CN114766597B - 一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程制造领域，公开了一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法，包括地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液制备、地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液制备、高压匀浆破壁、分离和超滤纯化、喷雾干燥等步骤。本发明通过选定特定地衣芽孢杆菌(CGMCC No.24209)与乳酸片球菌双联混合发酵，使得双联混合发酵后得到的抗菌肽粗品抗菌效价高，并对小麦赤霉菌有很好的抑菌效果；利用地衣芽孢杆菌和乳酸片球菌发酵过程中好氧菌与厌氧菌的生理特性互补的特点，使得在发酵后得到的抗菌肽粗品活性更强。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程制造领域，具体涉及一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法。
背景技术
传统抗生素以及杀菌剂的使用导致越来越多病原微生物和环境害虫产生耐药性，如β-内酰胺类抗生素的过敏反应以及长期使用导致耐药菌株的产生。
在养殖业中，由于长期在养殖过程中使用抗生素，导致病源微生物产生了耐药性，产生环境污染，威胁食品安全等突出问题。因此，抗生素替代品就成为市场需求的热点。抗菌肽具有无残留，无耐药性，促进动物肠道健康等优点，逐渐成为“饲料禁抗”后的一个研究热点。
抗菌肽作为一种新型的小分子碱性多肽，在动物、植物及细菌中广泛存在。因其具有高效性、抗菌谱广、溶解性好、耐热性强、pH适应范围广及对高等动物安全无毒等优点而受到广泛关注。
现有技术绝大多数是转基因菌种发酵制备抗菌肽，如专利号为 CN103194411B的《一种枯草芽孢杆菌及其在生产抗菌肽中的应用》，，或者是物理或化学方法提取抗菌肽，如专利号为CN101530434 B的《含蚕抗菌肽的蚕粉或蛹粉以及蛹血清粉的制备方法及其应用》。但双联菌种混合液体发酵鲜有报道，因此，亟需一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法来满足市场需求。
发明内容
本发明的目的就在于增加抗菌肽粗品抑菌范围扩展到小麦赤霉菌，并降低分离纯化成本，增加其在饲料添加剂中的应用，提供一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法，包括以下步骤，
S1地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液制备，将地衣芽孢杆菌和乳酸片球菌活化接种到种子液液体培养基中发酵，获得地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液；
S2地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液制备，将步骤S1获得的地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液接种到液体发酵培养基中发酵，接种后发酵40～60h，得到地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液；
S3高压匀浆破壁，将地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液打入高压匀浆机中进行细胞破碎，得到菌体破壁混合液；
S4分离和超滤纯化，将步骤S3获得的菌体破壁混合液在离心机中离心，得到上清液和沉淀，将上清液送入超滤膜进行分离纯化，得到抗菌肽粗品浓缩液；
S5喷雾干燥，将步骤S4获得的抗菌肽粗品浓缩液进行喷雾干燥，获得双联混合发酵抗菌肽饲料添加剂。
优选的，所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年12月29日，保藏号为 CGMCC No.24209；所述乳酸片球菌来源为CICC，菌株编号为CICC 24367。
优选的，步骤S1中，所述地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液内的地衣芽孢杆菌菌体浓度为1×107～1×1011CFU/ml，地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液内的乳酸片球菌菌体浓度为1×105～1×108CFU/ml。
优选的，所述步骤S1中，每升种子液液体培养基中包含：葡萄糖15～20g、蛋白胨5～15g、蔗糖6～20g、酵母提取物10～30g、氯化钠0.2～0.6g、硫酸镁0.3～0.8g、硫酸锰0.05～0.08g、柠檬酸三铵2～5g、磷酸氢二钾3～6g，其余为纯水。
优选的，所述步骤S1的发酵条件为：pH值为5.5～7.5，发酵温度为25～ 40℃，发酵时间为24～48h。
优选的，所述步骤S2中，地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液以2～8％的接种量接种至液体发酵培养基；每升所述液体发酵培养基包含：豆饼粉20～40g、玉米浆10～30g、牛骨蛋白粉10～25g、氯化钠1～5g、磷酸氢二钾2～8g、磷酸二氢钾2～8g、硫酸镁0.5～3g、其余为水；
步骤S2的发酵条件为：pH值为5.5～7.5，发酵温度为25～40℃，发酵时间为36～60h。
优选的，所述步骤S3中，高压匀浆机的工艺参数为：流量为5～15L/h，压力为15～30Mpa。
优选的，所述步骤S4中，所述离心机为碟式离心机；碟式离心机的转速为 4000～6000rpm，离心时间10～30min；超滤膜进行分离纯化过程中，超滤膜的截留的抗菌肽粗品的分子量范围为5～30KD。
优选的，所述步骤S5中，抗菌肽粗品浓缩液内加入有抗菌肽粗品浓缩液质量的5～15％的保护剂，再进行喷雾干燥；所述保护剂为可溶性糊精、可溶性淀粉、可溶性乳清粉中的至少一种。
优选的，所述步骤S5中，将加入保护剂的抗菌肽粗品浓缩液的喷雾干燥条件为：进口温度100～150℃，进料速度500～1500ml/h，进风量5～20m3/min，喷雾压力0.1～1.3Mpa。
优选的，所述步骤S5中，喷雾干燥得到的双联混合发酵抗菌肽饲料添加剂中的抗菌肽粗品的分子量在5～28KD之间；所述抗菌肽粗品抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、小麦赤霉菌生长。
本发明获得的双联混合发酵抗菌肽饲料添加剂中的抗菌肽粗品，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、小麦赤霉菌的抑菌效价在 1.0×103～1×105AU/mg内，检测方法参照GB/T 39101-2020-多肽抗菌性测定。
本发明的作用原理：
本发明采用地衣芽孢杆菌和乳酸片球菌混合来进行液体发酵，利用两个菌种的都能产生特定分子量抗菌肽的特性；利用好氧菌和厌氧菌代谢的特性(地衣芽孢杆菌是好氧菌，在生长过程中会消耗大量氧气，乳酸片球菌是厌氧菌，可以在缺氧的环境下生长，在静置培养过程中，培养基中的氧气呈现先被地衣芽孢杆菌利用，氧气被大量消耗后，地衣芽孢杆菌进入休眠的孢子状态。此时培养基中的氧气浓度降低，有利于乳酸片球菌大量生长繁殖和发酵，两种菌可以协同发酵；在本发明中，培养基指的是种子液液体培养基以及液体发酵培养基)，使得好氧菌和厌氧菌双菌联合发酵相互协同，在液体发酵过程中互补，提高其发酵后抗菌肽粗品的得率，降低生产成本，提高抗菌肽粗品产量，使得抗菌肽的分子量在特定范围内有很好的抗菌活性；利用高压匀浆机破碎，离心后膜过滤分离浓缩，得到抗菌肽粗品浓缩液，经过喷雾干燥后获得双联混合发酵的抗菌肽饲料添加剂。本发明或的抗菌肽粗品分子量集中在5～30KD范围内，且产生的抗菌肽粗品对小麦赤霉菌有很好的抑菌作用，能够推动抗菌肽在饲料添加剂领域的应用。
本发明制备的双联混合发酵抗菌肽饲料添加剂，不仅可以在饲料添加剂中应用，改善动物肠道健康；而且还可以解决饲料原料储存中发霉变质的问题。
本发明的工艺简单，获得的双联混合发酵抗菌肽饲料添加剂中的抗菌肽粗品含量高，发酵原料来源广泛并价格低廉，符合环保要求，适合在动物养殖行业进行推广应用，助力绿色养殖产业，保障食品安全。
本发明获得的双联混合发酵抗菌肽饲料添加剂中的抗菌肽粗品对小麦赤霉有杀灭作用，可以在饲料原料中添加来防范原料发霉变质，保障饲料安全；此外双联混合发酵抗菌肽饲料添加剂中还含有益生菌(地衣芽孢杆菌和乳酸片球菌)的多种代谢产物如有机酸，益生素等，对动物肠道粘膜有保护作用，促进畜禽的肠道健康和正常生理机能，达到减少饲喂抗生素的目的。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)本发明通过选定特定地衣芽孢杆菌(CGMCC No.24209)与乳酸片球菌双联混合发酵，使得双联混合发酵后得到的抗菌肽粗品抗菌效价高，并对小麦赤霉菌有很好的抑菌效果；利用地衣芽孢杆菌和乳酸片球菌发酵过程中好氧菌与厌氧菌的生理特性互补的特点，使得在发酵后得到的抗菌肽粗品活性更强；
2)本发明的双联混合发酵抗菌肽饲料添加剂中的抗菌肽粗品效价高，保护动物肠道健康；
3)本发明采用液体深层发酵的形式，可以连续生产，操作重复性好，发酵原料易得，有利于规模化量产。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
图2为本发明地衣芽孢杆菌CGMCC No.24209的16S rDNA序列的系统发育树。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
下述实施例中使用的设备型号如下：发酵罐为江苏丰泽生物工程设备制造有限公司生产的型号为FN-E型100L；高压匀浆机为宁波新芝生物科技股份有限公司生产的型号：SCIENTZ-207A；碟式离心机为辽宁富一机械有限公司生产的型号：DHC-500；喷雾干燥剂为上海雅程仪器设备有限公司生产的型号： YC-018喷雾干燥机。
实施例1
如图1、图2所示，一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法，包括以下步骤：
S1地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液制备，将地衣芽孢杆菌和乳酸片球菌活化接种到种子液液体培养基中发酵，获得地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液；其中地衣芽孢杆菌菌体浓度为1.8×108CFU/ml，乳酸片球菌菌体浓度为 2.3×106CFU/ml，发酵条件为：pH值为6.5，发酵温度为30℃，发酵时间为36h。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年12月29日，保藏号为CGMCC No.24209；，所述乳酸片球菌来源为CICC，菌株编号为CICC 24367。
种子液液体培养基每升中包含：葡萄糖15g、蛋白胨5g、蔗糖6g，酵母提取物10g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.3g、硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、磷酸氢二钾3g，其余为纯水。
S2地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液制备，将步骤S1获得的地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液以4％的接种量接种到液体发酵培养基中发酵，接种后发酵48h，得到地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液；发酵条件为：pH值为6.8，发酵温度为33℃，发酵时间为45h。其中每升液体发酵培养基包含：豆饼粉25g，玉米浆18g，牛骨蛋白粉15g，氯化钠3g，磷酸氢二钾4g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1.5g，其余为水。发酵条件为：pH值为6.8，发酵温度为28℃，发酵时间为44h。
S3高压匀浆破壁，将地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液打入高压匀浆机中进行细胞破碎，得到菌体破壁混合液；其中高压匀浆机的工艺参数为：流量为5L/h，压力为15Mpa。
S4分离和超滤纯化，将步骤S3获得的菌体破壁混合液在碟式离心机中离心，离心转速为4000rpm，离心时间为10min，得到上清液和沉淀，将上清液送入 10KD分子量的超滤膜进行截留分离纯化，得到抗菌肽粗品浓缩液。
S5喷雾干燥，将步骤S4获得的抗菌肽粗品浓缩液加入5％(抗菌肽粗品浓缩液质量的5％)的可溶性淀粉混合均匀，进行喷雾干燥。其中喷雾干燥的条件为：进口温度100℃，进料速度500ml/h，进风量5m3/min，喷雾压力0.1Mpa，获得双联混合发酵抗菌肽饲料添加剂。
本实施例得到的双联混合发酵抗菌肽饲料添加剂中的抗菌肽粗品分子量为10KD，检测方法参照《GB/T 39101-2020-多肽抗菌性测定》，对大肠杆菌抑菌效价在1.8×103AU/mg，金黄色葡萄球菌抑菌效价在2.4×103AU/mg，沙门氏菌抑菌效价在1.7×104AU/mg，铜绿假单胞菌抑菌效价在2.2×103AU/mg，小麦赤霉菌抑菌效价在1.3×103AU/mg。
实施例2
一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法，包括以下步骤，
S1地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液制备，将地衣芽孢杆菌和乳酸片球菌活化接种到种子液液体培养基中发酵，获得地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液；其中地衣芽孢杆菌菌体浓度为2.5×109CFU/ml，乳酸片球菌菌体浓度为 3.5×107CFU/ml，发酵条件为：pH值为5.5，发酵温度为25℃，发酵时间为48h。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年12月29日，保藏号为CGMCC No.24209；，所述乳酸片球菌来源为CICC，菌株编号为CICC 24367。
种子液液体培养基每升中包含：葡萄糖20g、蛋白胨15g、蔗糖20g，酵母提取物30g，氯化钠0.6g，硫酸镁0.8g、硫酸锰0.08g、柠檬酸三铵5g、磷酸氢二钾6g，其余为纯水。
S2地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液制备，将步骤S1获得的地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液以4％的接种量接种到液体发酵培养基中发酵，接种后发酵48h，得到地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液；发酵条件为：pH值为6.8，发酵温度为33℃，发酵时间为45h。其中每升液体发酵培养基包含：豆饼粉40g，玉米浆30g，牛骨蛋白粉25g，氯化钠5g，磷酸氢二钾8g，磷酸二氢钾8g，硫酸镁3g，其余为水。发酵条件为：pH值为7.0，发酵温度为40℃，发酵时间为 55h。
S3高压匀浆破壁，将地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液打入高压匀浆机中进行细胞破碎，得到菌体破壁混合液；其中高压匀浆机的工艺参数为：流量为15L/h，压力为30Mpa。
S4分离和超滤纯化，将步骤S3获得的菌体破壁混合液在碟式离心机中离心，离心转速为6000rpm，离心时间为30min，得到上清液和沉淀，将上清液送入 28KD分子量的超滤膜进行截留分离纯化，得到抗菌肽粗品浓缩液。
S5喷雾干燥，将步骤S4获得的抗菌肽粗品浓缩液加入15％(抗菌肽粗品浓缩液质量的15％)的可溶性淀粉混合均匀，进行喷雾干燥。其中喷雾干燥的条件为进口温度150℃，进料速度1500ml/h，进风量20m3/min，喷雾压力1.3Mpa，获得双联混合发酵抗菌肽饲料添加剂。
本实施例得到的双联混合发酵抗菌肽饲料添加剂中的抗菌肽粗品分子量为28KD，检测方法参照《GB/T 39101-2020-多肽抗菌性测定》，对大肠杆菌抑菌效价在3.1×103AU/mg，金黄色葡萄球菌抑菌效价在4.5×103AU/mg，沙门氏菌抑菌效价在2.6×104AU/mg，铜绿假单胞菌抑菌效价在3.8×103AU/mg，小麦赤霉菌抑菌效价在1.9×103AU/mg。
将地衣芽孢杆菌CGMCC No.24209按照实施例1和实施例2相同的种子液液体培养基和液体发酵培养基、方法制备得到产品，分别标记为地衣芽孢杆菌 CGMCC No.24209对照组1、地衣芽孢杆菌CGMCC No.24209对照组2。
将实施例1获得的产品标记为乳酸片球菌CICC 24367双联地衣芽孢杆菌 CGMCCNo.24209实施例1；将实施例2获得的产品标记为乳酸片球菌CICC 24367双联地衣芽孢杆菌CGMCC No.24209实施例2。
对上述地衣芽孢杆菌CGMCC No.24209对照组1、地衣芽孢杆菌CGMCC No.24209对照组2、乳酸片球菌CICC 24367双联地衣芽孢杆菌CGMCC No.24209实施例1、乳酸片球菌CICC 24367双联地衣芽孢杆菌CGMCC No.24209实施例2对应的抗菌肽粗品含量和不同菌种的抗菌效价进行检测，检测结果见表1、表2。
表1
表2
从表1中可以看到，相同的种子液发酵和发酵培养基发酵的条件下，乳酸片球菌(CICC 24367)双联地衣芽孢杆菌(CGMCC No.24209)明显比衣芽孢杆菌 (CGMCC No.24209)发酵制备抗菌肽粗品的含量高(22.78％-28.53％)。采用国标《GB/T 39101-2020-多肽抗菌性测定》方法，测定其产生的抗菌肽粗品对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，铜绿假单胞菌，小麦赤霉菌的效价后发现，效价提升明显(提高≥100％)。其中包含的抗菌肽粗品由于没有经过分离提纯，工艺简单，价格低廉，为在畜牧养殖过程中作为抗菌肽饲料添加剂使用奠定了基础，具有很高经济价值。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 焦作市佰役安生物工程有限公司
<120> 一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法
<141> 2022-03-21
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1488
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌CGMCC No.24209（Bacillus licheniformis）
<400> 1
ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgagcgga cagatgggag 60
cttgctccct gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga 120
ctgggataac tccgggaaac cggggctaat accggatgct tgattgaacc gcatggttca 180
attataaaag gtggctttta gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt 240
ggtgaggtaa cggctcacca aggcaacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca 300
cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca 360
atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaaa 420
ctctgttgtt agggaagaac aagtaccgtt cgaatagggc ggtaccttga cggtacctaa 480
ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt 540
gtccggaatt attgggcgta aagcgcgcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc 600
cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt 660
ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc 720
gactctctgg tctgtaactg acgctgaggc gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga 780
taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagagggtt tccgcccttt 840
agtgctgcag caaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact 900
caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg 960
cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgacaaccct agagataggg cttccccttc 1020
gggggcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1080
aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattcagttg ggcactctaa 1140
ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt 1200
atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg gcagaacaaa gggcagcgaa gccgcgaggc 1260
taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga 1320
agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1380
tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt 1440
tggagccagc cgccgaaggt gggacagatg attggggtga agtcgtaa 1488
Claims (9)
1.一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法，其特征在于：
S1地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液制备，将地衣芽孢杆菌和乳酸片球菌活化接种到种子液液体培养基中发酵，获得地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液；
S2地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液制备，将步骤S1获得的地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液接种到液体发酵培养基中发酵，接种后发酵40～60h，得到地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液；
S3高压匀浆破壁，将地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液打入高压匀浆机中进行细胞破碎，得到菌体破壁混合液；
S4分离和超滤纯化，将步骤S3获得的菌体破壁混合液在离心机中离心，得到上清液和沉淀，将上清液送入超滤膜进行分离纯化，得到抗菌肽粗品浓缩液；
S5喷雾干燥，将步骤S4获得的抗菌肽粗品浓缩液进行喷雾干燥，获得双联混合发酵抗菌肽饲料添加剂；
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年12月29日，保藏号为CGMCCNo.24209；所述乳酸片球菌来源为CICC，菌株编号为CICC 24367；所述抗菌肽粗品抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、小麦赤霉菌生长。
2.根据权利要求1所述的一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法，其特征在于：步骤S1中，所述地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液内的地衣芽孢杆菌菌体浓度为1×107～1×1011CFU/ml，地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液内的乳酸片球菌菌体浓度为1×105～1×108CFU/ml。
3.根据权利要求1所述的一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法，其特征在于：所述步骤S1中，每升种子液液体培养基中包含：葡萄糖15～20g、蛋白胨5～15g、蔗糖6～20g、酵母提取物10～30g、氯化钠0.2～0.6g、硫酸镁0.3～0.8g、硫酸锰0.05～0.08g、柠檬酸三铵2～5g、磷酸氢二钾3～6g，其余为纯水。
4.根据权利要求1所述的一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法，其特征在于：所述步骤S1的发酵条件为：pH值为5.5～7.5，发酵温度为25～40℃，发酵时间为24～48h。
5.根据权利要求1所述的一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法，其特征在于：所述步骤S2中，地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液以2～8％的接种量接种至液体发酵培养基；每升所述液体发酵培养基包含：豆饼粉20～40g、玉米浆10～30g、牛骨蛋白粉10～25g、氯化钠1～5g、磷酸氢二钾2～8g、磷酸二氢钾2～8g、硫酸镁0.5～3g、其余为水；
步骤S2的发酵条件为：pH值为5.5～7.5，发酵温度为25～40℃，发酵时间为36～60h。
6.根据权利要求1所述的一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法，其特征在于：所述步骤S3中，高压匀浆机的工艺参数为：流量为5～15L/h，压力为15～30Mpa。
7.根据权利要求1所述的一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法，其特征在于：所述步骤S4中，所述离心机为碟式离心机；碟式离心机的转速为4000～6000rpm，离心时间10～30min；超滤膜进行分离纯化过程中，超滤膜的截留的抗菌肽粗品的分子量范围为5～30KD。
8.根据权利要求1所述的一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法，其特征在于：所述步骤S5中，抗菌肽粗品浓缩液内加入有抗菌肽粗品浓缩液质量的5～15％的保护剂，再进行喷雾干燥；所述保护剂为可溶性糊精、可溶性淀粉、可溶性乳清粉中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法，其特征在于：所述步骤S5中，将加入保护剂的抗菌肽粗品浓缩液的喷雾干燥条件为：进口温度100～150℃，进料速度500～1500ml/h，进风量5～20m3/min，喷雾压力0.1～1.3Mpa；
所述步骤S5中，喷雾干燥得到的双联混合发酵抗菌肽饲料添加剂中的抗菌肽粗品的分子量在5～28KD之间。
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