施例6鼠李糖苷酶在淫羊藿苷制备中的应用

秤取0.2g朝藿定C粗品(朝藿定C含量为40％)加入到50ml离心管中，加入9ml乙酸钠缓冲液(pH 5.5)，充分溶解后加入里氏木霉LR10239重组表达的鼠李糖苷酶240u，再用乙酸钠缓冲液(pH 5.5)定容至10ml，在60℃的水浴锅中反应，每1h取样，用甲醇稀释5倍后进行HPLC检测，检测朝藿定C及淫羊藿苷的含量。结果如下表所示，反应6h后，85.6％的朝藿定C在重组鼠李糖苷酶的作用下发生水解，其中94％左右的朝藿定C转化为淫羊藿苷。由此可见，本发明提供的突变菌里氏木霉LR10239重组表达的鼠李糖苷酶能够大大提高朝藿定C到淫羊藿苷的转化率，科广泛应用于淫羊藿苷的生产。

综上，本发明提供的突变菌株里氏木霉LR10239可广泛应用于鼠李糖苷酶的生产，能显著降低该酶的生产成本，有利于促进该酶在食品、医药等领域中的推广与应用。

序列表

<110> 青岛蔚蓝康成生物科技有限公司

青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种高产鼠李糖苷酶的里氏木霉突变菌株及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 655

<212> PRT

<213> 棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)

<400> 1

Met His Ile Ile Thr Pro Leu Leu Ile Pro Ala Val Leu Val Ala Ala

1 5 10 15

Ala Arg Val Pro Tyr Arg Glu Tyr Ile Leu Ala Pro Ser Ser Arg Val

20 25 30

Ile Val Pro Ala Ser Val Arg Gln Val Asn Gly Ser Val Thr Asn Ala

35 40 45

Ala Gly Leu Thr Gly Ser Ser Leu Gly Thr Ala Val Phe His Gly Val

50 55 60

Ser Ser Val Thr Tyr Asp Phe Gly Lys Asn Val Ala Gly Ile Val Ser

65 70 75 80

Leu Thr Val Gly Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ala Phe Leu Gly Val Thr

85 90 95

Phe Ser Glu Ser Ser Leu Trp Ala Ser Ser Glu Ala Cys Asp Ala Thr

100 105 110

Gly Asn Ser Gly Leu Asp Ala Pro Leu Trp Phe Pro Val Gly Gln Lys

115 120 125

Ala Gly Thr Tyr Thr Pro Asp Ser Lys Tyr Val Arg Gly Gly Phe Arg

130 135 140

Tyr Leu Thr Val Val Ser Asn Thr Ser Ala Thr Ile Pro Leu Asn Ser

145 150 155 160

Leu His Ile Thr Phe Thr Ala Ala Pro Asp Gln Asp Leu Gln Ala Tyr

165 170 175

Gln Gly Trp Phe His Ser Asn Asp Glu Leu Leu Asn Glu Ile Trp Tyr

180 185 190

Ala Gly Ala Tyr Thr Asn Gln Leu Cys Thr Ile Asp Pro Thr Tyr Gly

195 200 205

Ser Ala Ser Ser Glu Thr Ile Ser Thr Ser Gly Leu Asn Tyr Trp Tyr

210 215 220

Asn Asn Leu Thr Ile Ala Asn Gly Thr Ser Thr Val Thr Asp Gly Ala

225 230 235 240

Lys Arg Asp Arg Ala Val Trp Pro Gly Asp Met Ser Ile Ser Leu Glu

245 250 255

Ser Ile Ala Val Ser Thr Asn Asp Leu Tyr Ser Val Arg Met Gly Leu

260 265 270

Glu Ala Leu Leu Ala Leu Gln Ser Ser Glu Gly Gln Leu Pro Trp Gly

275 280 285

Gly Lys Pro Phe Asn Ile Asp Val Ser Tyr Thr Tyr His Leu His Ser

290 295 300

Leu Ile Gly Met Ser Phe Leu Tyr Arg Phe Ser Gly Asp Lys Val Trp

305 310 315 320

Leu Ser Asn Tyr Trp Gly Gln Tyr Ser Lys Gly Val Glu Trp Ala Val

325 330 335

Arg Ser Val Asp Ser Thr Gly Leu Ala Asn Val Thr Ser Asn Val Ser

340 345 350

Ala Asp Trp Leu Arg Gly Gly Met Gly Gly His Asn Ile Glu Ala Asn

355 360 365

Ala Ile Leu Tyr Phe Val Leu Gln Glu Ala Gln Asn Leu Ala Arg Asp

370 375 380

Leu Asn Arg Ser Ser Glu Tyr Thr Asn Trp Ala Ser Val Ala Asp Gly

385 390 395 400

Val Lys Ser Ala Ala Asn Gln Leu Leu Trp Asp Asp Gln Ala Gly Leu

405 410 415

Tyr Arg Asp Asn Gln Thr Thr Glu Leu His Pro Gln Asp Gly Asn Ala

420 425 430

Trp Ala Val Lys Ser Asn Leu Thr Leu Ser Gly Ser Gln Asn Arg Ala

435 440 445

Ile Ser Gln Ala Leu Lys Ala Arg Trp Gly Arg Tyr Gly Ala Pro Ala

450 455 460

Pro Glu Ala Gly Ala Thr Ile Ser Pro Phe Ile Gly Gly Phe Glu Ile

465 470 475 480

Gln Ser His Phe Leu Ala Asn Gln Pro Asp Val Ala Leu Asp Met Ile

485 490 495

Arg Leu Gln Trp Gly Phe Met Leu Arg Asp Pro Arg Met Thr Gln Ser

500 505 510

Thr Leu Ile Glu Gly Tyr Ser Thr Asp Gly Ser Ile His Tyr Ala Pro

515 520 525

Tyr Ala Asn Asp Ala Arg Ile Ser His Ala His Gly Trp Ser Thr Gly

530 535 540

Pro Thr Tyr Ala Leu Thr Ala Tyr Ala Ala Gly Leu Gln Leu Leu Gly

545 550 555 560

Pro Ala Gly Asn Ser Trp Leu Ile Ala Pro Gln Pro Gly Gly Leu Thr

565 570 575

Ser Ile Asp Cys Gly Phe Ala Thr Ala Leu Gly Val Phe Ser Val Val

580 585 590

Phe Glu Arg Asp Ser Val Gly Arg Tyr Asn Ser Phe Ser Phe Gly Ala

595 600 605

Pro Thr Gly Thr Thr Gly Arg Ile Glu Leu Pro Gly Val Arg Gly Thr

610 615 620

Leu Val Ser Thr Thr Gly Gln Arg Val Gln Leu Val Asn Gly Thr Ala

625 630 635 640

Ser Gly Leu Arg Gly Gly Lys Trp Lys Leu Ile Glu Ser Ala Asp

645 650 655

<210> 2

<211> 1968

<212> DNA

<213> 棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)

<400> 2

atgcacatta tcactccttt gctgatacca gcagtgttag tggccgcagc ccgggtccca 60

taccgggagt atattctagc cccgtcctct cgagtgattg tccctgcctc agttcgtcag 120

gtcaacgggt ctgtcactaa tgcggctggc ctgactggat cctcattggg caccgccgtc 180

ttccatggcg tttcgtcggt gacctacgac tttggaaaga acgttgcagg cattgtgtcc 240

ctcacggttg gatcttcttc ctctccatct gccttcctgg gggtcacctt ctctgaatca 300

agcctgtggg cgagcagtga ggcgtgcgat gctactggaa attctggcct cgatgcacct 360

ttgtggttcc cggttggaca aaaggcggga acatataccc ctgacagcaa atacgttcga 420

ggtggtttcc ggtatctgac ggtcgtgagc aacacgagcg cgacgatccc tctcaactcc 480

ctccacatca cattcacagc tgccccggat caagatctgc aagcgtacca aggctggttc 540

cactcgaatg acgaattact gaacgagatc tggtatgcgg gagcatatac caatcagctg 600

tgtacaattg atccaacata tggctccgcg agctcggaga ctatttccac ctccggcctg 660

aattactggt ataacaatct cactatcgcc aatggaacca gcacagtgac cgatggcgca 720

aaacgagatc gcgctgtttg gccaggcgac atgtcgatct ctctcgagag tatcgcggtc 780

agcaccaacg atctgtacag tgttagaatg ggattggagg ccctactcgc tttgcaatca 840

tctgagggac aactgccttg gggtggcaag cctttcaaca ttgatgttag ttacacttac 900

cacctacatt cactgattgg aatgtccttc ctatatcggt tctcaggcga taaagtctgg 960

ctttccaact attggggtca atactcgaag ggggtcgaat gggcagtaag gagtgttgat 1020

agcactggtc tagcgaatgt gacatccaat gtcagtgccg actggttgcg agggggtatg 1080

ggaggccaca acatcgaggc taatgcgatt ctctactttg tcctccaaga agcgcagaat 1140

ctagcgcgcg acctcaaccg gagctccgag tacacgaact gggccagtgt tgctgatggt 1200

gtcaaatctg cagccaacca gctactctgg gacgaccaag caggacttta ccgagataac 1260

cagacaaccg agctccatcc acaggacgga aacgcctggg ctgtcaaatc caatttgacc 1320

ctttccggca gtcaaaatcg agctatttct caggcactca aggcgcgctg gggtcgttac 1380

ggtgcccccg cgcccgaggc cggggcaacc atctcgcctt tcatcggcgg ctttgaaatt 1440

caatctcact ttctggctaa ccagcccgat gtggctctgg atatgattcg gttgcagtgg 1500

gggttcatgc tgcgcgatcc ccgaatgacc cagtcgacat tgattgaggg atactccacg 1560

gatggctcga tccattacgc cccgtacgcc aacgacgcac gcatctcgca tgctcacggt 1620

tggtccaccg gcccaacata tgccttaaca gcctatgccg ctggtctgca gctactcgga 1680

ccggctggaa acagttggtt aattgctccg caacctgggg gtctgactag catagactgt 1740

ggattcgcta ctgctcttgg agtcttctcg gtcgtctttg aaagagattc agttggccgt 1800

tataattctt tctcttttgg cgcgccgact gggactaccg gcaggattga gttaccaggg 1860

gtccgaggca cgttggtctc caccacgggc caacgcgtgc agctggttaa tggtacagct 1920

tccggtttga gaggaggaaa atggaagctg attgagtcag ccgactga 1968

Claims

1.一种里氏木霉工程菌，其特征在于，所述的工程菌携带有重组表达鼠李糖苷酶基因的表达载体。

2.如权利要求1所述的里氏木霉工程菌，其特征在于，所述的鼠李糖苷酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

3.一种里氏木霉突变菌株，其特征在于，所述的突变菌株是以权利要求2所述的里氏木霉工程菌为出发菌，通过紫外诱变方法获得的。

4.如权利要求3所述的里氏木霉突变菌株，其特征在于，所述的突变菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2020700。

5.权利要求3或4所述的里氏木霉突变菌株在鼠李糖苷酶生产中的应用。