CN112342169A - 一株高地芽孢杆菌及其在防控雪茄发酵霉变中应用 - Google Patents

一株高地芽孢杆菌及其在防控雪茄发酵霉变中应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高地芽孢杆菌及其在防控雪茄发酵霉变中应用。本发明公开的高地芽孢杆菌为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC‑9，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.20884，该菌株可抑制真菌的生长，还可减少烟叶霉变，将该菌株与贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)ACCC02735组合在一起可以提高雪茄发酵外观品质。说明，本发明的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC‑9以及菌株组合可用于提高烟叶发酵过程中的品质。

Description

一株高地芽孢杆菌及其在防控雪茄发酵霉变中应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，一株高地芽孢杆菌及其在防控雪茄发酵霉变中应用。
背景技术
烟叶中微生物种类和数量繁多，基本可分为有益微生物和有害微生物两类，雪茄烟叶发酵过程中经过有益微生物、生物酶和化学元素的共同催化作用，可以使烟叶内在香气质量得以充分的显现和发挥，提高烟叶的使用价值，但真菌繁殖可导致烟叶利用率降低，破坏烟叶的物理性状，使烟叶失去弹性后易破损，且产生霉味，失去使用价值。
调制和发酵是雪茄烟叶质量形成的关键环节，并且发酵是为了弥补雪茄栽培、采收及晾制上的不足，是获得优质雪茄烟叶的关键。雪茄烟叶发酵是指在一定的温度和湿度等条件下，促使烟叶理化特性和其微生物种群发生变化，引起烟叶香气和内在品质明显改善的加工过程。发酵可以使烟叶产生独特的雪茄风味和芳香，并使烟叶色泽加深、颜色均匀一致，光泽油润均匀，弹性和燃烧性增强，同时减少雪茄烟气中的刺激性气味和辣、苦涩等不良感觉，改善烟叶品质。雪茄烟叶发酵过程中经过微生物、生物酶和化学元素的共同催化作用，可以使烟叶内在香气质量得以充分的显现和发挥，提高烟叶的使用价值。烟叶发酵分为自然陈化和人工发酵两种方式,自然陈化是提高烟叶香气的传统方法,具有人工发酵不可替代的优势，但是自然陈化烟叶贮存周期长,占用仓库面积大,生产成本高,国内烟草企业较难承受如此大的经济压力,因此多数制造商仍愿意采用人工发酵法处理烟叶。
Reid等人在1944年发现烤烟烟叶中的细菌种类主要为巨大芽孢杆菌，霉菌以青霉和曲霉为主。韩锦峰等认为芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌是发酵烤烟的优势种群，并没有酵母菌存在。王革等于2003年在国内首次报道，从自然发酵的烟叶上分离出了酵母菌，并指出酵母菌、光合细菌、固氮菌和生香产酸细菌也是烟叶发酵过程中的优势菌。李宁等对雪茄烟叶表面微生物采用稀释分离法进行分离鉴定，结果表明，人工发酵后雪茄烟叶表面微生物的数量急剧减少，细菌数量仍占绝对优势，仅有少量真菌被分离出来，芽孢杆菌属和青霉属在发酵前后均处于优势地位。张晓娟等在温度40℃、相对湿度70％条件下对雪茄外包皮烟叶面微生物进行分离鉴定，结果表明细菌数量占绝对优势，霉菌较少，未分离到酵母和放线菌。李跃锋等研究发现引起烟叶霉变的微生物主要为球桔青霉、黄曲霉、球孢枝孢和米曲霉，属有害微生物。
高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)是一种生防菌，也是芽孢产生菌，能产碱性蛋白酶。近年来，国内外对高地芽孢杆菌产碱性蛋白酶方面的研究较多，主要的研究集中在方法、性质和纯化等方面，但有关的产芽孢方面的研究较少。芽孢是有些细菌在生长发育后期细胞质高度脱水所形成的的圆形或椭圆形的休眠体。研究表明，芽孢具有耐高温高压、干燥、酸碱、有机溶剂等抗逆性，在医药、畜牧业等领域有重要作用，具有非常重要的研究与应用价值，但在工业发酵生产中，普遍存在芽孢生产不受控制、芽孢率低、芽孢数不高、生产成本高等的情况，给芽孢的生产造成了阻碍和困难，对工业生产效率和经济造成了消极影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何防控烟叶霉变。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC-9，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.20884。
本发明还提供了一种菌剂(记为菌剂1)，该菌剂的活性成分为所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC-9。
上述菌剂2可为具有下述1)-4)中任一功能的菌剂：
1)抑制真菌生长；
2)防治真菌所致病害；
3)防控烟叶或烟草霉变；
4)防治真菌所致烟叶或烟草病害。
进一步，所述真菌可为木霉和/或曲霉。
本发明还提供了一种菌株组合，该菌株组合由所述高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis)YC-9与贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)组成。
上述菌株组合中，所述贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)可为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)ACCC 02735(中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏号为ACCC 02735的菌株)。
本发明还提供了另一种菌剂(记为菌剂2)，该菌剂的活性成分为所述菌株组合。
上述菌剂2可为具有下述1)-4)中任一功能的菌剂：
1)抑制真菌生长；
2)防治真菌所致病害；
3)防控烟叶或烟草霉变；
4)防治真菌所致烟叶或烟草病害。
进一步，所述真菌可为木霉和/或曲霉。
本发明还提供了所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC-9，或所述菌剂1，或所述菌株组合，或所述菌剂2的下述任一应用：
X1)抑制真菌生长；
X2)制备抑制真菌生长产品；
X3)防治真菌所致病害；
X4)制备防治真菌所致病害产品；
X5)防控烟叶或烟草霉变；
X6)制备防控烟叶或烟草霉变产品；
X7)防治真菌所致烟叶或烟草病害；
X8)制备防治真菌所致烟叶或烟草病害产品。
本发明还提供了培养所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC-9的方法，所述方法包括将所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC-9在用于培养高地芽孢杆菌的培养基中培养完成所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC-9的培养。
本发明还提供了所述菌剂1的制备方法，所述方法包括如下骤：将所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC-9作为活性成分，得到所述菌剂。
本发明的菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
本发明中，所述木霉可为长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)。所述曲霉可为黑曲霉(Aspergillus niger)或构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。
在本发明的一个实施例中，所述长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)为长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)ACCC 32522。所述黑曲霉(Aspergillus niger)为黑曲霉(Aspergillus niger)ACCC 31566。所述构巢曲霉(Aspergillus nidulans)为构巢曲霉(Aspergillus nidulans)ACCC 32571。
所述烟叶可为雪茄。
本发明筛选出的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC-9，可抑制真菌的生长，还可减少烟叶霉变，将该菌与贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)ACCC 02735组合在一起可以提高雪茄发酵外观品质。说明，本发明的高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis)YC-9以及菌株组合可用于提高烟叶发酵过程中的品质。
生物材料保藏说明
分类命名：高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)
菌株编号：YC-9
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位简称：CGMCC
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101
保藏日期：2020-10-13
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.20884
附图说明
图1为基于16S rDNA基因序列的YC-9系统发育树。
图2为菌株YC-9在各碳源培养基中的生长曲线。
图3为菌株YC-9各组合pH曲线和生长曲线。
图4为菌株YC-9各组合在四个时间的菌体数、芽孢数以及芽孢率关系。每图中各组合从左至右各指标依次为菌体数、芽孢数以及芽孢率。
图5为菌株YC-9各添加碳源的pH曲线和生长曲线。
图6为菌株YC-9各添加碳源四个时间的菌体数、芽孢数以及芽孢率关系。每图中各碳源从左至右各指标依次为菌体数、芽孢数以及芽孢率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)ACCC 32522、黑曲霉(Aspergillus niger)ACCC 31566和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)ACCC 32571均于本申请的申请日前收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心，又称中国农业微生物菌种保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China，简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)ACCC 32522的收藏日为2013年3月23日，黑曲霉(Aspergillus niger)ACCC 31566的收藏日为2003年5月1日，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)ACCC 32571的收藏日为2013年10月9日，自收藏之日起，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得这三个菌株。ACCC设有专门网站，网站地址为：http://www.accc.org.cn，公众可以直接在网上进行菌种订购。长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)ACCC 32522的网址是http://www.accc.org.cn/Column_Content.asp？Column_ID＝48571&pid＝10211913；黑曲霉(Aspergillus niger)ACCC31566的网址是http://www.accc.org.cn/Column_Content.asp？Column_ID＝48571&pid＝10210966；构巢曲霉(Aspergillus nidulans)ACCC 32571的网址是http://www.accc.org.cn/Column_Content.asp？Column_ID＝48571&pid＝10211962。
贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)ACCC 02735于2007年12月3日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心，该菌株的网址为http://www.accc.org.cn/Column_Content.asp？Column_ID＝48571&pid＝10203415。
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ACCC 01431于2000年2月13日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心，该菌株的网址为http://www.accc.org.cn/Column_Content.asp？Column_ID＝48571&pid＝10202243。
枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)ACCC 01872于2007年6月30日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心，该菌株的网址为http://www.accc.org.cn/Column_Content.asp？Column_ID＝48571&pid＝10202665。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ACCC 02082于2007年7月20日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心，该菌株的网址为http://www.accc.org.cn/Column_Content.asp？Column_ID＝48571&pid＝10202863。
贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)ACCC 02747于2007年8月25日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心，该菌株的网址为http://www.accc.org.cn/Column_Content.asp？Column_ID＝48571&pid＝10203426。
简单芽胞杆菌(Bacillus simplex)ACCC 01137于2006年12月15日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心，该菌株的网址为http://www.accc.org.cn/Column_Content.asp？Column_ID＝48571&pid＝10201954。
坚强芽胞杆菌(Bacillus firmus)ACCC 01126于2006年12月15日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心，该菌株的网址为http://www.accc.org.cn/Column_Content.asp？Column_ID＝48571&pid＝10201943。
实施例1、抑制雪茄烟霉变菌株高地芽孢杆菌YC-9的分离与鉴定
1、样品与培养基
样品：广西烟草叶片。
分离培养基：LB培养基(Luria-Bertani broth)：蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂粉15.0g-20.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。115℃条件下灭菌20分钟。
将广西烟草叶片样品剪碎后混合均匀，取1.0g样品置于盛有99mL无菌水的三角瓶(带玻璃珠)中，摇床150r/mi n振荡30min。采用10倍稀释法依次配制10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的梯度稀释样品液，每个稀释度吸取100μL置于LB固体培养基上，使用涂布棒进行表面涂布，涂布后将LB固体培养基倒置于30℃恒温培养箱中培养1-2d，确定合适浓度，选取菌落数在10cfu～150cfu的平板，用接种环挑取具有不同菌落形态的单菌落进行划线纯化培养，后进行斜面转接及20％甘油管-80℃保存，整个过程要求无菌操作。
2、鉴定
1.1细菌序列鉴定
用无菌牙签挑取少量已纯化培养的菌体重悬于置有100μL无菌ddH2O的EP管中，在沸水浴中煮沸10min，立即置于-20℃冰箱30min，12000rpm离心1min，取上清液即为DNA模板进行PCR扩增，扩增引物为细菌通用引物，上游引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和下游引物1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，扩增片段约为1500bp。
用1.0％琼脂糖凝胶电泳对所得PCR产物进行检测和测序，结果显示，其中一株菌(菌株号为YC-9)的16S rDNA序列为序列表中序列1。
将YC-9的16S rDNA序列在https://www.ezbiocloud.net/网站上进行在线比对，下载相似度较高的模式菌序列，保存为文本格式，导入MAGA6.0中，进行多重比对，删除两端不能对齐的碱基，用Neighbor-Joining进行聚类分析，采用1000次Bootstrap method运算来评估系统进化树拓扑结构的稳定性，构建系统发育学进化树。结果(图1)显示，YC-9与Bacillus altitudinis 41KF2b亲缘关系最近，相似性最高。
1.2形态学鉴定
YC-9的形态学鉴定如下：YC-9菌株革兰氏阳性，菌株菌落表面褶皱，不透明。芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏。
根据如上结果，YC-9菌株被鉴定为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，将该菌株记为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC-9(简称为高地芽孢杆菌YC-9)，高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC-9已于2020年10月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.20884。
实施例2、高地芽孢杆菌YC-9对烟草具有抑霉效果
1、平板拮抗试验
检测实施例1的高地芽孢杆菌YC-9对真菌的抑菌效果，待测真菌为长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)ACCC 32522、黑曲霉(Aspergillus niger)ACCC31566、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)ACCC 32571。
将高地芽孢杆菌YC-9与待测真菌分别转接到LB和PDA培养基上进行菌株活化，接种后将培养皿置于恒温培养箱，高地芽孢杆菌YC-9于30℃培养1天，待测真菌于28℃培养3天。而后用直径6mm的打孔器从真菌菌落边缘打取菌块接种到新的PDA平板中央，用接种环挑取高地芽孢杆菌YC-9菌落接种在PDA平板四个方向半径中点，设置三个重复，置于28℃培养箱中培养72h后，测量高地芽孢杆菌YC-9周围抑菌圈直径大小来评价其对真菌的抑制效果。
实验结果如表1所示，在平板拮抗试验中，高地芽孢杆菌YC-9对真菌Trichodermalongibrachiatum、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans的生均长有一定的抑制效果。
表1、高地芽孢杆菌YC-9对真菌的抑菌圈直径
真菌菌株名称 长枝木霉ACCC 32522 黑曲霉ACCC 31566 构巢曲霉ACCC 32571
抑菌圈直径(cm) 3.06±0.069 2.4±0.014 1.88±0.008
2、雪茄烟叶微生物回添发酵抑霉效果研究
将实施例1的高地芽孢杆菌YC-9进行转接活化后于LB液体培养基液体扩大培养48h，将所得培养产物经过10000rpm/min离心10min，用无菌水清洗掉培养基后收集菌体沉淀，用无菌水重悬菌体沉淀并调OD600至1，得到YC-9菌体悬液。
将雪茄烟叶(2016年乐东中下杂)(雪茄烟叶由中国烟草总公司海南省公司海口雪茄研究所)先回潮2h(回潮在加湿房30℃，100％湿度下进行)，再喷加YC-9菌体悬液，每千克烟叶喷加30ml YC-9菌体悬液，以无菌水替换YC-9菌体悬液处理为空白对照。接种后在海南室内自然状态(温度25-33℃、湿度80-90％)下进行装袋保湿发酵10天，装袋量为0.5kg/袋，发酵结束观察并测量烟叶霉变状况，霉变是指霉菌在雪茄烟叶表面生长繁殖，形成的真菌菌丝斑点或霉层。
按照上述方法，将高地芽孢杆菌YC-9分别替换为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)ACCC 02735、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ACCC 01431、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)ACCC 01872、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ACCC02082、贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)ACCC 02747、简单芽胞杆菌(Bacillussimplex)ACCC 01137和坚强芽胞杆菌(Bacillus firmus)ACCC 01126，其他步骤均不变，作为对照。
将贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)菌株ACCC 02735进行转接活化后于LB液体培养基液体扩大培养48h，将所得培养产物经过10000rpm/min离心10min，用无菌水清洗掉培养基后收集菌体沉淀，用无菌水重悬菌体沉淀并调OD600至1，得到ACCC 02735菌体悬液；将YC-9菌体悬液与ACCC 02735菌体悬液等体积混合，得到混合菌液。将雪茄烟叶(2016年乐东中下杂)先回潮2h(回潮在加湿房30℃，100％湿度下进行)，再喷加混合菌液，每千克烟叶喷加30ml混合菌液。接种后在海南室内自然状态(温度25-33℃、湿度80-90％)下进行装袋保湿发酵10天，装袋量为0.5kg/袋，发酵结束观察并测量烟叶霉变状况。
实验结果如表2，可知，与无菌水处理(CK)相比，高地芽孢杆菌YC-9处理的雪茄烟叶的霉变率显著降低，烟叶霉变率降低了32.4％；与其他芽孢杆菌相比，高地芽孢杆菌YC-9处理的雪茄烟叶的霉变率也均显著降低。说明，高地芽孢杆菌YC-9在发酵过程中可对烟叶霉变起到一定的抑制作用，提高烟叶的利用率，改进烟叶品质。
而利用高地芽孢杆菌YC-9与贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)ACCC 02735的混合菌液处理(YC-9+02735)雪茄烟叶后其霉变率为21.5％，与高地芽孢杆菌YC-9单独处理处理相比，霉变率降低了4.3％，与贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)ACCC 02735单独处理处理相比，霉变率降低了14.1％。
其中，霉变率(％)＝(轻度霉变叶片数+中度霉变叶片数+重度霉叶片变数)/叶片总数×100％。
表2、不同菌剂处理下发酵烟叶霉变情况(第10d)
Figure BDA0002794544720000081
Figure BDA0002794544720000091
注：轻度霉变：存在1-9个霉点或存在一小片霉变，且不存在大片霉变；中度霉变：存在大于等于两小片霉变且不存在大片霉变；重度霉变：存在至少一大片霉变；
霉点：霉变面积小于100mm2；小片霉变：霉变面积大于等于100mm2且小于400mm2；大片霉变：霉变面积大于等于400mm2。
实施例3、高地芽孢杆菌YC-9的特性
本实施例通过分析Biolog系统GenⅢ微平板的71种碳源和全自动生长曲线对实施例1的高地芽孢杆菌YC-9生长量、生长周期，以及产生芽孢的影响，并在摇瓶水平上确定了高地芽孢杆菌YC-9的产孢条件。结果表明，高地芽孢杆菌YC-9对碳源代谢能力较好；芽孢产量较多的碳源为L-苹果酸和α-D-葡萄糖；高地芽孢杆菌YC-9的最适碳源为肌苷芽孢率最高达60.47％。
1材料与方法
1.1材料
试验菌株：高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC-9。
培养基：LB液体(固体)培养基(g/L)：酵母浸粉5.0，蛋白胨10.0，氯化钠5.0，(琼脂15～20)，pH 7.0-7.2，余量为水，121℃灭菌20min。
生长曲线液体培养基(g/L)：Biolog实验的筛选源5.0，(NH4)2SO4 3.0，KH2PO4 1.0，MgSO4 0.5，调节pH值为7.0，余量为水，115℃灭菌20min。生长曲线仪所用的菌体培养基。
组合实验发酵培养基(g/L)：实验筛选的芽孢产量低但菌体生长情况好的碳源5.0，芽孢产量高但菌体生长情况差的碳源5.0，(NH4)2SO4 3.0，KH2PO4 1.0，MgSO4 0.5，余量为水，调节pH值为7.0，115℃灭菌20min。
添加剂发酵培养基(g/L)：葡萄糖1.0，添加剂碳源5.0，蛋白胨3.0，酵母浸粉3.0，KH2PO4 1.0，MgSO4 0.5，pH7.0-7.2，余量为水，121℃灭菌20min。
1.2方法
1.2.1Biolog系统的菌株培养与芽孢量测定
高地芽孢杆菌YC-9在平板活化完成后，按照Biolog系统操作说明，将菌株YC-9置于Biolog系统培养箱中37℃培养，进行三次实验，即分别培养12h、24h和36h，培养完成后进行数据处理和镜检分析[4]。利用Biolog软件收集菌株YC-9的代谢表型数据并进行格式转换和数据分析，选三次实验平均的峰高度进行计算。
为了与Biolog对比分析及工作效率的提高，将一个干燥载玻片划分为4个或6个区域，按照GenⅢ板96孔顺序，一个区域涂布GenⅢ板中一个孔2μl菌液，涂片风干，番红染色，显微镜定性观察芽孢数量。菌体在显微镜下被染料染成红色，但芽孢芽孢壁厚、透性低，着色较困难，所以仍是透明无色的椭圆形状。芽孢数量用“+”表示，“+”表示芽孢率达1-20％，“++”表示芽孢率达21-40％，“+++”表示芽孢率达41-60％，“++++”表示芽孢率达61-80％，“+++++”表示芽孢率达81-100％。
1.2.2生长曲线菌株培养和测定
菌株YC-9接种到LB液体培养基中，37℃，200r/min培养12小时，制成菌悬液(种子液)。以Biolog筛选的碳源为培养基的碳源配制成生长曲线仪的液体培养基，菌悬液和液体培养基以1：7的比例混匀配制成生长培养液，按照生长曲线仪操作说明对菌株YC-9进行培养，每种碳源所配置的培养基在一个培养板上进行三次重复，37℃振荡培养48h。镜检的芽孢量测定方法同1.2.1。
1.2.3组合实验和添加剂实验方法与测定
组合实验发酵培养基以芽孢产量低但菌体生长情况好的的碳源做基础碳源，以芽孢产量高但菌体生长情况差的碳源做为组合碳源的培养基作为实验组，只以芽孢产量较低的碳源作为碳源的培养基为对照组。添加剂实验以葡萄糖作为基础碳源，以组合实验筛选的产芽孢量高的碳源作为添加剂碳源的培养基作为实验组，只添加葡萄糖的培养基为对照组。
将种子液以5％的接种量接入装有50ml培养基的锥形瓶(250ml)中，每种碳源重复三次，37℃、200r/min培养48h。
OD值测定：以空白培养基为对照，每4h对发酵液取样一次，用酶标仪在600波长下进行OD值测量，每个样品重复两次。
菌体和芽孢计数：培养结束后，采用平板菌落计数法检测细菌总数；80℃水浴加热10min后，用稀释涂布平板法检测芽孢的生成量。
2结果与分析
2.1菌株YC-9产芽孢的碳源筛选
菌株YC-9芽孢产量较多且代谢代谢情况好的碳源为4种，碳源种类是醇类、糖类和酸类；菌株YC-9芽孢产量高但代谢情况较差的碳源有14种，碳源种类有糖类、酸类、醇类，其中糖类居多，其次是酸类；芽孢产量低但代谢情况好的碳源有16种，碳源种类有糖类、醇类和酸类。
表3、菌株YC-9GenⅢ板上不同碳源的芽孢产量
Figure BDA0002794544720000111
备注：芽孢的产出量用百分比和“+”表示。“+”表示芽孢率达1-20％，“++”表示芽孢率达21-40％，“+++”表示芽孢率达41-60％，“++++”表示芽孢率达61-80％，“+++++”表示芽孢率达81-100％。
表4、菌株YC-9不同代谢情况和芽孢产量综合的碳源
Figure BDA0002794544720000121
综上所述，通过Biolog系统的培养试验，筛选出芽孢产量较低的碳源并且材料比较容易获得的碳源D-海藻糖、D-纤维二糖、水杨苷、α-D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露醇、甘油和L-苹果酸进行下一步生长曲线的测定的实验，进一步筛选出菌株YC-9芽孢产量不同的碳源。
2.2不同碳源对菌株YC-9生长周期和产芽孢的影响
菌株YC-9在以甘油为碳源时的生长情况较好，在将约46h，菌体密度到达最大，最大光密度约为1.5，镜检发现以甘油为碳源时，在24h时芽孢产量较高，36h和48h时芽孢率较低。菌株YC-9在以α-D-葡萄糖为碳源时约在10h时到达最大菌体密度，生长趋势较其他碳源有所不同，趋势在衰亡期的24h-48h有一段处于平稳阶段，镜检在48h芽孢率最大达90％。以L-苹果酸为碳源时在约28h时达最大菌体密度，在24-32h处于平稳阶段，菌株在36h和48h时芽孢率最大为95％(图2)。菌株YC-9较其他菌株来说，各碳源的生长趋势较集中，菌株生长的最大光密度相差不大。所以菌株YC-9的生长情况在不同碳源下差异不明显。
菌株YC-9在以α-D-葡萄糖和L-苹果酸为碳源时，都是在36h和48h时芽孢率较大，最大产量分别为88％和93％，在24h时芽孢率相比较很少，以这两种底物为碳源时，到达最大菌密度时间分别为10h和24h；以水杨苷和D-甘露醇为碳源时，芽孢率较低，水杨苷最低，但以水杨苷为碳源时，菌株的生长情况较好，两种碳源下菌株到达最大菌体密度时间分别为18h和12h(表5)。
表5、菌株YC-9在各碳源中的芽孢产量
Figure BDA0002794544720000131
备注：芽孢的产出量用百分比和“+”表示。“+”表示芽孢率达1-20％，“++”表示芽孢率达21-40％，“+++”表示芽孢率达41-60％，“++++”表示芽孢率达61-80％，“+++++”表示芽孢率达81-100％。
综上所述，通过对菌株YC-9生长曲线和芽孢产量的测定，进一步筛选到芽孢产量较低但菌体生长情况较好的碳源为水杨苷，结合Biolog实验将芽孢产量较高的碳源水苏糖、半乳糖醛酸、D-棉子糖、肌醇、L-鼠李糖、肌苷、D-山梨醇作为下一步实验的组合碳源。
2.3组合碳源对菌株YC-9产芽孢的影响
由图3的pH曲线可以看出，菌株YC-9各组合的pH曲线都呈下降趋势，水杨苷和肌醇两个组合下降趋势更急速些，最低pH达5.0左右，其他各组合pH的曲线趋势大体一致。
菌株YC-9中L-鼠李糖、D-山梨醇和肌苷三个组合生长曲线趋势大体一致，上升较缓慢，三种组合的趋势都是8h之后呈平稳趋势，在8h达最大菌密度，最大吸光度为0.4左右；其他四种组合上升趋势较急速，然后趋于平稳，最大光密度约在0.8-1.0左右；其中水苏糖组合在24h后有缓慢下降趋势，在48h时下降到0.6左右。
菌株YC-9肌苷组合和D-山梨醇组合芽孢率较高，芽孢产出也较其他组合较高，其中肌苷组合在24h时芽孢率达35.67％，D-山梨醇组合在24h时芽孢率达23.94％；水苏糖组合的菌体数较其他组合高，但芽孢产出较少；对照组中的菌体数和芽孢数都很低，芽孢数最低只有103，表明水杨苷不利于菌株YC-9的菌体生长和产孢；菌株YC-9在12h时菌体数较高，在12h和24h时芽孢数较高。高地芽孢杆菌YC-9组合实验验证产芽孢的结果与Biolog实验芽孢产生结果有一致性(图4)。
2.4碳源做添加剂对菌株YC-9产芽孢的影响
由图5的pH曲线可以看出，菌株YC-9以组合实验筛选的碳源肌苷和D-山梨醇作为添加剂时，三个组合的pH变化趋势大体一致，都是先下降在上升的趋势，pH值由大概7.0变化到碱性状态9.0。其中D-山梨醇组合的pH曲线在其他两个组合的上方，pH较大，肌苷组合整体最小，在三个曲线的最下方。
菌株YC-9三个组合的生长曲线变化趋势大致相同，其中D-山梨醇组合的生长曲线在其他两个下方，说明以D-山梨醇为添加剂时，YC-9菌体的生长情况较其他两个组合较差；肌苷组合的生长曲线在最上方，在12h达最大菌密度，以肌苷为添加剂时菌体生长情况较其他两个较好(图5)。
菌株YC-9添加肌苷的实验组的芽孢数相对较高，它在24h和48h的芽孢率较高，在24h时芽孢率高达60.47％；添加山梨醇的组合与添加肌苷的组合相比较，菌体数和芽孢数都较低，在36h时芽孢率最高，达56.64％；对照组的芽孢数在12h和48h时较低，为106，在24h和36h和时芽孢数和实验组相差不大，芽孢率在24h和48h时比添加D-山梨醇的实验组高。可以看出，对于菌株YC-9来说，发酵时间约为24-36h芽孢产量较高，发酵时间为12h时菌体产量较高(图6)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
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accatgcggg tgctataatg cagtcgagcg gacagaaggg agcttgctcc cggatgttag 60
cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa 120
accggagcta ataccggata gttccttgaa ccgcatggtt caaggatgaa agacggtttc 180
ggctgtcact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240
aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300
cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 360
agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa 420
caagtgcaag agtaactgct tgcaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact 480
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta 540
aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg 600
tcattggaaa ctgggaaact tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt 660
gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg 720
acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 780
taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt 840
aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct 960
tgacatcctc tgacaaccct agagataggg ctttcccttc ggggacagag tgacaggtgg 1020
tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080
cccttgatct tagttgccag cattcagttg ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac 1140
cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt 1200
gctacaatgg acagaacaaa gggctgcgag accgcaaggt ttagccaatc ccacaaatct 1260
gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agctggaatc gctagtaatc 1320
gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380
acgagagttt gcaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt atgagccagc cgccgaaggt 1440
ggtcagatg 1449

Claims (10)

1.高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC-9，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.20884。
2.一种菌剂，其活性成分为权利要求1所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC-9。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为具有下述1)-4)中任一功能的菌剂：
1)抑制真菌生长；
2)防治真菌所致病害；
3)防控烟叶或烟草霉变；
4)防治真菌所致烟叶或烟草病害；
进一步，所述真菌为木霉和/或曲霉。
4.菌株组合，由权利要求1所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC-9与贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)组成。
5.根据权利要求4所述的菌株组合，其特征在于：所述贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)ACCC 02735，所述贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)ACCC 02735在中国农业微生物菌种保藏管理中心的保藏号为ACCC02735。
6.一种菌剂，其活性成分为权利要求4或5所述的菌株组合。
7.根据权利要求6所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为具有下述1)-4)中任一功能的菌剂：
1)抑制真菌生长；
2)防治真菌所致病害；
3)防控烟叶或烟草霉变；
4)防治真菌所致烟叶或烟草病害；
进一步，所述真菌为木霉和/或曲霉。
8.权利要求1所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC-9，或权利要求2或3所述菌剂，或权利要求4或5所述菌株组合，或权利要求6或7所述菌剂的下述任一应用：
X1)抑制真菌生长；
X2)制备抑制真菌生长产品；
X3)防治真菌所致病害；
X4)制备防治真菌所致病害产品；
X5)防控烟叶或烟草霉变；
X6)制备防控烟叶或烟草霉变产品；
X7)防治真菌所致烟叶或烟草病害；
X8)制备防治真菌所致烟叶或烟草病害产品。
9.培养权利要求1所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC-9的方法，包括将所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC-9在用于培养高地芽孢杆菌的培养基中培养完成所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC-9的培养。
10.权利要求2或3所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)YC-9作为活性成分，得到所述菌剂。
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