CN114540203B

CN114540203B - 一种具有侵染幼蚕功能的球孢白僵菌、菌剂及其应用和白僵蚕的制备方法

Info

Publication number: CN114540203B
Application number: CN202210159358.3A
Authority: CN
Inventors: 杨宁; 王晓闻; 张向博; 李维宏
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2022-02-22
Filing date: 2022-02-22
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2042-02-22
Also published as: CN114540203A

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种具有侵染幼蚕功能的球孢白僵菌、菌剂及其应用和白僵蚕的制备方法。本发明提供的球孢白僵菌包括球孢白僵菌(Beauveriabassiana)UMCM2；本发明所述菌株对幼蚕具备较高的致病力，同时具有高僵化率、高产孢量的优势，在白僵蚕的生产和研究中具有广泛的应用前景。

Description

一种具有侵染幼蚕功能的球孢白僵菌、菌剂及其应用和白僵蚕的制备方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种具有侵染幼蚕功能的球孢白僵菌、菌剂及其应用和白僵蚕的制备方法。

背景技术

白僵蚕是蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori L.幼虫(蛹)被真菌门半知菌纲的球孢白僵菌Beauveria bassiana(Bals.)Vuill.感染或人工接种而感染致死的家蚕干燥虫(蛹)体，是我国传统中药，有着2000年以上的用药历史。白僵蚕性平，味咸、辛。具有熄风解痉、活血通络、化痰散结等功效，在临床上可用于多种疾病的治疗。

目前，白僵蚕主要来源于收集养蚕过程中的僵死病蚕，然而，随着蚕病防治技术的发展，家蚕僵病的发生得到有效控制，造成白僵蚕来源限制，原料紧缺，市场价格不断上扬，经济效益非常显著。同时，从生产中收集的白僵蚕存在良莠不齐的现象，质量难以保证。尽管现有技术中存在少量人工培养白僵蚕的技术手段，但是由于白僵蚕是菌虫复合体，不同的菌种对白僵蚕的产量和质量产生影响，且现有的菌种对于白僵蚕的质量和产量均存在一定程度上的制约。

发明内容

基于上述技术问题，本发明的目的为提供一种具有侵染幼蚕功能的球孢白僵菌、菌剂及其应用和白僵蚕的制备方法，本发明所述菌株能够有效侵染幼蚕，具有高僵化率、高产孢量的优势。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种具有侵染幼蚕功能的球孢白僵菌，所述球孢白僵菌包括球孢白僵菌(Beauveria bassiana)UMCM2；

所述球孢白僵菌UMCM2的保藏编号为CGMCC No.23270。

本发明还提供了一种侵染幼蚕的菌剂，所述菌剂的有效成分包括上述技术方案中所述的球孢白僵菌UMCM2。

优选的，所述菌剂中的球孢白僵菌UMCM2的活菌数为1×10⁷个/mL。

优选的，所述菌剂还包括表面活性剂。

本发明还提供了上述技术方案所述的球孢白僵菌或菌剂在制备白僵蚕中的应用。

本发明还提供了一种白僵蚕的制备方法，将上述技术方案中所述的菌剂喷施于蚕体背部，得到所述白僵蚕。

优选的，所述蚕体包括幼蚕。

本发明还提供了一种白僵蚕成品，所述白僵蚕成品的单体长为4.3～4.8cm、单条质量为0.87～1.15g、水分含量为10.70wt.％、总灰分含量为4.20wt.％、酸不溶性灰分含量为0.11wt.％、醇溶性浸出物含量为30.5wt.％、霉毒素B₁含量＜0.50μg·kg^-1和黄曲霉毒素含量＜2.0％。

本发明还提供了上述技术方案中所述白僵蚕成品的制备方法，将上述技术方案制备得到的白僵蚕干燥至水分小于10％，得到所述白僵蚕成品。

优选的，所述干燥温度为45℃，干燥时间为28h。

有益效果：

本发明提供了一种具有侵染幼蚕功能的球孢白僵菌，包括球孢白僵菌(Beauveriabassiana)UMCM2，所述的球孢白僵菌UMCM2由球孢白僵菌Bb1003诱变得到，且两株球孢白僵菌均已完成生物保藏。本发明所述球孢白僵菌UMCM2相较于球孢白僵菌Bb1003具有更优的致病力，能够达到97.64％，同时具有高僵化率、高产孢量的优势，其产孢量达到15.19×10⁷个/mL。因此，本发明所述菌株在白僵蚕的生产和研究中具有广泛的应用前景。

生物保藏信息

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bb1003，于2021年9月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.23269。

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)UMCM2，于2021年09月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.23270。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为球孢白僵菌Bb1003的菌落结构、分生孢子梗和分生孢子结构，其中1A为菌落结构，1B为分生孢子梗结构，1C为分生孢子结构；

图2为基于ITS基因序列构建的系统发育树；

图3-A为诱变得到球孢白僵菌UMCM1的菌落形态；

图3-B为诱变得到球孢白僵菌UMCM2的菌落形态；

图3-C为诱变得到球孢白僵菌UMCM3的菌落形态；

图3-D为诱变得到球孢白僵菌UMCM4的菌落形态；

图3-E为诱变得到球孢白僵菌UMCM5的菌落形态；

图3-F为诱变得到球孢白僵菌UMCM6的菌落形态；

图4为白僵蚕成品的外观图；

图5为白僵蚕成品的横截面图；

图6为实施例5中白僵蚕成品与市售僵蚕成品的外观比较图，中间为实施例5制备得到的白僵蚕。

具体实施方式

本发明提供了一种具有侵染幼蚕功能的球孢白僵菌，所述球孢白僵菌包括球孢白僵菌(Beauveria bassiana)UMCM2，所述的球孢白僵菌UMCM2由球孢白僵菌Bb1003诱变得到；所述球孢白僵菌Bb1003的保藏编号为CGMCC No.23269；所述球孢白僵菌UMCM2的保藏编号为CGMCC No.23270。

在本发明中，所述球孢白僵菌Bb1003分离自山西省晋城市阳城县次营镇桑蚕养殖农户发现僵虫。在本发明中，所述球孢白僵菌Bb1003的ITS序列优选如SEQ ID No.1所示：

ATTCGAGGTCACGTTCAGAAGTTGGGTGTTTTACGGCGTGGCCGCGTCGGGGTCCCGGTGCGAGCTGTATTACTGCGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTCCATTTCAGGGCCGGCGGTGTGCTGCCGGTCCCCAACGCCGACCTCCCCAAGGGGAGGTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGGATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCGTTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTGCCTTGCGGCGTATTCAGAAGATGCTGGAATACAAGAGTTTGAGGTCCCCGGCGGGCCGCTGGTCCAGTCCGCGTCCGGGCTGGGGCGAGTCCGCCGAAGCAACGATAGGTAGGTCACA。该菌株与NCBI数据库中的Beauveria bassiana NR111594.1菌株的相似性为100％；系统发育树可知该菌株与数据库中其他球孢白僵菌株为一大支，说明该菌株与数据库中的球孢白僵菌菌株具有较高的相似性。

本发明所述的球孢白僵菌Bb1003的菌落形态为：该菌落正面为白色粉状，呈短绒毛状凸起，后自菌落中心形成白色的孢子层(图1中1A)。且孢子层在培养后期逐渐变厚，显微镜观察发现，产孢细胞单生，很少簇生；产孢轴纤细，膝状弯曲，具小齿突(图1中1B)。分生孢子透明、光滑、椭圆形(图1中1C)。所述菌株对幼蚕具备较高的致病力，能够达到85.17％，产孢量为6.12×10⁷个/mL。

在本发明中，所述球孢白僵菌UMCM2优选由球孢白僵菌Bb1003诱变并筛选得到。本发明所述的球孢白僵菌UMCM2具有高僵化率、高产孢量的优势，产孢量为15.19×10⁷个/mL，致病力能够达到97.64％。

本发明所述球孢白僵菌UMCM2的筛选方法优选包括：

将复壮的球孢白僵菌Bb1003进行紫外诱变和微波诱变，得复合诱变处理的白僵菌；

将所述的复合诱变处理的白僵菌接种于产孢培养基培养后进行复筛，得所述球孢白僵菌UMCM2。

本发明所述紫外诱变的时间优选为30min；所述紫外诱变时，紫外灯功率优选为15W，照射距离优选为28cm；所述紫外诱变时紫外线的波长优选为254nm。本发明所述微波诱变的时间为60s；所述微波诱变时，功率为800W，微波频率为2450MHz。

得到复合诱变处理的白僵菌后，本发明将所述的复合诱变处理的白僵菌接种于产孢培养基培养后进行复筛，得所述球孢白僵菌UMCM2。

本发明所述产孢培养基优选包括以下浓度的组分：蔗糖15g/L、酵母粉5g/L、蛋白胨2g/L、蚕蛹粉3g/L、米粉2.5g/L、玉米粉2.5g/L、乳糖3g/L、棉仁粉1g/L、硼酸0.1g/L、硫酸镁1g/L、硫酸铜0.05g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸锌0.05g/L、硫酸亚铁0.05g/L、硫酸锰0.02g/L和琼脂12g/L。本发明所述培养包括初培养和纯化培养；所述初培养时的接种量优选为0.1mL/皿或0.1mL/平板；所述初培养时，每个皿中培养基的用量优选为15mL，每个平板中的培养基的用量优选为15mL；纯化培养时的接种量优选为0.1mL/皿或0.1mL/平板；所述纯化培养时，每个皿中培养基的用量优选为15mL，每个平板中的培养基的用量优选为15mL；所述初培养和纯化培养的培养温度均优选为26±1℃，均优选为暗培养；相对湿度优选为75±5wt.％；所述初培养的培养时间优选为5d；所述纯化培养的培养时间优选为10d。

在本发明中，所述球孢白僵菌UMCM2的菌落形态为：菌株正面为乳白色，之后变为浅黄色，菌落呈现出平绒状，菌落厚且生长均匀。通过显微镜观察菌株，可以看到分生孢子梗着生于营养菌丝，分生孢子在分生孢子梗上簇生，分生孢子为球形或近球形。

本发明还提供了一种侵染幼蚕的菌剂，所述菌剂的有效成分包括上述技术方案中所述的球孢白僵菌UMCM2。本发明所述的球孢白僵菌UMCM2的活菌数优选为1×10⁷个/mL。本发明所述的菌剂优选还包括表面活性剂，所述表面活性剂优选包括烷基酚聚氧乙烯醚类、脂肪醇聚氧乙烯醚类、木质素磺酸盐表面活性剂、有机硅表面活性剂或吐温-80，更优选包括吐温-80；所述菌剂中表面活性剂的体积百分含量优选为0.0075％～0.1％，更优选为0.1％。

本发明所述球孢白僵菌UMCM2能够有效侵染幼蚕，而且上述菌株均属于微生物，具有高产孢的优势。因此，本发明所述球孢白僵菌UMCM2或含有所述球孢白僵菌UMCM2的菌剂能够用于侵染幼蚕。

本发明还提供了上述技术方案所述的球孢白僵菌UMCM2或菌剂在制备白僵蚕中的应用。采用本发明所述球孢白僵菌UMCM2或菌剂的侵染致死率能够达到97.64％，产孢量达到15.19×10⁷个/mL。

本发明还提供了一种白僵蚕的制备方法，包括如下制备步骤：将上述技术方案中所述的菌剂喷施于蚕体背部，得到所述白僵蚕。本发明将所述菌剂喷施于蚕体背部，得到死亡蚕体。得到所述死亡蚕体后，本发明优选将所述死亡蚕体转移至蚕座上，培养至蚕体僵化，长出白色菌丝分生孢子，得到所述白僵蚕。本发明所述培养的温度优选为24～28℃，更优选为25℃；所述培养的湿度为90～98％，更优选为96％。本发明所述的蚕体优选包括幼蚕，进一步优选包括5龄幼蚕。本发明所述蚕体的品种优选为秋丰白玉。

本发明还提供了上述技术方案中所述白僵蚕成品的制备方法，将上述技术方案制备得到的白僵蚕干燥至水分小于10％，得到所述白僵蚕成品。本发明所述干燥温度优选为45℃；所述干燥时间优选为28h。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

球孢白僵菌Bb1003的分离鉴定

供试白僵蚕源：2021年6月3日在山西省晋城市阳城县次营镇桑蚕养殖农户中发现本次实验僵蚕。幼蚕为秋丰白玉，喂养至5龄幼蚕，进行试验，培养幼蚕的温度为26℃±1℃，相对湿度为60wt.％～70wt.％，光周期16L:8D(光照时间为16h，黑暗时间为8h)，得5龄幼蚕。

培养基为产孢培养基配方为：蔗糖15g，酵母粉5g，蛋白胨2g，蚕蛹粉3g，米粉2.5g，玉米粉2.5g，乳糖3g，棉仁粉1g，硼酸0.1g，硫酸镁1g，硫酸铜0.05g，磷酸二氢钾2g，硫酸锌0.05g，硫酸亚铁0.05g，硫酸锰0.02g，琼脂12g，加水至1000mL；

菌株的分离纯化：

在超净工作台将上述幼蚕僵虫用无菌钵杵在无菌研钵中研磨，充分研磨后，得到粉碎虫体；在粉碎虫体中加入1mL无菌水(该无菌水中含有体积百分含量为1％的吐温-80)继续充分研磨，使用移液枪将虫体浸泡液吸入10mL具塞刻度试管中，之后再在粉碎虫体加入1mL无菌水(该无菌水中含有体积百分含量为1％的吐温-80)继续充分研磨，使用移液枪将虫体浸泡液吸入10mL具塞刻度试管中，反复10次，得到10mL虫体浸泡液；将10mL虫体浸泡液充分摇匀后虫体浸泡液吸出1mL放入9mL无菌水(该无菌水中含有体积百分含量为1％的吐温-80)充分摇匀，得到稀释后的虫体浸泡液，之后将稀释后的虫体浸泡液吸出1mL放入9mL无菌水(该无菌水中含有体积百分含量为1％的吐温-80)充分摇匀，重复7次，后进行稀释。

将稀释10⁵、10⁶、10⁷、10⁸倍虫体浸泡液稀释液分别接种于15mL产孢培养基，虫体浸泡液稀释液的接种量为0.1mL，于26±1℃，全黑暗，相对湿度75±5wt.％的恒温培养箱中培养。培养5d后，挑取稀释10⁸倍虫体浸泡液中少量孢子(挑选标准为平板没有其他杂菌落，菌落未相连，为单孢子菌落)至新的产孢培养基26±1℃纯化培养15d，平板上长出的菌落形态特征一致，将该菌编号为Bb1003，即分离纯化的Bb1003。

菌株培养形态观察：

将分离纯化的Bb1003接种在产孢培养基平板于温度为26±1℃、全黑暗、相对湿度为75±5wt.％的恒温培养箱中培养；5d后挑取菌丝在光学显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗形态；10d后挑取成熟分生孢子观察分生孢子的形态与大小，观察结果如图1所示：在产孢培养基上培养基上该菌落正面为白色粉状，呈短绒毛状凸起，后自菌落中心形成白色的孢子层(图1中1A)。且孢子层在培养后期逐渐变厚。显微镜观察发现，产孢细胞单生，很少簇生；产孢轴纤细，膝状弯曲，具小齿突(图1中1B)；分生孢子透明、光滑、椭圆形(图1中1C)。

菌株分子生物学鉴定：

提取分离纯化的Bb1003的DNA，提取方法为：取20mg干燥的分离纯化的Bb1003菌株的菌体用液氮研磨成粉末，加入1.5mL离心管中，之后加入200μL Buffer Digestion和2μLβ-巯基乙醇，再加入20μL Proteinase K溶液，震荡混匀；56℃水浴1h至细胞完全裂解；之后加入100μLBufferPF，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min；然后室温10,000rpm离心5min，将所得上清转移到新的1.5mL离心管中，加入200μLBufferBD，充分颠倒混匀后，加入200μL的无水乙醇，充分颠倒混匀，得到混合液。

将吸附柱放入收集管中，用移液器将上述所得混合液全部加入吸附柱中，静置2min，再10,000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱放回收集管，加入500μLPw Solution，10,000rpm离心30s倒掉收集管中的废液，然后将吸附柱放回收集管，加入500μLWash Solution，10,000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。之后将吸附柱重新放回收集管中，于12,000rpm室温离心2min，离去残留的Wash Solution后，取出吸附柱，放入一个新的1.5mL离心管中，加入50μLTE Buffer静置3min，12,000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。

25μL反应体系包括：1μL模板DNA，7μLTaq Plus DNAPolymerase(5U/μL)，0.5μL50mM MgSO₄，2.5μL 10×PCR Buffer，2.5μL dNTP(each 10mM)，引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，SEQ ID No.2)/ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，SEQ IDNo.3)各1μL(20μmol/L)，ddH₂O 9.5μL。

反应条件：95℃变性5min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸90s；进行30个循环，72℃修复延伸10min。

用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收后，委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，

去除分离菌株rDNA-ITS序列两端质量不好的序列，该菌株的ITS序列为SQE IDNo.1所示将其与NCBI数据库进行BLAST比较，结果发现该菌株与NCBI数据库中的Beauveriabassiana NR111594.1菌株的相似性为100％。

制作系统发育树，如图2所示，分析结果表明：该菌株与数据库中其他球孢白僵菌株聚为一大支，说明该菌株与数据库中的球孢白僵菌菌株具有较高的相似性。综合形态特征鉴定和ITS序列相似性分析，将该菌株命名为球孢白僵菌Bb1003。

实施例2

球孢白僵菌Bb1003侵染最佳浓度确定

将球孢白僵菌Bb1003用体积百分含量为1％吐温-80分别配成浓度为1×10⁵个·mL^-1、1×10⁶个·mL^-1、1×10⁷个·mL^-1、1×10⁸个·mL^-1、1×10⁹个·mL^-1孢子悬浮液，采用超低量喷雾喷壶将上述不同浓度的孢子悬浮液分别喷至个体长度和活性相似的5龄幼蚕背部，置于26±1℃，湿度为90wt.％的培养实验室培养，每天喂食三次，饲喂足量桑叶。每个浓度处理500头幼虫，每个浓度重复3次，持续观察7d，每天记录幼虫僵化数，根据僵化率确定侵染的最佳浓度。

接种后不同浓度球孢白僵菌Bb1003的孢子悬浮液对5龄幼蚕的僵化率见表1。

表1不同浓度球孢白僵菌Bb1003的孢子悬浮液对5龄幼蚕的僵化率

由表1记载的可知，不同浓度球孢白僵菌Bb1003的孢子悬浮液对5龄幼蚕的僵化率有所不同，1×10⁵个/mL～1×10⁷个/mL幼蚕僵化率随着孢子浓度的增大而增大，1×10⁷个/mL～1×10⁹个/mL幼蚕僵化率随着孢子浓度的增大而减小。对5龄幼蚕有较好致病作用的孢子悬浮液为1×10⁷个/mL，因此，选用浓度为1×10⁷个/mL的孢子悬浮液作为侵染菌剂。

实施例3

球孢白僵菌复合诱变突变株的筛选及诱变效应的测定实验

培养基为产孢培养基；培养基的组分与实施例1相同。

将由实施例1中分离纯化的球孢白僵菌Bb1003扩繁(用含体积百分含量为1％吐温-80的无菌水把球孢白僵菌Bb1003配成1×10⁷mL^-1孢子悬液，取制备好的悬液1mL于产孢培养基内，用涂布棒涂均匀，培养温度为于26±1℃，全黑暗，相对湿度75±5wt.％的恒温培养箱中培养，培养10d)，得扩繁菌液；取三份扩繁菌液，均配成浓度为1×10⁷个mL^-1孢子悬浮液分别进行紫外诱变和微波诱变诱变来确定最佳诱变时间。

紫外诱变最佳时间确定：

取制备好的浓度为1×10⁷个mL^-1孢子悬浮液5mL于无菌培养皿内，并加入无菌的磁力搅拌子进行紫外照射(紫外灯功率为15W，照射距离为28cm，波长为254nm)不同时间(5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min)，将经过紫外线诱变处理的白僵菌孢子悬浮液进行稀释500000倍后接种于15mL产孢培养基上，使每皿大约有20个孢子，将培养皿在26±1℃恒温培养箱内培养10d，扩繁菌液稀释后未诱变前的稀释菌液为对照组。通过致死率及正突变率筛选出紫外诱变的最优时间，检测结果见表2。

表2紫外诱变的致死率及正突变率

照射时间(min)	5	10	20	30	40	50	60
								致死率(％)	40.67	53.49	76.97	85.34	96.41	97.31	98.86
正突变率(％)	0	2.16	7.64	18.73	0	0	0

其中，正突变率＝正突变的菌株/总菌株个数×100％(产孢量超过诱变前菌株1倍为正突变的菌落)，下述相同，不再赘述。

由表2记载的可知，球孢白僵菌Bb1003致死率随紫外照射时间增加而上升，紫外线照射时间与正突变率呈先上升后下降；其中正突变率最高的时间为紫外照射30min，正突变率为18.73％。

微波诱变最佳时间确定：

取制备好的浓度为1×10⁷个·mL^-1孢子悬浮液10mL于培养皿内，放入家用微波炉(功率为800W，微波频率2450MHz)辐射10s后冰上快速冷却10s再辐射，辐射时间累计分别10、20、30、40、50、60、70、80、90、100s，将经过紫外线诱变处理的白僵菌孢子悬浮液进行稀释500000倍后接种于15mL产孢培养基上，使每皿大约有20个孢子，然后将培养皿经黑布包裹后在26±1℃恒温培养箱内培养10d，将没有进行微波诱变处理的孢子悬浮液作为对照。通过致死率及正突变率筛选出微波诱变的最优时间，检测结果见表3。

表3微波诱变的致死率及正突变率

由表3记载的可知，球孢白僵菌致死率随微波时间增加而上升，正突变率呈先上升后下降，其中正突变率最高的时间为微波60s为17.15％。

复合诱变：

将由实施例1中分离纯化的球孢白僵菌Bb1003扩繁(用含体积百分含量为1％吐温-80的无菌水把球孢白僵菌Bb1003配成1×10⁷mL^-1孢子悬液，取制备好的孢子悬液1mL于产孢培养基内，用涂布棒涂均匀，培养温度为于26±1℃，全黑暗，相对湿度75±5wt.％的恒温培养箱中培养，培养10d)后取三份，均配成浓度为1×10⁷个mL^-1孢子悬浮液进行紫外微波复合诱变。

紫外微波复合诱变的具体方法：取制备好的浓度为1×10⁷个·mL^-1孢子悬浮液10mL，以紫外诱变和微波诱变的最佳诱变时间对菌悬浮液进行紫外微波复合诱变，即紫外照射(紫外灯功率为15W，照射距离为28cm，波长为254nm)40min后，立即用家用微波炉(功率为800W，微波频率2450MHz)辐射10s后冰上快速冷却10s再辐射70s，得球孢白僵菌UMCM1、球孢白僵菌UMCM2、球孢白僵菌UMCM3、球孢白僵菌UMCM4、球孢白僵菌UMCM5和球孢白僵菌UMCM6；

上述不同的孢白僵菌可放于本试验室4℃保存，备用。

对上述孢白僵菌的菌落形态进行观察，外观用肉眼观察，孢子和分生孢子梗用显微镜的高倍镜观察，部分菌株的菌落形态如图3-A～图3-F所示，对比差别不明显。

将上述经过复合诱变处理的白僵菌孢子悬浮液分别进行稀释500000倍后分别接种于15mL产孢培养基上，使每皿大约有20个孢子，然后将培养皿经黑布包裹后在26±1℃恒温培养箱内培养10d，将没有进行诱变处理的孢子悬浮液作为对照，比较诱变菌株在产孢量和致病力等方面的变异性，以筛选获得在生长特性或对幼蚕致病能力有显著提高的突变体。

以诱变前菌株作为对照，以产孢量超过诱变前菌株1倍以上的突变菌株作为正向突变菌株，计算正突变得突变率，计算结果见表4。

表4致死率和正突变得突变率

复合诱变方式	紫外微波复合诱变
		致死率(％)	95.41
正突变率(％)	24.64

由表4记载的可知，紫外微波复合诱变致死率为95.41％，正突变率为24.64％。

产孢量测定：用直径为6mm的打孔器切菌落3块于5mL含0.5‰吐温-80的溶液(即该溶液为体积百分含量为含0.5‰吐温-80)中，充分震荡后在显微镜下用血球计数板计数，以诱变前菌株(球孢白僵菌Bb1003)作为对照，计算产孢量，每个处理重复3次重复。检测结果见表5。

表5不同处理的得到的球孢白僵菌菌株的产孢量(10⁷个·mL^-1)

供试菌株	产孢量
		UMCM1	13.38
UMCM2	15.19
		UMCM3	14.26
UMCM4	13.06
		UMCM5	13.95
UMCM6	13.56
		对照	6.12

由表5记载的可知，经复合诱变后的菌株出现了不同趋向、不同幅度的变异。其中正向突变的菌株共有6株，产孢量最高的菌株为球孢白僵菌UMCM2，产孢量为15.19×10⁷个/mL。

实施例4

球孢白僵菌诱变复合株对幼蚕(Spodoptera frugiperda)幼虫的致病力测定

幼蚕5龄幼虫为供试材料，选择健康、大小基本一致的幼虫用于生物测定试验。

将实施例3中正突变的6株球孢白僵菌孢子分别稀释至1×10⁷个·mL^-1浓度的孢子悬浮液，以诱变之前菌株(球孢白僵菌Bb1003)对照。采用超低量喷雾喷壶喷至5龄幼蚕背部对幼蚕进行侵染，每个处理500头幼虫，每个处理重复3次，喷施量为只要背面可见小水滴即可；每天记录幼虫僵化数，共记录7d，根据僵化率筛选出高毒力菌株，结果见表6。

表6不同球孢白僵菌对幼蚕幼虫的僵化率

供试菌株	UMCM1	UMCM2	UMCM3	UMCM4	UMCM5	UMCM6	对照
								僵化率(％)	90.36	97.64	91.42	95.67	89.28	91.74	85.17

由表6记载的可知，接种后各球孢白僵菌诱变复合株对5龄幼蚕的致病力有所不同。第3天幼蚕开始死亡，球孢白僵菌UMCM2突变体的致病力比原始菌株有显著提高，在致死速度上快于原始菌株，说明球孢白僵菌UMCM2突变体对幼蚕幼虫具有较高的僵化率。

实施例5

将实施例4中死亡的蚕体转移到蚕座上，在温度为25℃和湿度为96％的条件下继续培养，直至长出白色菌丝分生孢子，将长出白色菌丝分生孢子的白僵蚕收集后干燥至水分小于10％，干燥的温度45℃，干燥时间为28h，得到白僵蚕成品。

对试的僵蚕成品，统计其单条体长及质量，并观察其横截面质地和色泽，如图4和图5所示，市售僵蚕与本发明中白僵蚕成品外观比较见图6，按照2020年版《中华人民共和国药典》的方法取样测定水分、总灰分、酸不溶性灰分、醇溶性灰分、黄曲霉毒素等各项指标，结果见表7。

表7实施例5中成品僵蚕的主要成分

由表7可以看出，采用本发明球孢白僵菌侵染得到的白僵蚕大小整齐，个大质优，品相佳，截面丝腺环清晰，且其所包含的成分均能够达到药典的标准。

由上述实施例记载的可知，本发明球孢白僵菌能够有效侵染蚕体，并得到品质优良的白僵蚕。而且本发明所述球孢白僵菌USCM2和球孢白僵菌Bb1003均能够使蚕体僵化，且球孢白僵菌USCM2较Bb1003能够更有效侵染蚕体，经过球孢白僵菌USCM2的蚕体的僵化率和产孢量都更高，分别可以达到97.68％和15.19×10⁷个/mL。因此，所述球孢白僵菌USCM2在白僵蚕的生产和研究中具有广泛的应用前景。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 山西农业大学

<120> 一种具有侵染幼蚕功能的球孢白僵菌、菌剂及其应用和白僵蚕的制备方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 465

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attcgaggtc acgttcagaa gttgggtgtt ttacggcgtg gccgcgtcgg ggtcccggtg 60

cgagctgtat tactgcgcag aggtcgccgc ggacgggccg ccactccatt tcagggccgg 120

cggtgtgctg ccggtcccca acgccgacct ccccaagggg aggtcgaggg ttgaaatgac 180

gctcgaacag gcatgcccgc cagaatgctg gcgggcgcaa tgtgcgttca aagattcgat 240

gattcactgg attctgcaat tcacattact tatcgcgttt cgctgcgttc ttcatcgatg 300

ccagagccaa gagatccgtt gttgaaagtt ttgattcatt tgttttgcct tgcggcgtat 360

tcagaagatg ctggaataca agagtttgag gtccccggcg ggccgctggt ccagtccgcg 420

tccgggctgg ggcgagtccg ccgaagcaac gataggtagg tcaca 465

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1.一株具有侵染幼蚕功能的球孢白僵菌（Beauveria bassiana），其特征在于，所述球孢白僵菌为球孢白僵菌UMCM2；

所述球孢白僵菌UMCM2的保藏编号为CGMCC No.23270。

2.一种侵染幼蚕的菌剂，其特征在于，所述菌剂的有效成分包括权利要求1中所述的球孢白僵菌UMCM2。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中的球孢白僵菌UMCM2的活菌数为1×10⁷个/mL。

4.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂还包括表面活性剂。

5.权利要求1所述的球孢白僵菌或权利要求2~4任一项所述的菌剂在制备白僵蚕中的应用。

6.一种白僵蚕的制备方法，其特征在于，将权利要求2~4任一项所述的菌剂喷施于蚕体背部，得到所述白僵蚕。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述蚕体包括幼蚕。

8.一种白僵蚕成品，其特征在于，将权利要求6或7所述制备方法制备得到的白僵蚕干燥至水分小于10%，得到所述白僵蚕成品；

所述白僵蚕成品的单体长为4.3~4.8cm、单条质量为0.87~1.15g、水分含量为10.70wt.%、总灰分含量为4.20wt.%、酸不溶性灰分含量为0.11wt.%、醇溶性浸出物含量为30.5wt.%、黄曲霉毒素B₁含量＜0.50μg·kg^-1和黄曲霉毒素含量＜2.0%。

9.权利要求8所述白僵蚕成品的制备方法，其特征在于，将权利要求6或7所述制备方法制备得到的白僵蚕干燥至水分小于10%，得到所述白僵蚕成品。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述干燥的温度为45℃，干燥的时间为28h。