CN103114060A - 芽孢杆菌同步高密度发酵工艺方法 - Google Patents

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庄国宏
王效禹
张琪
吴磊
潘艳妮
李双喜
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Abstract

本发明公开一种操作方法简单、可降低产品成本，适合大规模工业化生产的芽孢杆菌同步高密度发酵工艺方法，是经过制备液体种子、种子罐发酵及发酵罐扩大，本发明通过全自动发酵在线监测溶氧来确定糖（复合碳源和促芽孢生成剂）的流加时间，达到芽孢杆菌的缓释利用碳源，最终达到发酵液活菌数600亿/ml以上，发酵24h芽孢率即可达90%以上，整齐饱满。产品干燥收率达90%以上，降低了产品的生产成本。

Description

芽孢杆菌同步高密度发酵工艺方法
技术领域
本发明涉及一种芽孢杆菌的发酵工艺，尤其是一种操作方法简单、可降低产品成本，适合大规模工业化生产的芽孢杆菌同步高密度发酵工艺方法。
背景技术
近年来，在养殖饲料中添加抗生素用于预防肠道疾病已很普遍，虽然取得了一定的效果，但与此同时，不仅造成细菌耐药性的增强，而且药物的残留也威胁畜禽、水产品的食用安全，甚至直接影响人体健康。为此，人们采用了能够替代抗生素改善养殖环境、减少和预防畜禽肠道疾病、降低药残的微生态饲料添加剂。如微生态饲料添加剂中的芽孢杆菌，就可以消耗肠道游离氧形成厌氧环境促进肠道益生菌繁殖，产生多种酶，提高动物免疫力，并能通过饲料高温制粒，对提高饲料利用率，改善养殖环境和水质等方面起到了明显的作用。
目前，在中国专利申请的公开文献中，已经公开了两篇关于高密度发酵芽孢杆菌工艺 ，其中一篇是在芽孢杆菌发酵过程中不断流加铁离子营养液来提高活菌含量；另一篇是通过在发酵过程中添加复合微量元素提高活菌含量，由于需微滤，操作过程繁琐，不适合大规模工业化生产。也有文献资料显示枯草芽孢杆菌经过优化培养基其发酵活菌数最高可达400亿/ml，但没有进行大罐发酵生产，也没有关于芽孢率的描述。而芽孢率直接影响产品干燥的得率，间接影响芽孢杆菌能否更多通过饲料高温制粒以及生产成本，是非常关键的指标。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作方法简单、可降低产品成本，适合大规模工业化生产的芽孢杆菌同步高密度发酵工艺方法。
本发明的技术解决方案是：一种芽孢杆菌同步超高密度发酵方法，其特征是按照以下步骤进行：
a. 发酵种子制备
在无菌环境下，将芽孢杆菌在培养基中培养，制备活菌数达到10~20亿/ml的芽孢杆菌液体种子，培养基为每升水中含有：胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖10g及K2HPO4 3g；
b. 种子罐发酵
将芽孢杆菌液体种子接种到种子罐中，种子罐培养基计料体积与液体种子体积之比为500L：1000ml，培养基为每升水中含有：胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖10g及K2HPO4 3g，121℃灭菌30min；发酵培养工艺参数：温度30℃，罐压0.1~0.15Mpa，PH=6.5~8.0自动调节，转速60r∕min，流量150m3∕h，发酵培养时间5~6h；
c. 发酵罐发酵
将经种子罐发酵培养的芽孢杆菌移种至发酵罐中培养，发酵罐中初始培养基由基为每升水中含有：大豆蛋白胨10g、胰蛋白胨10g、酵母粉5g及K2HPO42g，121℃灭菌30min，所述糖为每升水中含有麦芽糊精30g、葡萄糖10 g、MgSO41. 5g、MnSO4 0.8g、Zn SO4 0.2g，121℃灭菌30min；移种前调节转速、流量为发酵罐所设定的最大值，设定时校正Do100点；
移种后初始转速、流量为最大值的60%，发酵工艺参数：温度30℃，罐压0.12Mpa，PH=7.0自动调节；当Do值降至60%时，按照每次增加转速最大值的10%及流量最大值的10%调节转速和流量，使Do值维持在60%以上，直至达到发酵罐所设定的最大值并维持转速及流量为最大值继续发酵；当Do降至50%时开始加糖，每半小时加一次糖，共加六次糖，每次加糖量均等，加糖总量与发酵罐中初始培养基中所加入糖的体积比为2：3；最后一次加糖后继续培养；
d. 菌体的收集
当芽孢形成90%以上时，降转速至80r/min，流量200m3/h，将菌液离心分离，取菌泥。
本发明通过全自动发酵在线监测溶氧来确定糖（复合碳源和促芽孢生成剂）的流加时间，达到芽孢杆菌的缓释利用碳源，最终达到发酵液活菌数600亿/ml 以上，发酵24h芽孢率即可达90%以上，整齐饱满。产品干燥收率达90%，降低了产品的生产成本。
具体实施方式
实施例1：
a. 发酵种子制备
在局部100级的无菌环境下，将从国家菌种库得到的产淀粉酶和蛋白酶的一株枯草芽孢杆菌（10035）在培养基中培养，制备1000ml活菌数达到10~20亿/ml的芽孢杆菌液体种子，培养基为每升水中含有：胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖10g及K2HPO4 3g；
b. 种子罐发酵
将芽孢杆菌液体种子接种到1吨种子罐中，种子罐培养基计料体积为500L，培养基为每升水中含有：胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖10g及K2HPO4 3g，121℃灭菌30min；发酵培养工艺参数：温度30℃，罐压0.1~0.15Mpa，PH=6.5~8.0自动调节，转速60r∕min，流量150m3∕h，发酵培养时间5~6h；
c. 发酵罐发酵
将经种子罐发酵培养的芽孢杆菌移种至5吨发酵罐中培养，发酵罐中初始培养基由基本培养基与糖构成，基本培养基计料体积为3000L，基本培养基为每升水中含有：大豆蛋白胨10g、胰蛋白胨10g、酵母粉5g及K2HPO4 2g，121℃灭菌30min，所述糖为每升水中含有麦芽糊精30g、葡萄糖10、MgSO40.5g、MnSO4 0.8g、Zn SO4 0.2g，121℃灭菌30min，灭菌后的糖为280L；移种前调节转速至220 r∕min（发酵罐设定的最大值），流量260 m 3∕h（发酵罐设定的最大值），设定时校正Do100点；
移种后初始转速132r∕min，流量156 m3∕h，发酵工艺参数：温度30℃，罐压0.12Mpa，PH=7.0自动调节；当Do值降至60%时，按照每次增加22 r∕min调节转速和增加26 m 3∕h调节流量，使Do值维持在60%以上，直至最大转速220r∕min及最大流量260 m 3∕h，并维持转速及流量为最大值继续发酵；此时无法通过调节流量和转速维持Do在60%以上，当Do降至50%时开始加糖，每半小时加一次糖，共加六次糖，每次加糖量均等，加糖总量为420L，即每次加糖70L，最后一次加糖后继续培养；
d. 菌体的收集
当芽孢形成90%以上时，降转速为80r/min，流量200m3/h，将菌液离心分离，取菌泥，经检测活菌数达600亿/ml以上。
菌体的收集干燥
取菌泥按质量比为1：0.5加入载体（普通淀粉）经高速混合后，再经摇摆
制粒，在真空干燥机上干燥，干燥温度85℃，真空度为0.08 Mpa，时间为2h，
产品干燥收率达90%以上。
实施例2：
a. 发酵种子制备
在局部100级的无菌环境下，将从国家菌种库得到的产淀粉酶和蛋白酶的一株枯草芽孢杆菌（10035）在培养基中培养，制备1000ml活菌数达到10~20亿/ml的芽孢杆菌液体种子，培养基为每升水中含有：胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖10g及K2HPO4 3g；
b. 种子罐发酵
将芽孢杆菌液体种子接种到1吨种子罐中，种子罐培养基计料体积为500L，培养基为每升水中含有：胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖10g及K2HPO4 3g，121℃灭菌30min；发酵培养工艺参数：温度30℃，罐压0.1~0.15Mpa，PH=6.5~8.0自动调节，转速60r∕min，流量150m3∕h，发酵培养时间5~6h；
c. 发酵罐发酵
 将经种子罐发酵培养的芽孢杆菌移种至10吨发酵罐中培养，发酵罐中初始培养基由基本培养基与糖构成，基本培养基计料体积为6000L，基本培养基为每升水中含有：大豆蛋白胨10g、胰蛋白胨10g、酵母粉5g及K2HPO4 2g，121℃灭菌30min，所述糖为每升水中含有麦芽糊精30g、葡萄糖10、MgSO40.5g、MnSO4 0.8g、Zn SO4 0.2g，121℃灭菌30min，灭菌后的糖为280L；移种前调节转速至180 r∕min（发酵罐设定的最大值），流量520 m 3∕h（发酵罐设定的最大值），设定时校正Do100点；
移种后初始转速108r∕min，流量208 m3∕h，发酵工艺参数：温度30℃，罐压0.12Mpa，PH=7.0自动调节；当Do值降至60%时，按照每次增加18 r∕min调节转速和增加52 m 3∕h调节流量，使Do值维持在60%以上，直至最大转速180r∕min及最大流量520 m 3∕h，并维持转速及流量为最大值继续发酵；此时无法通过调节流量和转速维持Do在60%以上，当Do降至50%时开始加糖，每半小时加一次糖，共加六次糖，每次加糖量均等，加糖总量为420L，即每次加糖70L，最后一次加糖后继续培养；
d. 菌体的收集
当芽孢形成90%以上时，降转速为80r/min，流量200m3/h，将菌液离心分离，取菌泥，经检测活菌数达600亿/ml以上。
菌体的收集干燥
取菌泥按质量比为1：0.5加入载体（普通淀粉）经高速混合后，再经摇摆制粒，在真空干燥机上干燥，干燥温度85℃，真空度为0.08 Mpa，时间为2h，产品干燥收率达90%以上。

Claims (1)

1.一种芽孢杆菌同步超高密度发酵方法，其特征是按照以下步骤进行：
a. 发酵种子制备
在无菌环境下，将芽孢杆菌在培养基中培养，制备活菌数达到10~20亿/ml的芽孢杆菌液体种子，培养基为每升水中含有：胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖10g及K2HPO4 3g；
b. 种子罐发酵
将芽孢杆菌液体种子接种到种子罐中，种子罐培养基计料体积与液体种子体积之比为500L：1000ml，培养基为每升水中含有：胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖10g及K2HPO4 3g，121℃灭菌30min；发酵培养工艺参数：温度30℃，罐压0.1~0.15Mpa，PH=6.5~8.0自动调节，转速60r∕min，流量150m3∕h，发酵培养时间5~6h；
c. 发酵罐发酵
将经种子罐发酵培养的芽孢杆菌移种至发酵罐中培养，发酵罐中初始培养基由基为每升水中含有：大豆蛋白胨10g、胰蛋白胨10g、酵母粉5g及K2HPO4 2g，121℃灭菌30min，所述糖为每升水中含有麦芽糊精30g、葡萄糖10、MgSO41.5g、MnSO4 0.8g、Zn SO4 0.2g，121℃灭菌30min；移种前调节转速、流量为发酵罐所设定的最大值，设定时校正Do100点；
移种后初始转速、流量为最大值的60%，发酵工艺参数：温度30℃，罐压0.12Mpa，PH=7.0自动调节；当Do值降至60%时，按照每次增加转速最大值的10%及流量最大值的10%调节转速和流量，使Do值维持在60%以上，直至达到发酵罐所设定的最大值并维持转速及流量为最大值继续发酵；当Do降至50%时开始加糖，每半小时加一次糖，共加六次糖，每次加糖量均等，加糖总量与发酵罐中初始培养基中所加入糖的体积比为2：3；最后一次加糖后继续培养；
d. 菌体的收集
当芽孢形成90%以上时，降转速至80r/min，流量200m3/h，将菌液离心分离，取菌泥。
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