CN113322293B

CN113322293B - 一种球磨辅助组合酶法少水化催化几丁质的方法

Info

Publication number: CN113322293B
Application number: CN202110586144.XA
Authority: CN
Inventors: 于欣君; 黄畅弋; 许哲贤; 姚哲焱; 杨潇; 章银军
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2021-05-27
Filing date: 2021-05-27
Publication date: 2022-11-25
Anticipated expiration: 2041-05-27
Also published as: CN113322293A

Abstract

本发明提供了一种球磨辅助组合酶法少水化催化虾蟹壳几丁质高效生产N‑乙酰氨基葡萄糖的方法，微生物发酵产酶和组合酶法结合球磨辅助，解决了几丁质难溶和产量低下的问题，能够高效降解虾蟹壳生产N‑乙酰氨基葡萄糖，得到较高的产量。球磨辅助组合酶法降解比单独一种酶的降解效率更高，产物中N‑乙酰氨基葡萄糖纯度也更高，通过一次反应能够得到一般酶法多次反应的效果。

Description

一种球磨辅助组合酶法少水化催化几丁质的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种球磨辅助组合酶法少水化催化虾蟹壳几丁质高效生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法。

背景技术

几丁质(chitin)，又名甲壳质，由N-乙酰氨基葡萄糖聚合而成，作为仅次于纤维素的第二大天然生物聚合物，广泛存在于自然界中，是迄今为止鉴定出的最丰富的氨基多糖，也是虾蟹壳中最有价值的部分。现代工业中，几丁质通过化学酸碱法降解为低聚糖、寡糖或者单糖，但会产生大量的酸碱废水造成环境污染，并且产物混杂，难以分离纯化。而生物酶法降解具有条件温和、易于控制和环境友好的特点。

N-乙酰氨基葡萄糖是几丁质的单体，天然状态下以6-磷酸酯的形式存在，具有抗氧化和增强免疫力的作用，能够用于保健食品、营养补充剂。它也是所有氨基糖的生化前体，能够合成聚糖、乙酰胺糖、抗生素和生物燃料等衍生物，因此广泛地应用于医药、食品、化工和化妆品等领域。

但几丁质的高结晶度和不溶性阻碍了生物酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的应用。针对这个问题，已报道一些几丁质的预处理方法，包括离子液体处理、高压均质、蒸汽爆破、超声等方法，但都存在着效率不高、产量低下等不足。因此，需要寻找一种简单高效的酶解方法，解决几丁质的高结晶度和难溶性问题，提高N-乙酰氨基葡萄糖的产量。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术降解几丁质时效率不高、产量低下等问题，提供了一种球磨辅助组合酶法少水化催化虾蟹壳几丁质高效生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，通过基因重组工程菌的构建，微生物发酵产酶和组合酶法结合球磨辅助，解决了几丁质难溶和产量低下的问题，能够高效降解虾蟹壳生产N-乙酰氨基葡萄糖，得到较高的产量。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种球磨辅助组合酶法少水化催化几丁质的方法，所述方法为：将几丁质、酶加入水中，调节pH为4-5.5(优选pH为5)，所得混合液在450-500rpm(优选500rpm)经磨珠球磨20-50min(优选30min)，然后30-50℃恒温孵育10-24h(优选45℃恒温孵育20h)，得到N-乙酰氨基葡萄糖；所述酶为几丁质降解酶OfHex1、TvChi1、CmChi1中两种以上的混合物；所述几丁质以粉末的形式加入。

优选所述的几丁质为虾蟹壳几丁质，所述混合液中，所述的几丁质的终浓度为200-600g/L(优选300g/L)。

优选所述混合液中所述的酶的终浓度为0.2-0.9g/L(优选0.6g/L)。

优选的情况下，对于上文所述方法中，所述的几丁质与磨珠的质量比为1:8。

进一步，所述几丁质降解酶来源于昆虫、真菌或细菌。

更优选所述酶为OfHex1、TvChi1和CmChi1的混合物，最优选OfHex1:TvChi1:CmChi1的质量比为3:3:4。

具体地，所述几丁质降解酶为重组酶，按以下方法制备：

(1)通过酶切、连接分别将SEQ ID NO：4所示的OfHex1基因、SEQ ID NO：5所示的TvChi1基因或SEQ ID NO：6所示的CmChi1基因(见序列表4、5和6)连接整合到pPIC9K质粒的SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点之间，分别将所得的重组质粒pPIC9K-OfHex1、pPIC9K-TvChi1和pPIC9K-CmChi1通过电穿孔转化法导入宿主细胞毕赤酵母GS115中，在含氨苄青霉素、G418硫酸盐和生物素的平板上进行抗性筛选，分别获得重组基因工程菌GS115/pPIC9K-OfHex1、GS115/pPIC9K-TvChi1和GS115/pPIC9K-CmChi1；

(2)将步骤(1)中所述的重组基因工程菌GS115/pPIC9K-OfHex1、GS115/pPIC9K-TvChi1和GS115/pPIC9K-CmChi1分别发酵培养，所得发酵液经低温高速离心，收集上清液，低温超滤，即分别得到重组OfHex1、重组TvChi1或重组CmChi1的浓缩酶液。

优选地，所述酶为重组OfHex1、重组TvChi1或重组CmChi1中的两种以上，进一步优选地，所述酶为重组OfHex1和重组CmChi1，最优选为重组OfHex1、重组TvChi1和重组CmChi1。更优选为重组OfHex1、重组TvChi1和重组CmChi1，最优选重组OfHex1:重组TvChi1:重组CmChi1的质量比为3:3:4。

优选地，所述发酵培养为：将所述重组基因工程菌在30℃、200rpm下于种子液培养基中分别培养得种子液，再以BMGY培养基培养30℃、200rpm下培养24h，4000rpm离心10min后收集菌体全部接种至BMMY培养基中，30℃、200rpm培养，分别在0、24、48、72h时加入体积为BMMY培养基体积的1％(v/v)的甲醇，发酵96h后，得到所述发酵液。

进一步优选地，所述种子液培养基由以下各组分组成：2％(w/v)蛋白胨，1％(w/v)酵母粉，2％(w/v)葡萄糖，溶剂为水，pH自然；

所述BMGY培养基由以下各组分组成：1％(w/v)酵母粉，2％(w/v)蛋白胨，0.3％(w/v)K₂HPO₄，1.18％(w/v)KH₂PO₄，0.34％(w/v)YNB(无氨基酵母氮源，不含硫酸铵)，1％(w/v)(NH₄)₂SO₄,1％(v/v)甘油，溶剂为水，pH自然；

BMMY培养基由以下各组分组成：1％(w/v)酵母粉，2％(w/v)蛋白胨，0.3％(w/v)K₂HPO₄，1.18％(w/v)KH₂PO₄，0.34％(w/v)YNB(不含硫酸铵)，1％(w/v)(NH₄)₂SO₄，溶剂为水，pH自然。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1.球磨辅助组合酶法降解虾蟹壳几丁质用水少，比传统的化学法条件更温和、环保，且操作简单；

2.球磨辅助组合酶法能够解决底物几丁质的难溶性问题，大幅提升反应的效率；

3.球磨辅助组合酶法降解比一般酶法降解几丁质产量更高，反应条件经过实验优化，N-乙酰氨基葡萄糖能够得到高达61.3g/L的产量和102.2g/g的单位酶产量；

4.球磨辅助组合酶法降解比单独一种酶的降解效率更高，产物中N-乙酰氨基葡萄糖纯度也更高，通过一次反应能够得到一般酶法多次反应的效果；

5.本发明使用的球磨作为现代工业中的常用手段，对扩大反应体系和工业化生产的应用具有良好的适应性。

附图说明

图1：本发明构建的重组质粒OfHex1的图谱

图2：本发明构建的重组质粒TvChi1的图谱

图3：本发明构建的重组质粒CmChi1的图谱

图4：反应的最佳底物浓度检测

图5：反应的最佳磨料与磨珠比检测

图6：反应的最佳研磨时间检测

图7：反应的最佳老化温度检测

图8：反应的最佳老化时间检测

具体实施方法

下述实施例作为对本发明的进一步描述，帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，而非对本发明进行限制。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思进行等同替换或改变均属于本发明保护范畴。

以下实施例中几丁质粉末使用粉碎机将虾蟹壳研磨而成。

单位酶产量＝N-乙酰氨基葡萄糖浓度×体系体积(34mL)÷酶量

种子液培养基由以下各组分组成：2％(w/v)蛋白胨，1％(w/v)酵母粉，2％(w/v)葡萄糖，溶剂为水，pH自然；

所述BMGY培养基由以下各组分组成：1％(w/v)酵母粉，2％(w/v)蛋白胨，0.3％(w/v)K₂HPO₄，1.18％(w/v)KH₂PO₄，0.34％(w/v)YNB(不含硫酸铵)，1％(w/v)(NH₄)₂SO₄,1％(v/v)甘油，溶剂为水，pH自然；

实施例1多种重组几丁质降解酶基因工程菌的构建

(1)基因的合成

在NCBI数据库获得GenBank Number分别为Q06GJ0_OSTFU(序列表1)、A6YNL9_HYPRU(序列表2)和A6YNL9_HYPRU(序列表3)的几丁质降解酶的氨基酸序列，经过信号肽预测后去除信号肽部分，再经过密码子优化(具体序列见序列表4、5和6)，交由北京擎科生物技术有限公司合成并连接至pPIC9K载体上，位于酶切位点SnaBⅠ和NotⅠ酶之间。

(2)重组质粒的提取

将公司合成的含有质粒的大肠杆菌菌株分别划线至含有100mg/mL Amp的LB固体培养基平板上，37℃恒温培养12-24h。分别挑取平板上的单菌落，接种至含100mg/mL的Amp抗性的LB培养基的液体培养基的摇瓶中，37℃摇床150rpm培养12-16h。分别取2mL菌液至EP管，12000rpm离心2min获得菌体沉淀，使用质粒提取试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)进行质粒提取。通过上述方法分别获得pPIC9K-OfHex1、pPIC9K-TvChi1和pPIC9K-CmChi1质粒，如图1-3所示。

(3)重组质粒的线性化与纯化

将上一步骤得到的重组质粒用SacⅠ限制性内切酶线性化。线性化产物使用试剂盒(购自天根生化科技有限公司)纯化后用于后续电穿孔转化P.pastrios GS115感受态细胞。酶切体系如下所示：

(4)毕赤酵母GS115感受态细胞的制备及电穿孔转化

将-80℃保存的GS115甘油菌取出，在YPD固体培养基上划线，于30℃恒温培养箱静置培养24-48h。挑取单菌落接种于50mL YPD液体培养基，30℃，200rpm培养16-18h，测定其OD600数值，之后将菌液接种于50mL YPD液体培养基中，使初始OD600＝0.1，培养约10h至OD600＝1.0-1.3。取30mL菌液于灭菌的50mL离心管中，4℃，3000rpm离心5min。弃上层清液，沉淀使用40mL预冷的灭菌超纯水重悬，4℃，3000rpm离心5min。重复一次后弃上清液，沉淀使用25mL预冷的灭菌1mol/L山梨醇重悬，4℃，3000rpm离心5min。重复一次后弃上清液，沉淀用1mL预冷的1mol/L山梨醇重悬，4℃，3000rpm离心5min。用枪头吸去上清液，将沉淀用250μL预冷的1mol/L山梨醇重悬，分装至灭菌的1.5mL EP管，80μL每管，置于冰上待用。

分别将纯化的线性化重组质粒pPIC9K-OfHex1、pPIC9K-TvChi1和pPIC9K-CmChi1(约1.5μg，20μL)与毕赤酵母感受态细胞混合，于冰上静置10min。然后分别转移至预冷的2mm电转杯底部，若有气泡产生，轻轻敲打杯壁使其排出。将电转仪开机预热30min，设置参数为电压1.5kV、电容25μF、电阻200Ω、电击时间5ms。确保电击过程在4-10ms内完成。待电击结束后立即加入1.0mL预冷的灭菌1mol/L山梨醇轻轻吹打混匀。将混合物分别转移至灭菌1.5mL EP管中，30℃孵育1h。然后在4℃，3000rpm离心5min，弃部分上清。剩余部分混匀后分别涂布于MD固体培养基平板上(含100μg/mL的Amp、250μg/mL的G418硫酸盐和0.5μg/mL生物素)，30℃恒温培养48-96h。

转化时设置对照为，线性化的空载体pPIC9K转化感受态细胞、未转化的感受态细胞直接涂布MD平板，以排除背景干扰。

(5)重组子的筛选

分别挑取MD平板上的重组工程菌单菌落，接种于30mL的YPD液体培养基摇瓶中(含100mg/mL的Amp和250μg/mL的G418)，30℃，180rpm培养16-18h。取适量菌液与1.5mL EP管中3000rpm离心5min，弃上清。使用酵母基因组提取试剂盒(购自生工生物工程有限公司)提取基因组。

以基因组为模板，以下列引物进行PCR反应，PCR产物的检测通过1.0％琼脂糖凝胶电泳进行验证。引物的DNA序列如下：

正向引物(5’AOX):GACTGGTTCCAATTGACAAGC

反向引物(3’AOX):GGCAAATGGCATTCTGACAT

实施例2微生物发酵产几丁质酶

分别挑取验证成功的工程菌单菌落接种至30mL YPD液体培养基中(含100mg/mL的Amp和1.5mg/mL的G418)，30℃摇床200rpm培养16-18h。取200μL菌液至30mL的BMGY液体培养基中(含0.5μg/mL生物素)，30℃摇床200rpm培养至OD600＝2-6。将菌液转移至灭菌的50mL离心管，4℃，4000rpm离心10min，弃上清，将菌体转移至50mL的BMMY液体培养基中(含0.5μg/mL生物素和1％的无水甲醇)。每24h向培养基中添加0.5mL纯甲醇。BMMY培养至96h后收取菌液，8000rpm离心后弃沉淀，上清即为几丁质酶粗酶液。

将粗酶液转移到超滤管中，4500rpm离心45min，得到浓缩酶液。通过DNS法测得OfHex1、TvChi1和CmChi1粗酶液酶活分别为0.2、0.6和0.7U/mL，浓缩酶液酶活分别为1.9、5.8和6.8U/mL，酶活回收率为95％，多次浓缩后，利用BCA法测定蛋白含量，得到OfHex1、TvChi1和CmChi1的蛋白浓度分别为22、26和23g/L。4℃贮存备用。

实施例3球磨辅助组合酶法少水化高效生产N-乙酰氨基葡萄糖

球磨罐中加入几丁质粉末6g，OfHex1 6.6mg，调整混合酶液pH至4.0，加水调整体积为33.33mL，研磨珠60g，将球磨罐安装于球磨机上，500rpm研磨20min。将研磨后样品置于培养皿中，放入恒温孵育箱，30℃恒温孵育10h。液相测得N-乙酰氨基葡萄糖浓度为6.7g/L，单位酶产量为33.5g/g。

实施例4球磨辅助组合酶法少水化高效生产N-乙酰氨基葡萄糖

球磨罐中加入几丁质粉末6g，TvChi1 6.6mg，调整混合酶液pH至4.0，加水调整体积为33.33mL，研磨珠60g，将球磨罐安装于球磨机上，500rpm研磨20min。将研磨后样品置于培养皿中，放入恒温孵育箱，30℃恒温孵育10h。液相测得N-乙酰氨基葡萄糖浓度为5.8g/L，单位酶产量为29g/g。

实施例5球磨辅助组合酶法少水化高效生产N-乙酰氨基葡萄糖

球磨罐中加入几丁质粉末6g，CmChi1 6.6mg，调整混合酶液pH至4.0，加水调整体积为33.33mL，研磨珠60g，将球磨罐安装于球磨机上，500rpm研磨20min。将研磨后样品置于培养皿中，放入恒温孵育箱，30℃恒温孵育10h。液相测得N-乙酰氨基葡萄糖浓度为7.5g/L，单位酶产量为37.5g/g。

实施例6球磨辅助组合酶法少水化高效生产N-乙酰氨基葡萄糖

球磨罐中加入几丁质粉末6g，OfHex1 3.3mg，TvChi1 3.3mg，调整混合酶液pH至4.0，加水调整体积为33.33mL，研磨珠60g，将球磨罐安装于球磨机上，500rpm研磨20min。将研磨后样品置于培养皿中，放入恒温孵育箱，30℃恒温孵育10h。液相测得N-乙酰氨基葡萄糖浓度为15.4g/L，单位酶产量为77.0g/g。

实施例7球磨辅助组合酶法少水化高效生产N-乙酰氨基葡萄糖

球磨罐中加入几丁质粉末6g，OfHex1 3.3mg，CmChi1 3.3mg，调整混合酶液pH至4.0，加水调整体积为33.33mL，研磨珠60g，将球磨罐安装于球磨机上，500rpm研磨20min。将研磨后样品置于培养皿中，放入恒温孵育箱，30℃恒温孵育10h。液相测得N-乙酰氨基葡萄糖浓度为17.8g/L，单位酶产量为89.0g/g。

实施例8球磨辅助组合酶法少水化高效生产N-乙酰氨基葡萄糖

球磨罐中加入几丁质粉末6g，TvChi1 3.3mg，CmChi1 3.3mg，调整混合酶液pH至4.0，加水调整体积为33.33mL，研磨珠60g，将球磨罐安装于球磨机上，500rpm研磨20min。将研磨后样品置于培养皿中，放入恒温孵育箱，30℃恒温孵育10h。液相测得N-乙酰氨基葡萄糖浓度为13.9g/L，单位酶产量为69.5g/g。

实施例9球磨辅助组合酶法少水化高效生产N-乙酰氨基葡萄糖

球磨罐中加入几丁质粉末6g，OfHex1 2.2mg，TvChi1 2.2mg和CmChi1 2.2mg，调整混合酶液pH至4.0，加水调整体积为33.33mL，研磨珠60g，将球磨罐安装于球磨机上，500rpm研磨20min。将研磨后样品置于培养皿中，放入恒温孵育箱，30℃恒温孵育10h。液相测得N-乙酰氨基葡萄糖浓度为18.5g/L，单位酶产量为92.5g/g。

实施例10球磨辅助组合酶法少水化高效生产N-乙酰氨基葡萄糖

球磨罐中加入几丁质粉末20g，OfHex1 6mg，TvChi1 9mg和CmChi1 15mg，调整混合酶液pH至5.5，加水调整体积为33.33mL，研磨珠120g，将球磨罐安装于球磨机上，500rpm研磨50min。将研磨后样品置于培养皿中，放入恒温孵育箱，50℃恒温孵育24h。液相测得N-乙酰氨基葡萄糖浓度为45.0g/L，单位酶产量为50.0g/g。

实施例11球磨辅助组合酶法少水化高效生产N-乙酰氨基葡萄糖

球磨罐中加入几丁质粉末10g，OfHex1 6mg，TvChi1 6mg和CmChi1 8mg，调整混合酶液pH至5.0，加水调整体积为33.33mL，研磨珠80g，将球磨罐安装于球磨机上，500rpm研磨30min。将研磨后样品置于培养皿中，放入恒温孵育箱，45℃恒温孵育20h。液相测得N-乙酰氨基葡萄糖浓度为61.3g/L，单位酶产量为102.2g/g。

序列表

1

594

Amino acid

物种名：Ostrinia furnacalisN-乙酰氨基葡萄糖苷酶

1 mwsrriplfi fgvlvlilsv aaedvvwrws cdngkcvklk ndprssepal sleackmfcn

61 eygllwprpt geadlgnfls kinlnsievk ilkkgatddl meaaakrfke qvslaiprgs

121 tpkltgkavd vylvnenpne kafslemdes yglrvspsga drvnatitan sffgmrhgle

181 tlsqlfvfdd irdhllmvrd vnisdkpvyp yrgilldtar nyysiesikr tieamaavkl

241 ntfhwhitds qsfpfvttkr pnlykfgals pqkvytkaai revvrfgler gvrvlpefda

301 pahvgegwqd tdltvcfkae pwksycvepp cgqlnptkde lyqylediys dmaevfdttd

361 ifhmggdevs eacwnssdsi qnfmmqnrwd ldkesflklw nyfqqkaqdk aykafgkklp

421 lilwtstltn ykhiddylnk ddyiiqvwtt gvdpqikgll ekgyrlimsn ydalyfdcgy

481 gawvgagnnw cspyigwqkv ydnspavial ehrdqvlgge aalwseqsdt stldgrlwpr

541 aaalaerlwa epatswqdae yrmlhirerl vrmgiqaesl qpewcyqneg ycys

2

424

Amino acid

物种名：Trichoderma viride

几丁质酶

1 mlgflgksma llaalqatlt satpvstndv svekrasgyt navyftnwgi ygrnfqpqdl

61 vasdithviy pfmnfqadgt vvsgdayady qkhysddswn dvgnnaygcv nqlfklkkan

121 rnlkvmlsig gwtwstnfps aastdanrkn faktaitfmk dwgfdgidvd weypaddtqa

181 tnmvlllkei rsqldayaaq yapgyhflls iaapagpehy salhmadlgq vldyvnlmay

241 dyagswssys ghdanlfanp snpnsspynt dqaikaying gvpaskivlg mpiygrsfes

301 tngigqtyng igsgswengi wdykvlpkag atvqydsvaq ayysydsssk elisfdtpdm

361 vskkvsylkn lglggsmfwe asadktgsds ligtshralg sldstqnlls ypnsqydnir

421 sgln

3

658

Amino acid

物种名：Chitinolyticbacter meiyuanensis

几丁质酶

1 msqinrfaia alpaaliaah afaaypvwqe gntyaagtfv syngkdyqaq vthtayvgan

61 wnpaatptlw kevgtstnpt ptpvaatptp vsatptpvva tptpkpatpt patatptpag

121 qypawsasgv ytqgnrvvyq gvvyeaqwwt qgdnpaqsgs wgvwrvvggn pvtatptpva

181 atptpvvatp tpvvatptpk patptpvvat ptpvaatptp vgptptpvtp sagtkqvgsy

241 faqwgvygrd yqvadiitsg sapkltfiny afgnvyqkng gyecdiltrt eagngdggda

301 wadfgmtpkr rvdpadtikw ddklagnfre fkalkakhpn ikmfislggw twskwfsnaa

361 ktdalrkqlv kscidiyikg nlpvvdgrgg agaaagvfdg ididwefpgv qgfgyntvda

421 adgknyelll aefrkqldel gattgkhypl tiaigmgkdk idqinagala akldwinmmt

481 ydynggwsle qtnfqshlyr dpaspndacs gtgtcyngrs lvsyyntddg vaqllaqgap

541 anklvlglpf ygrgwtgvpn vnnglyqkpt gaargtyeag iedykvlkna agtvyvhpvt

601 kqsykydgtn wwsydtpavi qtkvdyakak glggvfswel dgdttngelm nvmgnmnk

4

1719

Nucleotide

物种名：Ostrinia furnacalis

N-乙酰氨基葡萄糖苷酶

1 gaggatgttg tttggagatg gtcttgtgat aatggtaagt gtgttaagtt gaagaatgat

61 ccaagatctt ctgagcctgc tttgtctttg gaggcttgta agatgttttg taacgaatat

121 ggtttgttgt ggccaagacc tactggagaa gctgatttgg gtaacttttt gtctaagatt

181 aacttgaaca gtattgaagt taagattttg aagaagggtg ctactgatga tttgatggag

241 gctgctgcta agagatttaa agaacaagtt tctttggcta ttcctagagg ttccacccca

301 aagttgaccg gtaaggctgt tgacgtttac ttggttaacg aaaacccaaa cgaaaaggct

361 ttttctttgg aaatggatga atcttacggt ttgagagttt ctccaagtgg tgccgataga

421 gttaacgcta ccattactgc taattctttt tttggaatga gacatggttt ggaaactttg

481 tctcagttgt ttgtttttga tgatattaga gatcatcttt tgatggttag agatgttaat

541 atttctgata agcctgttta cccttacaga ggtattttgt tggatactgc tagaaactac

601 tactctattg agagtattaa gagaactatt gaggccatgg ctgctgttaa gttgaacacc

661 tttcattggc atattactga ttctcagtct tttccttttg ttaccactaa gagaccaaac

721 ttgtacaagt ttggtgcttt gtctccacaa aaggtttaca ctaaggctgc tattagagag

781 gttgttagat ttggattgga aagaggtgtt agagttttgc cagaatttga tgctcctgct

841 catgttggtg agggttggca agatactgat ttgactgttt gttttaaggc cgagccatgg

901 aagtcttatt gtgttgagcc accatgtggt cagttgaatc caactaagga tgaattgtac

961 cagtatttgg aggatattta ctctgatatg gcagaggttt ttgatactac tgatattttt

1021 catatgggtg gtgatgaagt ttctgaagca tgttggaact cttccgatagtattcaaaac

1081 tttatgatgc aaaacagatg ggatttggat aaggagtctt ttttgaaattgtggaactac

1141 tttcagcaaa aggcacagga taaggcttat aaggcctttg gtaagaagttgccattgatt

1201 ttgtggactt caaccttgac taactacaag catatcgatg attacttgaacaaagatgat

1261 tacattattc aagtttggac tactggtgtt gatccacaaa ttaagggtttgttggaaaag

1321 ggttacagat tgattatgtc caactacgac gccttgtact ttgattgtggttacggtgcc

1381 tgggttggtg ctggtaacaa ctggtgtagt ccatacattg gttggcagaaggtttatgat

1441 aactcccctg ctgttattgc cttggaacat agagatcagg ttttgggtggtgaagctgct

1501 ttgtggagtg aacagtccga tacttcaact ttggatggta gattgtggccaagagctgct

1561 gctttggctg agagattgtg ggctgaacca gctacttctt ggcaagatgcagaatataga

1621 atgttgcata ttagagagag attggttaga atgggtattc aggctgaaagtttgcaacca

1681 gaatggtgtt accagaacga aggatattgt tactcttaa

5

1209

Nucleotide

物种名：Trichoderma viride

几丁质酶

1 accccagttt ctaccaacga cgtttccgtt gaaaagagag cctctggtta caccaacgct

61 gtttatttta ctaactgggg tatttacggt agaaactttc aaccacagga cttggttgct

121 tctgatatca cccacgttat ttacccattt atgaattttc aagctgatgg aactgttgtt

181 tctggtgatg cttacgctga ctaccaaaag cactactctg atgattcttg gaatgatgtt

241 ggtaacaacg cctatggttg cgttaaccag ttgtttaagt tgaagaaagc caatagaaac

301 ttgaaggtta tgttgtctat tggtggatgg acttggtcta ctaattttcc aagtgctgct

361 tctactgatg ctaatagaaa gaactttgct aagactgcta ttacttttat gaaggattgg

421 ggttttgatg gtattgatgt tgattgggag tatcctgctg atgatactca agctactaat

481 atggttcttt tgttgaagga aattagatct cagttggatg cttacgccgc tcagtatgct

541 cctggttatc actttttgtt gtctattgct gctccagctg gtccagaaca ttactccgct

601 ttgcatatgg ctgatttggg tcaagttctt gattacgtta acttgatggc ttacgattat

661 gctggttctt ggtcttctta ctctggtcat gatgctaacc tttttgctaa cccttctaac

721 ccaaactctt ctccttacaa cactgatcaa gccattaaag cctacattaa cggtggagtt

781 ccagcttcta agattgttct tggtatgcca atttatggta gatcttttga atctactaac

841 ggtattggtc aaacctacaa cggtattgga tctggaagtt gggagaacgg tatttgggat

901 tataaggttt tgcctaaagc tggtgctact gttcaatacg atagtgttgc tcaggcttat

961 tacagttacg acagttcttc taaggaattg atttcttttg atactccaga catggtttcc

1021 aagaaggttt cttaccttaa gaaccttggt ttgggtggtt ctatgttttgggaagcttct

1081 gcagataaga ccggttctga tagtttgatt ggtacttctc atagagctttgggttctttg

1141 gactctactc aaaacttgtt gtcttatcct aattctcaat acgataacattagatctggt

1201 ttgaactaa

6

1908

Nucleotide

物种名：Chitinolyticbacter meiyuanensis

几丁质酶

1 gcttacccag tttggcaaga aggtaacacc tacgccgccg gtacctttgt ttcttacaac

61 ggtaaggatt accaggctca agttacccat actgcttacg ttggtgctaa ttggaaccca

121 gctgctactc ctaccttgtg gaaggaggtt ggtacttcta ctaacccaac tcctactcca

181 gtcgctgcca ccccaacacc agtttctgct actccaactc cagttgttgc tactcctact

241 cctaagccag ctactcctac accagctact gctactccaa ccccagccgg tcaataccca

301 gcttggtctg cttctggtgt ttacactcaa ggtaacagag ttgtttatca aggtgttgtc

361 tacgaagctc aatggtggac tcaaggagat aatccagccc aatccggttc ctggggtgtt

421 tggagagttg ttggtggtaa ccctgttact gccactccaa ctcctgttgc tgctactcca

481 acaccagtcg ttgctacccc aactccagtc gttgccactc ctactccaaa accagctact

541 ccaactccag ttgtcgctac tccaactcca gttgctgcca ctcctacccc agttggtcca

601 actccaactc cagttactcc atccgctggt actaaacaag tcggttccta ctttgcccaa

661 tggggtgttt acggtagaga ctaccaagtt gctgatatta ttacttctgg ttctgctcca

721 aaattgacct ttattaacta cgcttttgga aacgtctatc agaagaacgg tggttacgaa

781 tgtgatattt tgacaagaac tgaagctggt aacggagacg gaggtgatgc ttgggctgac

841 tttggaatga ctcctaagag aagagttgat ccagctgata ctattaagtg ggatgataag

901 ttggccggta actttagaga atttaaggca ttgaaggcaa agcatccaaa tattaagatg

961 tttatttctt tgggtggttg gacttggagt aaatggtttt ctaatgctgc taagaccgat

1021 gctttgagaa agcagttggt taaatcttgt attgatattt acattaagggaaacttgcct

1081 gttgttgatg gtagaggtgg tgctggtgct gctgctggtg tttttgatggtattgatatt

1141 gattgggaat ttcctggtgt tcagggtttt ggttataaca ctgttgatgctgctgatggt

1201 aagaattatg aattgttgtt ggctgagttt agaaagcagc ttgatgaattgggtgctact

1261 actggtaagc attatccttt gactattgct attggaatgg gtaaggataaaattgatcag

1321 atcaacgctg gtgctcttgc tgcaaagttg gattggatta acatgatgacttacgactac

1381 aatggaggtt ggtctttgga gcagactaac tttcaatctc atttgtacagagatccagcc

1441 tcccctaacg atgcttgtag tggaactggt acttgctata acggtagatccttggtttct

1501 tattataata ctgatgatgg tgttgctcag cttttggctc aaggtgctccagctaacaag

1561 ttggtcttgg gtttgccatt ttacggtaga ggttggactg gtgttcctaacgttaacaac

1621 ggtttgtacc agaagccaac tggtgctgct agaggtacat atgaagccggtattgaagat

1681 tataaggttt tgaagaacgc tgctggtact gtttacgtcc atccagtcactaagcaatct

1741 tacaagtatg atggtactaa ttggtggtca tatgacactc cagctgttattcaaactaag

1801 gttgattacg ccaaggctaa gggtttgggt ggtgtttttt cttgggaattggatggtgat

1861 actactaacg gtgaattgat gaacgttatg ggtaacatga ataagtaa

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种球磨辅助组合酶法少水化催化几丁质的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 594

<212> PRT

<213> Ostrinia furnacalis

<400> 1

Met Trp Ser Arg Arg Ile Pro Leu Phe Ile Phe Gly Val Leu Val Leu

1 5 10 15

Ile Leu Ser Val Ala Ala Glu Asp Val Val Trp Arg Trp Ser Cys Asp

20 25 30

Asn Gly Lys Cys Val Lys Leu Lys Asn Asp Pro Arg Ser Ser Glu Pro

35 40 45

Ala Leu Ser Leu Glu Ala Cys Lys Met Phe Cys Asn Glu Tyr Gly Leu

50 55 60

Leu Trp Pro Arg Pro Thr Gly Glu Ala Asp Leu Gly Asn Phe Leu Ser

65 70 75 80

Lys Ile Asn Leu Asn Ser Ile Glu Val Lys Ile Leu Lys Lys Gly Ala

85 90 95

Thr Asp Asp Leu Met Glu Ala Ala Ala Lys Arg Phe Lys Glu Gln Val

100 105 110

Ser Leu Ala Ile Pro Arg Gly Ser Thr Pro Lys Leu Thr Gly Lys Ala

115 120 125

Val Asp Val Tyr Leu Val Asn Glu Asn Pro Asn Glu Lys Ala Phe Ser

130 135 140

Leu Glu Met Asp Glu Ser Tyr Gly Leu Arg Val Ser Pro Ser Gly Ala

145 150 155 160

Asp Arg Val Asn Ala Thr Ile Thr Ala Asn Ser Phe Phe Gly Met Arg

165 170 175

His Gly Leu Glu Thr Leu Ser Gln Leu Phe Val Phe Asp Asp Ile Arg

180 185 190

Asp His Leu Leu Met Val Arg Asp Val Asn Ile Ser Asp Lys Pro Val

195 200 205

Tyr Pro Tyr Arg Gly Ile Leu Leu Asp Thr Ala Arg Asn Tyr Tyr Ser

210 215 220

Ile Glu Ser Ile Lys Arg Thr Ile Glu Ala Met Ala Ala Val Lys Leu

225 230 235 240

Asn Thr Phe His Trp His Ile Thr Asp Ser Gln Ser Phe Pro Phe Val

245 250 255

Thr Thr Lys Arg Pro Asn Leu Tyr Lys Phe Gly Ala Leu Ser Pro Gln

260 265 270

Lys Val Tyr Thr Lys Ala Ala Ile Arg Glu Val Val Arg Phe Gly Leu

275 280 285

Glu Arg Gly Val Arg Val Leu Pro Glu Phe Asp Ala Pro Ala His Val

290 295 300

Gly Glu Gly Trp Gln Asp Thr Asp Leu Thr Val Cys Phe Lys Ala Glu

305 310 315 320

Pro Trp Lys Ser Tyr Cys Val Glu Pro Pro Cys Gly Gln Leu Asn Pro

325 330 335

Thr Lys Asp Glu Leu Tyr Gln Tyr Leu Glu Asp Ile Tyr Ser Asp Met

340 345 350

Ala Glu Val Phe Asp Thr Thr Asp Ile Phe His Met Gly Gly Asp Glu

355 360 365

Val Ser Glu Ala Cys Trp Asn Ser Ser Asp Ser Ile Gln Asn Phe Met

370 375 380

Met Gln Asn Arg Trp Asp Leu Asp Lys Glu Ser Phe Leu Lys Leu Trp

385 390 395 400

Asn Tyr Phe Gln Gln Lys Ala Gln Asp Lys Ala Tyr Lys Ala Phe Gly

405 410 415

Lys Lys Leu Pro Leu Ile Leu Trp Thr Ser Thr Leu Thr Asn Tyr Lys

420 425 430

His Ile Asp Asp Tyr Leu Asn Lys Asp Asp Tyr Ile Ile Gln Val Trp

435 440 445

Thr Thr Gly Val Asp Pro Gln Ile Lys Gly Leu Leu Glu Lys Gly Tyr

450 455 460

Arg Leu Ile Met Ser Asn Tyr Asp Ala Leu Tyr Phe Asp Cys Gly Tyr

465 470 475 480

Gly Ala Trp Val Gly Ala Gly Asn Asn Trp Cys Ser Pro Tyr Ile Gly

485 490 495

Trp Gln Lys Val Tyr Asp Asn Ser Pro Ala Val Ile Ala Leu Glu His

500 505 510

Arg Asp Gln Val Leu Gly Gly Glu Ala Ala Leu Trp Ser Glu Gln Ser

515 520 525

Asp Thr Ser Thr Leu Asp Gly Arg Leu Trp Pro Arg Ala Ala Ala Leu

530 535 540

Ala Glu Arg Leu Trp Ala Glu Pro Ala Thr Ser Trp Gln Asp Ala Glu

545 550 555 560

Tyr Arg Met Leu His Ile Arg Glu Arg Leu Val Arg Met Gly Ile Gln

565 570 575

Ala Glu Ser Leu Gln Pro Glu Trp Cys Tyr Gln Asn Glu Gly Tyr Cys

580 585 590

Tyr Ser

<210> 2

<211> 424

<212> PRT

<213> Trichoderma viride

<400> 2

Met Leu Gly Phe Leu Gly Lys Ser Met Ala Leu Leu Ala Ala Leu Gln

1 5 10 15

Ala Thr Leu Thr Ser Ala Thr Pro Val Ser Thr Asn Asp Val Ser Val

20 25 30

Glu Lys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Asn Ala Val Tyr Phe Thr Asn Trp

35 40 45

Gly Ile Tyr Gly Arg Asn Phe Gln Pro Gln Asp Leu Val Ala Ser Asp

50 55 60

Ile Thr His Val Ile Tyr Pro Phe Met Asn Phe Gln Ala Asp Gly Thr

65 70 75 80

Val Val Ser Gly Asp Ala Tyr Ala Asp Tyr Gln Lys His Tyr Ser Asp

85 90 95

Asp Ser Trp Asn Asp Val Gly Asn Asn Ala Tyr Gly Cys Val Asn Gln

100 105 110

Leu Phe Lys Leu Lys Lys Ala Asn Arg Asn Leu Lys Val Met Leu Ser

115 120 125

Ile Gly Gly Trp Thr Trp Ser Thr Asn Phe Pro Ser Ala Ala Ser Thr

130 135 140

Asp Ala Asn Arg Lys Asn Phe Ala Lys Thr Ala Ile Thr Phe Met Lys

145 150 155 160

Asp Trp Gly Phe Asp Gly Ile Asp Val Asp Trp Glu Tyr Pro Ala Asp

165 170 175

Asp Thr Gln Ala Thr Asn Met Val Leu Leu Leu Lys Glu Ile Arg Ser

180 185 190

Gln Leu Asp Ala Tyr Ala Ala Gln Tyr Ala Pro Gly Tyr His Phe Leu

195 200 205

Leu Ser Ile Ala Ala Pro Ala Gly Pro Glu His Tyr Ser Ala Leu His

210 215 220

Met Ala Asp Leu Gly Gln Val Leu Asp Tyr Val Asn Leu Met Ala Tyr

225 230 235 240

Asp Tyr Ala Gly Ser Trp Ser Ser Tyr Ser Gly His Asp Ala Asn Leu

245 250 255

Phe Ala Asn Pro Ser Asn Pro Asn Ser Ser Pro Tyr Asn Thr Asp Gln

260 265 270

Ala Ile Lys Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Val Pro Ala Ser Lys Ile Val

275 280 285

Leu Gly Met Pro Ile Tyr Gly Arg Ser Phe Glu Ser Thr Asn Gly Ile

290 295 300

Gly Gln Thr Tyr Asn Gly Ile Gly Ser Gly Ser Trp Glu Asn Gly Ile

305 310 315 320

Trp Asp Tyr Lys Val Leu Pro Lys Ala Gly Ala Thr Val Gln Tyr Asp

325 330 335

Ser Val Ala Gln Ala Tyr Tyr Ser Tyr Asp Ser Ser Ser Lys Glu Leu

340 345 350

Ile Ser Phe Asp Thr Pro Asp Met Val Ser Lys Lys Val Ser Tyr Leu

355 360 365

Lys Asn Leu Gly Leu Gly Gly Ser Met Phe Trp Glu Ala Ser Ala Asp

370 375 380

Lys Thr Gly Ser Asp Ser Leu Ile Gly Thr Ser His Arg Ala Leu Gly

385 390 395 400

Ser Leu Asp Ser Thr Gln Asn Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Ser Gln Tyr

405 410 415

Asp Asn Ile Arg Ser Gly Leu Asn

420

<210> 3

<211> 658

<212> PRT

<213> Chitinolyticbacter meiyuanensis

<400> 3

Met Ser Gln Ile Asn Arg Phe Ala Ile Ala Ala Leu Pro Ala Ala Leu

1 5 10 15

Ile Ala Ala His Ala Phe Ala Ala Tyr Pro Val Trp Gln Glu Gly Asn

20 25 30

Thr Tyr Ala Ala Gly Thr Phe Val Ser Tyr Asn Gly Lys Asp Tyr Gln

35 40 45

Ala Gln Val Thr His Thr Ala Tyr Val Gly Ala Asn Trp Asn Pro Ala

50 55 60

Ala Thr Pro Thr Leu Trp Lys Glu Val Gly Thr Ser Thr Asn Pro Thr

65 70 75 80

Pro Thr Pro Val Ala Ala Thr Pro Thr Pro Val Ser Ala Thr Pro Thr

85 90 95

Pro Val Val Ala Thr Pro Thr Pro Lys Pro Ala Thr Pro Thr Pro Ala

100 105 110

Thr Ala Thr Pro Thr Pro Ala Gly Gln Tyr Pro Ala Trp Ser Ala Ser

115 120 125

Gly Val Tyr Thr Gln Gly Asn Arg Val Val Tyr Gln Gly Val Val Tyr

130 135 140

Glu Ala Gln Trp Trp Thr Gln Gly Asp Asn Pro Ala Gln Ser Gly Ser

145 150 155 160

Trp Gly Val Trp Arg Val Val Gly Gly Asn Pro Val Thr Ala Thr Pro

165 170 175

Thr Pro Val Ala Ala Thr Pro Thr Pro Val Val Ala Thr Pro Thr Pro

180 185 190

Val Val Ala Thr Pro Thr Pro Lys Pro Ala Thr Pro Thr Pro Val Val

195 200 205

Ala Thr Pro Thr Pro Val Ala Ala Thr Pro Thr Pro Val Gly Pro Thr

210 215 220

Pro Thr Pro Val Thr Pro Ser Ala Gly Thr Lys Gln Val Gly Ser Tyr

225 230 235 240

Phe Ala Gln Trp Gly Val Tyr Gly Arg Asp Tyr Gln Val Ala Asp Ile

245 250 255

Ile Thr Ser Gly Ser Ala Pro Lys Leu Thr Phe Ile Asn Tyr Ala Phe

260 265 270

Gly Asn Val Tyr Gln Lys Asn Gly Gly Tyr Glu Cys Asp Ile Leu Thr

275 280 285

Arg Thr Glu Ala Gly Asn Gly Asp Gly Gly Asp Ala Trp Ala Asp Phe

290 295 300

Gly Met Thr Pro Lys Arg Arg Val Asp Pro Ala Asp Thr Ile Lys Trp

305 310 315 320

Asp Asp Lys Leu Ala Gly Asn Phe Arg Glu Phe Lys Ala Leu Lys Ala

325 330 335

Lys His Pro Asn Ile Lys Met Phe Ile Ser Leu Gly Gly Trp Thr Trp

340 345 350

Ser Lys Trp Phe Ser Asn Ala Ala Lys Thr Asp Ala Leu Arg Lys Gln

355 360 365

Leu Val Lys Ser Cys Ile Asp Ile Tyr Ile Lys Gly Asn Leu Pro Val

370 375 380

Val Asp Gly Arg Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Val Phe Asp Gly

385 390 395 400

Ile Asp Ile Asp Trp Glu Phe Pro Gly Val Gln Gly Phe Gly Tyr Asn

405 410 415

Thr Val Asp Ala Ala Asp Gly Lys Asn Tyr Glu Leu Leu Leu Ala Glu

420 425 430

Phe Arg Lys Gln Leu Asp Glu Leu Gly Ala Thr Thr Gly Lys His Tyr

435 440 445

Pro Leu Thr Ile Ala Ile Gly Met Gly Lys Asp Lys Ile Asp Gln Ile

450 455 460

Asn Ala Gly Ala Leu Ala Ala Lys Leu Asp Trp Ile Asn Met Met Thr

465 470 475 480

Tyr Asp Tyr Asn Gly Gly Trp Ser Leu Glu Gln Thr Asn Phe Gln Ser

485 490 495

His Leu Tyr Arg Asp Pro Ala Ser Pro Asn Asp Ala Cys Ser Gly Thr

500 505 510

Gly Thr Cys Tyr Asn Gly Arg Ser Leu Val Ser Tyr Tyr Asn Thr Asp

515 520 525

Asp Gly Val Ala Gln Leu Leu Ala Gln Gly Ala Pro Ala Asn Lys Leu

530 535 540

Val Leu Gly Leu Pro Phe Tyr Gly Arg Gly Trp Thr Gly Val Pro Asn

545 550 555 560

Val Asn Asn Gly Leu Tyr Gln Lys Pro Thr Gly Ala Ala Arg Gly Thr

565 570 575

Tyr Glu Ala Gly Ile Glu Asp Tyr Lys Val Leu Lys Asn Ala Ala Gly

580 585 590

Thr Val Tyr Val His Pro Val Thr Lys Gln Ser Tyr Lys Tyr Asp Gly

595 600 605

Thr Asn Trp Trp Ser Tyr Asp Thr Pro Ala Val Ile Gln Thr Lys Val

610 615 620

Asp Tyr Ala Lys Ala Lys Gly Leu Gly Gly Val Phe Ser Trp Glu Leu

625 630 635 640

Asp Gly Asp Thr Thr Asn Gly Glu Leu Met Asn Val Met Gly Asn Met

645 650 655

Asn Lys

<210> 4

<211> 1719

<212> DNA

<213> Ostrinia furnacalis

<400> 4

gaggatgttg tttggagatg gtcttgtgat aatggtaagt gtgttaagtt gaagaatgat 60

ccaagatctt ctgagcctgc tttgtctttg gaggcttgta agatgttttg taacgaatat 120

ggtttgttgt ggccaagacc tactggagaa gctgatttgg gtaacttttt gtctaagatt 180

aacttgaaca gtattgaagt taagattttg aagaagggtg ctactgatga tttgatggag 240

gctgctgcta agagatttaa agaacaagtt tctttggcta ttcctagagg ttccacccca 300

aagttgaccg gtaaggctgt tgacgtttac ttggttaacg aaaacccaaa cgaaaaggct 360

ttttctttgg aaatggatga atcttacggt ttgagagttt ctccaagtgg tgccgataga 420

gttaacgcta ccattactgc taattctttt tttggaatga gacatggttt ggaaactttg 480

tctcagttgt ttgtttttga tgatattaga gatcatcttt tgatggttag agatgttaat 540

atttctgata agcctgttta cccttacaga ggtattttgt tggatactgc tagaaactac 600

tactctattg agagtattaa gagaactatt gaggccatgg ctgctgttaa gttgaacacc 660

tttcattggc atattactga ttctcagtct tttccttttg ttaccactaa gagaccaaac 720

ttgtacaagt ttggtgcttt gtctccacaa aaggtttaca ctaaggctgc tattagagag 780

gttgttagat ttggattgga aagaggtgtt agagttttgc cagaatttga tgctcctgct 840

catgttggtg agggttggca agatactgat ttgactgttt gttttaaggc cgagccatgg 900

aagtcttatt gtgttgagcc accatgtggt cagttgaatc caactaagga tgaattgtac 960

cagtatttgg aggatattta ctctgatatg gcagaggttt ttgatactac tgatattttt 1020

catatgggtg gtgatgaagt ttctgaagca tgttggaact cttccgatag tattcaaaac 1080

tttatgatgc aaaacagatg ggatttggat aaggagtctt ttttgaaatt gtggaactac 1140

tttcagcaaa aggcacagga taaggcttat aaggcctttg gtaagaagtt gccattgatt 1200

ttgtggactt caaccttgac taactacaag catatcgatg attacttgaa caaagatgat 1260

tacattattc aagtttggac tactggtgtt gatccacaaa ttaagggttt gttggaaaag 1320

ggttacagat tgattatgtc caactacgac gccttgtact ttgattgtgg ttacggtgcc 1380

tgggttggtg ctggtaacaa ctggtgtagt ccatacattg gttggcagaa ggtttatgat 1440

aactcccctg ctgttattgc cttggaacat agagatcagg ttttgggtgg tgaagctgct 1500

ttgtggagtg aacagtccga tacttcaact ttggatggta gattgtggcc aagagctgct 1560

gctttggctg agagattgtg ggctgaacca gctacttctt ggcaagatgc agaatataga 1620

atgttgcata ttagagagag attggttaga atgggtattc aggctgaaag tttgcaacca 1680

gaatggtgtt accagaacga aggatattgt tactcttaa 1719

<210> 5

<211> 1209

<212> DNA

<213> Trichoderma viride

<400> 5

accccagttt ctaccaacga cgtttccgtt gaaaagagag cctctggtta caccaacgct 60

gtttatttta ctaactgggg tatttacggt agaaactttc aaccacagga cttggttgct 120

tctgatatca cccacgttat ttacccattt atgaattttc aagctgatgg aactgttgtt 180

tctggtgatg cttacgctga ctaccaaaag cactactctg atgattcttg gaatgatgtt 240

ggtaacaacg cctatggttg cgttaaccag ttgtttaagt tgaagaaagc caatagaaac 300

ttgaaggtta tgttgtctat tggtggatgg acttggtcta ctaattttcc aagtgctgct 360

tctactgatg ctaatagaaa gaactttgct aagactgcta ttacttttat gaaggattgg 420

ggttttgatg gtattgatgt tgattgggag tatcctgctg atgatactca agctactaat 480

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cctggttatc actttttgtt gtctattgct gctccagctg gtccagaaca ttactccgct 600

ttgcatatgg ctgatttggg tcaagttctt gattacgtta acttgatggc ttacgattat 660

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ccaaactctt ctccttacaa cactgatcaa gccattaaag cctacattaa cggtggagtt 780

ccagcttcta agattgttct tggtatgcca atttatggta gatcttttga atctactaac 840

ggtattggtc aaacctacaa cggtattgga tctggaagtt gggagaacgg tatttgggat 900

tataaggttt tgcctaaagc tggtgctact gttcaatacg atagtgttgc tcaggcttat 960

tacagttacg acagttcttc taaggaattg atttcttttg atactccaga catggtttcc 1020

aagaaggttt cttaccttaa gaaccttggt ttgggtggtt ctatgttttg ggaagcttct 1080

gcagataaga ccggttctga tagtttgatt ggtacttctc atagagcttt gggttctttg 1140

gactctactc aaaacttgtt gtcttatcct aattctcaat acgataacat tagatctggt 1200

ttgaactaa 1209

<210> 6

<211> 1908

<212> DNA

<213> Chitinolyticbacter meiyuanensis

<400> 6

gcttacccag tttggcaaga aggtaacacc tacgccgccg gtacctttgt ttcttacaac 60

ggtaaggatt accaggctca agttacccat actgcttacg ttggtgctaa ttggaaccca 120

gctgctactc ctaccttgtg gaaggaggtt ggtacttcta ctaacccaac tcctactcca 180

gtcgctgcca ccccaacacc agtttctgct actccaactc cagttgttgc tactcctact 240

cctaagccag ctactcctac accagctact gctactccaa ccccagccgg tcaataccca 300

gcttggtctg cttctggtgt ttacactcaa ggtaacagag ttgtttatca aggtgttgtc 360

tacgaagctc aatggtggac tcaaggagat aatccagccc aatccggttc ctggggtgtt 420

tggagagttg ttggtggtaa ccctgttact gccactccaa ctcctgttgc tgctactcca 480

acaccagtcg ttgctacccc aactccagtc gttgccactc ctactccaaa accagctact 540

ccaactccag ttgtcgctac tccaactcca gttgctgcca ctcctacccc agttggtcca 600

actccaactc cagttactcc atccgctggt actaaacaag tcggttccta ctttgcccaa 660

tggggtgttt acggtagaga ctaccaagtt gctgatatta ttacttctgg ttctgctcca 720

aaattgacct ttattaacta cgcttttgga aacgtctatc agaagaacgg tggttacgaa 780

tgtgatattt tgacaagaac tgaagctggt aacggagacg gaggtgatgc ttgggctgac 840

tttggaatga ctcctaagag aagagttgat ccagctgata ctattaagtg ggatgataag 900

ttggccggta actttagaga atttaaggca ttgaaggcaa agcatccaaa tattaagatg 960

tttatttctt tgggtggttg gacttggagt aaatggtttt ctaatgctgc taagaccgat 1020

gctttgagaa agcagttggt taaatcttgt attgatattt acattaaggg aaacttgcct 1080

gttgttgatg gtagaggtgg tgctggtgct gctgctggtg tttttgatgg tattgatatt 1140

gattgggaat ttcctggtgt tcagggtttt ggttataaca ctgttgatgc tgctgatggt 1200

aagaattatg aattgttgtt ggctgagttt agaaagcagc ttgatgaatt gggtgctact 1260

actggtaagc attatccttt gactattgct attggaatgg gtaaggataa aattgatcag 1320

atcaacgctg gtgctcttgc tgcaaagttg gattggatta acatgatgac ttacgactac 1380

aatggaggtt ggtctttgga gcagactaac tttcaatctc atttgtacag agatccagcc 1440

tcccctaacg atgcttgtag tggaactggt acttgctata acggtagatc cttggtttct 1500

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Claims

1.一种球磨辅助组合酶法少水化催化几丁质的方法，其特征在于所述方法为：将几丁质、酶加入水中，调节pH为4-5.5，所得混合液在450-500rpm经磨珠球磨20-50min，然后30-50℃恒温孵育10-24h，得到N-乙酰氨基葡萄糖；所述酶为几丁质降解酶OfHex1、TvChi1和CmChi1的混合物；所述几丁质以粉末的形式加入；

所述几丁质降解酶为重组酶，按以下方法制备：

(1)通过酶切、连接分别将SEQ ID NO：4所示的OfHex1基因、SEQ ID NO：5所示的TvChi1基因或SEQ ID NO：6所示的CmChi1基因连接整合到pPIC9K质粒的SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点之间，分别将所得的重组质粒pPIC9K-OfHex1、pPIC9K-TvChi1和pPIC9K-CmChi1通过电穿孔转化法导入宿主细胞毕赤酵母GS115中，在含氨苄青霉素、G418硫酸盐和生物素的平板上进行抗性筛选，分别获得重组基因工程菌GS115/pPIC9K-OfHex1、GS115/pPIC9K-TvChi1和GS115/pPIC9K-CmChi1；

2.如权利要求1所述的球磨辅助组合酶法少水化催化几丁质的方法，其特征在于：所述混合液中，所述的几丁质的终浓度为200-600g/L。

3.如权利要求1所述的球磨辅助组合酶法少水化催化几丁质的方法，其特征在于：所述混合液中所述的酶的终浓度为0.2-0.9g/L。

4.如权利要求1所述的球磨辅助组合酶法少水化催化几丁质的方法，其特征在于：所述的几丁质与所述磨珠的质量比为1:8。

5.如权利要求1所述的球磨辅助组合酶法少水化催化几丁质的方法，其特征在于：重组OfHex1:重组TvChi1:重组CmChi1的质量比为3:3:4。