CN113412763B

CN113412763B - 一株中华腐生牛肝菌菌株

Info

Publication number: CN113412763B
Application number: CN202110631616.9A
Authority: CN
Inventors: 何明霞; 杨天伟; 张春霞; 许欣景; 曾念开; 刘静; 高锋; 方艺伟; 王文兵
Original assignee: Hainan Medical College; Yunnan Institute of Tropical Crops
Current assignee: Hainan Medical College; Yunnan Institute of Tropical Crops
Priority date: 2021-06-07
Filing date: 2021-06-07
Publication date: 2021-11-23
Anticipated expiration: 2041-06-07
Also published as: CN113412763A

Abstract

本发明公开了一株栽培性状稳定、产量高的中华腐生牛肝菌优良菌株。所述的中华腐生牛肝菌菌株BU001菌株，于2021年5月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21959。本发明提供的中华腐生牛肝菌BU001菌株，菌落成圆形或不规则形状，菌丝粗壮、浓密，呈黄白色。采用本发明提供的BU001菌株制作液体菌种，菌丝球淡褐色，大小均匀，发酵培养6～8d即可制成。用于制作栽培菌种，菌龄一致，菌丝金黄，浓密，抗杂性强，发菌快，出菇整齐、产量高，栽培周期短，有利于实现中华腐生牛肝菌大规模栽培生产。因此，中华腐生牛肝菌BU001菌株在中华腐生牛肝菌种质资源保护、开发利用和科学研究中具有重要的应用价值。

Description

一株中华腐生牛肝菌菌株

技术领域

本发明涉及一株中华腐生牛肝菌菌株，具体涉及一株栽培性状稳定、产量高，适合用于人工栽培的中华腐生牛肝菌菌株，属于微生物技术领域。

背景技术

中华腐生牛肝菌(Buchwaldoboletus xylophilus)因能够营腐生生活而得名，属于牛肝菌目，牛肝菌科、腐生牛肝菌属，是一种热带、亚热带地区的珍稀牛肝菌；国外主要分布于斯里兰卡、菲律宾、马来西亚，国内分布于云南、海南、香港等温热地区。中华腐生牛肝菌子实体中等大小，菌盖黄褐色或褐色，幼时菌盖边缘内卷；菌柄呈红褐色或褐色，菌柄基部可见浓密的黄色菌丝体；菌肉黄色或淡黄色，伤后迅速变蓝色；孢子卵球形或椭圆形。中华腐生牛肝菌野生资源稀少，产量极低，属于濒危物种。

目前，中华腐生牛肝菌菇房人工栽培获得成功，但不同菌株菌丝性状、抗杂程度不同，导致出菇率、出菇时间、产量及品质不稳定，从源头上制约了中华腐生牛肝菌扩大栽培。

发明内容

本发明的目的在于提供一株栽培性状稳定、产量高，适合人工栽培的中华腐生牛肝菌优良菌株。

本发明从云南省西双版纳州景洪市野生牛肝菌组织分离获得，对其进行了形态学、生理生化性质和ITS测序鉴定，将该菌株命名为：中华腐生牛肝菌Buchwaldoboletusxylophilus BU001，属牛肝菌目，牛肝菌科，腐生牛肝菌属，该菌株已于2021年5月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21959，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。

具体的，该菌株的ITS序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了所述的中华腐生牛肝菌BU001菌株的栽培方法，包括如下步骤：原种制作、栽培种制作和栽培出菇；所述原种制作是指将中华腐生牛肝菌母种接种到液体培养基或固体培养基中得到液体菌种或固体菌种。

具体的，得到所述液体菌种的操作如下：中华腐生牛肝菌母种转接到液体培养基中，置于140r/min的摇床上，27℃暗光培养6～8d，得到液体菌种。

进一步的，得到所述固体菌种的操作如下：中华腐生牛肝菌母种接入固体原种培养基中， 27℃，暗光培养45～55d，菌丝长满菌袋，得到固体原种。

其中，所述栽培种制作的操作如下：将所述的液体菌种或固体原种接入中华腐生牛肝菌栽培培养基中，26～28℃，暗光培养50～65d，菌丝长满菌袋，得到中华腐生牛肝菌栽培种。

具体的，所述栽培出菇的操作如下：将所述的中华腐生牛肝菌栽培种菌丝满袋后进行覆土，置于26～28℃的出菇房内，调整空气湿度60～90％，并给予200～900LX的散射光，诱导出菇，得到中华腐生牛肝菌子实体。

BU001菌株在PDA加富培养基上生长的菌落呈圆形或不规则形状，菌丝粗壮、浓密，呈黄白色；菌丝可在培养皿内快速萌发生长，有效加快了菌丝生长速度。

采用BU001菌株制作的液体菌种，菌丝球淡褐色，大小均匀，菌种呈淡黄色，发酵培养 6～8d即可制成。采用BU001菌株制作的栽培菌种，菌龄一致，菌丝浓密粗壮，抗杂性强，发菌快，出菇整齐、产量高，栽培周期短。子实体中等大小，菌盖黄褐色或褐色，菌盖边缘内卷；菌柄呈红褐色或褐色，菌柄基部可见浓密的黄色菌丝体；菌肉黄色或淡黄色，伤后迅速变蓝色；孢子卵球形或椭圆形，子实体有浓郁菌香味。

本发明的优点在于所提供的中华腐生牛肝菌BU001菌株，菌丝浓密粗壮、呈黄白色；其用于制作液体菌种，菌丝球黄褐色，大小均匀，发酵培养6～8d即可制成。用于制作栽培菌种，菌龄一致，菌丝金黄浓密，抗杂性强，出菇整齐、产量高，栽培周期短，有利于实现中华腐生牛肝菌大规模栽培生产。因此，中华腐生牛肝菌BU001菌株在中华腐生牛肝菌种质资源保护、开发利用和科学研究中具有重要的应用价值。

本发明的中华腐生牛肝菌菌株BU001，于2021年5月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21959，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。下面对本发明进行清楚、完整地描述。

实施例1中华腐生牛肝菌菌株分离及鉴定

从云南省西双版纳州景洪市野生牛肝菌组织分离获得，对其进行了形态学、生理生化性质和ITS测序鉴定，将该菌株命名为：中华腐生牛肝菌BU001，属牛肝菌目，牛肝菌科，腐生牛肝菌属。

中华腐生牛肝菌菌株BU001，于2021年5月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21959，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。

1.母种培养基制作：配制PDA加富培养基。

2.菌种分离：采集野生中华腐生牛肝菌子实体，清理菌盖表面、菌柄基部的枯枝、泥土、砂石等杂质。在无菌操作台内，将子实体切成两半，从菌盖与菌柄交界处切取3～5mm大小的菌肉组织，放入母种培养基中，25～30℃避光培养10～15d，得到中华腐生牛肝菌母种。

3.BU001菌株形态学鉴定

BU001菌株野外生境为腐烂的木屑锯末堆，其子实体中等大小，菌盖直径4～10cm，近半球形、凸镜形至平展，边缘内卷或下弯；菌盖呈黄褐色、红褐色，菌盖中央菌肉厚2.0～2.5cm，菌盖菌肉呈黄色，受后迅速变蓝色。菌柄中生，长6～9cm，直径2～5cm，近圆柱形，黄色至黄褐色，菌柄菌肉黄色，伤后变蓝色，菌柄基部有金黄色菌丝体。担孢子较小：4.5-5.5×3-4.5μm，卵球形或椭圆形。

云南省热带作物科学研究所联合海南医学院将BU001菌株的生长环境及其形态特征与国内外文献报道相比，发现BU001菌株与斯里兰卡报道并且保存的标本Buchwaldoboletus xylophilus的生态环境及形态特征十分相似[参考文献(1)Ortiz-Santana,B.,&Both,E.E.(2011). A preliminary survey of the genusBuchwaldoboletus(Boletales:Boletaceae).Bulletin of the Buffalo Society ofNatural Science.(2)Petch,T.(1922).Additions to Ceylon fungi II.Annals of theRoyal Botanic Gardens Peradeniya]。因此BU001菌株从形态学上被鉴定为Buchwaldoboletus xylophilus。

4.BU001菌株ITS测序鉴定

采用植物基因组提取试剂盒提取BU001菌株的基因组DNA并以其作为模板，以引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID No.1)和引物ITS5： 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’(SEQ ID No.2)为引物对，进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃预变性4min；94℃变性30S，50℃退火30S，72℃延伸2min，共35个循环； 72℃扩增后延伸7min。PCR扩增产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测后，用纯化试剂盒纯化回收DNA，扩增产物送往深圳华大基因进行测序。

BU001菌株的经过测序得到一段684bp的序列(SEQ ID No.3)：

TTATCGAATCTCTAGGAGAAACGTGAAGGGGGGAAGTCGAGCGGGCGAAGTTTGG TCGAGGTTGTCGCTGGCCCTTCGGGGCATGTTGCACGCCTTTGCCTTAGTCCTCGTTCTC TTTTCTCTTTTGCGTCGATCCGTTCTCTCACACACCTGTGCACCTGTTGTAGGTTTTCTCG AGAGAGGAAACCTATGTTTTTCATAAACACCTTTGTATGTCTATAGAATGTCTATGTTGAC GTCGACCACTGGGCGACGTTAAACAAAACTATGAACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTG GCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGATTTTC AGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCT GTTTGAGTGTCATTGAATTCTCAACCATGTCTTGATGTCGTCGAGCGCATGGCTTGGATG TGGGGGTTGCTGGCGGCGCGAGCTGTCGGCTCTCCTTAAATGCATTAGCAAAGGGCGAG CCTTTCGTGCACGGCCTTCGACGTGATAATGATCGTCGTGGCTGGAGCGGAAGGCATGA ATCGTCGTTGCTTCTAATCTCTGATCCTTTTGGGATCGCTTTCGAAACTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCAT

将该序列已提交GeneBank，序列号为：MW783439。采用BLAST进行同源性搜索，与数据库中各菌株序列进行相似性比对；将该菌株鉴定为Buchwaldoboletus xylophilus。

实施例2中华腐生牛肝菌BU001菌株栽培

1.中华腐生牛肝菌原种制作

(1)液体菌种：将中华腐生牛肝菌BU001母种转接到液体培养基中，置于140r/min，27℃摇床上暗光培养6～8d，得到液体菌种。

(2)固体原种：将中华腐生牛肝菌BU001母种接入固体原种培养基中，27℃，暗光培养45～55d，菌丝长满菌袋，得到固体原种。

2.中华腐生牛肝菌栽培种制作

将上述液体菌种或固体原种接入中华腐生牛肝菌栽培培养基中，26～28℃，暗光培养 50～65d，菌丝长满菌袋，得到栽培种。

3.栽培出菇

菌丝满袋后的栽培种进行覆土，置于26～28℃，的出菇房内，调整空气湿度60～90％，并给予200～900LX的散射光，诱导出菇；子实体发育成熟及时采收。

对比例1

该发明提供的中华腐生牛肝菌BU001菌株(保藏编号为：CGMCC No：21959)与其他中华腐生牛肝菌菌株(即BU002、BU003、BU004；这三个菌株保藏在云南省热带作物科学研究所植物保护与微生物利用研究中心)进行栽培菌种制作及栽培出菇比较，结果(表1)显示： BU001菌株长势最佳，其菌丝浓密、粗壮，菌丝生长速度达到8.43mm/d，平均54d可长满菌袋；抗杂性强，污染率低，平均鲜菇产量达到114.81g/袋。

表1.BU001菌株及其他菌株菌丝生长情况及产量

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 云南省热带作物科学研究所

海南医学院

<120> 一株中华腐生牛肝菌菌株

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<400> 1

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<400> 2

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

<210> 3

<211> 684

<212> DNA

<213> artificial

<400> 3

ttatcgaatc tctaggagaa acgtgaaggg gggaagtcga gcgggcgaag tttggtcgag 60

gttgtcgctg gcccttcggg gcatgttgca cgcctttgcc ttagtcctcg ttctcttttc 120

tcttttgcgt cgatccgttc tctcacacac ctgtgcacct gttgtaggtt ttctcgagag 180

aggaaaccta tgtttttcat aaacaccttt gtatgtctat agaatgtcta tgttgacgtc 240

gaccactggg cgacgttaaa caaaactatg aacaactttc agcaacggat ctcttggctc 300

tcgcatcgat gaagaacgca gcgaattgcg ataagtaatg tgaattgcag attttcagtg 360

aatcatcgaa tctttgaacg caccttgcgc tccttggtat tccgaggagc atgcctgttt 420

gagtgtcatt gaattctcaa ccatgtcttg atgtcgtcga gcgcatggct tggatgtggg 480

ggttgctggc ggcgcgagct gtcggctctc cttaaatgca ttagcaaagg gcgagccttt 540

cgtgcacggc cttcgacgtg ataatgatcg tcgtggctgg agcggaaggc atgaatcgtc 600

gttgcttcta atctctgatc cttttgggat cgctttcgaa acttgacctc aaatcaggta 660

ggactacccg ctgaacttaa gcat 684

Claims

1.一株中华腐生牛肝菌（Buchwaldoboletus xylophilus ）BU001菌株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21959；

该菌株的ITS序列如SEQ ID No.3所示。

2.权利要求1所述的中华腐生牛肝菌BU001菌株的栽培方法，其特征在于，包括如下步骤：原种制作、栽培种制作和栽培出菇；所述原种制作是指将中华腐生牛肝菌母种接种到液体培养基或固体培养基中得到液体菌种或固体菌种。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，得到所述液体菌种的操作如下：中华腐生牛肝菌母种转接到液体培养基中，置于140r/min的摇床上，27℃暗光培养6~8d，得到液体菌种。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，得到所述固体菌种的操作如下：中华腐生牛肝菌母种接入固体原种培养基中，27℃，暗光培养45~55d，菌丝长满菌袋，得到固体原种。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述栽培种制作的操作如下：将所述的液体菌种或固体原种接入中华腐生牛肝菌栽培培养基中，26~28℃，暗光培养50~65d，菌丝长满菌袋，得到中华腐生牛肝菌栽培种。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述栽培出菇的操作如下：将所述的中华腐生牛肝菌栽培种菌丝满袋后进行覆土，置于26~28℃的出菇房内，调整空气湿度60~90%，并给予200~900LX的散射光，诱导出菇，得到中华腐生牛肝菌子实体。