CN103642736B

CN103642736B - 一种菌株及其筛选方法和应用

Info

Publication number: CN103642736B
Application number: CN201310680544.2A
Authority: CN
Inventors: 郝之奎; 高影; 廖祥儒; 吴翰桂
Original assignee: Taizhou Vocational and Technical College
Current assignee: Taizhou Kangyuan Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2013-12-12
Filing date: 2013-12-12
Publication date: 2016-03-23
Anticipated expiration: 2033-12-12
Also published as: CN103642736A

Abstract

本发明涉及一种菌株及其筛选方法和应用，属于生物工程技术领域。为了解决现有的只能筛选到陆源性产几丁质菌，提供一种菌株及其筛选方法和应用，所述菌株为Bradyrhizobiaceaebacterium？SYBC-H2菌株，该方法包括取采集的海底淤泥样品加入灭菌后的富集培养基中进行培养，所述富集培养基中含有粉粒几丁质，得到富集培养液；取富集培养液进行稀释后涂布到筛选培养基平板上培养，挑取能够产生透明圈的菌株在另一新的筛选培养基平板上划线转接培养，上述所述筛选培养基中含有粉粒几丁质，得到纯培养物Bradyrhizobiaceae？bacterium？SYBC-H2菌株，具有较高产几丁质酶的能力。

Description

一种菌株及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及一种菌株及其筛选方法和应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

几丁质分子式为(C₈H₁₃NO₅)_n，其水解产物几丁寡糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖及其衍生物所具有的优异特性不断被发现并逐步应用于食品、医药、环保、生防等领域。而几丁质在自然界中分布广泛，大都存在于线虫的微纤维鞘、昆虫的肠道内壁、真菌的细胞壁、软体动物的器官以及虾、蟹等节肢动物的外骨架中。然而，海洋生物中的几丁质储存量约为10亿吨，资源丰富。但是，由于几丁质的为基本单位N-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖，通过β-1,4-糖苷键连接形成直链多糖，分子量大都在100万以上，不溶于水，大大影响了几丁质的大规模应用。而另一方面，几丁质酶是一类能催化水解至少含有一个N-乙酰葡萄糖胺基团糖苷键的酶，几丁质酶能水解几丁质生成几丁寡糖、几丁二糖或N-乙酰-D-氨基葡萄糖等。因此，通过获得几丁质酶能够大大提高几丁质的应用。虽然，随着现代分子生物技术的发展，可从环境中克隆出几丁质酶基因构建产几丁质酶基因工程菌，但是，从自然界中分离野生的几丁质酶合成微生物仍然是不可替代的工作。如中国专利（授权公告号：CN101942401B，公开日：2012年08月22日）提供了一种ChitinolyticbactermeiyuanensisSYBC-H1菌株，该菌株主要是从土壤中筛选得到，具有较高的产几丁质酶的效果。但现有的还没有从海底淤泥中筛选能够产几丁质酶的菌株，而海洋不仅蕴藏着丰富的几丁质，同时也是产几丁质酶的菌株的重要来源地之一，因此，如何从海洋淤泥中筛选新的菌株，且使筛选的菌株具有产几丁质酶的能力，具有一定的研究价值。

发明内容

本发明针对以上现有技术中存在的问题，提供一种菌株及其筛选方法和应用。解决的问题是提供一种新的菌株BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株，所述菌株具有产几丁质酶的效果。

本发明的目的之一是通过以下技术方案得以实现的，一种菌株，所述菌株为BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株，且所述BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO：M2013582。

本发明的菌株是从海底淤泥中分离并筛选得到的，本发明的菌株属于慢生根瘤菌科（Bradyrhizobiaceae）芽生杆菌属（Blastobacter）的一株新种，命名为BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2，已于2013年11月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M2013582，保藏地点为中国武汉武汉大学。

本发明的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株菌落呈圆形，表面光滑，半透明，边缘整齐，菌体粘稠不易挑起，菌体长度约为0.5μm～2μm，直径约0.5μm～0.9μm，杆状。

本发明的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株是革兰氏阴性菌，在10℃～42℃的温度范围内都能生成，在25℃～35℃适宜生长，最适温度为30℃；在pH值为6～8时都能生长，最佳生长pH值为7.0，严格好氧性，V-P实验阴性；产碱，能使明胶液化。能利用的碳源为核糖、蔗糖、N-乙酰氨基葡萄糖、壳二糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、纤维素、菊粉、麦芽、阿拉伯糖、木糖或鼠李糖等。能分泌的酶包括过氧化氢酶、几丁质酶、半乳糖酶、β-葡萄糖苷酶、尿酶、果聚糖酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、角蛋白酶、淀粉酶或微量脂肪酶等。不能产的酶有：葡萄糖转移酶、漆酶等。应用本发明的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株具有较广泛的应用。作为最优选，用于生产几丁质酶。

作为优选，上述所述BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株的16SrRNA序列如SEQ.NO1所示。

作为优选，上述所述BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株具有产几丁质酶的能力。

本发明的目的之二是通过以下技术方案得以实现的，一种菌株的筛选方法，所述菌株为BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株，该方法包括以下步骤：

A、取采集的海底淤泥样品加入灭菌后的富集培养基中进行培养，所述富集培养基中含有粉粒几丁质，得到富集培养液；

B、取培养后的富集培养液进行稀释后涂布到筛选培养基平板上进行培养，挑取能够产生透明圈的菌株在另一新的筛选培养基平板上进行划线转接培养，上述所述筛选培养基中含有粉粒几丁质，得到纯培养物BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株。

本发明的上述菌株的筛选方法中，通过在富集培养基中加入粉粒几丁质，从而使有富集培养后，使能利用几丁质的微生物生长得到进一步的强化并逐渐形成优势菌株，再经过筛选培养基使几丁质酶产生菌逐渐被分离筛选出来并形成菌落，然后转移到另一筛选培养平板上进行划线接种，直至得到纯培养物目标菌株。另一方面，由于粉粒几丁质是一种白色不透明物质，本发明通过使粉粒几丁质在筛选培养基中均匀分布后，当几丁质酶产生菌分泌的几丁质酶在固体筛选培养基中扩散后，可以把不透明的粉粒几丁质水解成可溶的物质，形成清晰的透明圈。因此，利用透明圈法能够提高几丁质酶产生菌筛选的可靠性和高效性。

在上述的菌株的筛选方法中，作为优选，步骤A中所述富集培养基包括以下成分的重量份（g/L）：

MgSO₄·7H₂O：0.3～0.8；KH₂PO₄：0.5～0.9；FeSO₄·7H₂O：0.005～0.015；粉粒几丁质：2～6。作为进一步的优选，步骤A中所述富集培养基包括以下成分的重量份（g/L）：

MgSO₄·7H₂O：0.4～0.6；KH₂PO₄：0.6～0.8；FeSO₄·7H₂O：0.01～0.015；粉粒几丁质：3～5。

在上述的菌株的筛选方法中，步骤B中所述筛选培养基与另一新的同样的筛选培养基的成分配比相同，在此仅是为了更清楚的描述。作为优选，步骤B中所述筛选培养基包括以下成分的重量份（g/L）：

MgSO₄·7H₂O：0.3～0.8；KH₂PO₄：0.5～0.9；FeSO₄·7H₂O：0.005～0.015；琼脂：15～25；粉粒几丁质：2～6；胶体几丁质：35～45；

且所述筛选培养基的pH值为7.0。作为进一步的优选，步骤B中所述筛选培养基包括以下成分的重量份（g/L）：

MgSO₄·7H₂O：0.4～0.6；KH₂PO₄：0.6～0.8；FeSO₄·7H₂O：0.01～0.015；琼脂：18～22；粉粒几丁质：3～5；胶体几丁质：35～42；

且所述筛选培养基的pH值为7.0。

本发明的目的之三是通过以下技术方案得以实现的，一种菌株的应用，所述菌株为BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株，且所述BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株用于生产几丁质酶。由于本发明的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株具有较高产几丁质酶的能力。因此，本发明的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株能够用于生产几丁质酶。

综上所述，本发明具有以下优点：

本发明的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株是一种新的菌株，具有较高的产几丁质酶的能力，能够用于生产几丁质酶，且本明的菌株的筛选方法通过在富集培养基中加入粉粒几丁质，强化了优势菌株的筛选，提高了筛选的选择性和定向性，且本发明还通过在筛选培养基中加入粉粒几丁质，从而使能够生产透明圈，实现采用透明圈法提高了筛选的可靠性和高效性。

附图说明

图1是本发明的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株的菌落形态图。

图2是本发明的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株的显微照片图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。

以下实施例中的胶体几丁质按照下列方法配制得到：

将5g粉粒几丁质（100目过筛）放入200mL烧杯中，加入丙酮20mL,充分浸润2分钟，再缓慢加入HCl100mL，充分搅拌至糊状，静置放置3小时，再将上述糊状物缓缓加入到盛有1000mL冷水的烧杯中，边加边剧烈搅拌，加完后静置，待胶体几丁质析出后，离心，收集胶体几丁质，反复用去离子水冲洗胶体几丁质，将得胶体几丁质用纤维细纱过滤到盛有1000mL去离子水中直至pH值达到5.4左右，检测胶体几丁质的质量浓度为0.5%，灭菌备用。

作为优选，以下实施例中所用的富集培养基、筛选培养基和发酵培养基均采用海水进行配制而成。

实施例1

BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株的筛选：

本实施例中所述的海底淤泥采集自浙江省台州市剑门港海区（28°1′57′′N,121°36′38′′E）的海底淤泥，经过干燥备用；

本实施例中所述富集培养基包括以下成分的重量份（g/L）：

MgSO₄·7H₂O：0.6；KH₂PO₄：0.6；FeSO₄·7H₂O：0.01；粉粒几丁质：3。

本实施例中所用的筛选培养基包括以下成分的重量份（g/L）：

MgSO₄·7H₂O：0.3；KH₂PO₄：0.9；FeSO₄·7H₂O：0.015；琼脂：15；粉粒几丁质：2；胶体几丁质：35；且所述筛选培养基的pH值为7.0。

取采集到的浙江省台州市剑门港海区海底淤泥样品1g，加入到灭菌后的富集培养基中，所述富集培养基中含有粉粒几丁质（100目过筛），然后在30℃，200r/min条件下进行振荡培养168小时，得到富集培养液，取培养后的富集培养液样品，用无菌水稀释10¹～10⁶倍，然后取稀释10⁴、10⁵和10⁶倍的三个样品各0.1mL分别涂布到相应的筛选培养基平板上，在30℃条件下培养70小时后观察，挑取能够产生透明圈的菌株在另一新的筛选培养基平板上进行连续划线转接培养，直至获得纯培养物

BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株。上述所述筛选培养基中含有粉粒几丁质（100目过筛）。该菌株已于2013年11月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO:M2013582，保藏地点为中国武汉大学。

实施例2

本实施例中的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株的筛选方法基本同实施例1一致，区别仅于所述的富集培养基和筛选培基与实施例1不同，具体为：

所述富集培养基包括以下成分的重量份（g/L）：

MgSO₄·7H₂O：0.5；KH₂PO₄：0.7；FeSO₄·7H₂O：0.01；粉粒几丁质：4。

所述筛选培养基包括以下成分的重量份（g/L）：

MgSO₄·7H₂O：0.5；KH₂PO₄：0.7；FeSO₄·7H₂O：0.01；琼脂：20；粉粒几丁质：4；胶体几丁质：40；

且所述筛选培养基的pH值为7.0。

本实施例的其它具体操作步骤和方法同实施例1一致，这里不再赘述。

实施例3

所述富集培养基包括以下成分的重量份（g/L）：

MgSO₄·7H₂O：0.4；KH₂PO₄：0.8；FeSO₄·7H₂O：0.015；粉粒几丁质：5。

所述筛选培养基包括以下成分的重量份（g/L）：

MgSO₄·7H₂O：0.4；KH₂PO₄：0.8；FeSO₄·7H₂O：0.015；琼脂：25；粉粒几丁质：6；胶体几丁质：45；

且所述筛选培养基的pH值为7.0。

选取上述实施例得到的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株进行鉴定和分析，具体鉴定和分析方法以及相应的鉴定结果如下所示。

BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株的鉴定

本方法所用的种子培养基包括以下成分的重量配比（g/L）：

MgSO₄·7H₂O：0.5，KH₂PO₄：0.7，K₂HPO₄：0.3，FeSO₄·7H₂O：0.01，葡萄糖：2，蛋白胨：2，牛肉膏：2，pH7.0。

本实施例中所用的发酵培养基包括以下成分的重量配比（g/L）：MgSO₄·7H₂O0.5，KH₂PO₄0.7，K₂HPO₄0.3，FeSO₄·7H₂O0.01，葡萄糖1，蛋白胨2，牛肉膏2，粉粒几丁质1，pH7.0。

方法：将实施例1中得到的菌株接种至种子培养基中进行培养，接种量为5%，采用600nm检测菌株生长情况，取生长一致的种子1mL分别接种到发酵培养基中（50mL/250mL三角瓶），在30℃、200r/min的条件下进行摇瓶培养96小时后得到酶液，检测酶活性。每个样品进行3个平等实验，几丁质酶酶活为3个平等实验的平均值。

几丁质酶活性的测定方法：

以胶体几丁质为底物，采用DNS比色法（3，5-二硝基水杨酸）测还原糖，将1.9mL0.1mol/L的广泛缓冲液（pH7.0）和0.5mL0.5%的胶体几丁质加100μl酶液组成的反应体系，37℃水浴30min，沸水浴5min后中止反应，加入1.5mLDNS试剂，沸水浴5min，冷却至室温，离心后取上清液，在波长为535nm下测定吸光度，以灭活的等量酶液作为空白对照。酶活的定义为：37℃下1min转化底物胶体几丁质产生1μmol还原糖所需的酶量规定为1个活力单位（U）：

上式中：ΔOD：吸光度OD的变化值；V总：反应液总体积(mL)；n：酶液稀释倍数；Δt：反应时间；V酶：酶液体积(mL)。检测结果表明本发明BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株的酶活能够达到0.64U/mL。

菌株形态学及生理生化特征的鉴定：

将BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株接种于种子培养基平板上，在30℃的条件下倒置培养24小时，观察其菌落生长状态；将BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株接种于筛选培养基平板上，在30℃的条件下倒置培养96小时，观察其透明圈形成状态。

观察其在5℃～45℃（间隔5℃）的恒温培养箱中观察其生长情况；在恒温培养30℃条件下，观察其在pH值为3～9时的生长情况，同时研究其对单一碳源的利用情况，碳源的深度分别为（g/L）0.2，0.5和0.7。

上述BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株形态学及生理生化特征的鉴定结果表明：

本发明的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株的形态学特征为：如图1所示，本发明的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株的菌落呈圆形，表面光滑，菌落呈圆形，表面光滑，半透明，边缘整齐，菌体粘稠不易挑起，菌体长度约为0.5μm～2μm，直径约0.5μm～0.9μm，从图2的显微照片图（10000×）中可以看出本发明的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株形状呈杆状。本发明的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株的生理生化实验结果表明：BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株是革兰氏阴性菌，在10℃～42℃的温度范围内都能生成，在25℃～35℃适宜生长，最适温度为30℃；在pH值为6～8时都能生长，最佳生长pH值为7.0，严格好氧性，V-P实验阴性；产碱，能使明胶液化。能利用的碳源为核糖、蔗糖、N-乙酰氨基葡萄糖、壳二糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、纤维素、菊粉、麦芽、阿拉伯糖、木糖或鼠李糖等。能分泌的酶包括过氧化氢酶、几丁质酶、半乳糖酶、β-葡萄糖苷酶、尿酶、果聚糖酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、角蛋白酶、淀粉酶或微量脂肪酶等。不能产的酶有：葡萄糖转移酶、漆酶等。

本发明的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株的脂肪酸含量的测定由上海市公共卫生临床中心检测；醌型测定由广州微生物研究所检测。脂肪酸含量的检测结果表明：

BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株含主要脂肪酸是C_12:0 _3OH（5.87%），C_14:0（3.65%），C_16:12OH（2.15%），C_16:0（28.16%），C_18:1ω7c（20.48%）和SummedFeature3（C_{16:1w7c/15iso2OH}，34.12%），其含量与组成比例在分子水平上属于Bosea属；醌型测定结果表明本发明的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株的醌型为Q-8，与Bosea属醌型一致。对本发明的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H菌株的G+C含量进行检测表明，菌株DNA中G+C的含量为67.3624%，属于Bosea属DNA中G+C含量范围内（66～75mol%），根据现有文献常规的报道，不同属微生物G+C的含量相差在10%以上。因此，认为G+C含量在10%以上的微生物可认为是非同属。因此，也可以确认本发明的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株属于Bosea属。

本发明的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株16SrRNA的PCR扩增采用常规的方法即可。本发明中PCR扩增中的DNA提取采用上海赛百盛基因技术有限公司的细菌基因组提取试剂盒，具体的提取方法按照试剂盒的方法进行，扩增采用的引物为通用引物，由上海赛百盛基因技术有限公司合成，引物为：

5’-GAGTTTGATCCTGGCTCA-3’；

5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’；

PCR反应条件为：94℃预变性4min，进入循环，94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min后保存4℃状态。PCR产物用UltraCleanPCRClean-upkit纯化得到。并由上海生物工程有限公司完成测序，测序结果如SEQNO.1所示。将本发明的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株16SrRNA基因序列进行同源性分析，结果显示，与Boseasp.BIWAKO-01(AB425327.1)最接近。MaxIdent达到99%。选择有代表性的菌株使用软件Mega3.1利用临接法（Neighbor-Joinning）构建系统发育树进行验证，同样表明本发明的BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株与Bosea属的遗传距离最接近。

从上述的形态学、生理生化、脂肪酸组成及含量、G+C（mol%）含量、醌型及分子生物学特征等鉴定结果表明。本发明的菌株属于慢生根瘤菌科（Bradyrhizobiaceae），芽生杆菌属（Blastobacter）中的一种，对于该属能够产几丁质酶的菌株还未曾见过文献报道，属于一株新的菌株。

本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims

1.一种菌株，其特征在于，所述菌株为BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株，且所述BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO：M2013582。

2.根据权利要求1所述菌株，其特征在于，所述BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株的16SrRNA序列如SEQ.NO1所示。

3.根据权利要求1所述菌株，其特征在于，所述BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株具有产几丁质酶的能力。

4.一种如权利要求1所述菌株在生产几丁质酶中的应用，其特征在于，所述菌株为BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株，且所述BradyrhizobiaceaebacteriumSYBC-H2菌株用于生产几丁质酶。