CN110423700A - 一种高产鼠李糖苷酶的黑曲霉菌株 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株高产鼠李糖苷酶的黑曲霉菌株及其应用。申请人首先构建得到重组表达鼠李糖苷酶基因的黑曲霉工程菌株，然后进一步通过紫外诱变方法筛选获得一株高产鼠李糖苷酶的突变菌株，其保藏编号为CCTCC NO:M2019432。20L罐发酵160h后，该突变菌发酵上清液中鼠李糖苷酶酶活达到1002 U/ml，比出发菌提高了109.2%，取得了意料不到的技术效果。所述黑曲霉菌株可广泛应用于鼠李糖苷酶的生产，从而有利于降低鼠李糖苷酶的生产成本，促进其在食品加工领域中的推广与应用。

Description

一种高产鼠李糖苷酶的黑曲霉菌株

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体内容涉及一株高产鼠李糖苷酶的黑曲霉菌株及其应用。

技术背景

α-L-鼠李糖苷酶 (α -L -rhamnosidase (EC3.2.1.40))属于转化糖苷水解酶类，能够专一、高效地水解许多糖苷类物质如柚皮苷、芦丁、橙皮苷等末端的α-L-鼠李糖基。α-L-鼠李糖苷酶的来源广泛，在动物组织、植物和微生物中均发现了α-L-鼠李糖苷酶。目前关于动物组织和植物来源的α-L-鼠李糖苷酶的报道相对较少，主要是通过细菌（如芽孢杆菌属、拟杆菌属、乳杆菌属及单胞菌属等）和真菌（如曲霉属、青霉属、木霉属、犁头霉属及裂殖菌属等）发酵来获取α-L-鼠李糖苷酶。

国内关于鼠李糖苷酶研究，主要集中在Absidia sp. R9g代谢产生的α-L-鼠李糖苷酶，国外研究相对较多，主要有黑曲霉、白曲霉、棘孢曲霉、青霉菌、拟杆菌属和热微菌门等。据报道，细菌产的α-L-鼠李糖苷酶可以水解人们日常饮食中最常见的黄酮苷类化合物（云香苷和槲皮苷等）。真菌中的α-L-鼠李糖苷酶最初是从青霉菌和曲霉菌代谢生产的酶制剂中纯化来的。近年来，已经可以用土曲霉（Aspergillus terreus）和构巢曲霉（Aspergillus nidulans）生产α-L-鼠李糖苷酶。

α-L-鼠李糖苷酶是柚苷酶及橙皮苷酶的主要活性成分，是去除柑桔类果汁苦味的有效物质。果汁中的苦味物质柚皮苷被柚苷酶水解的过程共有两步反应，首先在α-L-鼠李糖苷酶的作用下水解柚皮苷生成普鲁宁，接着在β-D-葡萄糖苷酶的作用下，生成柚皮素。在果汁酶法脱苦过程中，α-L-鼠李糖苷酶参与的第一步反应是脱苦的关键，Chien等用HPLC法证明仅有柚苷酶的另一组份β-D-葡萄糖苷酶存在时，苦味物质柚皮苷是不能被水解的。有研究报道，对王官溪蜜柚果汁进行脱苦时，在α-L-鼠李糖苷酶加量为10 U/m L的条件下40℃处理60 min，苦味就能降低到阈值以下。除了在饮料行业中用来去除柑橘类果汁的苦味，在其他行业也具有很多潜在的应用价值，如通过水解柚皮苷生产L-鼠李糖和普鲁宁，降低黄酮类化合物的生产成本; 增加酿造酒的香味，改善葡萄汁和饮料的香气成分; 切除一些糖苷类药物原料末端的L-鼠李糖等。由于α-L-鼠李糖苷酶的重要应用价值，越来越多的国内外学者致力于该酶的研究开发。

微生物分泌的α-L-鼠李糖苷酶是一种诱导酶，需要诱导物柚皮苷、橙皮苷、鼠李糖等存在时才能合成α-L-鼠李糖苷酶，而且微生物中α-L-鼠李糖苷酶的诱导受到碳源代谢调节，给微生物发酵产α-L-鼠李糖苷酶造成阻碍。同时随着α-L-鼠李糖苷酶的应用越来越广泛，传统发酵的生产方式不能满足日益增长的需求，也很难达到很高的纯度。因此，选择现代分子生物学技术构建高效重组表达α-L-鼠李糖苷酶的生产菌株是一种必然趋势。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一株高产鼠李糖苷酶的黑曲霉菌株及其应用。申请人首先构建得到重组表达鼠李糖苷酶基因的黑曲霉工程菌株，然后进一步通过紫外诱变方法筛选获得一株鼠李糖苷酶高产菌株，有利于降低该酶的生产成本，应用前景广阔。

本发明一方面提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带有鼠李糖苷酶基因。

所述鼠李糖苷酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明一方面提供了一种黑曲霉工程菌株，所述菌株携带有上述重组质粒。

本发明还提供了一种突变菌株黑曲霉Su12-3944B（Aspergillus niger Su12-3944B），是以上述的黑曲霉工程菌为出发菌株通过紫外诱变获得的。

所述突变菌株已于2019年6月5日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019432。

本发明还提供了所述黑曲霉突变菌株在生产鼠李糖苷酶中的应用。

本发明将来源于棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）的鼠李糖苷酶基因在黑曲霉宿主中过表达，构建得到黑曲霉Su12-3944A。20L罐发酵160h后，该菌株发酵上清液中鼠李糖苷酶酶活达到479 U/ml。

为了提高鼠李糖苷酶的产量，申请人以黑曲霉Su12-3944A为出发菌株，进一步通过紫外诱变的方法筛选获得一株突变菌株黑曲霉Su12-3944B，能大幅度提高鼠李糖苷酶的产量。20L罐发酵160h后，该突变菌株发酵上清液中鼠李糖苷酶酶活达到1002 U/ml，比出发菌提高了109.2%，取得了意料不到的技术效果。所述黑曲霉菌株可广泛应用于鼠李糖苷酶的生产，从而有利于降低鼠李糖苷酶的生产成本，促进其在食品加工领域中的推广与应用。

附图说明

图1为质粒pSU图谱；

图2为pH-相对酶活曲线；

图3为温度-相对酶活曲线；

图4为20L罐发酵曲线；

图5为SDS-PAGE蛋白电泳图，其中：M为蛋白分子量Marker，泳道1、2分别为出发菌黑曲霉Su12-3944A、突变菌黑曲霉Su12-3944B发酵上清液。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1 鼠李糖苷酶基因的克隆

以棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）基因组为模板，利用引物1和引物2扩增出鼠李糖苷酶基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

PCR引物和反应条件如下：

引物1（F）：ATGTTGTGGTCATCCTGGATC；

引物2（R）：CTATAGCCCCTTCAAGGTCCA。

反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸120s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，扩增得到的鼠李糖苷酶基因大小为1845bp。

实施例2 重组载体的构建

PCR扩增上述鼠李糖苷酶基因，引物两端引入XbaI位点。引物序列如下：

引物3（F）：GTATCTAGA ATGTTGTGGTCATCCTGGATC；

引物4（R）：GACTCTAGACTATAGCCCCTTCAAGGTCCA。

PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸120s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，鼠李糖苷酶基因为大小1845bp的片段。

将上述获得的鼠李糖苷酶基因片段与表达载体pSU分别进行限制性内切酶XbaI单酶切，酶切条件如下：

PCR片段酶切体系（50ul）	质粒pSU酶切体系（50ul）
		PCR片段 20ul	pTG质粒 20ul
10*M 5ul	10*M 5ul
		BSA 5ul	BSA 5ul
XbaI 2ul	XbaI 2ul
		ddH<sub>2</sub>O 18ul	ddH<sub>2</sub>O 18ul

37℃水浴酶切处理2h，电泳后分别回收两个目的片段，溶于20 ul ddH₂O。用T4 DNA连接酶进行连接，连接体系如下：

PCR片段	2ul
		pSU	2ul
10*Buffer	1ul
		T4 DNA ligase	1ul
ddH<sub>2</sub>O	4ul
		总体积	10ul

22℃连接1h，转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布LB+AMP平板，37℃培养过夜后长出单菌落，菌落PCR验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到含有鼠李糖苷酶基因的重组载体pSU-3944。

实施例3 鼠李糖苷酶的重组表达

1、原生质体制备：

接种黑曲霉宿主菌Su12于PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine 1%；琼脂粉1.5%）平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine 1%）培养基中，30℃培养16h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。

2、 转化：

将上述获得的黑曲霉Su12原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到10⁸个/ ml；每200ul原生质体中分别加入10ul准备好的重组载体pSU-3944，加入50ul 25%的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25%的PEG6000，室温放置5min；加入4ml 山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。

3、转化子筛选：

培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养3d。将正常生长的转化子分别接种到新鲜的PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种50ml液体摇瓶培养基（麦芽糖12%；玉米浆1.5%；硫酸铵0.5%；硫酸镁0.3%；硫酸钾0.37%；氯化钙0. 1125%；微量元素0.1%）中发酵，30℃培养5d。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，进行SDS-PAGE蛋白电泳检测及鼠李糖苷酶酶活力检测。

申请人将鼠李糖苷酶酶活最高的阳性转化子命名为黑曲霉Su12-3944A（Aspergillus niger Su12-3944A），该菌株发酵上清液中鼠李糖苷酶活力为97 U/ml。

（1）鼠李糖苷酶酶活单位的定义

在50℃、pH值为4.8 的条件下，每分钟从浓度为5 mmol/L的4-硝基苯基 α-L-阿拉伯呋喃糖苷的溶液中降解释放1微摩尔对硝基酚所需要的酶量为一个酶活力单位U。

（2）酶活测定方法

5 mmol/L 4-硝基苯基 α-L-阿拉伯呋喃糖苷溶液：准确称取4-硝基苯基 α-L-阿拉伯呋喃糖苷0.0713g,精确到0.0001g，缓缓加入相应的缓冲液接近50ml，磁力搅拌约10min，用2mol/L的柠檬酸或者氢氧化钠调相应的pH值，最后定容到50ml，现用现配。

酶液：用pH4.8的柠檬酸钠缓冲液稀释至适当倍数，控制吸光值在0.2-0.4范围。

标准曲线的绘制：将5mmol/L对硝基苯酚溶液精确稀释10倍，再分别稀释2、4、6、8、10、12、16倍。

取0.5mL上述对硝基苯酚稀释液（空白对照取缓冲液），加入碳酸钠溶液2mL，加入底物溶液0.5mL，混合均匀，以空白对照调零，以在410nm测定吸光值。

以体系中对硝基苯酚的含量为横坐标（X），吸光值为纵坐标（y），绘制标准曲线y=kA+b。

稀释倍数	空白对照	16	12	10	8	6	4	2
									体系中对硝基苯酚含量（μmol）	0	0.0156	0.0208	0.025	0.0313	0.0417	0.0625	0.125

测定：取适量底物，50℃预热5min；

取四支15×150试管 (一支空白管，三支样品管)，分别向四支管中，准确加入用已稀释好的酶液0.5mL；

将四支试管同时置于50±0.1℃水浴中，预热2min；

准确向样品试管中加入0.5mL底物溶液，准确计时15min；

迅速、准确地向各管中加入碳酸钠溶液2.0ml，于空白管中准确加入底物溶液0.5ml，摇匀。

以空白管调零，在分光光度计波长410nm下，用10mm比色杯，分别测量。

三支样品管中样液的吸光度，取平均值。

通过查标准曲线或用线性回归方程求出对硝基苯酚的含量。

酶活计算公式：A=X×1/0.5×n/15

式中：

A—鼠李糖苷酶酶活力，U/g(或U/ml)；

X—吸光度在标准曲线上查得 (或计算出)的对硝基苯酚含量，μmol；

1/0.5—所加入的酶液体积；

n—酶样的稀释倍数；

15—时间换算系数。

实施例4 诱变筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以黑曲霉Su12-3944A为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其鼠李糖苷酶的产量。

1、确定致死率：

接种黑曲霉工程菌Su12-3944A于PDA平板，30℃培养5-7d。待菌落表面产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液（浓度为1×10⁷/ml），加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射90s时，致死率为96%，选取该照射时间进行后续诱变实验。

2、第一轮诱变筛选

取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液（浓度为1×10⁷/ml），加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射105s后稀释1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d。

第一轮筛选共涂布190块PDA平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出20-40个菌落，先通过菌落形态，筛选短分枝的突变体。申请人挑取菌落形态较小、菌丝致密、菌落周围绒毛较短的突变菌共96个，分别接种到PDA平板，30℃培养5-7d。每个突变菌割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种50 ml液体摇瓶培养基中发酵，30℃培养5d。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行蛋白电泳检测及鼠李糖苷酶酶活力检测。同时以出发菌黑曲霉Su12-3944A作为对照组。

结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的96株突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液中鼠李糖苷酶酶活高于出发菌；其中，88株突变菌的酶活与出发菌基本相当，其余突变菌的酶活甚至比出发菌降低了5-10%。

申请人按照上述方法继续进行了12轮诱变筛选，最终获得一株鼠李糖苷酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为黑曲霉Su12-3944B（Aspergillus niger Su12-3944B）。该突变菌株摇瓶发酵上清液中鼠李糖苷酶酶活力达到157 U/ml，比出发菌提高了61.9%。

实施例5 鼠李糖苷酶的酶学性质分析

1、最适作用pH值

采用pH值分别为2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0的缓冲液，将出发菌黑曲霉3944A和突变菌黑曲霉3944B发酵上清液进行稀释，鼠李糖苷酶底物也分别用对应pH值的缓冲液配制，在50℃条件下进行鼠李糖苷酶活力测定，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图2所示，本发明提供的突变菌黑曲霉3944B发酵上清液中鼠李糖苷酶的pH-相对酶活曲线与出发菌基本相同，最适作用pH均为4.5-5.5。

2、最适作用温度

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃，pH4.8条件下，测定出发菌黑曲霉3944A和突变菌黑曲霉3944B发酵上清液的鼠李糖苷酶活力，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图3所示，本发明提供的突变菌黑曲霉3944B发酵上清液中鼠李糖苷酶的温度-相对酶活曲线与出发菌基本相同，最适作用温度均为60℃。

综上所述，与出发菌重组表达的鼠李糖苷酶相比，本发明提供的突变菌黑曲霉3944B重组表达的鼠李糖苷酶的酶学性质未发生明显的变化。

申请人进一步将出发菌黑曲霉Su12-3944A和突变菌黑曲霉Su12-3944B分别进行20L罐发酵，发酵曲线如图4所示，发酵上清液SDS-PAGE电泳检测结果如图5所示。发酵160h后，出发菌发酵上清液中鼠李糖苷酶酶活达到479 U/ml，而突变菌黑曲霉Su12-3944B发酵上清液中鼠李糖苷酶酶活高达1002 U/ml，比出发菌提高了109.2%，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2019年6月5日将突变菌株黑曲霉Su12-3944B（Aspergillus nigerSu12-3944B）保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019432。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种高产鼠李糖苷酶的黑曲霉菌株

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 660

<212> PRT

<213> 棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)

<400> 1

Met Leu Trp Ser Ser Trp Ile Leu Thr Pro Ala Leu Leu Ala Ile Gly

1 5 10 15

Ser His Ala Val Pro Phe Glu Asp Tyr Ile Leu Ala Pro Gln Ser Arg

20 25 30

Thr Leu Asn Pro Ser Leu Val Tyr Gln Val Asn Gly Thr Val Asp Asn

35 40 45

Pro Glu Ala Leu Val Gly Leu Thr Thr His Gln Thr Thr Leu His Gly

50 55 60

Lys Ser Ser Val Thr Tyr Asp Phe Gly Arg Asn Ile Ala Gly Ile Val

65 70 75 80

Ser Leu Asp Val Thr Ser Val Ser Ser Lys Ala Ala Gln Leu Gly Val

85 90 95

Thr Phe Thr Glu Ser Ser Leu Trp Ile Ser Ser Glu Ala Cys Asp Ala

100 105 110

Thr Ser Asp Ala Gly Leu Asp Ser Pro Leu Trp Phe Ser Val Gly His

115 120 125

Gly Pro Gly Thr Tyr Gly Ala Asp Lys Lys His Leu Arg Gly Ala Phe

130 135 140

Arg Tyr Leu Thr Leu Val Asn Asn Ser Thr Ala Thr Ile Ser Leu Asp

145 150 155 160

Gly Leu Ser Ile Asn Tyr Thr Ala Ala Pro Thr Gln Asp Leu Arg Gly

165 170 175

Tyr Lys Gly Tyr Phe His Ser Ser Asp Glu Leu Ile Asn Arg Ile Trp

180 185 190

Tyr Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Gln Leu Cys Thr Ile Asp Pro Thr Thr

195 200 205

Gly Asp Ser Leu Ile Trp Leu Gly Val Ile Ser Ser Ser Asp Asn Ile

210 215 220

Thr Leu Pro Gln Thr Asp Ser Trp Trp Asn Asn Tyr Thr Ile Thr Asn

225 230 235 240

Gly Ser Thr Thr Leu Val Asp Gly Ala Lys Arg Asp Arg Leu Val Trp

245 250 255

Pro Gly Asp Met Ser Ile Ala Ile Glu Ser Ala Ala Val Ser Thr Ala

260 265 270

Asp Leu Glu Ser Val Arg Thr Ala Leu Glu Ser Leu Phe Val Leu Gln

275 280 285

Lys Ala Asn Gly Gln Leu Pro Tyr Ala Gly Arg Pro Phe Leu Asp Ile

290 295 300

Val Ser Phe Thr Tyr His Leu His Ser Leu Ile Gly Ala Ser Ser Tyr

305 310 315 320

Tyr Gln Tyr Thr Gly Asp Arg Ser Trp Ile Thr Arg Tyr Trp Gly Gln

325 330 335

Tyr Lys Lys Gly Leu Gln Trp Ala Leu Ser Ser Leu Asp Asn Ser Gly

340 345 350

Leu Ala Asn Ile Thr Ala Ser Ala Asp Trp Leu Arg Phe Gly Met Gly

355 360 365

Gly His Asn Ile Glu Ala Asn Ala Ile Leu Tyr Tyr Val Leu Asn Asp

370 375 380

Ala Ile Ser Leu Ala Ser Ser Leu Asp Asp Arg Ala Asn Val Gly Asn

385 390 395 400

Trp Ser Thr Ala Ala Ser Lys Ile Lys Ala Ala Ala Asn Ala Arg Leu

405 410 415

Trp Asp Ala Gln Asn Ser Leu Tyr Arg Asp Asn Glu Thr Thr Thr Leu

420 425 430

His Pro Gln Asp Gly Asn Ala Trp Ala Ile Lys Ala Asn Leu Thr Leu

435 440 445

Ser Ser Asn Gln Ser Glu Ala Ile Ser Ser Ala Leu Ala Ala Arg Trp

450 455 460

Gly Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Pro Glu Ala Gly Ser Thr Val Ser Pro

465 470 475 480

Phe Ile Gly Gly Phe Glu Leu Gln Ala His Tyr Leu Ala Asn Glu Pro

485 490 495

Asp Arg Ala Leu Asp Leu Leu Arg Leu Gln Trp Gly Phe Met Leu Asp

500 505 510

Asp Pro Arg Met Thr Asn Ser Thr Phe Ile Glu Gly Tyr Ser Thr Asp

515 520 525

Gly Ser Leu Ala Tyr Ala Pro Tyr Arg Asn Thr Pro Arg Val Ser His

530 535 540

Ala His Gly Trp Ser Thr Gly Pro Thr Ser Ala Leu Thr His Tyr Thr

545 550 555 560

Ala Gly Leu Arg Leu Thr Gly Pro Ala Gly Ser Thr Trp Leu Phe Lys

565 570 575

Pro Gln Pro Gly Asn Leu Thr Glu Val Gln Ala Gly Phe Glu Thr Gln

580 585 590

Leu Gly Leu Phe Ala Thr Gln Tyr Gln Lys Ser Ala Thr Gly Thr Phe

595 600 605

Gln Gln Leu Thr Phe Thr Ala Pro Asn Gly Thr Ser Gly Ser Val Glu

610 615 620

Ile Glu Gly Ala Thr Gly Gln Leu Ile Ser Lys Arg Gly Gln Ala Val

625 630 635 640

Lys Leu Val Asn Gly Lys Ala Arg Gly Leu Gln Gly Gly Thr Trp Thr

645 650 655

Leu Lys Gly Leu

660

<210> 2

<211> 1983

<212> DNA

<213> 棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)

<400> 2

atgttgtggt catcctggat cttgactccg gccttgctgg ccattggctc gcacgccgtt 60

ccttttgaag actatattct tgccccccaa tcaaggacct tgaatccttc attggtgtat 120

caggtcaacg gaactgtgga caatcctgaa gctctcgtcg gtcttacaac ccaccagaca 180

actcttcatg gcaagtcgtc cgtgacttat gattttggtc gcaatattgc tggtatagta 240

tctctggatg tgacttcggt ctcttccaaa gcagctcaac ttggagttac tttcacagag 300

tcgagcttgt ggataagcag cgaggcatgc gatgctacca gcgatgctgg tcttgattcg 360

cctctttggt tctcagtggg ccatggacca ggaacctacg gtgcggacaa gaagcacctt 420

cggggtgcgt tccgatacct cacacttgtc aacaattcta ccgccactat atccctggat 480

ggtctcagca tcaactacac cgcggctcct actcaagatc ttcgcggtta caaaggctac 540

ttccacagca gcgatgagct tatcaatcgg atctggtatg caggtgctta taccttgcag 600

ctctgcacaa ttgatcccac caccggagac tccttgatct ggttgggcgt gatatcttca 660

tccgataaca ttactctgcc tcaaaccgat tcctggtgga acaattacac tatcactaac 720

ggcagtacta ctctcgttga tggagcgaag cgtgatcgct tggtctggcc gggcgatatg 780

tcaattgcta tagaaagcgc ggcagtcagc accgcggatc tcgaaagtgt tcgcacagct 840

ttggagtctt tgttcgtgct tcagaaggca aatggtcaac ttccttatgc aggcaggcca 900

ttcctggata ttgtgagctt cacataccac ctccacagtt tgatcggcgc gtcgtcctat 960

tatcaataca ctggagaccg aagctggatc actcgttact gggggcaata caagaaaggt 1020

ctgcaatggg cattgtcgag cctggacaat tcaggtcttg ccaatatcac agccagtgcc 1080

gactggctac gattcggtat gggtggacat aacatcgaag ctaatgcgat cctttactac 1140

gtcctcaatg acgccatctc tctggcaagc tctctcgatg atcgcgccaa cgtgggcaat 1200

tggagcacag ctgcatcgaa gatcaaagcg gctgccaacg cccgtctctg ggacgcacaa 1260

aatagcctat accgggacaa cgagaccacg acacttcacc cacaagatgg caatgcttgg 1320

gccattaaag cgaatctaac actttcttct aatcaatctg aagctatttc ttctgctcta 1380

gcggcacggt ggggacctta tggagcaccc gcccctgaag ctgggtcaac tgtgtctccc 1440

tttatcggcg ggttcgagct gcaagcgcat tatttagcta atgaaccaga tcgagcacta 1500

gatcttctgc gcctgcagtg ggggttcatg cttgacgacc cacgcatgac aaattctact 1560

tttatcgaag gttactcaac cgatgggtca ctggcctatg ctccttatcg aaacacaccg 1620

cgagtgtccc atgcccacgg atggtctacg ggtcccacct ccgctctcac acattacaca 1680

gcgggtttgc gtctaactgg tcccgctggc tcgacttggt tattcaagcc tcaacctggt 1740

aacctcactg aggtccaagc cggatttgaa acacaattgg gactattcgc aactcaatat 1800

cagaagtctg caaccgggac gtttcagcag ttgacattta ctgcgccgaa tggcacttcg 1860

gggtctgtgg agattgaggg cgctactggg cagctgatat ctaagcgtgg acaagctgtg 1920

aagttggtca atggcaaggc tcgaggtcta caagggggta cttggacctt gaaggggcta 1980

tag 1983

Claims (7)

1.一种黑曲霉工程菌株，其特征在于，所述的黑曲霉工程菌株携带有用于重组表达鼠李糖苷酶的重组质粒。

2.如权利要求1所述的黑曲霉工程菌株，其特征在于，所述的鼠李糖苷酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

3.如权利要求1或2所述的黑曲霉工程菌株，其特征在于，所述的鼠李糖苷酶，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

4.一种黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述的黑曲霉突变菌株是对权利要求3所述的黑曲霉工程菌株进行紫外诱变后筛选获得的。

5.如权利要求4所述的黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述的黑曲霉突变菌株的保藏编号为CCTCC NO: M2019432。

6.权利要求1所述的黑曲霉工程菌株在生产鼠李糖苷酶中的应用。

7.权利要求4或5所述的黑曲霉突变菌株在生产鼠李糖苷酶中的应用。