FI72343B

FI72343B - Foerfarande foer framstaellning av enzymet beta-glukanas genomfermentering av svampen rhizomucor pusillus

Info

Publication number: FI72343B
Application number: FI842888A
Authority: FI
Inventors: Bernt August Nissen; Jon Hovland
Original assignee: Norsk Hydro As
Priority date: 1982-12-22
Filing date: 1984-07-18
Publication date: 1987-01-30
Also published as: NO824321L; NO151294C; FI842888A; FI72343C; NO151294B; WO1984002533A1; US4588690A; EP0129559A1; JPS60500318A; FI842888A0

Description

1 72343

Menetelmä /Vglukanaasientsyymin valmistamiseksi fermentoi-malla Rhizomucor pusillus - sientä Tämä keksintö koskee menetelmää /*-glukanaasin val-5 mistamiseksi viljelemällä mikro-organismia ravintoväliai-neessa.

On ollut kauan tunnettua, että ohra sisältää polysakkaridia /1-glukaani. Ohran />-glukaani on rakenteeltaan polysakkaridi, joka koostuu glukoosista, ja jossa on /2-1,4-10 ja /1-1,3-sidoksia glukosidiyksiköiden välillä, jolloin noin 70 % sidoksista on /VI, 4-sidoksia ja 30 % /'-l, 3-sidoksia .

Jos ohraa, jonka /Vglukaanisisältö on suuri, käytetään kananruokana, joutuvat kanat hankaluuksiin, koska niiden ruuansulatusjärjestelmä ei kykene hajottamaan /Vglukaa-15 nia. /-glukaani läpäisee ruuansulatusjärjestelmän ja tulee ulos tahmeina ulosteina, ja kanoissa esiintyy ripulioireita.

Kun pelkkää ohraa käytetään mallastetun ohran sijasta oluen panoon, tulee vierteestä jäykkäliikkeistä, mikä tekee vierteen suodatuksen eroon mäskistä vaikeaksi.

20 Syynä on se, että mallastamaton ohra sisältää vain vähän glukaania hajottavaa /Vglukanaasientsyymiä.

Edellä mainittu ongelma voidaan välttää lisäämällä ohraan /Vglukanaasia, mutta tämä on hintakysymys ja oluenpanon yhteydessä myös lainsäädännöllinen kysymys.

25 Lisäksi on myös kysymys siitä, että viljellään mik ro-organismeja, jotka ovat erityisen sopivia /J-glukanaa-sin tuottamiseen. On kysymys myös mikro-organismeistä saatavista entsyymisaannoista ja mikro-organismien oikeista viljelyolosuhteista.

30 On tunnettua, että joillakin mikro-organismeilla on kyky tuottaa /Vglukanaasientsyymiä, joka on käytössä />-glukaanin hajottamisessa.

GB-patenttijulkaisussa 1 421 127 kuvataan menetelmää /Vglukanaasin, joka soveltuu /'-glukaanin hajottamiseen 35 ohrassa, valmistamiseksi, jossa käytetään mikro-organismia Penicillium emersonii. Se on termofiilinen mikro-organismi, jonka kasvuoptimi on 50-54°C, ja jonka kasvu on hyvin hidas- 2 72343 ta alle 37-40°C:n lämpötiloissa. Optimiolosuhteiden alapuolella fermentointi kestää 7-10 vrk.

DD-patenttijulkaisussa 148 891 kuvataan myös menetelmää /3-glukanaasin valmistamiseksi, mutta tässä mene-5 telmässä käytetään mikro-organismia Bacillus subtilis.

Entsyymin valmistus tapahtuu aerobisissa ja pinnanalaisissa olosuhteissa vapaasti virtaavassa ravintoväliaineessa noin 30°C:ssa.

DE-hakemusjulkaisussa 2 408 237 kuvataan menetelmää 10 p-glukanaasin valmistamiseksi mikro-organismin Aspergillus phoenicis avulla. Tätä organismia ei kuvata termofiilisek-si, ja kasvuoptimi näyttää olevan 25-35°C:ssa kasvatettuna aerobisissa olosuhteissa.

Yllä mainituilla tunnetuilla menetelmillä on joita-15 kin heikkouksia. Ensinnäkin fermentointi kestää liian kauan käytettäessä mikro-organismia Penicillium emersonii, ja toiseksi entsyymillä, jota tuotetaan fermentoimalla Penicillium emersoniita ja Bacillus subtilista, on rajoittunut aktiivisuus matalahkossa pH:ssa. Länsisaksalaisessa 20 menetelmässä käytettyä Aspergillus phoenicista ei voida luonnehtia ollenkaan termofiiliseksi, sillä sen kasvuoptimi on alueella 25-35°C.

Nyt on ilmeistä, että lajin Rhizomucor pusillus (Lindt) Schipper mikro-organismit täyttävät keksinnön tar-25 koituksen, koska tämä mikro-organismi on termofiilinen, kasvaa nopeasti ja antaa korkean entsyymisaannon suhteessa lyhyeen fermentointiaikaan.

Mainitun organismin lajeja on eristetty maasta ja ohranjyvistä. Eräs näistä on osoittautunut erittäin hyvin 30 soveltuvaksi ja se on talletettu numerolla CBS 551.82

Centralbureau voor Schimmelculturesiin, Hollanti. Lisäksi on tutkittu the American Type Culture Collektionista, USA, saadut Rhizomucor pusillus-lajit. Parhaimmin soveltuvalla on numero ATCC 22074. Mainitun organismin tärkeyden hyväl-35 le tulokselle lisäksi on myös mainittava, että ravintovä-liaineen koostumus, ilmastus ja fermentointiastian muoto 3 72343 ovat tärkeitä tekijöitä optimaalisten olosuhteiden saavuttamiseksi fermentoinnin aikana ja siten vaikuttavat keksinnön tarkoituksen saavuttamiseen.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle /^-glukanaasin val-5 mistamiseksi on tunnusomaista, että sienen Rhizomucor pusillus (Lindt) Schipper lajeja käytetään inokulaatin valmistukseen, ja tätä inokulaattia lisätään fermentoriin, joka sisältää ravintoväliainetta, joka sisältää ravintosuolo-ja, hivenaineita ja hiili- ja typpiaineosia, jolloin /^-glu-10 kanaasin tuotanto tapahtuu pinnan alla aerobisissa ja ter-mofiilisissä olosuhteissa.

Ravintoväliaine

Yllä mainittuja sieniä voidaan viljellä kasvattamalla niitä kiinteällä väliaineella, esimerkiksi peruna-15 dekstroosi-agarilla 40-45°C:ssa. Suurten /'»-glukanaasimää- rien tuottamiseksi sienet tulee siirtää nestemäiseen väli- 2 aineeseen. Noin 2 x 2 cm :n agarpala leikataan irti ]a homogenoidaan hyvin tunnetulla tavalla noin 10 ml:n kanssa väliainetta. 2 ml homogenaattia siirrostetaan steriiliin 20 erlenmeyeriin, joka sisältää 100 ml väliainetta.

Väliaineena käytetään:

Liukoista tärkkelystä 5,0 g KH2P04 1,0 g

MgS03*7H20 0,88 g 25 CaCl·^ 0,1 g

Hivenaineliuosta 1,25 ml (NH^)2“tartraattia 3,0 g

Tislattua vettä 1,0 1 pH säädetty 5,5:ksi.

30 Hivenaineliuoksen koostumus oli: Väkevää H2S04 1,5 ml

CuS04*5H20 1,0 g

FeS04-7H20 15,0 g

ZnS04'7H20 6,2 g 35 MnS04'H20 1,5 g

Tislattua vettä 1,0 1 4 72343

Erlenmeyereitä inkuboidaan 40°C:ssa ravistellen, kunnes saavutetaan kohtalainen kasvu 48-72 h:n kuluttua.

300 ml inokulaattia siirrostetaan 7 l:n fermentoriin, joka sisältää 5 1 suolaväliainetta, jolla on seuraava koos-5 tumus: KH2P04 2,0 g

MgS04*7H20 1,75 g

CaCl2 0,2 g

Hivenaineliuosta 2,5 g 10 Vettä 1,0 1.

Hivenaineliuoksella on sama koostumus kuin edellä kuvatulla.

Väliaine sisältää myös substraatin, joka antaa sienelle välttämättömän energian ja hiilen, samoin kuin typ-15 pilähteen.

Kasvatuksen aikana käytetään erilaisia energia- ja hiililähteitä, joista tavalliset perunajauho, ohrajauho ja maissijauho ovat sopivimpia.

Jauhoa lisätään suhteessa fermentorin hapenkulje-20 tuskapasiteettiin sillä tavalla, että viljelmä on aina aerobisissa olosuhteissa.

Seuraavia voidaan käyttää soveltuvina N-lähteinä: KNO^, NH4C1 ja urea. Typpilähdettä lisätään suhteessa hiilen määrään sillä tavalla, että painosuhde hiilen ja typen 25 välillä on pienempi kuin 7.

Fermentori tulee varustaa tunnetulla tavalla hapon ja emäksen lisäämistä varten kasvatuksen aikana pH:n säätämiseksi alueelle 4,0-6,0. Rhizomucor pusillusin kasvatukseen käytettävä laitteisto steriloidaan ennalta, ja fermen-30 toinnin yhteydessä käytetään aseptisia menetelmiä.

Ilmastus

Entsyymisaannon kannalta on erittäin tärkeää, että mikro-organismia sekoitetaan hyvin fermentorissa fermentoin-nin aikana. On myös tärkeää, että fermentoriin lisättävä 35 ilma tai happi dispergoidaan ravintoväliaineeseen siten, että kaikkialla fermentorissa vallitsevat aerobiset olosuhteet fermentoinnin aikana.

li 5 72343

Laitteiston malli

Keksintöön johtavan työn aikana havaittiin, että fermentorin koko ja muoto ovat oleellisia entsyymisaannon kannalta. On tärkeää, että syötetty ilma tai happi jakau-5 tuu kaikkialle fermentoriin, että sekoitus on tehokasta, niin että sieni on tasaisesti jakautuneena fermentoinnin aikana eikä kerrostu fermentorin seinille ja putkistoihin, ja että olosuhteet fermentorin sisällä ovat koko ajan aerobiset. Viittaamme jäljempänä oleviin esimerkkehin 1 ja 10 5, joista esimerkki 1 kuvaa 7 l:n fermentorin käyttöä ja esimerkki 5 300 l:n fermentorin käyttöä.

Analyysi

Entsyymiaktiivisuus määritetään mittaamalla kasvava pelkistävän sokerin määrä fotometrisesti aallonpituu-15 della 450 nm. Pelkistävän sokerin analyysi tehdään S. Dy-gertin, L.H. Lin, D. Floridan ja J.A. Thoman mukaan /Analytical Biochemistry 13 (1965) 367-374/ seuraavassa kuvattavalla tavalla.

5 ml kuparireagenssia lisätään kuhunkin kuudesta 20 koeputkesta. 5 ml:n entsyyminäyte, joka on temperoitu 30°C:een, sekoitetaan 5 ml:aan ohran ^-glukaania (myös temperoitu 30°C:een) kirkkaassa koeputkessa ja 1 ml seosta imetään ja lisätään ensimmäiseen kuparireagenssia sisältävään koeputkeen. Aika tulee rekisteröidä. Sitten imetään 25 5 min:n väliajoin 20 min:n aikana 1 ml:n näyte ohran yft- glukaaniseosta, joka sitten lisätään vapaana oleviin kuparireagenssia sisältäviin koeputkiin. Lopuksi lisätään 1 ml asetaattipuskuria kuudenteen ja viimeiseen kuparireagenssia sisältävään koeputkeen. Kaikkiin koeputkiin lisätään 30 5 ml neokuproiinireagenssia ja sitten ne kaikki sijoitetaan kiehuvaan vesihauteeseen 12 min:ksi. Sitten koeputket jäähdytetään kylmällä vedellä ja kuhunkin niistä lisätään 11 ml tislattua vettä. Pelkistävän sokerin pitoisuus mitataan fotometrisesti aallonpituudella 450 nm käyttäen pelkkää 35 asetaattipuskuria sisältävää koeputkea nollanäytteenä.

Yllä mainittu kuparireagenssi valmistetaan punnitsemalla 40,0 g Na^O^ ja 16,0 g glysiiniä, jotka liuote- 6 72343 taan 600 mlraan tislattua vettä. Kun ne ovat liuenneet, lisätään 0,45 g CuS04*5H20 ja täytetään 1000 ml:ksi.

Yllä mainittu neokuproiinireagenssi valmistetaan punnitsemalla 1,20 g neokuproiini*HC1 (2,9-dimetyyli-5 1,10-fenantroliinihydrokloridi), joka liuotetaan veteen, ja säätämällä tilavuus 1000 ml:ksi.

Yllä mainittu ohran /1-glukaaniliuos valmistetaan punnitsemalla 0,50 g ohran/’-glukaania, joka liuotetaan 70 ml:aan tislattua vettä kuumentamalla 80-90°C:ssa 20 min. 10 Suodatetaan ja suodokseen lisätään 10 ml 0,5 M asetaatti-puskuria (pH 4,0). Laimennetaan 100 ml:ksi mittapullossa ja lisätään sitten 0,02 g NaN^·

Asetaattipuskuri valmistetaan punnitsemalla 30,3 g etikkahappoa, joka laimennetaan noin 900 ml :11a tislattua 15 vettä. Sitten lisätään 2,5 g kiinteää NaOH ja pH säädetään 4,0:ksi 1 N NaOH:11a. Sitten lisätään 0,2 g NaN^ ja täytetään 1000 ml:ksi.

Kokeen aikana on entsyymiliuoksen pitoisuutta säädeltävä siten, että ohran /^-glukaanista tuleva pelkistä-20 vän sokerin määrän on lineraarisessa suhteessa aikaan. Mikäli välttämätöntä, entsyymiliuosta laimennetaan 0,05 M asetaattipuskurilla. Entsyymiaktiivisuus analysoidaan edellä mainitun analyysimenetelmän mukaisesti pelkistävänä sokerina käyttäen glukoosia referenssiaineena. Yksi entsyy-25 miyksikkö (EU) määritellään siksi määräksi entsyymiä, joka antaa 1 pmol glukoosia vastaavan määrän pelkistävää so-i o keriä minuutissa 30 C:ssa.

Keksinnön ymmärtämiseksi paremmin viitataan seuraa-viin esimerkkeihin.

30 Esimerkki 1 300 ml Rhizomucor pusillus (Lindt) Schipper CBS 551.82 -inokulaattia lisätään fermentoriin (7 1), joka sisältää 5 1 suolaväliainetta, jonka koostumus on seuraava: KH2P04 2,0 g 35 MgS04*7H20 1,75 g

CaCl2 0,2 g

Hivenaineliuosta 2,5 ml

Vettä 1,01 7 72343

Hivenaineliuoksella on sama koostumus kuin edellä kuvatulla inokulaatin valmistukseen käytetyllä liuoksella.

Vaahdon alentamiseen käytettiin Berol 374 (Berol Kemi AB, Ruotsi). Fermentointi suoritettiin pH 5,5:ssä 5 40°C:n lämpötilassa käyttäen sekoitusnopeutta noin 600 rpm.

Ilmastusnopeus oli 3 vvm so. 15 1 ilmaa/min fermentoriin.

Hiililähteenä käytettiin 40 g/1 perunatärkkelystä ja typpilähteenä 13,4 g/1 NH^Cl. Fermentointiaika oli 67 h. Entsyymiaktiivisuus oli 400 EU/1.

10 Esimerkki 2

Rhizomucor pusillus (Lindt) Schipper CBS 551.82:a kasvatettiin 40 g/1 ohrajauhoa sisältävässä väliaineessa ja fermentoitiin samoissa olosuhteissa kuin esimerkissä 1, mutta fermentointiaika oli 45 h. Entsyymiaktiivisuudeksi 15 mitattiin 950 EU/1.

Esimerkki 3

300 ml Rhizomucor pusillus (Lindt) Schipper CBS

551.82- inokulaattia fermentoitiin esimerkin 2 yhteydessä mainituissa olosuhteissa. Typpilähteenä käytettiin 7,5 g/1 20 ureaa. Entsyymiaktiivisuuden mitattiin olevan 870 EU/1.

Esimerkki 4 300 ml Rhizomucor pusillus ATCC 22074-inokulaattia lisättiin fermentoriin (7 1), joka sisälsi 5 1 esimerkin 1 mukaista suolaväliainetta, ja fermentoitiin esimerkin 2 25 mukaisissa olosuhteissa. Entsyymisaanto oli 170 EU/1.

Esimerkki 5

300 ml Rhizomucor pusillus (Lindt) Schipper CBS

551.82- inokulaattia lisättiin fermentoriin (14 1), joka sisälsi 10 1 suolaväliainetta, ja fermentoitiin esimerkin 30 2 mukaisesti. Tämä 10 l:n erä käytettiin inokulaattina fer mentoriin (300 1), joka sisälsi 200 1 esimerkin 1 mukaista suolaväliainetta. Fermentointi suoritettiin väliaineessa, joka sisälsi 40 g/1 ohrajauhoa ja 13,4 g/1 NH^Cl, pH 4,7:ssä ja 40°C:n lämpötilassa sekoitusnopeudella noin 410 rpm. II-35 mastusnopeus oli 0,17 vvm, so. 34 1 ilmaa/min fermentoriin.

Entsyymiaktiivisuus oli 4800 EU/1 79 h:n kuluttua ja 5200 EU/1 92 h:n kuluttua.

β 72343

Esimerkit osoittavat seuraavat keksinnön edut tunnettujen mikro-organismien käyttöön nähden: - Rhizomucor pusillus (Lindt) Schipper CBS 551.82 antaa paremman entsyymisaannon jopa lyhyellä fermentointiajal- 5 la (2-3 vrk).

- Mainittu mikro-organismi ei ole herkkä korkeissakaan lämpötiloissa (40-50°C) ja alhaisessa pH:ssa (pH noin 4,0).

- Aerobiset olosuhteet aikaansaadaan kaikkialla fermento-rissa, mikä on hyvin tärkeää hyvän entsyymisaannon saami- 10 seksi.

Claims

9 72343

1. Menetelmä /^-glukanaasin valmistamiseksi viljelemällä mikro-organismia ravintoväliaineessa, t u n - 5. e t t u siitä, että sienen Rhizomucor pusillus (Lindt) Schipper lajeja käytetään inokulaatin valmistukseen, ja tätä inokulaattia lisätään fermentoriin, joka sisältää ravintoväliainetta, joka sisältää ravintosuoloja, hivenaineita ja hiili- ja typpiaineosia, jolloin/’-glukanaasin 10 tuotanto tapahtuu pinnan alla aerobisissa ja termofiilisis-sä olosuhteissa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytettävä sienilaji on Rhizomucor pusillus (Lindt) Schipper CBS 551.82.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että hiililähteenä käytetään tärkkelystä sisältävää kasvijauhoa.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että typpilähteenä käytetään epäorgaanista 20 typpiaineosaa ja/tai ureaa.

5. Patenttivaatimusten 3 ja 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että painosuhde C:N on alueella 3-7, edullisesti noin 5.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n - 25. e t t u siitä, että käytettävän ravintoliuospohjän pH on 4,0-6,0 ja edullisesti noin 4,5.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentointi suoritetaan lämpötilassa 40-50°C, edullisesti noin 45°C.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että fermentointi lopetetaan 2-4 vrk:n kuluttua, minkä jälkeen fermentointineste erotetaan tunnetulla tavalla kiinteäksi osaksi, joka sisältää mikro-organismin, ja nestemäiseksi osaksi, jolloin nestemäinen osa 35 sisältää y!*-glukanaasientsyymin.