CN104962498A - 一种乳酸链球菌的发酵培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种乳酸链球菌的发酵培养基，包括以下重量配比的组分：葡萄糖25-35份、玉米浆10-20份、磷酸氢二钾2-3份、醋酸钠3-5份、明胶1.5-2.5份、抗坏血酸钠0.4-0.6份、硫酸镁0.2-0.4份、硫酸锰0.05-0.1份、蒸馏水1000份。所述发酵培养基的制备方法包括调pH值步骤：调整溶液pH值至6.8～7.0。所述发酵培养基的制备方法还包括灭菌步骤：采用高压蒸汽灭菌锅灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min。采用本发明发酵培养基制备乳酸链球菌菌液，含菌量为3.8-6.0×109 cfu/ml,从得到的菌液中提取的乳酸链球菌抗菌肽纯度为63-72%。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵培养基，适用于乳酸链球菌发酵生产使用，具体地说，涉及一种乳酸链球菌的发酵培养基及其应用，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
近年来，随着抗生素在畜牧业越来越广泛的应用，其弊端逐渐显现出来，耐药性细菌的产生、动物肠道菌群的失调、残留药物对人体的危害等方面使抗生素治疗受到限制。寻找天然无害且高效的抗菌活性物质已成为预防、治疗畜禽疾病的趋势。乳酸链球菌抗菌肽具有平衡胃肠道菌群，杀灭胃肠道病原菌，促进消化吸收等作用，对于鸡等较易发生的消化道疾病，如腹泻、传染性胃肠炎、鸡肠炎、沙门氏菌病等有极好的功效。
尽管乳酸链球菌抗菌肽有着显著的优势，然而由于其自身不能合成多种氨基酸、维生素及相关生长因子，因此导致营养要求和培养条件较为复杂。常用的乳酸链球菌培养基为MRS培养基，原料昂贵，尤其氮源成分价格比重较大，在生产中应用成本太高。生长过程中，菌体会产生乳酸等有机酸类代谢产物，使培养基的pH值不断下降，从而抑制乳酸链球菌的生长，导致菌体活性下降甚至死亡。因此，采用传统的发酵培养基，菌种密度较低，质量无法保证，且生产成本较高。
现有技术的乳酸链球菌培养基具有以下缺陷：乳酸链球菌的发酵时间长，制得的菌液含菌量低，提取的抗菌肽纯度低，抗菌效果不够理想，培养基成本高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种乳酸链球菌的发酵培养基，实现以下发明目的：
1、提高制备的乳酸链球菌菌液的含菌量；使含菌量为3.8-6.0×109 cfu/ml；
2、提高培养的乳酸链球菌中提取的抗菌肽纯度；使纯度为63-72%；
3、提高培养的乳酸链球菌中提取的抗菌肽的抗菌效果；
4、缩短发酵培养乳酸链球菌的发酵时间；
5、降低发酵培养基的成本。
为实现上述发明目的，采用以下技术方案：
一种乳酸链球菌的发酵培养基，所述的发酵培养基包括下列组分：葡萄糖、玉米浆、磷酸氢二钾、醋酸钠、明胶、抗坏血酸钠、硫酸镁、硫酸锰、蒸馏水。
以下是对上述技术方案的进一步改进：
所述发酵培养基组分的总量份为：葡萄糖25-35份、玉米浆10-20份、磷酸氢二钾2-3份、醋酸钠3-5份、明胶1.5-2.5份、抗坏血酸钠0.4-0.6份、硫酸镁0.2-0.4份、硫酸锰0.05-0.1份、蒸馏水1000份。
所述发酵培养基包括以下重量份的组分： 葡萄糖30份、玉米浆15份、磷酸氢二钾2份、醋酸钠4份、明胶2份、抗坏血酸钠0.5份、硫酸镁0.3份、硫酸锰0.08份、蒸馏水1000份。
所述发酵培养基的制备方法包括调pH值步骤：调整溶液pH值至6.8～7.0。
所述发酵培养基的制备方法还包括灭菌步骤：采用高压蒸汽灭菌锅灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min。
一种乳酸链球菌的发酵培养基的应用，包括制备种子液、接种、发酵步骤。
所述的制备种子液步骤：乳酸链球菌菌种接种量为10g/L，制成的种子液的乳酸链球菌含量为1.0×107-5.0×107cfu/ml。
所述的接种步骤中种子液：培养基的体积比为4:100。
所述的发酵步骤：发酵温度为37-39℃，发酵罐的搅拌转速为120r/min，发酵罐内压力为0.05MPa。
采用本发明发酵培养基制备乳酸链球菌菌液，含菌量为3.8-6.0×109 cfu/ml, 从得到的菌液中提取的乳酸链球菌抗菌肽纯度为63-72%。
采用本发明技术方案，与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、采用本发明发酵培养基制备乳酸链球菌菌液，含菌量为3.8-6.0×109 cfu/ml；
2、采用本发明发酵培养基生产提取的乳酸链球菌抗菌肽纯度为63-72%；
3、采用本发明发酵培养基生产提取的乳酸链球菌抗菌肽，对大肠杆菌的抑菌圈直径为8.11-9.36mm，效价为7723-8627 IU/mL；抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为8.56-9.05mm，效价为7824-8778 IU/mL；
4、采用本发明发酵培养基进行发酵培养乳酸链球菌，发酵时间为30-34小时；
5、本发明发酵培养基成本为1920-2321元/吨。
具体实施方式
实施例1 一种乳酸链球菌的发酵培养基
培养基所含组分及其重量份如下：
葡萄糖25份、玉米浆20份、磷酸氢二钾3份、醋酸钠3份、明胶1.5份、抗坏血酸钠0.4份、硫酸镁0.2份、硫酸锰0.05份、蒸馏水1000份；
培养基制备方法：
步骤1、按上述重量份称取所有的组分，备用；
步骤2、将称好的葡萄糖、玉米浆溶解于蒸馏水中，得到葡萄糖、玉米浆混合溶液，在无菌条件下过滤，滤液保持无菌，备用；
步骤3、调pH值
将称好的除葡萄糖、玉米浆、蒸馏水以外的其他所有组分混合均匀，加入到步骤2的混合溶液中，搅拌至完全溶解，转速80r/min，溶解后，调整溶液pH值至6.8～7.0；
步骤4、灭菌
将步骤3得到的混合溶液置于121℃高压蒸汽灭菌锅中，灭菌30min；
步骤5、在无菌条件下，灭菌后的混合溶液冷却至常温，制得成品发酵培养基。
实施例2 一种乳酸链球菌的发酵培养基
培养基所含组分及其重量份如下：
葡萄糖30份、玉米浆15份、磷酸氢二钾2份、醋酸钠4份、明胶2份、抗坏血酸钠0.5份、硫酸镁0.3份、硫酸锰0.08份、蒸馏水1000份；
培养基制备方法：采用实施例1的制备方法。
实施例3 一种乳酸链球菌的发酵培养基
培养基所含组分及其重量份如下：
葡萄糖35份、玉米浆10份、磷酸氢二钾2份、醋酸钠5份、明胶2.5份、抗坏血酸钠0.6份、硫酸镁0.4份、硫酸锰0.1份、蒸馏水1000份；
培养基制备方法：采用实施例1的制备方法。
实施例4 一种乳酸链球菌的发酵培养基
培养基所含组分及其重量份如下：
葡萄糖30份、玉米浆15份、磷酸氢二钾2份、醋酸钠4份、明胶2份、抗坏血酸钠0.5份、硫酸镁0.3份、硫酸锰0.08份、南瓜汁0.6份、枸橼酸铁铵0.06份、天门冬素 0.12份、盐酸吡哆醇 0.1份、维生素B6 0.08份、维生素C 0.3份、维生素 D 0.1份、蒸馏水1000份；
培养基制备方法：
步骤1、按上述重量份称取所有的组分，备用；
步骤2、将称好的葡萄糖、玉米浆溶解于蒸馏水中，得到葡萄糖、玉米浆混合溶液，在无菌条件下过滤，滤液保持无菌，备用；
步骤3、将称好的除葡萄糖、玉米浆、蒸馏水以外的其他所有组分混合均匀，得到混合溶液；
步骤4、调pH
将步骤2和步骤3得到的溶液混合，100rpm转速搅拌20min,静止后，调pH至6.8-7.0；
步骤5、灭菌
将步骤3得到的混合溶液置于121℃高压蒸汽灭菌锅中，灭菌30min；
步骤6、在无菌条件下，灭菌后的混合溶液冷却至常温，制得成品发酵培养基。
实施例5 一种乳酸链球菌的发酵培养基
培养基所含组分及其重量份如下：
葡萄糖30份、玉米浆15份、磷酸氢二钾2份、醋酸钠4份、明胶2份、抗坏血酸钠0.5份、硫酸镁0.3份、硫酸锰0.08份、南瓜汁0.7份、枸橼酸铁铵0.07份、天门冬素 0.14份、盐酸吡哆醇 0.11份、维生素B6 0.1份、维生素C 0.4份、维生素 D 0.12份；
培养基制备方法：采用实施例4的制备方法。
实施例6 一种乳酸链球菌的发酵培养基
培养基所含组分及其重量份如下：
葡萄糖30份、玉米浆15份、磷酸氢二钾2份、醋酸钠4份、明胶2份、抗坏血酸钠0.5份、硫酸镁0.3份、硫酸锰0.08份、南瓜汁0.8份、枸橼酸铁铵0.08份、天门冬素 0.16份、盐酸吡哆醇 0.12份、维生素B6 0.12份、维生素C 0.5份、维生素 D 0.14份；
培养基制备方法：采用实施例4的制备方法。
实施例7 一种乳酸链球菌的发酵培养基的应用
菌种：乳酸链球菌，状态为冻干粉，购自：山东中科嘉亿生物工程有限公司。
步骤1、制备种子液
称取1g乳酸链球菌菌种冻干粉,接种于100mL MRS培养基（市售商品）中，在温度37℃下，转速100r/min，培养18h，制成种子液, 乳酸链球菌含量为1.0×107-5.0×107cfu/ml。
步骤2、接种
将制好的乳酸链球菌种子液加入发酵罐中，发酵罐内装有灭菌的实施例1-6的培养基，加入的种子液：培养基的体积比为4：100。
步骤3、发酵
乳酸链球菌接种完成后，在搅拌状态下进行发酵，发酵温度为37-39℃，发酵罐的搅拌转速为120r/min，罐内压力为0.05MPa,培养过程中，采取实时在线检测，培养至乳酸链球菌均生长成熟，即可停止培养。
对照实施例：
采用实施例7的应用方法，只改变接种步骤中所使用的培养基为MRS标准培养基，进行发酵。
实验结果：
（1）、采用实施例1-6的培养基培养乳酸链球菌，结果见表1：
表1乳酸链球菌培养结果指标
由表1可见，实施例5为最优选实施例。
采用本发明发酵培养基培养乳酸链球菌，发酵时间短，得到的菌液含菌量高，发酵得到的乳酸链球菌，品质好，培养基成本低；发酵时间为30-34小时，菌液含菌量为3.8-6.0×109 cfu/ml，培养基成本为1920-2321元/吨。
（2）、采用实施例1-6的培养基培养乳酸链球菌，从中提取抗菌肽，进行检测；
取发酵好的乳酸链球菌菌液，提取抗菌肽，进行药敏试验（指示菌分别为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌），加入发酵液上清的样品孔，24h后测量抑菌圈大小。乳酸链球菌抗菌肽周围出现明显抑菌圈，说明本发明乳酸链球菌抗菌肽对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较为明显的抑菌作用，用游标卡尺对抑菌圈直径进行测量，计算效价，结果见表2；
表2 抗菌肽指标检测结果
由表2可见，实施例5为最优选实施例。
采用本发明乳酸链球菌的发酵培养基进行发酵培养乳酸链球菌，提取抗菌肽，抗菌肽纯度高，抗菌效果好；抗菌肽纯度为63-72%，抗菌肽对大肠杆菌的抑菌圈直径为8.11-9.36mm，效价为7723-8627 IU/mL；抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为8.56-9.05mm，效价为7824-8778 IU/mL。
通过对现有技术的乳酸链球菌发酵培养基的成分进行分析发现，多数培养基含有蛋白胨、酵母膏、脱脂乳、番茄汁、胡萝卜汁、葡萄糖以及多种无机盐等成分，而本发明培养基葡萄糖和玉米浆两种主要成分含量较高，其他几种成分的含量很小，且这两种主要成分价格较低，因此粗略计算，每吨发酵培养基成本降低了2000-3000元，本发明在乳酸链球菌抗菌肽效价大幅提高的同时，极大地降低了发酵培养基的成本。
以上所述为本发明最佳实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识。本发明的保护范围以权利要求的内容为准，任何基于本发明的技术启示而进行的等效变换，也在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种乳酸链球菌的发酵培养基，其特征在于：所述的发酵培养基包括下列组分：葡萄糖、玉米浆、磷酸氢二钾、醋酸钠、明胶、抗坏血酸钠、硫酸镁、硫酸锰、蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的一种乳酸链球菌的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基组分的重量配比为：葡萄糖25-35份、玉米浆10-20份、磷酸氢二钾2-3份、醋酸钠3-5份、明胶1.5-2.5份、抗坏血酸钠0.4-0.6份、硫酸镁0.2-0.4份、硫酸锰0.05-0.1份、蒸馏水1000份。
3.根据权利要求1所述的一种乳酸链球菌的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基包括以下重量份的组分： 葡萄糖30份、玉米浆15份、磷酸氢二钾2份、醋酸钠4份、明胶2份、抗坏血酸钠0.5份、硫酸镁0.3份、硫酸锰0.08份、蒸馏水1000份。
4.根据权利要求1所述的一种乳酸链球菌的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基的制备方法包括调pH值步骤：调整溶液pH值至6.8～7.0。
5.根据权利要求4所述的一种乳酸链球菌的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基的制备方法还包括灭菌步骤：采用高压蒸汽灭菌锅灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min。
6.一种乳酸链球菌的发酵培养基的应用，其特征在于：包括制备种子液、接种、发酵步骤。
7.根据权利要求6所述的一种乳酸链球菌的发酵培养基的应用，其特征在于：所述的制备种子液步骤：乳酸链球菌菌种接种量为10g/L，制成的种子液的乳酸链球菌含量为1.0×107-5.0×107cfu/ml。
8.根据权利要求6所述的一种乳酸链球菌的发酵培养基的应用，其特征在于：所述的接种步骤中种子液：培养基的体积比为4:100。
9.根据权利要求6所述的一种乳酸链球菌的发酵培养基的应用，其特征在于：所述的发酵步骤：发酵温度为37-39℃，发酵罐的搅拌转速为120r/min，发酵罐内压力为0.05MPa。
10.根据权利要求6所述的一种乳酸链球菌的发酵培养基的应用，其特征在于：采用本发明发酵培养基制备乳酸链球菌菌液，含菌量为3.8-6.0×109 cfu/ml, 从得到的菌液中提取的乳酸链球菌抗菌肽纯度为63-72%。
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