CN114317280A - 一株中华网柄牛肝菌菌株及诱导产生子实体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株中华网柄牛肝菌(Retiboletus sinensis)菌株及诱导产生子实体的方法。该菌株于2021年12月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.23887。该菌株菌落成圆形或近似圆形，菌丝粗壮浓密，呈黄绿色，子实体原基为淡黄色小米粒形，子实体分化前期菌盖淡黄色，菌柄白色带绒毛。该菌株在合适的培养基及培养方法能够在纯培养条件下直接产生子实体，因此有助于实现中华网柄牛肝菌的商业化栽培。所以，中华网柄牛肝菌LD‑001菌株在中华网柄牛肝菌的合理开发利用以及外生菌根真菌结实机制的研究等方面具有重要的应用价值及科研价值。

Description

一株中华网柄牛肝菌菌株及诱导产生子实体的方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株中华网柄牛肝菌菌株及诱导产生子实体的方法。

背景技术

中华网柄牛肝菌(Retiboletus sinensis)为可食用牛肝菌，是牛肝菌目、牛肝菌科、网柄牛肝菌属的一种，该属种类较少，世界仅报道7种1变种，其中在我国分布的有6种，需要与壳斗科植物形成外生菌根才可以产生子实体，不可以直接培养得到子实体。其子实体中等大小，具有可食性；菌盖近半球形至凸镜形，有时平展，橄榄褐色、黄褐色、灰褐色至褐色，菌盖边缘下弯；菌柄中生，近圆柱形，实心，黄色至黄褐色，被粗网纹，基部菌丝黄色；菌肉黄色，伤变色为黄褐色。孢子梭形至椭圆形，橄榄褐色至黄褐色，表面光滑。

由于中华网柄牛肝菌只分布在中国华南、东南地区，野生资源稀少，因此对其研究也比较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一株中华网柄牛肝菌菌株LD-001(Retiboletussinensis)。

该菌株从山东省招远市罗山省级自然保护区小园庙林场组织分离获得，对其进行了形态学、生理生化性质和ITS测序鉴定，鉴定为中华网柄牛肝菌(Retiboletussinensis)，属于牛肝菌目，牛肝菌科，网柄牛肝菌属，该菌株已于2021年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.23887，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。

经过ITS测序，该菌株的ITS序列如SEQ ID No.1所示。

经过研究发现，该中华网柄牛肝菌菌株能够脱离共生植物腐生结实，将菌丝体直接人工诱导培养产生子实体，这种直接产生子实体的中华网柄牛肝菌菌株目前还属于首次报道。

本发明还公开了上述中华网柄牛肝菌菌株人工诱导培养成子实体的方法，所述方法为：首先配制诱导培养基，将菌种接种到诱导培养基中，在26～28℃，暗光培养20～30d，待菌丝体长满培养基后，移入20～22℃的环境中，调整空气湿度70～90％，光照强度300～500LX，散射光照3～7d产生原基，分化成子实体。

优选地，所述诱导培养基配方为：马铃薯150～200g/L、果糖10～15g/L、β-环糊精5～10g/L、蛋白胨5～8g/L、磷酸二氢钾1～2g/L、硫酸镁1～2g/L、抗坏血酸0.3～0.6g/L、维生素B1 0.3～0.6g/L、维生素B2 0.3～0.6g/L、琼脂20g/L。

更加优选地，所述诱导培养基配方为：马铃薯180g/L、果糖12g/L、β-环糊精8g/L、蛋白胨6g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、硫酸镁1.5g/L、抗坏血酸0.4g/L、维生素B1 0.5g/L、维生素B2 0.5g/L、琼脂20g/L。

中华网柄牛肝菌菌株LD-001在平板固体培养基中菌落成圆形或近似圆形，菌丝粗壮浓密，呈淡黄色至黄绿色，子实体原基为淡黄色小米粒形，子实体分化前期菌盖淡黄色，菌柄白色带绒毛。

本发明的优点：

现有技术中网柄牛肝菌属的牛肝菌需要与壳斗科植物形成外生菌根才可以产生子实体，而单独培养不可以产生子实体，但是本发明通过筛选得到了一种新的中华网柄牛肝菌菌株LD-001，其可以在菌丝体纯培养条件下产生子实体，因此有助于实现中华网柄牛肝菌的商业化栽培。所以，中华网柄牛肝菌LD-001菌株在中华网柄牛肝菌的合理开发利用以及外生菌根真菌结实机制的研究等方面具有重要的应用价值及科研价值。

附图说明

图1是中华网柄牛肝菌子实体。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1中华网柄牛肝菌菌株LD-001的分离及鉴定。

1.菌株的获得

从山东省招远市罗山省级自然保护区小园庙林场野生牛肝菌组织分离获得。

2.母种培养基的制备：配制PDA加富培养基。

3.菌种分离：清理干净牛肝菌表面的泥土、枯枝、沙石等杂质，在超净工作台内去除菌盖，在菌盖于菌柄交界处切取1～1.5cm厚度0.2～0.5cm的组织块，将其接入母种培养基内，25～30℃避光培养30天，得到中华网柄牛肝菌母种。

4.LD-001菌株生物学特性鉴定：菌株野外生境为壳斗科植物林下空地，单生或群生。其子实体中等大小，具有可食性；菌盖近半球形至凸镜形，有时平展，橄榄褐色、黄褐色、灰褐色至褐色，菌盖边缘下弯；菌柄中生，近圆柱形，实心，黄色至黄褐色，被粗网纹，基部菌丝黄色；菌肉黄色，伤变色为黄褐色。孢子梭形至椭圆形，橄榄褐色至黄褐色，表面光滑。

5.ITS测序鉴定

采用植物基因组提取试剂盒提取LD-001菌株的基因组DNA并以其作为模板，以引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SEQ ID No.2)和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3’(SEQ ID No.3)为引物对，进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30S，50℃退火30S，72℃延伸1min，共35个循环；72℃扩增后彻底延伸7min。PCR扩增产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测后，用纯化试剂盒纯化回收DNA，扩增产物送往上海生工生物工程进行测序。经过测序得到一段503bp的序列，其序列如SEQ ID No.1所示。

该序列已提交至GeneBank，序列数据ID为：OL339344。采用BLAST进行同源性搜索比对，确定该菌株为中华网柄牛肝菌Retiboletus sinensis。

因此，通过上述对其进行了形态学、生理生化性质和ITS测序鉴定，确定其为中华网柄牛肝菌Retiboletus sinensis，属于牛肝菌目，牛肝菌科，网柄牛肝菌属，并且于2021年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNO.23887。

实施例2一种中华网柄牛肝菌子实体诱导方法

1.诱导培养基制作：将马铃薯150g、果糖10g、β-环糊精5g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁1g、抗坏血酸0.3g、维生素B10.3g、维生素B20.3g、琼脂20g，溶于饮用水，加水定容为1L，分装入组培瓶中，121℃灭菌30min，冷却后将菌种接入中华网柄牛肝菌子实体诱导培养基中，26℃，暗光培养50d，菌丝长满培养基。

2.子实体诱导：待菌丝体长满培养基后，移入22℃的环境中，调整空气湿度70％，光照强度300LX散射光照，15d产生原基，分化成子实体。

实施例3一种中华网柄牛肝菌子实体诱导方法

1.诱导培养基制作：将马铃薯200g、果糖15g、β-环糊精10g、蛋白胨8g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁2g、抗坏血酸0.6g、维生素B10.6g、维生素B20.6g、琼脂20g，溶于饮用水，加水定容为1L，分装入组培瓶中，121℃灭菌30min，冷却后将菌种接入中华网柄牛肝菌子实体诱导培养基中，28℃，暗光培养40d，菌丝长满培养基。

2.子实体诱导：待菌丝体长满培养基后，移入22℃的环境中，调整空气湿度90％，光照强度500LX散射光照，7d产生原基，分化成子实体。

实施例4一种中华网柄牛肝菌子实体诱导方法

1.诱导培养基制作：将马铃薯180g、果糖12g、β-环糊精8g、蛋白胨6g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸镁1.5g、抗坏血酸0.4g、维生素B10.5g、维生素B20.5g、琼脂20g，溶于饮用水，加水定容为1L，分装入组培瓶中，121℃灭菌30min，冷却后将菌种接入中华网柄牛肝菌子实体诱导培养基中，27℃，暗光培养45d，菌丝长满培养基。

2.子实体诱导：待菌丝体长满培养基后，移入21℃的环境中，调整空气湿度80％，光照强度400LX散射光照，12d产生原基，分化成子实体。

为了得到本发明的技术方案，发明人在实际实验过程中还进行了诸多实验，其中两个实验具体如下：

实验一不同诱导培养基对中华网柄牛肝菌子实体诱导的影响

使用MMN培养基、麦芽汁培养基、胡萝卜培养基、GPC培养基、GPY培养基培养基与本发明培养基(改良PDA培养基)进行子实体诱导率比较，其中本发明培养基采用实施例4的培养基配方；MMN培养基、麦芽汁培养基、胡萝卜培养基、GPC培养基、GPY培养基培养基配方如下：

MMN培养基：葡萄糖10g/L，麦芽浸粉3g/L，维生素B10.0001g/L，CaCl₂·2H₂O0.05g/L，NaCl 0.025g/L，(NH4)₂HPO₄ 0.25g/L，MgSO₄·7H₂O 0.15g/L，FeCl₃ 0.012g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，琼脂15g/L。

麦芽汁培养基：45g麦芽磨碎，琼脂15g/L，pH自然。

胡萝卜培养基：胡萝卜200g/L(煮汁)，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L。

GPC培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，玉米浆10g/L，琼脂15g/L。

GPY培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏10g/L，琼脂15g/L。

采用上述培养基分别对中华网柄牛肝菌子实体进行诱导，其余培养条件均相同，观察不同培养基中菌丝体长势及子实体诱导情况，具体见表1。

表1.菌株LD-001在不同培养基中菌丝体长势及子实体诱导率

从表1可以看出，其中麦芽汁培养基和胡萝卜培养基均在培养过程中停止生长，可见其完全不适合中华网柄牛肝菌子实体的诱导，因此采用这两种培养基不能诱导出子实体，在MMN培养基和GPC培养基虽然可以产生子实体，单其生长速度和子实体诱导率均不高，而在本发明的培养基中，菌株LD-001长势最佳，菌丝浓密呈黄绿色，子实体诱导率高达90％，可以作为中华网柄牛肝菌子实体诱导培养基。

实验二不同中华网柄牛肝菌菌株LD-001(本发明)、与其它中华网柄牛肝菌菌株(LD-002、LD-003、LD-004；保藏于鲁东大学农学院菌种室)均以本发明的改良PDA培养基作为子实体诱导培养基进行子实体诱导对比，结果见表2。

表2.LD-001菌株与其它菌株菌丝体长势及子实体诱导率

从表2可以看出，四个菌株的生长速度差异不大，但是，只有本发明的LD-001菌株可以诱导出子实体，其它菌株均未诱导出子实体，可见，在实际的生产过程中，LD-001菌株更具有应用价值，因此，将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，为以后该菌株的合理开发利用提供一个途径。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

序列表

<110> 鲁东大学

<120> 一株中华网柄牛肝菌菌株及诱导产生子实体的方法

<130> 2021

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 503

<212> DNA

<213> Retiboletus sinensis

<400> 1

atcgactgtt gctggctcag ttttgactac tgaagcatgt gcacgtctac cattttatct 60

acacacctgt gcacctactg taggtccttg aaagaggatg ctatgtattt tgataacctt 120

tacatgtatg gaatggggat atatattgga tatatacaac tttcagcaac ggatctcttg 180

gctctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaat tgcgataagt aatgtgaatt gcagattttc 240

agtgaatcat cgaatctttg aacgcacctt gcgctccttg gtattccaag gagcatgcct 300

gtttgagtgt cattaaatca tcaaccatgt ctattagaca ttggcttgga gttgggaatt 360

gctggctcgt tcagctgtcc tgaaatgcat gctaattgga cgtgtacacg gcttgcgacg 420

tgataatgat cgttgtggct ggagcaccaa accaatgtag ggattttgac ctcaaatcag 480

gtaggactac ccgctgaact taa 503

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Retiboletus sinensis

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Retiboletus sinensis

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (6)

1.一株中华网柄牛肝菌菌株，其特征在于，所述菌株为中华网柄牛肝菌(Retiboletussinensis)，所述菌株于2021年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.23887。

2.根据权利要求1所述的中华网柄牛肝菌菌株，其特征在于，所述菌株的ITS序列如SEQID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的中华网柄牛肝菌菌株，其特征在于，所述中华网柄牛肝菌菌株能够脱离共生植物腐生结实，将菌丝体直接人工诱导培养产生子实体。

4.权利要求1～3任一项所述的中华网柄牛肝菌菌株人工诱导培养成子实体的方法，其特征在于，所述方法为：首先配制诱导培养基，将菌种接种到诱导培养基中，在26～28℃，暗光培养20～30d，待菌丝体长满培养基后，移入20～22℃的环境中，调整空气湿度70～90％，光照强度300～500LX，散射光照3～7d产生原基，分化成子实体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基配方为：马铃薯150～200g/L、果糖10～15g/L、β-环糊精5～10g/L、蛋白胨5～8g/L、磷酸二氢钾1～2g/L、硫酸镁1～2g/L、抗坏血酸0.3～0.6g/L、维生素B10.3～0.6g/L、维生素B20.3～0.6g/L、琼脂20g/L。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基配方为：马铃薯180g/L、果糖12g/L、β-环糊精8g/L、蛋白胨6g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、硫酸镁1.5g/L、抗坏血酸0.4g/L、维生素B10.5g/L、维生素B20.5g/L、琼脂20g/L。

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