CN101942401A - 一株产几丁质酶菌株及高产几丁质酶的方法 - Google Patents
一株产几丁质酶菌株及高产几丁质酶的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101942401A CN101942401A CN2009102642030A CN200910264203A CN101942401A CN 101942401 A CN101942401 A CN 101942401A CN 2009102642030 A CN2009102642030 A CN 2009102642030A CN 200910264203 A CN200910264203 A CN 200910264203A CN 101942401 A CN101942401 A CN 101942401A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chitinase
- strain
- enzyme
- producing
- seed culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
一株产几丁质酶菌株及高产几丁质酶的方法，属于生物技术领域。本发明提供了一株高产几丁质酶的菌株(Chitinolyticbactermeiyuanensis)SYBC-H1。已保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC3483，保藏日期2009年11月30日。同时还发明了以该菌为出发菌种，经种子培养和已优化的产酶培养基发酵生产几丁质酶的方法，发酵液酶活最高可达6.0U/ml以上。所制备的酶可高效水解几丁质，生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖，可广泛用于化工、医药、食品、材料、染料等领域。
Description
技术领域
本发明利用一株高产几丁质酶的菌株(细菌类)，为变形菌纲的一个新种，我们将其分类命名为Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1及利用该菌株为出发菌种，经种子培养和已优化的培养基发酵产几丁质酶的方法，所制备的酶可高效水解几丁质，所生成的N-乙酰-D-氨基葡萄糖，可广泛用于化工、医药、食品、材料、染料等领域，属于生物技术领域。
背景技术
几丁质酶可高效降解几丁质，生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖。研究表明：N-乙酰-D-氨基葡萄糖是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位，尤其是甲壳类动物的外骨骼含量最高。它是合成双歧因子的重要前体，在生物体内具有许多重要生理功能。临床上用于治疗风湿性及类风湿性关节炎。也可以作为食品抗氧化剂及婴幼儿食品添加剂，糖尿病患者甜味剂。主要用于临床增强人体免疫系统的功能，抑制癌细胞或纤维细胞的过度生长，对癌症和恶性肿癌起到抑制和治疗作用；对于各种炎症，能起到有效的治疗，对骨关节炎及关节疼痛也有治疗作用。
几丁质酶的价格极为昂贵，如日本的chitin T-1几丁质酶市价为每50毫克20000日元
由于几丁质酶具有广阔的应用前景和极高的经济开发价值，世界上一些发达国家都在进行生物技术生产几丁质酶的研究。为此，我们确定筛选高产几丁质酶的新菌株，并建立利用新菌株发酵生产几丁质酶的方法作为博士论文研究课题，取得了突破性的进展。
发明内容
本发明的目的利用一株高产几丁质酶的菌株(细菌类)，为变形菌纲的一个新种，我们将其分类命名为Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1及利用该菌株为出发菌种，经种子培养和已优化的培养基发酵产几丁质酶的方法，所制备的酶可高效水解几丁质，生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖，可广泛用于化工、医药、食品、材料、染料等领域，来替代价格昂贵的进口的几丁质酶。
本发明的技术方案：一株高产几丁质酶的菌株(细菌类)，为变形菌纲的一个新种，我们将其分类命名为Chitinolyticbacter meiyuanensis)SYBC-H1已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC3483。
用CGMCC3483菌株为出发菌种，经种子培养和已优化的培养基发酵产几丁质酶的方法；工艺为：
(1)种子培养
种子培养基(以质量浓度计)：磷酸二氢钾0.07，磷酸氢二钾0.03，硫酸镁0.05，七水硫酸亚铁0.001，酵母浸出物0.4，葡萄糖0.2，蛋白粉0.4。
培养条件：从平板上处于指数生长期的该菌菌落取两接种环接种于盛有50ml种子培养基的250ml三角瓶中进行培养，pH值：7.0，温度：30℃，转速200rpm，培养时间：12h。
(2)产酶培养
产酶培养基：磷酸二氢钾(0.05-0.1)，磷酸氢二钾(0.02-0.06)，硫酸镁(0.03-0.07)，七水硫酸亚铁(0.001-0.005)，酵母浸出物(0.2-0.4)，葡萄糖(0.10-0.30)，尿素(0.4-1.0)，几丁质粉粒(1-2)。
产酶条件：再以2％-6％接种量，进行5L发酵罐发酵，pH：7.0-8.5，温度：26-36，发酵时间：60-84h，转速：200-500prm，通气量：1.0-2.0L/min/L。
根据上述条件，在5L的发酵罐中进行发酵，发酵液几丁质酶活最高可达6U/ml。
本发明从不同环境条件下的土壤中筛选出一种高产几丁质酶的新菌种，分类命名为Chitinolyticbacter meiyuanensisSYBC-H1。
本菌株的筛选和菌种鉴定：
1.1采集大量不同环境条件下的土壤样品，取1g土壤样本加到灭菌后的含1％粉末几丁质的50ml溶液中，培养24h后，对培养液进行无菌稀释适当倍数，涂布于种子培养基(含1％琼脂)平板培养。挑选产生透明圈较大的单菌落进行斜面保存。
1.2将筛选到的菌株，用产酶培养基进行液体摇瓶发酵。最终筛选到一株产几丁质酶活力较高的菌株(图1)，经生理生化鉴定(见表1)和电镜观察(见图2)及16S rDNA序列鉴定(见序列SEQ ID NO：1)，发现该菌株为一株产几丁质酶的新种，我们将其分类命名为Chitinolyticbacter meiyuanensisSYBC-H1。
表1：SYBC-H1的部分生理生化试验
| 项目\类别 | 淀粉水解 | V-P试验 | H2S生成 | H2O2的生成 | 明胶液化 | 石蕊、牛乳 | 甲基红试验 | 乙醇的氧化 |
| SYBC-H1 | + | - | - | - | + | - | + | - |
2、酶活的测定方法
发酵液经6000rpm、4℃、10min离心后，取0.5ml上清液，加入1ml 0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 6.5)，0.5ml 0.5％的胶体几丁质(W/V)，37℃保温30min，取出后加入DNS试剂0.5ml，沸水浴10min后，迅速用冰水冷至室温，6000rpm离心8min，530nm处比色，重复三次，取平均值作试验结果，同时以高温灭活的上清液同样处理作为对照，最后以OD530的平均值来计算还原糖的含量，计算出酶活。酶活力定义为在上述条件下每分钟释放相当于1mmolNAG所需要的酶量为一个酶活单位(U)。
本发明的有益效果：首先提供了一株高产几丁质酶的菌株为出发菌及利用该出发菌采用液体发酵制备几丁质酶的方法。本发明的菌种和发酵产酶方法与其他菌种和制备几丁质酶方法相比较，具有酶活力高，发酵技术简便和成本低的优点，且生产的几丁质酶可高效水解几丁质，因此，本发明的菌种和发酵产酶技术有着广泛的工业使用价值和显著的经济效益前景。
附图表说明
图1Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1的平板菌落。
图2Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1的透射电镜形态。
生物材料样品保藏
Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2009年11月30日，保藏编号为CGMCC3483。
具体实施方式
实施例1
产酶培养基(以质量浓度计)：磷酸二氢钾(0.05)，磷酸氢二钾(0.02)，硫酸镁(0.03)，七水硫酸亚铁(0.001)，葡萄糖(0.10)，尿素(0.4)，几丁质粉粒(0.4)。
产酶条件：接种量2％：，进行5L发酵罐发酵，pH：8.5，温度：26℃，发酵时间：72h，转速：200prm，通气量：1.0L/min/L。
在以上条件下发酵，所得到的粗酶酶活可达5.2U/mL。摇瓶对照酶活为5.5U/mL。
实施例2
产酶培养基(以质量浓度计)：磷酸二氢钾(0.07)，磷酸氢二钾(0.05)，硫酸镁(0.06，七水硫酸亚铁(0.001)，葡萄糖(0.12)，尿素(0.4)，几丁质粉粒(0.4)。
产酶条件：接种量5％，进行5L发酵罐发酵，pH：7.5，温度：28℃，发酵时间：60h，转速：200prm，通气量：2.0L/min/L。
在以上条件下发酵，所得到的粗酶酶活可达6.0U/mL。摇瓶对照酶活为5.7U/mL.
实施例3
产酶培养基(以质量浓度计)：磷酸二氢钾(0.10)，磷酸氢二钾(0.06)，硫酸镁(0.07)，七水硫酸亚铁(0.001)，葡萄糖(0.3)，尿素(1.0)，几丁质粉粒(1.0)。
产酶条件：接种量5％：，进行5L发酵罐发酵，pH：8.0，温度：36℃，发酵时间：72h，转速：500prm，通气量：2.0L/min/L。
在以上条件下发酵，所得到的粗酶酶活可达5.4U/mL。摇瓶对照酶活为5.3U/mL。
序列表
<210>SEQ ID NO：1
<211>1526
<212>DNA
<213>Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1
agagtttgat cctggctcag cttgaacgct ggcggcatgc tttacacatg caagtcgaac 60
ggtaacaggg acttcggtcc gctgacgagt ggcgaacggg tgagtaatac atcggaacgt 120
gcctattagt gggggatagc ccggcgaaag ccggattaat accgcatacg ccctgagggg 180
gaaagtgggg gatcgcaaga cctcacgcta ttagagcggc cgatggctga ttagctagtt 240
ggtagggtaa aggcctacca aggcgacgat cagtagcggg tctgagagga cgacccgcca 300
cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atcttggaca 360
atgggcgcaa gcctgatcca gcaatgccgc gtgggtgaag aaggccttcg ggttgtaaag 420
cccttttgtc agggagcaaa tccttggagc taatatctcc cggggatgag agtacctgaa 480
gaataaggac cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt ccaagcgtta 540
atcggaatta ctgggcgtaa agcgtgcgca ggtggcttgt taagagcgat gtgaaatccc 600
cgggctcaac ctgggaactg cattgctgac tggctcgcta gagtgcggca gaggggggtg 660
gaattccacg tgtagcagtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccgat ggcgaaggca 720
accccctggg ctgacactga cactcatgca cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat 780
accctggtag tccacgccct aaacgatgtc tactagttgt tggggatttc gatccttagt 840
aacgcagcta acgcgtgaag tagaccgcct ggggagtacg gtcgcaagat taaaactcaa 900
aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gatgatgtgg attaattcga tgcaacgcga 960
aaaaccttac ctggtcttga catgtacgga accctttaga gatagagggg tgccttcggg 1020
agccgtaaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1080
tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtccttag ttgctaccat tcagttgagc actttaagga 1140
gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttatg 1200
accagggctt cacacgtcat acaatggtcg gtacagaggg tcgccaaccc gcgaggggga 1260
gccaatctca taaaaccgat cgtagtccgg attgcactct gcaactcgag tgcatgaagt 1320
cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg tcgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1380
acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt ctaccagaag tagctaggct aaccgcaagg 1440
aggccggtta ccacggtagg attcatgact ggggtgaagt cgtaacaagg tagccgtagg 1500
ggaacctgcg gctggatcac ctcctt 1526
Claims (2)
1.一株高产几丁质酶菌株(细菌类)，为变形菌纲的一个新种，我们将其分类命名为Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC3483。
2.用权利要求1所述的菌株发酵生产几丁质酶的方法，其特征在于用该菌为出发菌种，经种子培养和已优化的培养基发酵产几丁质酶：工艺为：
(1)种子培养
种子培养基(以质量浓度计)：磷酸二氢钾0.07，磷酸氢二钾0.03，硫酸镁0.05，七水硫酸亚铁0.001，酵母浸出物0.4，葡萄糖0.2，蛋白粉0.4。
培养条件：从平板上处于指数生长期的该菌菌落取两接种环接种于盛有50ml种子培养基的250ml三角瓶中进行培养，pH值：7.0，温度：30℃，转速200prm，培养时间：12h。
(2)产酶培养
产酶培养基：磷酸二氢钾(0.05-0.1)，磷酸氢二钾(0.02-0.06)，硫酸镁(0.03-0.07)，七水硫酸亚铁(0.001-0.005)，酵母浸出物(0.2-0.4)，葡萄糖(0.10-0.30)，尿素(0.4-1.0)，几丁质粉粒(0.4-1.0)。
发酵条件：再以2％-6％接种量，进行5L发酵罐发酵，pH：6.5-8.5，温度：26-36℃，发酵时间：60-84h，转速：200-500rpm，通气量：1.0-2.0L/min/L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009102642030A CN101942401B (zh) | 2009-12-31 | 2009-12-31 | 一株产几丁质酶菌株及高产几丁质酶的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009102642030A CN101942401B (zh) | 2009-12-31 | 2009-12-31 | 一株产几丁质酶菌株及高产几丁质酶的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101942401A true CN101942401A (zh) | 2011-01-12 |
| CN101942401B CN101942401B (zh) | 2012-08-22 |
Family
ID=43434613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2009102642030A Active CN101942401B (zh) | 2009-12-31 | 2009-12-31 | 一株产几丁质酶菌株及高产几丁质酶的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101942401B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102433351A (zh) * | 2011-12-21 | 2012-05-02 | 河南省农业科学院 | 绿色木霉几丁质酶基因Tvchi及其表达产物与应用 |
| CN103642736A (zh) * | 2013-12-12 | 2014-03-19 | 台州职业技术学院 | 一种菌株及其筛选方法和应用 |
| CN104531639A (zh) * | 2014-12-18 | 2015-04-22 | 南京工业大学 | 一种抑菌的几丁质酶解方法 |
| CN110591971A (zh) * | 2019-10-11 | 2019-12-20 | 南京工业大学 | 藤黄单胞菌新菌种及其培养方法和应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100999718B (zh) * | 2006-07-06 | 2011-06-15 | 湖南师范大学 | 几丁质酶基因重组的苏云金杆菌工程菌 |
| CN101144066B (zh) * | 2007-08-21 | 2011-07-13 | 山东省科学院中日友好生物技术研究中心 | 伯克氏菌多功能工程菌株及其构建方法 |
| CN101492646B (zh) * | 2009-01-15 | 2010-09-15 | 山东大学 | 一株绿色木霉工程菌及其应用 |
-
2009
- 2009-12-31 CN CN2009102642030A patent/CN101942401B/zh active Active
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102433351A (zh) * | 2011-12-21 | 2012-05-02 | 河南省农业科学院 | 绿色木霉几丁质酶基因Tvchi及其表达产物与应用 |
| CN102433351B (zh) * | 2011-12-21 | 2014-02-19 | 河南省农业科学院 | 绿色木霉几丁质酶基因Tvchi及其表达产物与应用 |
| CN103642736A (zh) * | 2013-12-12 | 2014-03-19 | 台州职业技术学院 | 一种菌株及其筛选方法和应用 |
| CN103642736B (zh) * | 2013-12-12 | 2016-03-23 | 台州职业技术学院 | 一种菌株及其筛选方法和应用 |
| CN104531639A (zh) * | 2014-12-18 | 2015-04-22 | 南京工业大学 | 一种抑菌的几丁质酶解方法 |
| CN104531639B (zh) * | 2014-12-18 | 2017-12-22 | 南京工业大学 | 一种抑菌的几丁质酶解方法 |
| CN110591971A (zh) * | 2019-10-11 | 2019-12-20 | 南京工业大学 | 藤黄单胞菌新菌种及其培养方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101942401B (zh) | 2012-08-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102199050B (zh) | 一种复合微生物肥料及其制备方法 | |
| CN102409007B (zh) | 一种芽孢杆菌微生态制剂及其液固结合发酵制备工艺 | |
| CN111363684B (zh) | 一种木质纤维高效降解复合菌剂及其在堆肥中的应用 | |
| CN102389022B (zh) | 利用地衣芽孢杆菌降解羽毛制备菌肽复合蛋白饲料添加剂的方法 | |
| CN107974421A (zh) | 一种嗜酸乳杆菌及其筛选方法和应用、一种菌剂 | |
| CN104130961A (zh) | 一株产几丁质酶的菌株及其在酶解几丁质中的应用 | |
| CN103444981A (zh) | 米曲霉降解食用药用真菌菌渣生产蛋白饲料的方法 | |
| CN101942401B (zh) | 一株产几丁质酶菌株及高产几丁质酶的方法 | |
| CN103710272A (zh) | 一种用于好氧发酵沼渣的复合微生物菌剂及其制备方法 | |
| CN103571810A (zh) | 一种优化的发酵高产几丁质酶的方法 | |
| CN102146354B (zh) | 一种生产β-甘露聚糖酶的菌株及生产工艺 | |
| CN103352016B (zh) | 利用Alteromonas colwelliana A321发酵浒苔制备生物肥 | |
| CN104911135B (zh) | 一种海藻糖合酶生产菌株及其应用 | |
| CN104342372B (zh) | 一种利用益生菌发酵生产酵母水解物的方法 | |
| CN114107139A (zh) | 一株烟管菌f21及其在生产纤维素酶中的应用 | |
| CN105349462B (zh) | 一株龙舌兰芽孢杆菌Hexi1及其在堆肥中的应用 | |
| CN105349461A (zh) | 一株产琼胶酶溶藻弧菌及应用 | |
| CN104651339B (zh) | 微泡菌属发酵生产褐藻胶裂解酶的培养基及其发酵方法 | |
| CN103589664A (zh) | 两株低温泡菜乳酸菌的增殖培养基 | |
| CN103305437B (zh) | 一株l-乳酸铵耐受菌及其应用 | |
| CN107603884A (zh) | 一株高产中性纤维素酶的里氏木霉突变菌株 | |
| CN1302105C (zh) | 高活性纤维素酶及其制造方法 | |
| CN105861373A (zh) | 一种产角蛋白酶的铜绿假单胞菌及其应用 | |
| CN1295327C (zh) | 纤维素酶固体发酵大规模生产方法及其设备 | |
| CN101805709A (zh) | 一株产过氧化氢酶菌株及利用该菌株以柠檬酸为碳源发酵产酶的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP02 | Change in the address of a patent holder | ||
| CP02 | Change in the address of a patent holder |
Address after: No. 188, Beitang street, Liangxi District, Wuxi City, Jiangsu Province Patentee after: Jiangnan University Address before: 214122 Jiangsu Province, Wuxi City Lake Road No. 1800, Jiangnan University Institute of biological engineering Patentee before: Jiangnan University |