CN1295327C - 纤维素酶固体发酵大规模生产方法及其设备 - Google Patents

Abstract

一种纤维素酶固体发酵大规模生产方法，选择绿色木霉工程菌株，经菌种斜面试管、摇瓶扩大培养，发酵罐再扩大直至所需液体种子量，固体发酵，通过无菌通道送至无菌接种室，然后铺设在塑料盘中接种培养基，培养72小时，制取原酶，发酵后的物料浸提，浸提后榨干，榨出液浓缩，加苯甲酸钠制成液体酶，将液体酶的榨出液超滤浓缩，加入白色硫酸铵，干燥制成粉状工业酶。本发明的优点是实现固体发酵大规模生产纤维素酶无污染，生产产量高、质优价廉。

Description

纤维素酶固体发酵大规模生产方法及其设备

技术领域

本发明涉及一种纤维素酶固体发酵方法。

背景技术

纤维素酶是水解植物纤维的酶类，由C-1酶、C-x酶和β-葡萄糖苷酶组成，它可以将植物细胞壁的纤维素逐步降解，直至最后分解生成葡萄糖。因此，纤维素酶广泛用于很多加工制造行业，如食品、饮料、饲料、制酒、发酵、造纸、纺织物后处理，中草药有效成分提取，石油开采，污水处理等领域，用后无不优质高产。在植物生物技术的研究工作中，也经常应用纤维素酶来水解细胞壁以便进行基因工程和细胞工程等操作。所以纤维素酶被誉为打开植物宝库的金钥匙。纤维素酶在我国目前只有几家小作坊式的生产厂，远不够市场需求，国内需要依赖进口，价格昂贵，大大增加了国内各行业的制造成本。所以十分需要大规模生产质优价廉的纤维素酶技术出现。

目前，国内外生产纤维素酶的菌种主要是绿色木霉(一种真菌)的各种变异菌株(经诱变或基因工程操作获得)，木霉的生物学特性适宜在有氧温暖和潮湿的静止环境下生长，这规定了它的发酵条件，因此木霉不适合液体发酵，需要进行固体发酵。国内外的诸多研究证明，固体比液体发酵产酶量多70％以上，酶活高，酶的质量好。但固体发酵容易污染，这是限制不易大量生产质优价廉纤维素酶的主要技术原因。

发明内容

本发明的目的是提供一种纤维素酶固体发酵大规模生产技术，解决固体发酵容易污染的技术难题，可实现产量高、质优价廉。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

生产步骤如下：

1、液体制种：选择菌种为绿色木霉AS3.3030工程菌株，发酵活力为1000单位/克稻草以上；经菌种斜面试管、摇瓶扩大培养，发酵罐再扩大直至所需液体种子量；

2、固体发酵：将稻草粉碎至长度4-8mm，取重量比例为85-95∶5-15的稻草粉和麸皮在混料机中拌匀后移入蒸球中，再加入2.5-3倍的营养液，关闭蒸球，在旋转中灭菌1小时；

将蒸球内的灭菌料通过无菌通道送至无菌接种室，然后铺设在料盘中，待料温降至35℃±5℃时接种液体培养基，接种量为料的12％-15％(w/w)，将料盘送至发酵室，在28℃-30℃的无菌空气和80％-90％的相对湿度条件下培养72小时；

3，制取原酶：将发酵完毕后的物料在50℃-60℃的热气流中烘干至物料不再减重为止。干后的物料粉碎过筛80-100目，取筛下物料检测每克酶活在1000单位以上为合格品。

4、制取液体酶：将发酵后的物料在浸提罐中以5-7倍水在30℃以下浸提，缓慢搅拌，经实验室的压榨机取样，榨干物中的残余酶活小于每克150单位即可；将浸提后的物料经车间压榨机榨干，榨出液经超滤机浓缩至每毫升酶活不小于1000单位即可。加1‰-3‰的苯甲酸钠保存、包装。

5、制取粉状工业酶：将液体酶的榨出液超滤浓缩至每毫升200-250单位酶活，加入重量比例8％-10％的白色硫酸铵，在缓慢搅拌下输入喷雾干燥机，成品酶活在每克2000单位以上即合格。

上述菌种斜面采用马铃薯培养基，培养基配方比例为：每升培养液中含有马铃薯160-240克、葡萄糖8-13克、琼脂14-22克、磷酸二氢钾2-4克、7水硫酸镁1.3-1.8克、滤纸粉8-12克，其余为水；

上述液体种子培养基配方比例为：每升培养液中含有米糠8-12克、麸皮4-6克、硫酸铵1.5-2.5克、磷酸二氢钾0.8-1.2克、无水氯化钙0.8-1.2克、葡萄糖3-5克、微量元素溶液9-11毫升。其中微量元素溶液每升中含7水硫酸亚铁0.4-0.6克、4水二氯化锰0.17-0.21克、7水硫酸锌0.34-0.38克、6水二氯化钴0.35-0.39克，自然PH值为5.4。

上述固体发酵培养液配方比例为：每升培养液中含有硫酸铵8-12克、磷酸二氢钾1-3克、7水硫酸镁0.4-0.6克、2水氯化钙0.4-0.6克，溶液PH值为5.4。

生产的主要设备：

1，实验室设备：包括分光光度计、超净工作台、灭菌柜、控温振荡水浴、控温培养箱、离心机等。

2，车间设备：蒸球(蒸汽灭菌用)、板筐压滤机、超滤机、喷雾干燥机、气流干燥床、粉碎机、振荡筛、液体种子发酵罐、包装机等。

3，固体发酵设备及条件：

(1)，设置固体发酵室，内涂防霉仿瓷涂料，室内设置装有发酵料塑料盘的多层金属架；发酵室内设置保温暖气和保湿设备，发酵时湿度即可达80-90％，室外设置温、湿度指示器；多个发酵室并联，有无菌风管道相通，每个发酵室与输送无菌风的总管相连；发酵室顶部设有带逆止阀的发酵废气排出口，只许废气排出，不许进入；

(2)，固体发酵接种室：接种室设置在液体种子罐的隔壁，经不锈钢管道将液体培养基送入接种室，接种室经严格灭菌并通入无菌风，接种室有两个相对的无菌通道，一个通道输入装盘的无菌料，另一通道输出接种的发酵料，无菌通道内设有连接蒸球的晾料室与发酵室的传送带。

(3)，从蒸球灭菌出料开始，经装盘晾料、接种，至发酵完毕，都要在无菌状态下进行，各工序之间用无菌通道和传送带连接，输入的空气用高压鼓风机经无菌过滤以管道送至各室，以舒适风的强度充满室内即可。

本发明的优点：实现固体发酵大规模生产纤维素酶无污染，生产产量高、质优价廉。

具体实施方式

生产步骤如下：

1、选择菌种及传代培养：产纤维素酶工程菌，系绿色木霉(Trichoderma sp.)，取自北京中科院微生物所，编号：As3.3030。

发酵活力为1000单位/克稻草以上；经常规的菌种斜面试管、摇瓶扩大、发酵罐再扩大直至所需液体种子量；

培养基配方：菌种斜面采用马铃薯培养基，培养基配方比例为：每升培养液中含有马铃薯克200克、葡萄糖10克、琼脂18克、磷酸二氢钾3克、7水硫酸镁1.5克、滤纸粉10克，加水至1000毫升；

2、培养条件：a，摇瓶，接种时用接种环将菌丝体刮入摇瓶，在恒温振荡水浴上于28-30℃培养48小时，至PH值下降到3.0-2.8为止，振荡速度为110转/分；b，液体种子罐121℃灭菌60分钟，接种菌丝体，接种量8.9％，培养温度29-30℃，搅拌速度110转/分，培养时间约48小时，PH值下降到3.0-2.8为止。

液体种子培养基比例为：米糠10克、麸皮5克、硫酸铵2克、磷酸二氢钾1克、无水氯化钙1克、葡萄糖4克、微量元素溶液10毫升。微量元素溶液每升中含7水硫酸亚铁0.5克、4水二氯化锰0.19克、7水硫酸锌0.36克、6水二氯化钴0.37克，自然PH值为5.4。

3、固体发酵：

(1)，培养液：每升培养液中含有下列化学物质：

硫酸铵10克、磷酸二氢钾2克、7水硫酸镁0.5克、2水氯化钙0.5克，此时溶液PH值为5.4。

(2)，取95千克粉碎至5mm的稻草粉，与5千克麸皮在混料机中拌匀后移入蒸球中，再加入3倍的培养液，即300千克，关闭蒸球，在1.5千克/平方厘米的压力下灭菌1小时，蒸球同时以每分钟1转的速度旋转。

(3)，将蒸球内的灭菌料通过无菌通道送至无菌接种室，以8-10厘米的厚度铺在塑料盘中，待料温降至35℃时接种液体培养基，接种量为料的12-15％(w/w)，将盘送至发酵室，在28-30℃的无菌空气和90％的相对湿度条件下培养72小时。

4、制取原酶：将发酵完毕后的原酶在气流烘干机中以60℃-121℃的热气流中烘干，至物料不再减重(在千分之三误差以内)为止。干后的物料粉碎80-100目过筛，取筛下物料检测每克酶活在1000单位以上为合格品。筛上物料可做牛羊饲料。

5、制取液体酶：将发酵后的物料在浸提罐中以7倍水在30℃以下浸提，缓慢搅拌(约每分钟1转)，取样在实验室的压榨机中榨干，榨干物中的残余酶活小于每克150单位即可(约需1小时)，榨干后的渣每克保持在酶活150单位，还可做饲料添加剂，也避免反复提取水分太多，超滤费电费时，本工艺综合经济效益高。浸提后从浸提罐用泵将物料打入车间压榨机榨干。榨出液经超滤机浓缩至每毫升酶活不小于1000单位即可。加1-3‰的苯甲酸钠保存。包装。

6、制取粉状工业酶：将步骤5的榨出液超滤浓缩至每毫升200-250单位酶活，加入8-10％(重量)的白色硫酸铵，在缓慢搅拌下输入喷雾干燥机，成品酶活在每克2000单位以上即合格。

主要设备及设施

1、实验室设备：分光光度计、超净工作台、灭菌柜、控温振荡水浴、控温培养箱、离心机等。

2、车间设备：蒸球(蒸汽灭菌用)、板筐压滤机、超滤机、喷雾干燥机、气流干燥床、粉碎机、振荡筛、液体种子发酵罐、包装机等。

3、固体发酵室及发酵盘：固体发酵室为圆形，水泥结构，内涂防霉仿瓷涂料，高2-2.5米，直径4.5-5米(约15-20平方米)。墙上装有可折叠铝合金架，架上能放装有发酵料的塑料盘，架共三层。发酵室用暖气保温，发酵时湿度即可达80-90％(相对)，室外要设置温、湿度指示器。多个发酵室成并联设置，有无菌风管道相通，每发酵室底部有无菌风支管进入口，支管另端与输送无菌风的总管相连。发酵室顶部有发酵废气排出口，排出口设有不锈钢网与逆止伐，只许废气排出，不许进入。发酵室内不必设加水及排水设施，发酵湿度可以满足需要。发酵室壁设有玻璃窗可观察真菌生长情况。发酵盘材质为硬质无毒塑料，长宽高为100×40×15厘米。

4，固体发酵接种室：接种室设置在液体种子罐的隔壁，经不锈钢管由管的出料口排入接种室的容器中，接种室经严格灭菌并通入无菌风，接种室有两个相对的无菌通道，一个通道输入装了盘的无菌料，另一通道输出接了种的发酵料，无菌通道设有传送带，一头与蒸球的晾料室相连，一头与发酵室相连。

5、灭菌接种和固体发酵工艺路线：此一工艺路线从灭菌出料开始，至发酵完毕，都要在无菌状态下进行。工序之间用无菌通道和传送带连接，输入的空气用高压鼓风机经无菌过滤以管道送至各室，以舒适风的强度充满室内即可，以箭头示之如下：

蒸球灭菌出料→装盘晾料至35℃→接种→输入发酵室发酵--→

产品分析检测方法：

为品了检测一般只需分析总酶活即可。酶的其他组分分析不是为了研究不常用。纤维素酶的分析方法在一般书中都能查到，下面只提一下方法名称。

总酶活：以滤纸做底物，用3、5-二硝基水杨酸比色法，又称滤纸酶活。测定酶的总活力。

C1酶活：以脱脂棉做底物，仍用上述二硝基水杨酸法，测定酶对长纤维的断裂能力。

Cx酶活：以羧甲基纤维素钠(CMC)为底物，仍用二硝基水杨酸法，测定将长纤维素链水解成纤维寡糖的能力。

β-葡萄糖苷酶活：以水杨苷为底物，仍用上述比色法，测定将纤维寡糖水解成单糖的能力。

还有许多辅助酶如果胶酶、半纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶等在纤维素酶应用上均有作用。没有特殊目的一般不作测定。

Claims (9)

1、一种纤维素酶固体发酵大规模生产方法，其特征是生产步骤如下：

(1)、液体制种：选择菌种为绿色木霉AS3.3030工程菌株，发酵活力为1000单位/克稻草；经菌种斜面试管、摇瓶扩大培养、发酵罐再扩大直至所需液体种子量；

(2)、固体发酵：将稻草粉碎至5mm，取重量比例为95∶5的稻草粉和麸皮在混料机中拌匀后移入蒸球中，再加入3倍的培养液，关闭蒸球，在旋转中灭菌1小时；

将蒸球内的灭菌料通过无菌通道送至无菌接种室，然后铺设在特制的塑料盘中，待料温降至35℃时接种种子液，接种量为料的12％-15％(w/w)，将盘送至发酵室，在28℃-30℃的无菌空气和90％的相对湿度条件下培养三天；

(3)、制取原酶：将发酵完毕后的物料在60℃-121℃的热气流中烘干至物料不再减重为止，干后的物料粉碎过筛80-100目，取筛下物料检测每克酶活在1000单位以上为合格品。

2、根据权利要求1所述的纤维素酶固体发酵大规模生产方法，其特征是：将发酵后的物料在浸提罐中以7倍水在30℃以下浸提，缓慢搅拌，取样在实验室的压榨机中榨干，榨干物中的残余酶活小于每克150单位即可，榨干后的渣每克保持在酶活150单位，浸提后从浸提罐用泵将物料打入压榨机榨干，榨出液经超滤机浓缩至每毫升酶活不小于1000单位即可，加1‰-3‰的苯甲酸钠保存、包装，即制成液体酶。

3、根据权利要求2所述的纤维素酶固体发酵大规模生产方法，其特征是：将液体酶的榨出液超滤浓缩至每毫升200-250单位酶活，加入重量比例8％-10％的白色硫酸铵，在缓慢搅拌下输入喷雾干燥机，成品酶活在每克2000单位以上即合格，制取粉状工业酶。

4、根据权利要求1所述的纤维素酶固体发酵大规模生产方法，其特征是：菌种斜面采用马铃薯培养基，培养基配方比例为：每升培养液中含有马铃薯200克、葡萄糖10克、琼脂18克、磷酸二氢钾3克、7水硫酸镁1.5克、滤纸粉10克，其余为水。

5、根据权利要求1所述的纤维素酶固体发酵大规模生产方法，其特征是液体种子培养基配方比例为：每升培养液中含有米糠10克、麸皮5克、硫酸铵2克、磷酸二氢钾1克、无水氯化钙1克、葡萄糖4克、微量元素溶液10毫升；其中微量元素溶液每升中含7水硫酸亚铁0.5克、4水二氯化锰0.19克、7水硫酸锌0.36克、6水二氯化钴0.37克，自然PH值为5.4。

6、根据权利要求1所述的纤维素酶固体发酵大规模生产方法，其特征是固体发酵培养液配方比例为：每升培养液中含有硫酸铵10克、磷酸二氢钾2克、7水硫酸镁0.5克、2水氯化钙0.5克，溶液PH值为5.4。

7、一种为实施如权利要求1所述的纤维素酶固体发酵大规模生产方法而专门设计的设备，包括控制培养箱、离心机实验室设备和蒸球、压滤机、超滤机、干燥机、液体种子发酵罐车间设备，其特征是：并设置固体发酵室，内涂防霉仿瓷涂料，室内设置装有发酵料塑料盘的多层金属架；发酵室内设置保温暖气和保湿设备，室外设置温、湿度指示器；数个发酵室排串联，有无菌风管道相通，每个发酵室底部有与输送无菌风的总管相连的无菌风支管进入口；发酵室顶部设有带逆止阀的发酵废气排出口；固体发酵接种室设置在液体种子罐的隔壁，经不锈钢管由管的出料口排入接种室的容器中，接种室有两个相对的无菌通道，一个通道输入装盘的无菌料，另一通道输出接种的发酵料，无菌通道内设有连接蒸球的晾料室与发酵室的传送带。

8、根据权利要求7所述的设备，其特征是：固体发酵室为圆形水泥结构，内涂防霉仿瓷涂料，高2-2.5米，直径4.5-5米。

9、根据权利要求7所述的设备，其特征是：发酵盘材质采用无毒塑料，长宽高分别为100厘米、40厘米和15厘米。