JPS60500318A - 菌類の醗酵による酵素β↓−グルカナ−ゼの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 菌類のｌ！ｉ！酵による酵素β−グルカナーゼの襄法本発明はβ−グルカナーゼ （β−ｇｌｕｅａｎａｌｉｌθ）　のＭ法に関する。

大麦が多糖類β−グルカン（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅβ−（＜１ｕｃａｎ 　）を含有することは長年にわたって知られている、大麦−β−グルカンは構造 的にはグルコシド単位の間にβ−／、ｌＩ−結合及びβ−／、３−結合をもち、 且つ結合の約りｏ　Ｔ）ｐｈがβ−ｌ、≠−結合であり、また３　０　ｐｐｈが β−／、３−結合であるグルコースよりなる多糖類である。

β−グルカンの高含量をもつ大麦を養鶏用飼料として使用すると、鶏の消化系が β−グルカンを分解できないために鶏は病気となる。大麦は消化系を通過し、べ たつく糞と１７で排泄され、鶏は下痢の症状を示す。

ビール醸造のためにモルトを含有する大麦の代りに純粋な大麦を使用すると、麦 芽汁は粘稠となり、マイシュから麦芽汁をＣ過プることは困難となる。

この理由はモルトを含有しない大麦だけでは少量のグルカンを分解できる酵素β −グルカナーゼを含有するにすぎないためである。

上述の問題はβ−グルカナーゼを大麦に添加することによって回避できるが、し かしこれ・は価格の問題が符表昭ＧＯ−５００３１８（２） あり、またビール醸造のためには法律上の問題もある。

更にβ−グルカナーゼの製造に特に適する微生物を培養する問題もある。また微 生物からの酵素の収量及び微生物の正しい培養条件の問題もある。

いくつかの微生物がβ−グルカンの分解のために使用する酵素β−グルカナーゼ を製造できることが知られている。

英国特許第１，１１２／、１２７号明細書には微生物笠三ｙ」乞妃ニヱ玉ｊ−と ｊζぞ署＝バＤ魁世占ｕｎ　ｅｍｅ聾１１）を使用した場合の大麦のβ−グルカ ンを分解するために適するβ−グルカナーゼの製造方法が記述されている。微生 物ペニシリウム・エメルノニーの最適温度条件は５０〜Ｓｑ℃で、３７〜≠θ℃ 以下の温度では成長が極端に遅い高温性微生物である。最適温度条件未満では醗 酵は７〜１０日間続く。

東ドイツ特許第１’Ｉｇ、ｇ９１号明細書もまたβ−グルプ・ナーゼの製造方法 を記述しているが、しかし該方法においては微生物バチルス・サグステイリス（ Ｂａｃｉ、１１ｔｘｓｅｕｂｔｉ１１．ｓ　）が使用されている。酵素の製造は 約３θ℃で自由に流動する栄養培地中で好気性水中培養条件士−で行われる。

西ドイツ特許出頭＠コ、ＯＱ、ｇ、コ、７７号明細書には微生物りゑで一竺イ麺 ス゛チーさ二／−４杏＾７−ｐぜ一１ｕ夛−用法Ｃ−臆）の方法によるβ−グル カナーゼの製置方法が記述されている。この生物は高温度微生物として記述され てい（３） るものではなく、また好気性条件下で成長させた場合２５〜３５℃に成長最適温 度条件があると思われる。

上述の既知の方法は若干の欠点をもつ。第１に、高より製造され九酵素は比較的 低いｐＨで活性が最低となる。上述の西ドイツ特許の方法において使用されたエ ニシスの適宜な成長最適温度は２！ｒ〜３５℃の範囲であろう。

リソムコール・プシルス（リント）シュバー　［：Ｒｈｉ−ｚｏｍｕｃｏｒ　ｐ ｕｓｉｌｌｕｅ（Ｌｉｎｄｔｌ　８ｃｈｉｐｐｅｒ″３塊の微生物が本発明の目 的を満足することが今般明らかとなった。これは核微生物が高温性であり、成長 が速く、また短時間の醗酵で酵素を高収率で得られるためである。

該生物の塊は土ＩＮ！及び大麦穀粒から単離されたものである。これらの１つは 本発明に非常に適当であることが観察されたものであり、オランダのザ・セント ラルビューロー・フォール・シュメルカルチャーズ（ｔｈθＣｅｎｔｒａｌｂｕ ｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ　）に寄託されＣＢＳ ダタｔ、ｔＸとして記述されている。更に米国のザ・アメリカン・タイプ・カル チャー・コレクション（ｔｈｅコール・プシルスの種が試験された。最も適した 種はＡＴＣｏ　、２コθクグという種である。良好な結果を得るためには前記生 物の重要性に加えて、栄養培地の組成、空気の維持及び醗酵容器の形状は醗酵中 の最適条件を達成するための重要な要因であり、またこのようにして本発明の目 的の実現に寄与するために記載しなければ上述の菌類は固体培地例えばジャガイ モ質ブドウ塘−寒天培地上でｌθ〜ａ３℃の温度で面を成長させることによって 培養できる。よシ多量のβ−グルカナーゼを製造するために菌は液化培地へ移動 する必要がある。約コ×ユｃＩＬ２の寒天片を切り取り、約ｌＯゴの液化培地を 用いて既−ｔＶの方法で均一に分散する。この均一化したものコ４を殺歯した３ ０θｄエルレンマイヤー多ラスコにｌθθｄの液化培地と共に移動した。

下記に示すような培地を使用する： 可溶性でんぷん　３．０９ ＫＨ，ＰＯ４八θＩ ）１ｇＳｏ４・ｑＦＩ、ｏ　Ｏ，ｇ　ｇ　ＩＣａＣ，Ｌ２０．／　１ 微量元素ａ＠液　へユタｍｌ −石酸アンモニウム　３．０ｇ 蒸　留　水　ｔ、ｏ　ｔ ｐＨは９．５に調節した （５） 微量元素類溶液は下記の成分よりなる：濃硫酸　／、５ｄ ｃｕｓｏ４−ｊＨ７Ｏｔ、θ１ ＦｅＳＯ４・７Ｆ１．Ｏ／　！、０１ ＺｎＳＯ４・７Ｈ，０６−２１ Ｍｎ５Ｏ−Ｙｌ　Ｏ／Ｊ　Ｉ 蒸　留　水　／、ＯＡ！ エルレンマイヤーフラスコ中でｔｉｔ〜７２時間後かなりの成育が達成されるま で攪拌することによってａＯ℃で培養を行った。接種液３００ゴを下記の組成を もつ塩培養基５Ｉと共に７ｊの醗酵槽へ移した：ＫＨ２ＰＯ４２，ＯｊＩ ＭｇＳＯ４・７Ｈ７〇　八７ＳＩ ＣａＣＪ　２　０−＝１ 微量元素類溶液　コ、、ｉ　ｐ 水　／−０１ 微量元素類溶液は一ヒ述したものと同じ組成をもつ。

また培地は菌類に必要なエネルギー源及び炭素源ならびに窒素源を含有するっ 種々のエネルギー源及び炭素源が成育中使用され、一般にジャガイモ粉末、大麦 粉末及びとうもろこし粉末が鏝も適１７ている。

上述の粉末は培養が常に好気条件下にあるように醗酵槽の酸素移動能力に関連し て添加される。

次に挙げるものが適当な窒素源として使用できる：？８表昭６Ｏ−５００３１８ （３） ＫＮＯ、、ＮＨ，（’Ａ及び尿素。窒素源は炭素／窒素重量割合がり／ｌ以下に なるよう炭素の量に関連して添力口される。

醗＃槽は成育中ａ、Ｏ〜６．０にｐＨを調節するために酸あるいは苛性アルカリ を添加するための周知の手段を備えなければならない。リゾムコール・グシルス の成育に使用する装置は予め収繭され、また防腐技法は醗酵に関して使用された 。

空気の維持 醗酵中に微生物な醗酵槽中で良く混合することは酵素の収量に啄めて重要である 。また醗酵槽に添加する空気あるいは歳素はｉ１客中Ｊ酵漕全体が好気条件とな るよつに栄養培地中に分散させることが重要である。

装置の構造 本発明に到達する実検中に醗酵槽の寸法及び形状が酵素を取得するための必須条 件であることが見出された。供給する空気あるいＶｉ酸素を＋ｍ酵槽全体に分散 させ、混合が菌類をまた磨酵中に円滑ｌこ分赦し、且つ醗酵装置鍛上あるいはバ イブ系内にスケールが付着せず、また醗酵槽内が常時好気性条件にあることのた めに混合が重要である。この点）でついて隆運する例！及び例Ｓを参照されたい 。例／は７１８酵漕の使用を、また例５は３００１醗酵槽の使用を記述するもの である。

分　析 酵素の活性はｔりθｎ１ｌｌ＋での分光分析方法により還元糖の増量を測定する ことによって測定された。還元糖分析はアナリテイカル・バイオケミストリー（ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｅｈｅｍｉｅｔｒｙ　）第１３巻（ｔｑｂｚ年） の３６７〜３７≠頁に発表されたニス・ダイゲート（Ｓ、Ｄｙｇｅｒｔ）−。

エル・エイチ・リー（Ｌ、　ｌｌＬ　Ｌｉ、）、ディー・フロリダ（Ｄ、　Ｆｌ ｏｒ　ｉｄａ　）及びジエー・エイ・トーマ（：ｒ　、Ａ、Ｔｈｏｍａ）の以下 の記載に従った： 銅試薬ｚ　ｍｌを４本の試験管それぞれに添加する。

３０℃は温度調節された酵素試料タボを澄明試験管中でタボの大麦β−グルカン （これもまた３０℃に温度調節されている）と混合し、得られ丸混合物のｌａｌ を吸い上げ、銅試薬の入った最初の試験管に添加する。

時間を記録する。次に１０分間にわたって夕分毎に大麦β−グルカン混合物の試 料ｔｍずつを吸い上げ、次に鋼試薬の入った使用していない試験管に添加する。

最後に酢酸緩衝液／　ｍｌを６番目すなわち鋼試薬の入った試験管へ添■する。

ネオクプロイン試薬（ｎｅｏｃｕｐｒｏｉｎ−１ｃｒｅａｇｅｎｔ　）ターを全 ての試験管に添加し、次に全ての試験管を１２分間沸騰する湯浴に入れる。矢に 試験管を冷水で冷却し、蒸留水Ｉ’ｄを各々の試験管に添加する。還元糖の量は 純粋な酢酸緩衝液の入った試験管をグリシンとして４５　ＱＭｌで分光分析する ことにより測定された。

上述の鋼試薬はＮａ、Ｃｏ、　ＩＩ　Ｏ，０１及びグリシン／Ｇ、θ９を秤量し 、６００ｄの蒸留水に溶解し、溶解したら０ｕＳＯ４・Ｓ　Ｈ，Ｏθ、＊　ｓ　 ｉを添加し、得られた６液をｌθ０θゴとすることによって製造される。

上述の不オクプロイン試薬は／、２０Ｉのネオクプロイン・Ｈｅ／＝　（Ｊ　、 　？−ジメチルー／、／θ−フェナントロリンハイドロクロライドンを秤量し、 ・水に溶解し、１ＱＯＯＮｌとすることによって製造される。

上述の大麦β−グルカン溶液は大麦β−グルカンｏ、ｓ　ｏ　ｉを秤量し、二〇 −の蒸留水に添加し、ｔＯ〜ｑＯ℃で２０分間加熱して溶解し、ｆ過を行ない、 ｒ液にｐＨダ、０のｄｊ　Ｍ酢酸緩衝溶液１０−を添加し、メスフラスコ中で１ ００４に希釈し、次に０．０コｌのＮａＮ、を添加することによって製造される 。

酢酸緩衝溶液は酢１１２３θ、３１を秤量し、約デθθゴの蒸留水で希釈し、次 に固体形態のＮａＯＨ２，りＩを添７１０し、またｌ規定ＮａＯＨを用いてｐＨ をａ、ｏＶｃｇ１４節し、次に０．２　＃　ＮａＮ、を添加し、溶液をｌＯθ０ ゴに希釈することによって製造できる。

試験中酵素溶液の濃度は大麦に起因する還元糖量が時間と正比例するように調節 すべきである、もし必要であれば酵素容液を０．０　！；　Ｍ酢酸緩衝溶液を用 いて希釈する。酵素の活性は上述の分析法によりグルコースを基準還元糖として 分析される。ｌ酵素単位（ＫＵ）は３０℃での１分毎の７マイクロモルのグルコ ースに相当する還元糖を得るための酵素の量として規定される。

本発明は請求の範囲に従うものである。

本発明をよりよく理解するために以下に例を記載する。

（デ） リソムコール・グクルス（リント）シュバーＣＢＳりｒ　ｔ、ｇコの接種液３θ Ｑｄを７１醗酵槽にりｊの下記の組成をもつ塩培地と共に添加する。

ＫＨ，ＰＯ４２，０１ Ｍｇ１３０４　・　７　Ｈ２Ｏ／、り！ｒｐＯａＯＪＬ２０．コＩ 微量元素類溶液　コＪｄ 水　（、θ！ 微量元素類溶疲は接種ｆＬ製造のために上述した溶液と同じ組成をもつ。

気泡抑制のためにべ゛ロールＪ　７　ａ　（Ｂｅｒｏｌ　、７ＩＱ（ベロール・ ケミーエービ（Ｂｅｒｏｌ　Ｋｅｍｉ　ＡＢＩスエーデン〕を使用した、醗酵は ｅｏ℃の温度で、ｐＨ！、！；で６００ｒｐｍ　の回転速度で攪拌して行なわれ た。空気維持はＪ　ＶＶｍすなわちｔＳＺ１分で空気を醗酵槽へ送って行なった 。

ジャガイモでんぷんａ　ｏ　ｐ　／　ｔを炭素源として使用し、ＮＨ４０ｊ　／ 　Ｊ、４’　Ｉ　／　ｌを窒素源として使用した。醗酵時間は６７時間である。

酵素活性はダｏｏｗＵ／ｌであった。

例−一」− リゾムコール・グンルス（リントンシュバー　（ＢＳ　５！１．ｇ２をダθ、θ ｙ　／　ｉの大麦粉末上で育成し、醗酵時間が４（＆時間である以外は例１に記 述したものと同じ条件下で醗酵した。酵素活性は９！；ＯＷＵ／ｌと測定された 。

−タＬ−Ｊ− 竹表昭６０−５００３１８　（４） リゾムコール・ブシルス（リントンシュパーＣＢＳ　ｊ　＆　／、ｔ　２を用い た接塊液３００Ｒ１を窒素源として７．左ｐ　／　ｉの尿素を使用した以外は例 コに記述したものと同じ条件下で醗酵した。酵素活性はにｑｏｗｒｙ／ｌと測定 された。

」Ｌ」し リゾムコール・プシルスＡＴＣＣ２２０？≠を用いた接′Ｓ液３θＯＭｔを例１ のような塩培地りｊと共に７Ｉ醗酵槽へ添加し、例コと同じ条件下で醗酵した。

得られた酵素の活性ばｔｑｏｗＵ／ｌであった。

を用いた接種液３００ｄを１０１の塩培地と共に／ダｊの撥酵噛へ添加し、例＝ と同じ条件下で醗酵した。これら１０１を３θ０ｉ−ｆｉｌ酵槽の接種類として 例１Ｖｃ記述する塩培地コ００１と共に使用した。醗酵は大麦ｑ。

、１１　／　を及びｌｉ’Ｆ１４０Ｊ−／　３ｊｔ　Ｉ／ｌを用いた培地中、’ ｐＨ’ｃ？、温度ダＯ℃、ｌＩＩＯｒｐｍの回転速度で攪拌して行なった。

空気維持は０．／　７　ｖｖｍ　、すなわち３１Ｉｊ／分で空気を醗酵槽へ送っ て行なった。酵素活性は７９時間後ｑにＯＯｗｙ／ｉであり、また９２時間後Ｓ ２０θＥＩＴ／ｌでちった。

上述の例は既矧の微生物を使用するよりも後述するような発明性のある利点を示 す： リソムコール・プシルス（リント）シュパーＣＢＣ５！ｒ！、ｇ　２は醗酵時間 が短い（２〜３日）時でさえも酵素を高収率で得られる。

前記微生物は高温（ダｏ−ｓｏ℃）及び低ｐＨ（ｐＨ約先０）でさえも感受性で はない。

″＆酵槽全体の好気条件の達成は好収率で４素を帰るために非常ｖｃｆｔ要であ る。

国際調査＠＃テ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ　栄養物中の故生物のそ養によるβ−グル刀ナーゼの製造方法において、単離 した選定されたａ種であるリゾムコール・プ／ルス（リント）シュバーを接櫨液 の調製に使用し、この接種液を栄養塩、微量物質、炭素成分及び窒素成分を含有 する栄養物と共に醗酵槽へ添加し、それによってβ−グルカナーゼを好気性、且 つ高温培養条件下で水中で製造することを特徴とするβ−グルカナーゼの製造Ｊ 法。 コ　使用する菌種がリゾムコール・ブシルス（リント）シュバーＯＢＳりｓ　ｔ 、ｇユである請求の範囲第１項記載の製造方法。 ３　でんぷん含有植物粉末を炭素源として受用する請求の範囲第１項記載の製造 方法。 ｑ　無機窒素成分または尿素またはそれら両者を窒素源として使用する請求の範 囲第１項記載の製造方法。 第ψ項に記載の製造方法。 ｋ　使用する栄養物の基質がｐＨＱ、θ〜６．０、好ましくは約ｔ、５をもつ請 求の範囲第１項記載の製造方法。 ２　醗酵を弘０〜ＳＯ℃の温度、好ましくはｔり℃で行う請求の範囲第１項記載 の製造方法。 ｇ　醗酵を２〜１日後に終了し、次に醗酵液を微生・物含有固体区分及びβ−グ ルカナーゼ酵素含有液体区（１３） 分に既矧の方法により分離し、液体区分がβ−グルカナーゼ敵素を含有する請求 の範囲第１項記載の製造方法。 （１）