CN115386501B - 一株普陀条孢牛肝菌菌株ld-0312及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株普陀条孢牛肝菌菌株LD‑0312及应用，所述菌株LD‑0312为普陀条孢牛肝菌(Boletellus putuoensis)，所述菌株于2022年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.40300。该菌株LD‑0312属于条孢牛肝菌属Boletellus，为该属新种，该菌株属于首次分离得到，其发现和利用丰富了外生菌根真菌的可利用微生物资源。并且该菌株LD‑0312可以促进共生植物的生长，具体包括促进黑松植株增高、提高鲜重、增长根长、提高光合作用等，因此该菌株的分离、培养及保藏丰富了外生菌根真菌的可利用微生物资源。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株普陀条孢牛肝菌菌株LD-0312及应用。
背景技术
在自然界森林系统中，植物只能从枯枝落叶层中获取到有限的氮(N)和磷(P)，外生菌根共生体的生物学功能是将真菌吸收的矿质营养物质交换为植物来源的碳水化合物。通过散发有机酸，真菌菌丝可以从枯枝落叶层中甚至能够进入固化的矿物并利用矿物营养物质。吸收的元素在真菌菌丝体中被转运到哈氏网中进行代谢和储存，在哈氏网中，真菌氮(N)和磷(P)被交换为植物碳(C)。因此，外生菌根植物往比非菌根植物具有更高的氮(N)和磷(P)含量。从学者们大量的盆栽试验及田间试验表明，外生菌根真菌能够满足其共生植物80％的氮需求。氮对植物来说是一种十分重要的元素，它可以对植物的组织结构及生物量产生直接的影响。外生菌根真菌在土壤中含氮化合物转化和其共生植物氮营养中的作用的研究引起了许多研究者的关注。
牛肝菌作为我国分布最广的菌根型野生食用菌森林资源，它除了具有非常显著的生态意义，其子实体味道鲜美还具有较高的经济价值。由此可见，牛肝菌类外生菌根真菌在自然资源保护及生态修复方面具有广阔的开发利用前景。为了充分开发牛肝菌的生态功能，有必要进一步在丰富外生菌根真菌种质资源中筛选获得更多优异的菌株，为其开发利用提供保障。
发明内容
本发明的目的在于提供一株普陀条孢牛肝菌菌株LD-0312(Boletellusputuoensis)。
本发明所述菌株LD-0312是从浙江省嘉兴市海盐县胡家湾采集的子实体分离获得，对其进行了形态学、生理生化性质和ITS测序鉴定，鉴定为条孢牛肝菌属Boletellus属的一个新种，该菌株的分类地位是Boletellus sp.，根据命名方法将其命名为Boletellusputuoensis。
该菌株已于2022年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.40300，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
进一步的，所述菌株是从普陀条孢牛肝菌子实体中分离所得。
本发明还公开了上述普陀条孢牛肝菌菌株LD-0312的培养方法为：
(1)将牛肝菌菌种于GPY固体培养基中活化，22℃，暗培养30天，备用；
(2)使用8mm打孔器在长好牛肝菌菌丝体的固体培养基中打孔，取大小一致的菌种块接种于GPY(葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏10g/L)培养基的三角瓶中，装液量为100/200mL，置于22℃，150r/min的摇床中进行暗培养20d。
本发明还包括上述菌株普陀条孢牛肝菌菌株LD-0312在促进共生植物生长上的应用。
进一步的，上述共生植物为黑松。具体地，所述普陀条孢牛肝菌菌株能够促进黑松植株增高、提高鲜重、增长根长、提高光合作用。其中，所述根长包括总根长和侧根长。
本发明还包括一种应用上述新种菌株Boletellus putuoensis LD-0312对促进黑松生长的方法，所述方法为：将菌株LD-0312接种到黑松组培苗和/或实生苗中；所述接种方法为：将黑松组培苗和/或实生苗接种于培养LD-0312的培养基中和/或将LD-0312的液体菌种浇灌到黑松组培苗和/或实生苗的根系。
本发明的优点：
本发明的菌株是首次从牛肝菌中分离出来的新种普陀条孢牛肝菌(Boletellusputuoensis)LD-0312菌株，属于条孢牛肝菌属Boletellus，为该属新种，该菌株属于首次分离得到，该新种的发现和利用丰富了外生菌根真菌的可利用微生物资源。
本发明还对其应用进行了研究，结果发现，其可以促进共生植物的生长，具体包括促进黑松植株增高、提高鲜重、增长根长、提高光合作用，因此可在生态修复等领域提供优异的种质资源。
附图说明
图1为本发明菌株LD-0312的形态及显微结构图；
图2为本发明菌株LD-0312的系统发育树图；
图3为本发明菌株LD-0312接种黑松幼苗生长图；图中，A为未接种LD-0312菌株的CK组；B为接种LD-0312菌株的黑松幼苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。
若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1普陀条孢牛肝菌菌株LD-0312的分离及鉴定。
1.菌株的获得
本发明的菌株是从浙江省嘉兴市海盐县胡家湾采集的子实体分离获得。
2.平板固体培养基和GPY培养基(葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏10g/L)的配制：按照常规操作方法即可。
3.菌种的分离
(1)将牛肝菌菌种于平板固体培养基中活化，22℃，暗培养30天，备用；
(2)使用8mm打孔器在长好牛肝菌菌丝体的固体培养基中打孔，取大小一致的菌种块接种于GPY培养基的三角瓶中，装液量为100/200mL，置于22℃，150r/min的摇床中进行暗培养20d，得到普陀条孢牛肝菌菌株。
4.菌株LD-0312生物学特性鉴定：
该菌株在GPY固体培养基中菌落呈圆形或近似圆形，褐色至深棕色。菌落不呈现放射状，生长前期多为气生菌丝，后期多为基内菌丝。菌丝直径3.2-3.8μm，表面光滑，局部膨大，无锁状联合。
5.分子生物学鉴定
用测序得到的28S、TEF1、RPB2序列使用RAxML法与GenBank数据库中的亲缘关系相近种的已知序列构建系统发育树(图2)。
因此，通过上述对其进行了形态学、生理生化性质和测序鉴定，鉴定为条孢牛肝菌属Boletellus属的一个新种，该菌株的分类地位是Boletellus sp.，根据命名方法将其命名为Boletellus putuoensis。并且于2022年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.40300。
实施例2对黑松生长的促进作用
供试植物：黑松种子采自于鲁东大学校园内。
1.菌株LD-0312与黑松苗的共培养：
(1)LD-0312菌株液体菌种制作
将牛肝菌菌种于平板固体培养基中活化，22℃，暗培养30天，备用。使用8mm打孔器在长好牛肝菌菌丝体的固体培养基中打孔，取大小一致的菌种块接种于GPY培养基(葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏10g/L)的三角瓶中。装液量为100/200mL，接种量为8块菌种块。置于22℃，150r/min的摇床中进行暗培养20d。
(2)黑松苗接种菌株LD-0312
将黑松种子使用0.5mg/L的无菌水溶液浸泡48h后使用5％的次氯酸钠溶液消毒15min，并使用无菌水冲洗4-5次。将处理好的种子置入装有栽培基质(草炭土∶蛭石1∶1)的容器中进行育苗处理，25℃。培育15天后将LD-0312的液体菌种注射到上述栽培基质中，注射量为20mL/瓶，同时向CK组注射等量的无菌水。
2.LD-0312对黑松苗生长的促进作用
本实验在鲁东大学农学院菌种保藏中心的温室内进行，随机取6株黑松菌根苗与非菌根苗，测量其株高、鲜重和根长，并测定光合作用强度，以检验LD-0312对黑松苗的促生效果。由图3、表1可以看出，黑松菌根苗的株高、鲜重和根长显著高于非菌根苗，并且菌根苗的侧根明显多于非菌根苗。在光合作用方面，菌根苗比非菌根苗的光合作用强度高接近1倍。
表1接种菌株LD-0312的黑松菌根苗与非菌根苗的生理指标
综上所述，本申请的LD-0312菌株属于新种菌株，能起到促进黑松生长的作用，是一种性能良好的植物外生菌根真菌。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。
Claims (6)
1.一株普陀条孢牛肝菌菌株LD-0312，其特征在于，所述菌株为普陀条孢牛肝菌(Boletellus putuoensis)，所述菌株于2022年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.40300。
2.权利要求1所述的普陀条孢牛肝菌菌株LD-0312的液体菌种的培养方法，其特征在于，所述方法为：
（1）将牛肝菌菌种于GPY固体培养基中活化，22℃，暗培养30天，备用；
（2）使用8mm打孔器在长好牛肝菌菌丝体的固体培养基中打孔，取大小一致的菌种块接种于GPY培养基的三角瓶中，装液量为100/200 mL，置于22℃，150 r/min的摇床中进行暗培养20d，得到普陀条孢牛肝菌菌株液体菌种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述GPY培养基的配方为葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏10 g/L。
4.权利要求1所述的普陀条孢牛肝菌菌株在促进黑松生长中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述普陀条孢牛肝菌菌株能够促进黑松植株增高、提高鲜重、增长根长、提高光合作用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述根长包括总根长和侧根长。
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| 中国牛肝菌已知种类;李泰辉等;贵州科学;第21卷(第1-2期);78-86 * |
| 美味牛肝菌菌塘中菌根促生菌的筛选与鉴定;郭霞等;菌物学报;1802-1807 * |
| 黑松－美味牛肝菌菌根辅助细菌的筛选与鉴定;郭霞等;森林与环境学报;第39卷(第3期);315-319 * |
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