CN113293110B - 一种抗菌脂肽类化合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗菌脂肽类化合物的制备方法，解决了枯草芽孢杆菌现有发酵培养基产量低、生产成本高、抗菌脂肽类化合物提取困难等问题。本发明选用的发酵培养基在氮源选择方面采用价格低廉、添加方便的牛骨蛋白胨代替原有昂贵、黏稠的牛肉膏，有效的降低了抗菌脂肽类化合物发酵生产成本，同时加入了锰、镁等金属离子，更有利于促进枯草芽孢杆菌产孢及合成产物，显著提高了抗菌脂肽类化合物的产量以及抗菌活性的能力。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，特别是一种抗菌脂肽类化合物的制备方法。
背景技术
近年来，随着现代化和工厂化畜禽和水产养殖的迅速发展，为抑制病害而引发的抗生素滥用现象屡禁不绝。在饲料或养殖水体中添加益生菌或者益生菌发酵代谢产生的活性物质，进而代替抗生素已成为健康养殖新的研究方向。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌，能够产生耐热、抗逆的芽孢，可以在恶劣的环境中生存。抗菌脂肽类化合物是枯草芽孢杆菌通过非核糖体途径合成的小分子抗菌脂肽类化合物，具有抑菌性广、耐药性低和热稳定性高等优点。在食品领域，抗菌脂肽类化合物能作为防腐剂来改善食品的性状；在农业领域，它能够抑制植物致病菌，生防效果良好；在医药领域可用于脂肽类疫苗，用来控制细菌病原菌；在畜牧业领域常用于饲料添加剂，促进畜禽生长。此外，抗菌脂肽类化合物也是目前唯一从微生物中得到并对黄曲霉具有显著抑制作用的活性物质。
但是在现有的技术中，由枯草芽孢杆菌发酵培养基生产抗菌脂肽类化合物的活性水平比较低，且价格昂贵，这严重制约了抗菌脂肽类化合物的大规模工业化生产。因此，寻找一种可以提高产量、降低生产成本的发酵培养基和一种制备抗菌脂肽类化合物的方法是当下迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是要解决现有技术中抗菌脂肽类化合物产量低，生产成本高的问题，提供一种抗菌脂肽类化合物的制备方法。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
一种抗菌脂肽类化合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、取枯草芽孢杆菌菌株，接种于斜面LB培养基上，于30℃培养24h，挑取单菌落，接种于液体LB培养基，于30℃摇瓶培养16-18h，得到枯草芽孢杆菌活化液，所述枯草芽孢杆菌活化液的OD600为0.8-1.0；
步骤二、将枯草芽孢杆菌活化液接种于发酵培养基中，所述枯草芽孢杆菌活化液的接种量为4-8％，于28-32℃，150-210r/min旋转条件下发酵培养36-60h，得到发酵液；
步骤三、将所述发酵液离心，得到发酵上清液；
步骤四、调节所述发酵上清液的pH＝2，静置2-8h，离心收集沉淀；再用甲醇反复抽提，使用旋转蒸发仪干燥其抽提液，得到抗菌脂肽类化合物脂肽提取物。
优选地，所述步骤一中，所述LB培养基由如下质量百分比的组分组成：胰蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠1％，所述LB培养基的pH值为7.2-7.4。
优选地，所述步骤二中，发酵培养基由如下质量百分比的组分组成：糖0.5％-2.5％、蛋白胨0.5％-3％、金属离子化合物以金属离子计0.01％-1％，所述金属离子为锌离子、钾离子、镁离子、锰离子中的一种或多种，所述糖为葡萄糖、蔗糖、甘油中的一种或多种，所述蛋白胨为胰蛋白胨、牛骨蛋白胨、大豆蛋白胨中的一种或多种，所述发酵培养基的pH值为6.0-8.0。
优选地，所述步骤三中，离心转速为4000-10000r/min，离心时间为10-20min。
优选地，所述步骤四中，离心转速为4000-10000r/min，离心时间为5-15min。
优选地，所述步骤四中，使用4-8mol/L的HCl溶液调节发酵上清液的pH值。
优选地，所述步骤四中，旋转蒸发仪干燥温度为50-70℃。
优选地，所述步骤二中，枯草芽孢杆菌活化液的接种量为5％。
优选地，所述发酵培养基由如下质量百分比的组分组成：糖1％、蛋白胨1.5％、金属离子化合物以金属离子计0.54％。
优选地，所述钾离子以磷酸氢二钾的形式添加，所述镁离子以硫酸镁的形式添加，所述锰离子以硫酸锰的形式添加。
与现有技术相比，本发明提供了一种抗菌脂肽类化合物的制备方法，解决了枯草芽孢杆菌现有发酵培养基产量低、生产成本高、抗菌脂肽类化合物提取困难等问题。本发明选用的发酵培养基在氮源选择方面采用价格低廉、添加方便的牛骨蛋白胨代替原有昂贵、黏稠的牛肉膏，有效的降低了抗菌脂肽类化合物发酵生产成本，同时加入了锰、镁等金属离子，更有利于促进枯草芽孢杆菌产孢及合成产物，能快速地培养枯草芽孢杆菌，提高抗菌脂肽类化合物的产量以及抗菌活性的能力。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
本发明是将枯草芽孢杆菌活化液接种于上述发酵培养基中培养，得到发酵液。本发明对具体的枯草芽孢杆菌种类没有特别限制，本领域用于生产抗菌脂肽类化合物的枯草芽孢杆菌均可。为了说明本发明发酵培养基的作用，在本发明更具体的实施方式中，所述枯草芽孢杆菌活化液优选使用保存的枯草芽孢杆菌菌株(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)经活化得到。所述接种量优选为4％-8％，更优选为5％；所述发酵培养温度优选为28-32℃，更优选为30℃；所述发酵培养振荡频率优选为150-210r/min，更优选为180r/min；所述发酵培养时间为36-60h，更优选为48h。
实施例1
按重量称取葡萄糖1％、牛骨蛋白胨1.5％、硫酸镁0.02％、硫酸锰0.02％、磷酸氢二钾0.5％，将上述组份依次溶解后，调节pH值为7.0，121℃灭菌20min，制备成由枯草芽孢杆菌生产抗菌脂肽类化合物的发酵培养基。
实施例2
将保存的枯草芽孢杆菌菌株，接种于斜面LB培养基上，于30℃培养24h，挑取单菌落，接种于液体LB培养基，于30℃摇瓶培养至OD600为0.8-1，得到枯草芽孢杆菌活化液。本实施例中，LB培养基由如下质量百分比的组分组成：胰蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠1％，所述LB培养基的pH值为7.2。
实施例3(摇瓶发酵液)
将实施例2培养的枯草芽孢杆菌活化液，按5％的接种量接种于实施例1制备的发酵培养基，1L发酵摇瓶中装液量为200mL培养基，于30℃，180r/min发酵培养48h。离心取发酵上清液200μL，以副溶血性弧菌为指示菌检测上清液的抑菌直径。
实施例4(摇瓶发酵成品)
将实施例3中5个摇瓶的发酵液，经离心合并收集上清液共1L。经喷雾干燥器(蠕动泵速率为30％、风机大小为90％、进风温度为200℃)得到该枯草芽孢杆菌粉末状干品，称重并计算收率。
实施例5(发酵罐发酵液)
将实施例2培养的枯草芽孢杆菌活化液，按5％的接种量接种于实施例1制备的发酵培养基，20L发酵罐中起始培养基装量为13L，于30℃，180r/min发酵培养40h。离心取发酵上清液200μL，以副溶血性弧菌为指示菌检测上清液的抑菌直径。
实施例6(发酵罐成品)
将实施例5中的13L发酵液利用膜过滤进行固液分离，收集发酵清液，加入5％的可溶性淀粉作为载体，经喷雾干燥器(蠕动泵速率为30％、风机大小为90％、进风温度为200℃)得到该枯草芽孢杆菌粉末状干品，称重并计算收率。
实施例7
称取实施例6制备的干品40mg，溶于1mL无菌水中，取200μL溶解液，以副溶血性弧菌为指示菌检测其抑菌直径。
对比例1(对照摇瓶发酵液)
发酵培养基采用原始培养基，其余同实施例3。
原始培养基由如下质量百分比的组分组成：1.0％葡萄糖、1.5％牛肉膏、0.6％K2HPO4，调节pH值为7.0。
对比例2(对照摇瓶发酵成品)
发酵培养基采用对比例1中的原始培养基，其余同实施例4。
对比例3(对照发酵罐发酵液)
发酵培养基采用原始培养基，其余同实施例5。
对比例4(对照发酵罐成品)
干品由对比例3中的发酵液制备，其余同实施例6。
对比例5
干品由对比例3中的发酵液制备，其余同实施例7。
分别将对比例1、对比例3和对比例5与实施例3、实施例5和实施例7的发酵上清液以副溶血性弧菌为指示菌测定其抑菌圈直径大小，其检测结果如表1所示。
表1
由表1可知，三个实施例子的发酵上清液的抑菌圈直径比对应的三个对比例子提高20-30％。
再分别将对比例2和对比例4与实施例4和实施例6的制备抗菌脂肽产量和收率进行比较，结果如表2所示。
表2
由表2可知，三个实施例子的制备抗菌脂肽产量收率比对应的三个对比例子提高40-60％。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种抗菌脂肽类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、取枯草芽孢杆菌菌株，接种于斜面LB培养基上，于30℃培养24 h，挑取单菌落，接种于液体LB培养基，于30℃摇瓶培养16-18 h，得到枯草芽孢杆菌活化液，所述枯草芽孢杆菌活化液的OD600为0.8-1.0；
步骤二、将枯草芽孢杆菌活化液接种于发酵培养基中，所述枯草芽孢杆菌活化液的接种量为4-8%，于28-32℃，150-210 r/min旋转条件下发酵培养36-60 h，得到发酵液；其中，发酵培养基由如下质量百分比的组分组成：葡萄糖1%、牛骨蛋白胨1.5%、硫酸镁0.02%、硫酸锰0.02%、磷酸氢二钾0.5%，所述发酵培养基的pH值为6.0-8.0；
步骤三、将所述发酵液离心，得到发酵上清液；
步骤四、调节所述发酵上清液的pH=2，静置2-8 h，离心收集沉淀；再用甲醇反复抽提，使用旋转蒸发仪干燥其抽提液，得到抗菌脂肽类化合物脂肽提取物。
2.根据权利要求1所述的抗菌脂肽类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，所述LB培养基由如下质量百分比的组分组成：胰蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、氯化钠1%，所述LB培养基的pH值为7.2-7.4。
3.根据权利要求1所述的抗菌脂肽类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，离心转速为4000-10000 r/min，离心时间为10-20 min。
4.根据权利要求1所述的抗菌脂肽类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，离心转速为4000-10000 r/min，离心时间为5-15 min。
5.根据权利要求1所述的抗菌脂肽类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，使用4-8 mol/L的HCl溶液调节发酵上清液的pH值。
6.根据权利要求1所述的抗菌脂肽类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，旋转蒸发仪干燥温度为50-70℃。
7.根据权利要求1所述的抗菌脂肽类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，枯草芽孢杆菌活化液的接种量为5%。
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