CN107988086B - 一种高产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的菌株 - Google Patents

一种高产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的菌株 Download PDF

Info

Publication number
CN107988086B
CN107988086B CN201711343443.0A CN201711343443A CN107988086B CN 107988086 B CN107988086 B CN 107988086B CN 201711343443 A CN201711343443 A CN 201711343443A CN 107988086 B CN107988086 B CN 107988086B
Authority
CN
China
Prior art keywords
aspergillus aculeatus
hydrolase
rhamnosan
microorganism aspergillus
rhamnosan galacturonic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711343443.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107988086A (zh
Inventor
徐晓东
周利伟
张珍珍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Weifang KDN Biotechnology Co., Ltd.
Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Original Assignee
Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd filed Critical Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority to CN201711343443.0A priority Critical patent/CN107988086B/zh
Publication of CN107988086A publication Critical patent/CN107988086A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107988086B publication Critical patent/CN107988086B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01171—Rhamnogalacturonan hydrolase (3.2.1.171), i.e. rhamnogalacturonase

Abstract

本发明属于微生物改造技术领域，具体内容涉及一株高产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的棘孢曲霉突变菌株。本发明以棘孢曲霉(Aspergiulls aculeatus)DSM2344为出发菌株，通过紫外诱变方法筛选获得突变菌株棘孢曲霉T13，其保藏编号为CCTCC NO:M2017784。所述突变菌株固体摇瓶发酵3.5d后，鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶酶活达到63.7u/g，比出发菌提高了41.6％，取得了意料不到的技术效果。本发明提供的棘孢曲霉突变菌株可广泛应用于鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，促进鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶在食品行业中的推广与应用。

Description

一种高产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的菌株
技术领域
本发明属于微生物改造技术领域，具体内容涉及一株高产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的棘孢曲霉突变菌株。
技术背景
高等植物的细胞壁是由纤维素，主要有半纤维素聚合体形成的互相支撑的结构、果胶基质聚合物和球形及非球形蛋白构成。除了球形蛋白以外，所有的聚合物在细胞壁中都起着结构性作用。当细胞壁成熟时，形成交连、链间和链内连接，最后木质素沉积在细胞壁上，从而使细胞壁变得非常稳定，使其组分难于分离、消化和处理。
果胶是在初级细胞壁和在所有植物细胞之间的中间层中富含的支化杂多糖的复杂基团。果胶聚合物是化学上不同的酸性分子，其含有比例较高的通过α-1,4糖苷键连接的D-半乳糖醛酸残基。这种果胶α-(1-4)多聚半乳糖醛酸主链可以被随机乙酰化和甲基化。果胶由两个基本部分组成，如：一个基本的由半乳糖醛酸基(同型聚半乳糖醛酸，作为光滑区是已知的)组成的无支链聚合物和一个由鼠李糖基与半乳糖醛酸基交替形成的聚合物，后一种聚合物能被长的中性侧链(鼠李聚糖半乳糖醛酸I，带有“毛发”，作为毛发状区是已知的)所取代。果胶多糖构成双子叶植物细胞壁的30-50％，植物细胞壁的果胶基质是同型聚半乳糖醛酸(HGA)、鼠李聚糖半乳糖醛酸I(RG-I)和鼠李聚糖半乳糖醛酸II(RG-II)聚合物的复杂混合物。
在动物饲料工业和食品工业中，果胶用作胶凝剂。在反刍动物中，消化道中的细菌和真菌酶有助于其消化。果胶降解酶可将来自柑橘皮和甜菜加工的富含果胶的副产物转化为更高价值的物质，具有商业利益。果胶分解酶(诸如酯酶、水解酶和裂解酶)也用在需要加工果胶的其它工业中。
许多能够水解毛发状区域中的阿拉伯聚糖、半乳聚糖或阿拉伯半乳聚糖侧链的酶已被报道。相反，只有少数能够降解鼠李聚糖半乳糖醛酸骨架的酶被报道。有报道表明，已克隆出来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)属于糖基水解酶28家族的鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶和属于裂解酶4家族的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
美国专利US20030026810公开了一种来源于细菌的新型鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶，根据基于疏水聚类分析的分类，该鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶被认为是两个迄今未确定的糖基水解酶家族的成员。新型鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶与已知来自28家族的鼠李糖聚半乳糖醛酸水解酶或来自裂解酶4家族的鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶的氨基酸序列没有同源性。
目前生产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的菌株比较少，且产量较低，不利于该酶的广泛应用，因此筛选高产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的微生物菌种具有重要的意义。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一株高产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的棘孢曲霉(Aspergiulls aculeatus)菌株及其应用。申请人以购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)、保藏号为DSM 2334的棘孢曲霉为出发菌株，通过紫外诱变的方法，筛选获得一株突变菌株，能大幅度提高鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的产量，效果显著。
本发明一方面提供了一种突变菌株棘孢曲霉T13(Aspergiulls aculeatus T13)，已于2017年12月11日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017784。
本发明一方面提供了所述棘孢曲霉在生产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶中的应用。
本发明还提供了一种生产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的方法，是以所述棘孢曲霉为发酵菌株。
本发明还提供了一种鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶，是由所述棘孢曲霉发酵获得的。
本发明以棘孢曲霉(Aspergiulls aculeatus)DSM2344为出发菌株，通过紫外诱变方法筛选获得突变菌株棘孢曲霉T13。所述突变菌株固体摇瓶发酵3.5d后，鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶酶活达到63.7u/g，比出发菌提高了41.6％，取得了意料不到的技术效果。本发明提供的棘孢曲霉突变菌株可广泛应用于鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，促进鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶在食品行业中的推广与应用。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。
实施例1棘孢曲霉DSM2344固体摇瓶发酵及酶活检测
棘孢曲霉(Aspergiulls aculeatus)DSM2344购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，保藏号为DSM No.2334。该菌株能发酵生产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶。
申请人首先将棘孢曲霉DSM2344接种到新鲜的PDA平板(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；琼脂粉1.5％)，30℃培养5d。
吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，接种50ml液体CSL-果糖种子培养基(麦芽糖10％；果糖5％；葡萄糖1％；玉米浆10％；硫酸镁0.05％；磷酸二氢钠0.1％；pH 5.8)，30℃培养2d。培养2d后，吸取2ml菌丝体接种5g固体摇瓶培养基，30℃培养3.5d，每天翻曲。培养结束后加40ml无菌水，搅拌2h洗脱，离心获得上清液即为粗酶液。将发酵上清液进行鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶酶活力测定，结果显示，所述发酵上清液中鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶酶活达到45u/g，从而说明棘孢曲霉DSM2344确实能够高产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶。
鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶酶活力检测
(1)鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶酶活单位的定义
在40℃，pH为4.0条件下，每分钟水解7mg/ml鼠李糖半乳糖醛酸聚糖底物，生成等同于1微摩尔半乳糖醛酸的还原糖的酶量定义为一个活力单位(IU)。
(2)酶活测定方法
(2.1)试剂和溶液：
底物：AZCL-Rhamnogalacturonan(Megazyme，T-RHAM)
50mM乙酸钠缓冲液：秤取冰醋酸3.05g，溶于900ml蒸馏水，用1MNaOH溶液调节pH到4.0(约12ml)，加入0.2g叠氮化钠，定容至1L，4℃储存6个月；
终止液2％磷酸三钠溶液：秤取20g磷酸三钠溶于900ml蒸馏水中，用1M HCL调节pH到11.0，定容至1L，室温储存6个月；
(2.2)样品溶液的制备：
准确吸取酶液1ml，用19ml乙酸钠缓冲液稀释，该溶液当做母液，再用乙酸钠缓冲液稀释到适当倍数测酶活，使590nm吸光值在0.2～1.4范围。
(2.3)酶活力测定：
取经过适当稀释的酶液0.5ml于试管中，40℃放置5min；
加入AZCL-Rhamnogalacturonan片剂，静置不要搅拌，计时10min后，加入10ml磷酸三钠终止液，涡旋震荡后立即放到室温；
室温放置5min，冷却后，再次涡旋混匀，用Whatman No.1(9cm)滤纸过滤，过滤后590nm比色读数；
空白管中酶液先加入终止液，再加入AZCL-Rhamnogalacturonan片剂。
酶活计算公式：
酶活力(U/ml)：X＝Y×(1/1000)×2×n
式中：Y――标准曲线计算出的酶活mU/ml；
1/1000――mU到U的转换系数；
2――酶液0.5ml到1ml的转换系数；
n――稀释倍数；
实施例2诱变筛选
申请人以棘孢曲霉(Aspergiulls aculeatus)DSM2344为出发菌株，进一步通过紫外诱变的方法筛选鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶产量提高的突变菌株。
2.1确定致死率
将出发菌株棘孢曲霉DSM2344接种于PDA平板，30℃培养5d。待菌落表面产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度约为1×107个/mL)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、60s、90s、120s、150s、180s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射150s时，致死率为99％，选取该照射时间进行后续诱变实验。
2.2诱变筛选
取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×107个/mL)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射150s后稀释1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d。
共涂布100块PDA平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出10-20个菌落。首先通过观察菌落形态，筛选出菌落形态发生显著变化的突变菌共56个，分别接种到PDA平板，30℃培养5d；每个突变菌菌落用5ml无菌水进行洗脱，获得孢子液；分别接种至50ml液体CSL-果糖种子培养基，30℃培养2d；然后分别吸取2ml菌丝体接种至5g固体摇瓶培养基(麸皮2g；木质纤维素2g；阿拉伯树胶粉1g)，30℃培养3.5d，每天翻曲；培养结束后加40ml无菌水，搅拌2h洗脱，离心获得上清液即为粗酶液。
通过对上述获得的粗酶液进行鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶酶活力检测，申请人最终筛选出一株鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶产量最高的突变菌株，命名为棘孢曲霉T13(Aspergiulls aculeatus T13)，该菌株发酵获得的粗酶液中鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的酶活达到63.7u/g，较出发菌提高41.6％，取得了意料不到的技术效果。
申请人已于2017年12月11日将上述突变菌株棘孢曲霉T13(Aspergiullsaculeatus T13)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2017784。

Claims (3)

1.一种棘孢曲霉，其特征在于，所述的棘孢曲霉为棘孢曲霉（Aspergiullsaculeatus），其保藏编号为CCTCC NO:M2017784。
2.权利要求1所述的棘孢曲霉在生产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶中的应用。
3.一种生产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的方法，其特征在于，所述的方法是以权利要求1所述的棘孢曲霉为发酵菌株进行发酵来生产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶。
CN201711343443.0A 2017-12-14 2017-12-14 一种高产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的菌株 Active CN107988086B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711343443.0A CN107988086B (zh) 2017-12-14 2017-12-14 一种高产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的菌株

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711343443.0A CN107988086B (zh) 2017-12-14 2017-12-14 一种高产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的菌株

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107988086A CN107988086A (zh) 2018-05-04
CN107988086B true CN107988086B (zh) 2019-11-08

Family

ID=62038378

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711343443.0A Active CN107988086B (zh) 2017-12-14 2017-12-14 一种高产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的菌株

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107988086B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112961852B (zh) * 2019-12-12 2023-11-21 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种启动子及其在棘孢曲霉基因自克隆表达中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1139457A (zh) * 1993-12-01 1997-01-01 诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司 曲霉表达系统
CN104013057A (zh) * 2014-05-26 2014-09-03 南昌大学 一种富含多酚的南酸枣汁饮料的生产方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1139457A (zh) * 1993-12-01 1997-01-01 诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司 曲霉表达系统
CN104013057A (zh) * 2014-05-26 2014-09-03 南昌大学 一种富含多酚的南酸枣汁饮料的生产方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
一种棘孢曲霉α-L-鼠李糖苷酶的结构及性质特征研究;于越 等;《现代食品科技》;20151231;第82-92，参见全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107988086A (zh) 2018-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107488615B (zh) 一株高产脂肪酶的假单胞菌及其发酵产酶方法
Ilgın et al. Statistical and kinetic modeling of Aspergillus niger inulinase fermentation from carob extract and its partial concentration
CN107760606A (zh) 一种里氏木霉突变菌株及其应用
CN112375755A (zh) 一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法
CN103937691B (zh) 一株产β‑果糖苷酶的米曲霉菌株及其培养方法与应用
CN111100825A (zh) 一株芽孢杆菌及其在工业中的应用
CN107988086B (zh) 一种高产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的菌株
CN104911135B (zh) 一种海藻糖合酶生产菌株及其应用
CN104342372B (zh) 一种利用益生菌发酵生产酵母水解物的方法
Fernandes et al. Low-cost agro-industrial sources as a substrate for the production of l-asparaginase using filamentous fungi
CN107603884A (zh) 一株高产中性纤维素酶的里氏木霉突变菌株
CN107739721A (zh) 产琼胶降解酶的芽孢杆菌Bacillus sp.W2017及其应用
CN107446904B (zh) 一种脂肪酶及其生产方法与应用
CN106754829B (zh) 一种利用芽孢杆菌hs17发酵生产壳聚糖酶的方法及其应用
CN110172407A (zh) 一株产果糖基转移酶的米曲霉及其应用
CN109456898A (zh) 一种球毛壳菌右旋糖酐酶的发酵制备及其应用
CN107988085B (zh) 一种高产酸性果胶酶的棘孢曲霉菌株及其应用
CN101942401A (zh) 一株产几丁质酶菌株及高产几丁质酶的方法
CN112143681B (zh) 一株可产阿魏酸酯酶的贝莱斯芽孢杆菌及其应用
CN114369558B (zh) 一株粘质沙雷氏菌及其在生产柚苷酶中的应用
FI72343B (fi) Foerfarande foer framstaellning av enzymet beta-glukanas genomfermentering av svampen rhizomucor pusillus
CN110564629A (zh) 一株里氏木霉及其培养方法与应用
CN109439559A (zh) 一株产阿魏酸酯酶的乳酸片球菌
CN103740599B (zh) 一种α-转移葡萄糖苷酶的生产菌株及其应用
CN114958623B (zh) 一株高产纤维素酶的盖姆斯木霉及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20191031

Address after: Miao road Laoshan District 266061 Shandong city of Qingdao province Shandong No. 29 high building 12A07

Co-patentee after: Weifang KDN Biotechnology Co., Ltd.

Patentee after: Qingdao Weilan Biology Group Co., Ltd.

Address before: Miao road Laoshan District 266061 Shandong city of Qingdao province Shandong No. 29 high building 12A07

Patentee before: Qingdao Weilan Biology Group Co., Ltd.

TR01 Transfer of patent right